CN101716161A - 一种新的胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种猪胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂及其制备方法。采用的技术方案是：一种新的猪胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂，是利用壳聚糖对猪胸腺肽进行微胶囊化，获得猪胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂。制备方法如下：将壳聚糖溶于醋酸溶液中，配成壳聚糖醋酸溶液；将无机盐和胸腺肽加入壳聚糖醋酸溶液中，搅拌至完全溶解，作为水相；将含有乳化剂的液体石蜡，作为油相；将水相逐滴加入到油相中，搅拌；逐滴加入交联剂，搅拌，进行交联固化；将所得产物离心，洗涤，干燥。本发明实现了胸腺肽体内缓慢释药，进而为临床胸腺肽的治疗及辅助性给药提供基础。

Description

一种新的胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于食品和药剂学领域，具体地涉及一种新的胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂及其制备方法。

背景技术

胸腺肽(Thymosin)是胸腺组织上皮细胞分泌的多肽激素。1966年，Golden从小牛胸腺中将其提取，自此把这种具有生物活性的物质命名为胸腺肽。其分子量集中在10000Da以下，是几种多肽的复合物。由于胸腺肽在临床应用中具有明显的免疫调节作用、肿瘤辅助治疗作用、肝炎辅助治疗作用等，因此无论是从动物中提取或是通过分子方式合成的胸腺肽都得到医药保健领域越来越广泛的关注。

然而，胸腺肽作为具有生物活性的小肽，在体内作用的半衰期很短(约为30s)，故而其剂型的研究越来越成为热点。目前，胸腺肽剂型主要有以下几种：

1)注射型

注射剂型已应用于临床，其常用剂型以注射用溶液剂和冻干粉针剂为主，前者稳定性较差，需要冷藏(2-8℃)保存，因此造成运输和储存的不便。后者则在药物中加入赋型剂(甘露糖或右旋糖苷)制成冻干粉状，用时加生理盐水稀释即可，其稳定性大大增加。

注射制剂最大的优势在于避免了胃肠道蛋白酶的破坏，见效快，用量小，这也是目前临床上使用注射制剂的主要原因。然而，由于无法解决胸腺肽体内半衰期短的问题，要达到稳定的血药浓度，仍然需频繁给药。频繁注射给药不仅给患者造成极大的不便，而且加重了患者的身体、心理和经济负担。

2)口服剂型

口服制剂由于服用方便、痛苦少，是患者最易接受的一种的剂型，临床使用的主要有片剂和胶囊两种。但是胸腺肽易被胃、肠蛋白酶分解而失去作用，因此，口服剂型中胸腺肽生物利用率极低。通过观察胸腺肽对小鼠淋巴细胞的转化率和E-玫瑰花环形成率的影响，发现要使小鼠淋巴细胞转化率达到45％和E-玫瑰花环形成率约为20％，片剂的用量是注射剂用量的25倍。因此，片剂的使用会造成许多不必要的浪费。

尽管胸腺肽口服剂型的研究取得了一定的进展，但是生物利用率低仍然是人们要解决的一大难题。人们需要一种既不易被胃、肠蛋白酶破坏，又可以缓慢释放的理想剂型，因此新剂型和制剂新技术的研究便应运而生。

发明内容

本发明针对胸腺肽体内半衰期短，而注射剂型易给病人带来痛苦，通过以天然多聚物壳聚糖为壳材对胸腺肽进行微胶囊化，制备胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂，以实现胸腺肽体内缓慢释药，进而为临床胸腺肽的治疗及辅助性给药提供基础。

本发明的另一目的是提供一种胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种新的胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂，是利用壳聚糖对胸腺肽进行微胶囊化，获得胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂。

