CN104587453A - Glp-1衍生物颗粒复合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种GLP-1衍生物颗粒复合物及其制备方法、以及其在制备糖尿病治疗药物与减肥药物中的应用。所述复合物是在修饰聚合物γ-PGA-L-PAE形成的颗粒中包载GLP-1衍生物aGLP-1或mGLP-1所形成的一种壳核结构复合体系。本发明复合物粒子能在溶液中稳定存在，能抵御DPPIV酶对GLP-1衍生物降解，延长体循环时间，具缓释效应，延长其体内的活性时间，不仅能实现长效降血糖，还具有控制体重增长的减肥效果。本发明还公开了降血糖和/或降体重的组合物。本发明制备方法中涉及的原料均无生物毒性，安全性高，成本低，制备工艺简单，包裹效率高，所得复合物粒径均匀可控，稳定性好，体内活性时间长，体重控制效果好，适合工业化规模生产，具良好应用前景。

Description

GLP-1衍生物颗粒复合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物药物技术领域，涉及一种GLP-1衍生物颗粒复合物及其制备方法与应用、以及一种降血糖和/或降体重的组合物。

背景技术

糖尿病是当前威胁全球人类健康的最重要的慢性非传染性疾病之一。我国糖尿病患者已超过一亿，成为全球糖尿病患者最多的国家。糖尿病新型药物的研发近年来一直是医药研发中重要的一环，而胰高血糖素样肽-1，即Glucagon-like peptide 1,缩写为GLP-1，类新型药物成为糖尿病医药研发的焦点。GLP-1是一种强效的降血糖激素，并且具有葡萄糖依赖性的刺激胰岛素分泌和抑制胰高血糖素分泌功能，降低了低血糖的危险[Vilsboll T.Diabetes ObesMetab.2009Dec:11]。此外，GLP-1还能刺激胰岛细胞再生，保护胰岛β细胞功能，是新型2型糖尿病靶点特异性小肽[Vella A.Diabetes.2000Apr:49(4):611-7]。

但GLP-1进入体内后由于DPPIV等酶的降解，其半衰期仅为2分钟[Knudsen LB.Int J ClinPract Suppl.Oct:64(167):4-11]。这使得将GLP-l直接做为临床药物不切合实际，因此大量的研究工作用作修饰GLP-1的动力学参数，产生了一系列的类似物与衍生物。目前已被FDA批准上市的药物，如诺华诺德公司研制的利拉鲁肽，其34位精氨酸替换为赖氨酸，26位的赖氨酸处连接1个16C脂肪酸侧链；礼来研制的艾塞那肽，是由蜥蜴(钝尾毒蜥)分泌的具有39个氨基酸的多肽，与GLP-1具有59％的同源性；葛兰素史克研制的阿必鲁肽，其为GLP-1二聚体与人白蛋白重组体。而国内药物公司还未有被批准上市的相关药物，使得该类药物价格昂贵，给病人造成大的经济负担。

但是，利拉鲁肽由于其化学修饰，在临床试验中被发现有致癌风险，被FDA黑框警告[Parks M.N Engl J Med 2010；362:774-7]；艾塞那肽由于其低同源性，被发现有恶心、呕吐等肠胃道副反应[Ruiz Grande C.Can J Physiol Pharmaco1.1990Dec:68(12):1568-73]，以及胰腺炎报告案例，同样被FDA黑框警告；阿必鲁肽虽然可一周给药一次，但面临的肠胃道副反应也更加严重[Richard E.The Lancet Diabetes & Endocrinology,2014,2(4):289-297]。所以，还需要研制一种更为经济，安全，长效的新型GLP-1衍生物。

同时，肥胖症是21世纪威胁人类健康的另一大病症，1997年世界卫生组织已将肥胖正式宣布为一种疾病并作为一种严重的慢性疾病而进行重点防治[许榕仙.肥胖的病因与防治.海峡预防医学杂志,2002,8(5):1-33]。据WHO统计，现全球肥胖症患者已经超过3亿人，11亿人体重过重，中国的肥胖症患者已经超过七千万人，列在全球肥胖病发病率排行榜第10位。而肥胖症给患者带来巨大的健康隐患：增加脑血管疾病的风险，肥胖症患者容易发生大脑动脉粥样硬化；增加糖尿病的风险，肥胖是发生2型糖尿病的重要危险因素之一，在长期肥胖的人群中，糖尿病的患病率明显增加，可高达普通人群的4倍，而2型糖尿病人中，80％是肥胖者；引起骨关节疾病，肥胖可能引起的骨关节疾病主要有三种：骨性关节炎、糖尿病性骨关节炎和痛风性关节炎；增加患癌症的风险，肥胖与某些癌症的发生密切相关[吴丽明,中国医药科学,2011(2):25-26]。

但现有的减肥药物主要由于安全性低，负面报道频现。过去的40年内，有5种减肥药因安全隐患而退出市场。其中最著名的两种药物——惠氏公司的Pondimin芬氟拉明和Redux右芬氟拉明，被发现有增加心脏瓣膜病变风险，在上市一年后便退出市场；赛诺菲的Acomplia利莫那班由于可能引发抑郁症或自杀于2008年退市；Servier公司的Mediator苯氟雷司由于引发心脏瓣膜病变于2009年退市；在我国，由于副反应明显，国家食品药品监督管理局禁止了西布曲明制剂和原料药在中国的生产、销售和使用，结束了以“曲美”为代表的减肥药物长达10年的销售史。因此，需要研制更为安全、有效的减肥药物。

γ-聚谷氨酸，即γ-PGA，是由谷氨酸的α-氨基和γ-羧基缩合而成的线性大分子，由于其生物相容性高，在体内能被降解为内源性谷氨酸，不易产生积蓄和毒副作用，安全可靠，而成为一种理想的药物载体[李睿.高分子材料科学与工程,2014,30(1):11-14]。但γ-PGA其侧链带有大量的游离羧基，与水高度亲和，无法在水中自聚形成颗粒。本发明巧妙地将γ-PGA进行疏水性修饰，即通过将L-苯丙氨酸乙酯，即L-PAE，的氨基与γ-PGA侧链的羧基通过肽键缩合反应相连接，使其成为新型的两亲性共聚物γ-PGA-L-PAE，其中γ-PGA作为水溶性的骨架、L-PAE作为疏水性区域，因而在水中能自聚形成由内部疏水区域和外部亲水区域所组成的稳定颗粒。根据这样的特性，该复合物在水溶液形成颗粒的过程中，能将水溶液中的GLP-1衍生物包裹在颗粒中，装载成为药物-颗粒复合物，该过程的形成示意图如图1所示。装载的两种GLP-1衍生物已有专利授权保护：aGLP-1，专利申请号为CN200910045188，其在给药后体内降血糖活性为440min，其序列如SEQ ID No：1所示；mGLP-1,专利申请号为CN200610024355，其在给药后体内降血糖活性为180min，其序列如SEQ ID No：2所示。

在已经上市的药物中，为了增加药物溶解度、提高药物稳定性，往往需要对药物进行结构改造或者使用药物辅料，如由美国百时美-施贵宝公司研制的紫杉醇注射剂Taxol，为提高紫杉醇的水溶性使用了聚氧乙烯蓖麻油系列衍生物CrEL[Huizing M,J Chromatogr B,1998,709(1):161-5]，而CrEL被发现具有急性超敏反应、外周神经毒性、细胞毒性等一系列不良反应，限制了其使用的广度与深度[高鹏.药学与临床研究,2010,18(1):61-63]。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种GLP-1衍生物颗粒复合物即GLP-1衍生物-NPs，在γ-PGA-L-PAE形成的颗粒中，包载了GLP-1衍生物，形成一种壳核结构复合体系。其中，所述装载的GLP-1衍生物包括aGLP-1或mGLP-1。由于装载的内含物不同，形成了两种GLP-1衍生物-NPs，即aGLP-1颗粒复合物aGLP-1-NPs和mGLP-1颗粒复合物mGLP-1-NPs。两种GLP-1衍生物-NPs即aGLP-1-NPs和mGLP-1-NPs的颗粒直径均在100-150nm之间，呈单分散体系，表面Zeta电位30-35mV，表明粒子能在溶液中稳定存在。GLP-1衍生物-NPs的外层为γ-PGA-L-PAE，为L-PAE的氨基与γ-PGA的羧基通过肽键缩合反应相连接形成的复合物，L-PAE在γ-PGA上的接入率为54％～95％。γ-PGA-L-PAE对aGLP-1和mGLP-1的包裹率分别达78.40±1.80％和81.50±2.50％。GLP-1衍生物经γ-PGAL-PAE-包裹后，能起到抵御DPPIV酶对其降解、延长体循环时间与缓释的作用，从而延长GLP-1衍生物在体内的活性时间。

其中，所述aGLP-1的序列如SEQ ID No：1所示之序列；所述mGLP-1的序列如SEQ IDNo：2所示之序列。

其中，所述GLP-1衍生物-NPs的外壳，即修饰聚合物γ-PGA-L-PAE形成的外壳结构中，所述L-PAE的氨基与γ-PGA的羧基通过肽键缩合反应相连接，从而形成γ-PGA-L-PAE复合物。所述GLP-1衍生物-NPs的外壳结构中，γ-PGA-L-PAE复合物中的L-PAE在γ-PGA上的接入率为54％～95％。

本发明另一目的是提供GLP-1衍生物-NPs的制备方法，经L-PAE疏水性修饰的γ-PGA具有两亲性，在水中能够自聚形成亲水基团在外、疏水基团在内的颗粒，同时包裹GLP-1衍生物进入疏水核心，从而制备得到所述GLP-1衍生物-NP。所述方法包括以下步骤：

1)将由枯草芽孢杆菌Bacillus licheniformis ATCC 9945a发酵提取所得的大分子γ-PGA高温酸解，得到分子量15～30万的γ-PGA；