所述的新的胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂的制备方法包括以下步骤：

1)将壳聚糖溶于醋酸溶液中，配成壳聚糖醋酸溶液；

2)将无机盐和胸腺肽加入壳聚糖醋酸溶液中，搅拌至完全溶解，作为水相；

将含有乳化剂的液体石蜡，作为油相；

3)将水相逐滴加入到油相中，搅拌，形成W/O乳液；

4)向W/O乳液中，逐滴加入交联剂，搅拌，进行交联固化；

5)将所得产物离心，洗涤，干燥。

所述的制备方法中，壳聚糖醋酸溶液的浓度，按质量体积比为1～3％；即：1～3g壳聚糖溶于2％醋酸溶液中，稀释到100ml，在实际应用中，可以按此比例扩大或缩小。

所述的制备方法中，无机盐、胸腺肽和壳聚糖的用量为，无机盐和胸腺肽按重量比为3∶1～1∶3；壳聚糖和胸腺肽按重量比为1∶1～1∶5。

所述的制备方法中，水相和油相的用量为，水相和油相按体积比为1∶2～1∶8。

所述的制备方法中，所述的无机盐是NaCl、硫酸钠、氯化钾或三聚磷酸钠等。

所述的制备方法中，油相中，按体积百分比，乳化剂的含量为3.5％～13％，乳化剂是Span80、Span80与Tween80混合溶液、OP-10或JFC等。

所述的制备方法中，交联剂是25％戊二醛、氧化葡萄糖、葡聚糖、氧化葡聚糖。交联剂通常按一定比例添加，最优化的比例是每10ml W/O乳液加0.5～2ml的交联剂。在实际应用中，可以按此比例扩大。

所述的制备方法中，步骤4)中的搅拌时间是2～6小时；

一个示例性的例子是，新的胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂的制备方法包括以下步骤：

1)将壳聚糖溶于醋酸溶液中，配成按质量体积比，浓度为1％的壳聚糖醋酸溶液；即：1g壳聚糖溶于2％醋酸溶液中，稀释到100ml，可以按此比例扩大或缩小。

2)NaCl和胸腺肽按重量比1∶1，壳聚糖和胸腺肽按重量比为1∶1，将NaCl和胸腺肽加入壳聚糖醋酸溶液中，搅拌至完全溶解，作为水相；

按体积百分比，将含有7％Span80的液体石蜡，作为油相；

3)按水相和油相体积比为1∶2，将水相逐滴加入到油相中，搅拌，形成W/O乳液；

4)向W/O乳液中，逐滴加入25％戊二醛，搅拌4小时，进行交联固化；

5)将所得产物离心；洗涤，干燥。

上述步骤中所述的胸腺肽可以是猪胸腺肽、小牛胸腺肽或其他多肽。

微球(microspheres)是药物溶解或分散于高分子材料中形成的微小球状实体，是目前研究最多的缓释剂型。微球作为药物缓释载体，具有毒性低、可生物降解，可制成不同粒径，可包封多种药物，且药物包封率高等优点。与脂质体相比，微球更稳定，体内代谢更慢，更有利于药物的缓慢释放。可生物降解的缓释微球，被广泛用于药物的缓释和靶向载体，特别是在多肽和蛋白质类药物的缓释方面起到了重要作用。这类生物医药类材料主要包括天然高分子材料、半合成高分子材料和合成高分子材料三大类。

壳聚糖作为天然高分子材料的典型被广泛应用于医药领域。壳聚糖的基本组成单位是氨基葡萄糖。壳聚糖大分子链上分布着两种活泼的反应性基团，在弱酸溶液中游离氨基可以结合质子，成为带有正电荷的聚电解质，有很强的吸附和螯合能力，可作为细胞及生物大分子的固定化载体，并易于进行化学修饰。还有一些N-乙酰胺基与羟基、氨基形成各种分子内和分子间的氢键，由于这些氢键的存在，使壳聚糖分子更容易形成结晶区，所以壳聚糖的结晶度较高，具有很好的吸附性、成膜性、成纤性和保湿性等良好的物理机械性能。由于其优越的功能性质和独特的分子结构，壳聚糖作为可生物降解材料广泛用于新型给药系统，通过改变给药途径可大大提高药物疗效，具有控制释放、增加靶向性、减少刺激和降低毒副作用，以及提高疏水性药物通过细胞膜、增加药物稳定性等作用特点。