2)将步骤1)得到的γ-PGA在EDC.I催化下与L-PAE反应，得γ-PGA-L-PAE复合物；

3)将步骤2)所得的产物溶于有机溶剂DMSO中，将γ-PGA-L-PAE溶液缓慢滴加于等体积的GLP-1衍生物溶液中，形成白色乳状体系；

4)将步骤3)所得的产物离心，弃去上清，加水洗涤离心，所得沉淀即为所述GLP-1衍生物-NPs。

在一个具体实施方案中，所述方法包括以下步骤：

1)将大分子γ-PGA配制成2％的水溶液，用盐酸将其pH值调节至3.0，于98℃水浴中高温降解，降解结束立即冰浴冷却，并将其pH值用氢氧化钠溶液调节至7.0，于超纯水中透析72小时，冷冻干燥，得到分子量15～30万的γ-PGA。

2)将步骤1)中得到的15～30万分子量的γ-PGA配制成2％的水溶液，按照γ-PGA:EDC.I:L-PAE＝1:2:0.60～0.98加入反应，于摇床中37℃，210rpm反应24小时。离心得白色沉淀，用超纯水洗涤后再次离心，重复3次，冻干，即得γ-PGA-L-PAE。

3)将步骤2)所得的产物溶于有机溶剂DMSO中，将γ-PGA-L-PAE溶液缓慢滴加于等体积的GLP-1衍生物溶液中，形成白色乳状体系。

4)将步骤3)所得的产物，于高速冷冻离心机中16000rpm，4℃离心15min，弃去上清，再次加水洗涤离心，重复3次，所得沉淀即为GLP-1衍生物-NPs。

本发明中，所述大分子γ-PGA是由微生物发酵合成的，其分子量为60～100万。所述步骤1)中高温降解时间3～15min。所述步骤2)中摩尔比为：γ-PGA:EDC.I:L-PAE＝1:2:0.60～0.98。所述步骤3)中γ-PGA-L-PAE溶液浓度5～40mg/ml；GLP-1衍生物溶液浓度0.25～3.0mg/ml。

本发明另一目的是提供GLP-1衍生物-NPs在制备糖尿病治疗药物中的用途。

本发明另一目的是提供GLP-1衍生物-NPs在制备减肥药物中的用途，所述GLP-1衍生物-NPs可用作体重调控剂或体重调控药物。

本发明另一目的是提供一种组合物，用于降血糖和/或降体重，其含有所述GLP-1衍生物颗粒复合物。所述组合物包括药物组合物。可根据本领域公知方法制备。可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或辅剂，包括本领域公知的各种稀释剂、润滑剂、湿润剂、黏合剂、崩解剂、助流剂等。可制成适用的任何剂型包括液体剂型、固体剂型、半固体剂型等，包括普通制剂、缓释制剂、靶向制剂等。所述GLP-1衍生物颗粒复合物或所述组合物可以单位剂量给药，给药途径包括肠道或非肠道，包括口服、注射等。可单独使用或与其他药物结合使用。所述GLP-1衍生物颗粒复合物在所述组合物中的含量为0.1～99％。在一个具体实施方案中，所述组合物包括甘露醇、mGLP-1-Nps或aGLP-1-NPs，其含量比为50mg/ml甘露醇、1mg/mlmGLP-1-Nps或aGLP-1-NPs。

本发明有益效果包括：

第一，本发明的外层骨架为L-PAE修饰的γ-PGA，可在体内被降解为内源性的氨基酸，不会产生蓄积和毒副作用，生物安全性高，避免了由于采用具有非可降解性、免疫原性高的药物载体而引起身体产生副反应。且本发明采用的γ-PGA采用生物发酵制备，无化学合成而产生的副产物，安全性高，成本低，克服了采用化学合成法副反应多、结构不均一的缺点。第二，本发明针对GLP-1衍生物采用瞬间包裹，制备、纯化工艺简单，避免了采用共价连接导致的致耗时长、引入反应试剂多、纯化复杂等诸多问题。第三，本发明不直接针对GLP-1衍生物做化学性修饰，避免了化学性修饰可能引起的副反应以及可能的蛋白失活。第四，本发明制备过程中，对游离药物包裹效率高，能高效利用游离药物，避免了包裹率低而导致的得率低、成本增加。第五，本发明制备的GLP-1衍生物-NPs颗粒均一，Zeta电位30-35mV，能防止颗粒自聚、沉降，使其能够在溶液中稳定存在，为药物的保存、输运奠定基础。第六，本发明制备而得的GLP-1衍生物-NPs在小鼠体内活性时间可达48-72小时，能够持续性有效降血糖，相比天然GLP-1体内静注2-3min，能够极大程度减少患者注射次数，减轻病人痛苦。第七，本发明GLP-1衍生物-NPs具有控制体重效果，减肥效果明显。

本发明采用的药物载体为L-PAE修饰γ-PGA而成，其生物相容性高，在体内被安全的降解成为内源性的谷氨酸和苯丙氨酸，可被正常生理代谢利用，不会造成生物蓄积，安全可靠。并且本发明采用的γ-PGA通过生物发酵而成，成本低，对环境友好，而传统的化学合成法是将氨基酸逐个连接形成多肽，这一过程工艺路线长、副产物多，合成的γ-PGA通常是α型和γ型的随机混合物，结构难以控制。因而本发明采用的药物载体在载体本身及其来源均显示很强的优越性，为整体药物的安全性奠定了基础。

本发明制备得到的GLP-1衍生物颗粒复合物，即GLP-1衍生物-NPs，在制备过程中，采用的是用两亲性共聚物γ-PGA-L-PAE在水溶液中自聚瞬间包裹的形式，整个颗粒化过程是瞬时进行的，制备过程便捷、迅速。已有的相关报导大都采用将GLP-1衍生物与药物载体共价相连的形式，存在诸多问题。如Ji-Hyun Kong等[Biomaterials,2010,31:4121–4128]将艾塞那肽通过乙烯砜连接到透明质酸上，不仅制备过程复杂，耗时长达24小时，而且在制备过程中需要引入邻苯二甲酰丁辛酯、二异丙基乙胺、磷酸三氯乙酯等生物毒性大的有机试剂或催化剂，给整体药物安全性埋下隐患，需要后续繁琐的纯化步骤；其长时间的反应过程、反应时碱性环境(pH9.0)、复杂的纯化工艺也不利于易降解、易变性的多肽类GLP-1衍生物的活性维持。而本发明在颗粒制备过程中，仅在包裹时引入相对温和、低毒性、低浓度的DMSO，包裹瞬间完成后，即可通过离心出去，既制备快速、工艺简单，又极大程度上保护了GLP-1衍生物的生物活性。

本发明GLP-1衍生物-NPs颗粒分布均一，其表面Zeta电位30-35mV，其强电位保证了其在溶液中能够稳定存在，不会自聚、沉降团聚，为其后续使用过程中的储存、运输奠定了基础。γ-PGA-L-PAE对aGLP-1和mGLP-1的包裹率分别达78.40±1.80％和81.50±2.50％，能高度利用游离药物，控制生产成本，奠定其大规模生产的基础。

本发明首次将GLP-1衍生物包裹颗粒化，依靠外壳保护作用，抵御体内DPPIV等酶的降解；颗粒化增加了GLP-1衍生物的直径大小，从而抵御肾小球的清除作用；装载成颗粒后，减少体内酶对外壳的降解，延长体循环时间，形成缓释效应，实现长效降血糖。实验表明，本发明GLP-1衍生物颗粒复合物即GLP-1衍生物-NPs，在体内有效降血糖活性时间可达48-72小时，而天然GLP-1静注体内半衰期仅为2～3min，本发明具显著优越性，有望2-3天注射一次即可有效控制血糖，减缓病人频繁注射的痛苦，提高病人的顺应性。在肥胖模型鼠的治疗中表明，本发明能够显著抑制体重增长，具有良好的减肥效果。在长期动物实验中表明，GLP-1衍生物-NPs对于糖尿病模型鼠具有良好的治疗效果，且不具备药物毒性。本发明涉及的原料均无生物毒性，安全性高，成本低，制备工艺简单，包裹效率高，得到的GLP-1衍生物-NPs粒径均匀可控，稳定性好，体内活性时间长，适合大批量生产用作长效降血糖药物，降低糖尿病患者频繁注射的痛苦，同时还能显著抑制体重增加，可用作减肥药物。

附图说明

图1为GLP-1衍生物-NPs形成示意图。

图2为大分子γ-PGA分别高温酸解3，5，7，9，11，15min后的琼脂糖凝胶电泳图谱。

图3为γ-PGA-L-PAE复合物的¹H核磁共振图谱。

图4为aGLP-1-NPs的透射电镜图。

图5为mGLP-1-NPs的透射电镜图。

图6为aGLP-1-NPs的颗粒直径分布图。

图7为mGLP-1-NPs的颗粒直径分布图。

图8为aGLP-1-NPs治疗的db/db鼠体重变化率图

图9为mGLP-1-NPs治疗的db/db鼠体重变化率图

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1γ-PGA的制备方法

(1)γ-PGA的制备

菌种活化：将冻存的芽孢杆菌(Bacillus licheniformis ATCC 9945a)从-80℃冰箱中取出，待融化后，按1％接种量接入种子培养基中，37℃、210r/min培养11h。种子培养基(LB液体培养基)：蛋白胨1％，NaCl 0.5％，酵母提取物0.5％。

发酵培养：按5％接种量将上述种子液接入发酵培养基中，37℃、210r/min培养12h 60-72h，至培养液呈粘稠状。发酵培养基：麦芽糖5％，氯化钠1％，酵母粉1％，谷氨酸钠3％，磷酸二氢钾0.5％，七水硫酸镁0.05％。

γ-PGA的提取与纯化：将上述发酵培养液的pH值调为3.0，10,000r/min离心30min去除菌体，得上清液，调节pH值至7.0-8.0。缓缓倒入3-5倍的酒精中，并用玻璃棒不断搅拌，获得γ-PGA于烘箱中烘干，得γ-PGA粗产品。将干燥后的γ-PGA粗产品重新溶于水中，配制成2％溶液，调节pH值至2.0-3.0，10,000r/min，离心30min，于酒精中二次沉淀，烘干。再次将得到的γ-PGA溶于超纯水中，在4℃环境中，在超纯水中透析72小时(截留分子量MW：10000，每隔8小时换一次透析液)，去除杂质和小分子物质，最后将溶液冷冻干燥得到白色粉末状物质，此白色物质即为大分子γ-PGA。