通过壳聚糖对胸腺肽进行微胶囊化不仅具有高度安全性，也解决了胸腺肽更广泛应用中所遇到的活性及利用率问题。

本发明通过建立四因素三水平正交试验L9(43)，以获得胸腺肽壳聚糖缓释微球的优选工艺条件，实现其口服给药。

综合考虑微球批量制备过程中的经济因素及影响因素，以壳聚糖醋酸溶液的浓度、戊二醛用量、芯材比值(即壳聚糖和胸腺肽的比值)、油水相比值为正交四因素，以微球粒径、粒径跨距、载药量及包封率作为微球综合评价指标，优选出最佳微球。对其进一步体外释药性研究，验证所得口服微球缓释效用。

本发明的有益效果是：本发明的胸腺肽壳聚糖口服微球药物制剂不仅避免了具有免疫活性的小肽——胸腺肽在经过胃肠道时酸液的破坏，也实现了胸腺肽的肠道缓释，有效解决了其体内半衰期短、需反复给药的问题。为备受关注的胸腺肽的应用提供了更大的可行空间。应用到工业中，一方面，胸腺肽壳聚糖微球的制备，原料丰富且价廉，实现了低成本高收益。其中，壳聚糖是自然界含量丰富的天然可降解糖类，价格低廉。从猪胸腺中提取胸腺肽更是实现了变废为宝的价值观。另一方面，在医药领域备受关注的壳聚糖材料的应用解决了胸腺肽口服给药易失活、体内作用半衰期短等问题，避免了频繁给药，减轻了病人痛苦。同时，所得微球的突释率较低，能有效避免释药初期突释量大导致的血药浓度接近或超过中毒水平，而产生的毒副作用。本发明的胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂的制备条件简易，微球在口服过程可实现胸腺肽缓释作用，且突释率低，表明所得最佳微球具有口服可行性，为胸腺肽应用提供了更广阔前景。

附图说明

图1是实施例4制得的猪胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂释放曲线图。

图中，■是：pH 6.8；◆是：pH7.4；▲是：pH 1.0。

具体实施方式

实施例1  低pH值法提取猪胸腺肽

原料：猪胸腺，来源：市购

制备方法如下：

1)猪胸腺去脂肪用蒸馏水清洗，取90g胸腺，按1∶3(w/v，90g/270ml)加蒸馏水研磨。

2)用4mol/L HCl调pH值为3.5。

3)-20℃反复冻融3次，每次24h。

4)室温融化后，7000rpm 4℃离心30min，留上清。

5)用4mol/L NaOH调pH值为6.8±0.2。

6)80℃水浴加热5min，立即-20℃冷却12h。

7)融化后，7000rpm 4℃离心30min，留上清。

8)用四层滤纸过滤后再用0.22μm滤膜过滤除菌。

9)截留分子量为10kD的透析袋透析(内液∶外液体积比为1∶30)，6h后将透析外液42℃旋转蒸发。

10)真空干燥成为干粉，即为纯化胸腺肽。

实验结果表明，所得胸腺肽经SDS-PAGE验证，其分子量集中在6500Da以下，且为蛋白复合物；紫外扫描图谱显示在251nm处胸腺肽有最大吸收峰，符合药典规定胸腺肽特征，并且干粉的得率为27.39±0.261(x±s)。