(2)γ-PGA的降解

对于大分子γ-PGA的降解采用高温酸解法。将提取纯化后的大分子γ-PGA溶于纯水中，配制成2％溶液，将pH值用盐酸调节至3.0，于98℃水浴锅中降解3～15min，结束后立即冰浴冷却，并将pH值用氢氧化钠溶液调回至7.0，以结束降解反应。置于透析袋中，在超纯水中透析72小时(截留分子量MW：10000，每隔8小时换一次透析液)，冷冻干燥。降解后的γ-PGA分子量采用琼脂糖凝胶电泳检测分子量大小，配置0.8％的琼脂糖凝胶，上样样品浓度1％，上样体积3ul，置于80V状态下跑50min，结束后用亚甲基蓝染液染色20min，再于纯水中脱色过夜。凝胶电泳图谱，如图2所示，从左到右的上样顺序依次为，30万标准γ-PGA Marker，15万标准γ-PGA Marker，降解时间为3min，5min，7min，9min，11min，15min的γ-PGA，从结果可以看出，随着降解时间的延长，其分子量依次减小，3～15min降解时间得到的γ-PGA分子量在15～30万之间。

实施例2γ-PGA-L-PAE的制备

称取实施例1中得到的γ-PGA 0.1g溶于50ml纯水中，配制成2％的溶液，加入EDC.I2.97g，于摇床中37℃，210rpm震荡15min，再称取L-PAE 0.96～1.69g加入反应体系中，继续于摇床中37℃，210rpm反应24小时。溶液中产生白色沉淀物质，离心，弃去上清，再次用超纯水洗涤，离心弃上清，重复3次，将得到的白色沉淀进行冷冻干燥48-72小时，得到的白色固体物质即为γ-PGA-L-PAE。对于得到的γ-PGA-L-PAE进行核磁共振氢谱检测，溶剂为氘代DMSO，图谱如图3所示，结果显示，图谱中出现了γ-PGA的特征峰——化学位移4.0处，以及L-PAE的特征峰——化学位移8.0处，表明L-PAE已成功连接至γ-PGA上，形成了γ-PGA-L-PAE。

实施例3aGLP-1-NPs的制备及表征

制备方法：将实施例2中得到γ-PGA-L-PAE溶于DMSO中，成5～40mg/ml溶液。取γ-PGA-L-PAE 500ul，缓慢滴加于500ul 0.25～3mg/ml aGLP-1衍生物溶液中，形成白色乳状体系，于高速冷冻离心机中16000rpm，4℃离心15min，弃去上清，再次加水洗涤离心，重复3次，所得白色沉淀即为aGLP-1-NPs，即aGLP-1-NPs。其中，aGLP-1的序列如SEQ ID No：1所示之序列。

将aGLP-1-NPs用1％钼酸铵染色，通过透射电镜观察aGLP-1-NPs的微观结构，呈现100-150nm尺度的圆形颗粒状态，分布均一，如图4所示；用纳米粒度仪检测了其颗粒大小，颗粒直径为140nm，且为单分散体系，如图6所示，其电动电势为30-35mV，大于临界值30mV，表明该体系能在溶液中稳定存在。

包裹率计算：采用BCA蛋白浓度测定试剂盒分析蛋白浓度。按照以下公式计算包裹率：包裹率＝(投入蛋白的总量-未包裹的蛋白量)/投入蛋白的总量×100％，其中未包裹的蛋白量即为离心后上清液中蛋白含量。结果表明γ-PGA-L-PAE对aGLP-1的包裹率达78.40±1.80％。

实施例4mGLP-1-NPs的制备及表征

将实施例2中得到γ-PGA-L-PAE溶于DMSO中，成5～40mg/ml溶液。取γ-PGA-L-PAE500ul，分别缓慢滴加于500ul 0.25～3mg/ml mGLP-1衍生物溶液中，形成白色乳状体系，于高速冷冻离心机中16000rpm，4℃离心15min，弃去上清，再次加水洗涤离心，重复3次，所得白色沉淀即为mGLP-1-NPs。其中，mGLP-1的序列如SEQ ID No：2所示之序列。

将mGLP-1-NPs用1％钼酸铵染色，通过透射电镜观察mGLP-1-NPs的微观结构，呈现100-150nm尺度的圆形颗粒状态，分布均一，如图5所示；用纳米粒度仪检测了其颗粒大小，颗粒直径为113nm，且为单分散体系，如图7所示，其电动电势为30-35mV，大于临界值30mV，表明该体系能在溶液中稳定存在。

包裹率计算：采用BCA蛋白浓度测定试剂盒分析蛋白浓度。按照以下公式计算包裹率：包裹率＝(投入蛋白的总量-未包裹的蛋白量)/投入蛋白的总量×100％，其中未包裹的蛋白量即为离心后上清液中蛋白含量。结果表明γ-PGA-L-PAE对mGLP-1的包裹率达81.50±2.50％。

实施例5aGLP-1-NPs在健康KM鼠体内的降血糖活性

将重量为25克左右的健康KM鼠禁食12h，之后测量空腹血糖(FBG)。根据FBG和体重将KM鼠组间无差异分成3组：Control组(n＝8)，aGLP-1组(n＝8)，aGLP-1-NPs组(n＝8)，在0时刻以上3组分别注射生理盐水、96nmol/kg aGLP-1、96nmol/kg aGLP-1-NPs。检测时间点为:6h,12h,24h,48h,72h,96h，并提前0.5h给KM鼠进行补糖，剂量为36mmol/kg。采用尾尖取血的方法，用血糖仪配套试纸进行血糖的测量。

结果如表1所示，表中数值为Control组，aGLP-1组，aGLP-1-NPs组的降糖率，所示数值均为n＝8的均值。aGLP-1组只表现出6h降血糖活性，而aGLP-1-NPs组的表现出强劲的持续降血糖能力，在72h的降糖率达25.30％，是原aGLP-1降血糖时间的约12倍。

表1.aGLP-1-NPs在KM鼠上的降血糖作用

实施例6mGLP-1-NPs在健康KM鼠体内的降血糖活性

将重量为25克左右的健康KM鼠禁食12h，之后测量空腹血糖(FBG)。根据FBG和体重将KM鼠组间无差异分成3组：Control组(n＝8)，mGLP-1组(n＝8)，mGLP-1-NPs组(n＝8)，在0时刻以上3组分别注射生理盐水、96nmol/kg mGLP-1、96nmol/kg mGLP-1-NPs。检测时间点为:3h,6h,12h,24h,48h,72h，并提前0.5h给KM鼠进行补糖，剂为36mmol/kg。采用尾尖取血的方法，用血糖仪配套试纸进行血糖的测量。

结果如表2所示，表中数值为Control组，mGLP-1游离组，mGLP-1-NPs的降糖率所示数值均为n＝8的均值。mGLP-1组只表现出3h降血糖活性，而mGLP-1-NPs组与之相比显示出强烈的优越性，其有效降血糖时间可达48h。

表2.mGLP-1-NPs在KM鼠上的降血糖作用

实施例7aGLP-1-NPs在db/db糖尿病模型鼠体内的降血糖活性

为了更好的观察aGLP-1-NPs的降血糖活性，我们又在自发型2型糖尿病小鼠db/db鼠中进行生物学活性验证。根据FBG，将db/db鼠分成组间无差异的3组：Control组(n＝5)，aGLP-1组(n＝5)，aGLP-1-NPs组(n＝5)，在0时刻以上3组分别注射生理盐水、96nmol/kg aGLP-1、96nmol/kg aGLP-1-NPs。检测时间点为:3,6,9,24,32,48,56,72,80,96h。采用尾尖取血的方法，用血糖仪配套试纸进行血糖的测量。

结果如表3所示，得到在KM鼠体内相似的结果。结果表明，aGLP-1-NPs组与aGLP-1组相比，显示出强烈的优越性，其降血糖活性时间可达到72小时，而aGLP-1组降血糖活性仅为9h。

表3.aGLP-1-NPs在db/db糖尿病模型鼠上的降血糖作用

实施例8mGLP-1颗粒在db/db糖尿病模型鼠体内的降血糖活性

同样的，我们在db/db糖尿病模型鼠体内验证mGLP-1-NPs的降血糖活性。根据FBG，将db/db鼠分成组间无差异的3组：Control组(n＝5)，mGLP-1组(n＝5)，mGLP-1-NPs组(n＝5)，在0时刻以上3组分别注射生理盐水、96nmol/kg mGLP-1、96nmol/kg mGLP-1-NPs。检测时间点为:3,6,12,24,48,72h。采用尾尖取血的方法，用血糖仪配套试纸进行血糖的测量。

结果如表4所示，同样得到在KM鼠体内相似的结果。结果表明，mGLP-1-NP组与mGLP-1组相比，显示出强烈的优越性，其降血糖活性时间可达到48小时，而游离组mGLP-1降血糖活性仅为3h。

表4.mGLP-1-NPs在db/db糖尿病模型鼠上的降血糖作用

实施例9aGLP-1-NPs在STZ诱导的2型糖尿病模型鼠体内的降血糖活性

采用50mg/kg的剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释的STZ，避光、腹腔注射于C57BL/6J鼠体内。每天进行一次注射，连续注射5天，空腹血糖高于11.1mmol/L作为合格T2DM模型。根据FBG将合格的C57BL/6J T2DM模型鼠组间无差异分成3组：Control组(n＝8)，aGLP-1组(n＝8)，aGLP-1-NPs组(n＝8)，在0时刻以上3组分别注射生理盐水、96nmol/kg aGLP-1、96nmol/kg aGLP-1-NPs。检测时间点为3,6,12,24,36,48h，并提前0.5h给小鼠进行补糖，剂为18mmol/kg。结果如表5所示，同样的，aGLP-1-NPs在C57BL/6J T2DM模型鼠上显示长效的降血糖效果，可达36h，而aGLP-1组仅表现3h降血糖活性。