实施例2  一种新的猪胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂

制备方法如下：

1)称取1g壳聚糖细粉，溶于2％(w/v)的醋酸溶液中，稀释到100ml，配成按质量体积比，浓度为1％的壳聚糖醋酸溶液，隔夜充分溶胀。

2)按表1取NaCl和35mg按照实施例1方法获得的猪胸腺肽，加于3.5ml壳聚糖醋酸溶液中，搅拌至完全溶解，作为水相。

按表1取7ml油相。

3)将水相逐滴加入到油相中(滴加速度保持1滴/秒)，磁力搅拌器，在一定搅拌速度下，搅拌30min，形成稳定的W/O乳液。

4)向W/O乳液中，逐滴加入25％戊二醛，磁力搅拌，搅拌时间如表1，进行交联固化。25％戊二醛的加入量为：每10ml W/O乳液加入0.5ml。

5)将所得产物移入离心管中，8000r/min离心5min。

6)将所得沉淀用无水乙醇及丙酮各洗涤一次，脱水洗涤三次；每次洗涤，充分涡旋溶解沉淀物，于8000r/min离心5min。

7)最终产物弃去上清液于37℃恒温培养箱中常压干燥。得淡黄色粉末即为胸腺肽壳聚糖微球。

表1

公式：载药量＝微球中药物量/微球总重量

      包封率＝微球中药物量/总投药量

本实施例，利用单因素研究NaCl的量、搅拌时间、搅拌速度及乳化剂Span80的含量对微球的影响。

微球制备结果表明，四个研究因素的最佳条件分别为：NaCl：胸腺肽(w∶w)比值为1∶1、搅拌时间为4h、搅拌速度为1600rpm、Span80的含量为7％时，所得微球的形态较圆整、平均粒径约1～2μm、包封率达60％。

实施例3，一种新的猪胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂

制备方法如下：

1)分别称取1g，2g，3g壳聚糖细粉，溶入2％(v/v)的醋酸溶液中，稀释到100ml，配成按质量体积比，浓度分别为1％，2％，3％的壳聚糖醋酸溶液，隔夜充分溶胀。

2)将一定量NaCl和一定量按实施例1方法获得的猪胸腺肽加于7ml壳聚糖醋酸溶液中，NaCl和胸腺肽按重量比为1∶1，壳聚糖和胸腺肽的重量比如表2，搅拌至完全溶解，作为水相。

取含7％Span80的液体石蜡，作为油相；油相和水相的体积比如表2。

3)将水相逐滴加入到油相中(滴加速度保持1滴/秒)，在搅拌速度为1600rpm下，搅拌30min，形成稳定的W/O乳液。

4)向W/O乳液中，逐滴加入25％戊二醛，搅拌4h，交联固化；戊二醛的加入量为：每10ml W/O乳液加入0.5～2ml。

5)将所得产物移入离心管中，8000r/min离心5min。

6)将所得沉淀用无水乙醇及丙酮各洗涤三次；每次洗涤，充分涡旋溶解沉淀物，于8000r/min离心5min。

7)弃去上清液后，所得沉淀于37℃恒温培养箱中常压干燥。得淡黄色粉末即为胸腺肽壳聚糖微球。

表2中不同实验号，分别对应于不同的壳聚糖醋酸溶液浓度，戊二醛的用量，油、水相比值和壳聚糖∶胸腺肽的比值。

实验中，每组实验按表3选择壳聚糖醋酸溶液浓度，戊二醛的用量，油、水相比值和壳聚糖与胸腺肽的比值。

表2  正交设计水平因素表

表3  胸腺肽壳聚糖微球正交实验表

本实施例以实施例2为基础，设计正交试验研究最佳微球的交联剂的用量，油、水相比值，壳聚糖醋酸溶液的浓度和芯材(壳聚糖∶胸腺肽)比值的条件。

结果：极差分析表明正交试验各因素对微球粒径、载药量等微球性质的影响不是单一的，而是相互制约共同作用。正交实验归一值分析表明1号微球为最佳微球，其平均粒径为1.3μm，微球集中在1-2μm，大小均匀且分散性好，其载药量为51.5％，包封率为80.2％。即优选微球的制备工艺为：壳聚糖醋酸溶液的浓度为1％、25％戊二醛用量为0.5ml、油水比值为2∶1、壳聚糖∶胸腺肽比值为1∶1。

实施例4，一种新的猪胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂

制备方法如下：

1)称取壳聚糖细粉，溶入2％(v/v)的醋酸溶液中，配成按质量体积比浓度为1％的壳聚糖醋酸溶液(如：1g壳聚糖溶于2％的醋酸溶液中，稀释到约100ml，也可以同比例扩大)，隔夜充分溶胀。