表5.aGLP-1-NPs在STZ诱导的2型糖尿病模型鼠上的降血糖作用

实施例10mGLP-1-NPs在STZ诱导的2型糖尿病模型鼠体内的降血糖活性

采用50mg/kg的剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释的STZ，避光、腹腔注射于C57BL/6J鼠体内。每天进行一次注射，连续注射5天，空腹血糖高于11.1mmol/L作为合格T2DM模型。根据FBG将合格的C57BL/6J T2DM模型鼠组间无差异分成3组：Control组(n＝8)，mGLP-1组(n＝8)，mGLP-1-NPs组(n＝8)，在0时刻以上3组分别注射生理盐水、96nmol/kgmGLP-1、96nmol/kg mGLP-1-NPs。检测时间点为3,6,12,24,36h，并提前0.5h给小鼠进行补糖，剂为18mmol/kg。结果如表6所示，同样的，mGLP-1-NPs在C57BL/6J T2DM模型鼠上显示长效的降血糖效果，可达36h，而mGLP-1组仅表现3h降血糖活性。

表6.mGLP-1-NPs在STZ诱导的2型糖尿病模型鼠上的降血糖作用

实施例11包含aGLP-1-Nps的组合物的降血糖活性评价

取包含1mg aGLP-1的aGLP-1-Nps，溶解于0.5ml去离子水中；另取50mg甘露醇，溶解于0.5ml去离子水中；将二者混匀即为aGLP-1-Nps与甘露醇的组合物，其中含1mg/ml的以aGLP-1-Nps存在形式的aGLP-1以及50mg/ml的甘露醇。将本实施例制备的含aGLP-1-Nps的组合物用于实施例5、实施例7、实施例9的降血糖实验中，均获得了同样的结果，表明aGLP-1-Nps的组合物具有良好的降血糖活性，能够延长aGLP-1的半衰期，因而可作为糖尿病的治疗药物。

实施例12包含mGLP-1-Nps的组合物的降血糖活性评价

取包含1mg mGLP-1的mGLP-1-Nps，溶解于0.5ml去离子水中；另取50mg甘露醇，溶解于0.5ml去离子水中；将二者混匀即为mGLP-1-Nps与甘露醇的组合物，其中含1mg/ml的以mGLP-1-Nps存在形式的mGLP-1以及50mg/ml的甘露醇。将本实施例制备的含mGLP-1-Nps的组合物用于实施例6、实施例8、实施例10的降血糖实验中，均获得了同样的结果，表明mGLP-1-Nps的组合物具有良好的降血糖活性，能够延长mGLP-1的半衰期，因而可作为糖尿病的治疗药物。

实施例13STZ诱导的2型糖尿病模型鼠长期体内实验

由于在短期体内实验中，aGLP-1-NPs比mGLP-1-NPs显示出更为优良的降血糖活性，故在长期体内动物实验中，选择aGLP-1-NPs用于长期体内疗效的药物。

采用50mg/kg的剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释的STZ，避光、腹腔注射于C57BL/6J鼠体内。每天进行一次注射，连续注射5天，空腹血糖高于11.1mmol/L作为合格T2DM模型。根据FBG将合格的C57 BL/6J T2DM模型鼠组间无差异分成3组：Control组(n＝8)，aGLP-1组(n＝8)，aGLP-1-NPs组(n＝8)。其中，Control组注射空载的由γ-PGA-L-PAE复合物形成的空载颗粒，aGLP-1组每天注射一次96nmol/kg aGLP-1，aGLP-1-NP组每两天注射一次96nmol/kg aGLP-1-NPs。每周统计这3组的饮水饮食与空腹血糖，并在8周治疗结束后，取血，检测各组小鼠血液中的糖化血红蛋白指标。在这8周治疗中，其每周饮食饮水统计如表7，表8所示，数值均以均值显示，结果表明，每天一次的aGLP-1组和两天一次aGLP-1-NPs组均能明显抑制C57BL/6J T2DM模型鼠的饮水饮食，达到等效的效果。糖化血红蛋白检测结果如表9所示，数值均以均值显示，结果表明：每天给药一次的aGLP-1-96nmol/kg体重组其糖化血红蛋白与Control组相比有显著性差异(P＜0.01)，糖化血红蛋白相较于Control组降低了2.8％；每两天一次的aGLP-1-NPs-96nmol/kg组的糖化血红蛋白与Control组相比有极显著性差异(P＜0.001)，糖化血红蛋白相较于Control组降低了3.5％，说明aGLP-1-NPs在两天给药一次的情况下，得到了很好的治疗效果，甚至更优于aGLP-1组一天给药一次。

表7.aGLP-1-NPs对STZ诱导的2型糖尿病模型鼠8周治疗的饮水统计

表8.aGLP-1-NPs对STZ诱导的2型糖尿病模型鼠8周治疗的饮食统计

表9.经8周治疗后糖化血红蛋白检测结果

实施例14aGLP-1-NPs在肥胖模型鼠db/db鼠上的减肥效果评价

根据体重，将肥胖模型鼠db/db鼠分成组间无差异的2组：Control组(n＝6)，aGLP-1-NPs组(n＝6)。其中，Control组每天注射一次生理盐水，aGLP-1组每两天注射一次96nmol/kgaGLP-1-NPs。在给药期间，每周统计一次体重变化，并计算体重变化率，其结果如图8所示。结果表明，通过6周的给药治疗，aGLP-1-NPs能够显著抑制体重增长，具有良好的体重控制效果。

实施例15mGLP-1-NPs在肥胖模型鼠db/db鼠上的减肥效果评价

根据体重，将肥胖模型鼠db/db鼠分成组间无差异的2组：Control组(n＝6)，mGLP-1-NPs组(n＝6)。其中，Control组每天注射一次生理盐水，mGLP-1组每两天注射一次96nmol/kgmGLP-1-NPs。在给药期间，每周统计一次体重变化，并计算体重变化率，其结果如图9所示。结果表明，通过6周的给药治疗，mGLP-1-NPs能够显著抑制体重增长，具有良好的体重控制效果。

实施例16包含aGLP-1-Nps的组合物减肥效果评价

取包含1mg aGLP-1的aGLP-1-Nps，溶解于0.5ml去离子水中；另取50mg甘露醇，溶解于0.5ml去离子水中；将二者混匀即为aGLP-1-Nps与甘露醇的组合物，其中含1mg/ml的以aGLP-1-Nps存在形式的aGLP-1以及50mg/ml的甘露醇。将本实施例制备的含aGLP-1-Nps的组合物用于实施例14的减肥活性评价中，获得了同样的结果，表明aGLP-1-Nps的组合物具有良好的减肥效果，因而可用作减肥药物。

实施例17包含mGLP-1-Nps的组合物减肥效果评价

取包含1mg mGLP-1的mGLP-1-Nps，溶解于0.5ml去离子水中；另取50mg甘露醇，溶解于0.5ml去离子水中；将二者混匀即为mGLP-1-Nps与甘露醇的组合物，其中含1mg/ml的以mGLP-1-Nps存在形式的mGLP-1以及50mg/ml的甘露醇。将本实施例制备的含mGLP-1-Nps的组合物用于实施例15的减肥活性评价中，获得了同样的结果，表明mGLP-1-Nps的组合物具有良好的减肥效果，因而可用作减肥药物。

实施例18aGLP-1-NPs及空载包裹材料于STZ诱导的2型糖尿病模型鼠体内的急性毒性检测

如实施例13中所示，经8周治疗结束后，取血，检测各组小鼠血液中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素(Urea)、肌酐(Cr)指标，其结果如表10所示，结果均以均值显示，根据统计结果显示，aGLP-1组和aGLP-1-NPs组与Control组相比，均不显示差异，表明，aGLP-1-NPs不具备肝毒性和肾毒性，具有良好的生物安全性。

表10.急性毒性实验ALT/AST、Urea、Cr检测结果

Claims (10)

1.一种GLP-1衍生物颗粒复合物，其特征在于，所述复合物为GLP-1衍生物-NPs，在修饰聚合物γ-PGA-L-PAE形成的颗粒中装载了GLP-1衍生物所形成的壳核结构体系。

2.如权利要求1所述的GLP-1衍生物颗粒复合物，其特征在于，所述装载的GLP-1衍生物包括aGLP-1或mGLP-1；所述GLP-1衍生物-NPs包括aGLP-1-NPs或mGLP-1-NPs。

3.如权利要求2所述的GLP-1衍生物颗粒复合物，其特征在于，所述aGLP-1的序列如SEQID No：1所示之序列；所述mGLP-1的序列如SEQ ID No：2所示之序列。

4.如权利要求1所述的GLP-1衍生物颗粒复合物，其特征在于，所述复合物的外壳结构中，L-PAE的氨基与γ-PGA的羧基通过肽键缩合反应相连接。

5.如权利要求4所述的GLP-1衍生物颗粒复合物，其特征在于，所述复合物的外壳结构中，γ-PGA-L-PAE复合物中的L-PAE在γ-PGA上的接入率为54％～95％。

6.一种GLP-1衍生物-NPs的制备方法，其特征在于，基于经L-PAE疏水性修饰的γ-PGA具有两亲性，在水中能够自聚形成亲水基团在外、疏水基团在内的颗粒，同时包裹GLP-1衍生物进入疏水核心制备而成；包括以下步骤：

1)将由枯草芽孢杆菌Bacillus licheniformis ATCC 9945a发酵提取所得的大分子γ-PGA高温酸解，得到分子量15～30万的γ-PGA；

2)将步骤1)中得到的γ-PGA在EDC.I催化下与L-PAE反应，得γ-PGA-L-PAE复合物；

3)将步骤2)所得的产物溶于有机溶剂DMSO中，即形成γ-PGA-L-PAE溶液，再将该溶液缓慢滴加于等体积的GLP-1衍生物溶液中，形成白色乳状体系；

4)将步骤3)所得的产物离心，弃去上清，加水洗涤离心，所得沉淀即为所述GLP-1衍生物颗粒复合物。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，高温降解时间为3～15min；所述步骤2)中，摩尔比γ-PGA:EDC.I:L-PAE＝1:2:0.60～0.98；所述步骤3)中，γ-PGA-L-PAE溶液浓度5～40mg/ml，GLP-1衍生物溶液浓度0.25～3.0mg/ml。

8.如权利要求1所述的GLP-1衍生物颗粒复合物在制备糖尿病治疗药物中的应用。

9.如权利要求1所述的GLP-1衍生物颗粒复合物在制备减肥药物中的应用。

10.一种降血糖和/或降体重组合物，其特征在于，所述组合物含有如权利要求1所述的GLP-1衍生物颗粒复合物。