2)NaCl和按实施例1方法获得的猪胸腺肽按重量比1∶1，壳聚糖和猪胸腺肽按重量比1∶1，将NaCl和猪胸腺肽加入壳聚糖醋酸溶液中，搅拌至完全溶解，作为水相；

按体积百分比，将含有7％Span80的液体石蜡，作为油相；

3)按水相和油相体积比为1∶2，将水相逐滴加入到油相中(滴加速度保持1滴/秒)，在搅拌速度为1600rpm下，搅拌30min，形成稳定的W/O乳液。

4)向W/O乳液中，逐滴加入25％戊二醛(用量比例为：每10ml W/O乳液加入0.5ml)，搅拌4小时，进行交联固化；

5)将所得产物移入离心管中，8000r/min离心5min。

6)将所得沉淀用无水乙醇及丙酮各洗涤一次，脱水洗涤三次；每次洗涤，充分涡旋溶解沉淀物，于8000r/min离心5min。

7)最终产物弃去上清液于37℃恒温培养箱中常压干燥。得淡黄色粉末即为猪胸腺肽壳聚糖微球。

产品结果：平均粒径为1.3μm，微球集中在1-2μm，大小均匀且分散性好，其载药量为51.5％，包封率为80.2％。所得微球在释放介质pH6.8的PBS、pH7.4的PBS、pH1.5的HCl中进行体外释放研究，表明所得猪胸腺肽壳聚糖微球的释放具有一定的pH依赖性，实验结果见图1。在pH1.5的HCl中，释放率约为50％，在pH6.8的PBS、pH7.4的PBS中释放率都在80％左右，且都在10h左右接近释放终点，24小时释放结束。微球在各释放介质中突释较小，30min突释率在10％左右，1h释放率约为20％左右，其后缓慢而持续的释放。所得微球缓释效果明显，可有效确保猪胸腺肽的肠道缓释，从而在一定程度上避免了胸腺肽被胃、肠蛋白酶的破坏，提高胸腺肽的利用率及有效作用时间。

实施例5  一种新的小牛胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂

原料：小牛胸腺肽，生化试剂，来源：市购

制备方法如下：

1)称取壳聚糖细粉，溶入2％(v/v)的醋酸溶液中，配成按质量体积比浓度为1％的壳聚糖醋酸溶液(如：1g壳聚糖溶于2％的醋酸溶液中，稀释到约100ml，也可以同比例扩大)，隔夜充分溶胀。

2)NaCl和小牛胸腺肽按重量比1∶1，壳聚糖和小牛胸腺肽按重量比1∶1，将NaCl和小牛胸腺肽加入壳聚糖醋酸溶液中，搅拌至完全溶解，作为水相；

按体积百分比，将含有7％Span80的液体石蜡，作为油相；

3)按水相和油相体积比为1∶2，将水相逐滴加入到油相中(滴加速度保持1滴/秒)，在搅拌速度为1600rpm下，搅拌30min，形成稳定的W/O乳液。

4)向W/O乳液中，逐滴加入25％戊二醛(用量比例为：每10ml W/O乳液加入0.5ml)，搅拌4小时，进行交联固化；

5)将所得产物移入离心管中，8000r/min离心5min。

6)将所得沉淀用无水乙醇及丙酮各洗涤一次，脱水洗涤三次；每次洗涤，充分涡旋溶解沉淀物，于8000r/min离心5min。

7)最终产物弃去上清液于37℃恒温培养箱中常压干燥。得淡黄色粉末即为小牛胸腺肽壳聚糖微球。

产品结果：平均粒径为1.3μm，微球集中在1-2μm，大小均匀且分散性好，其载药量为50.8％，包封率为81.1％。所得微球在释放介质pH 6.8的PBS、pH 7.4的PBS、pH 1.5的HCl中进行体外释放研究，表明所得微球与实施例4中猪胸腺肽壳聚糖微球的释放类似，也具有一定的pH依赖性。微球在pH1.5的HCl中，前2h释放了约30％，其后8h仅释放了13％，终释放率约为50％；在pH6.8的PBS、pH7.4的PBS中终释放率都在80％左右，且都在10h左右接近释放终点，24h释放结束。微球在各释放介质中突释较小，30min突释率在10％左右，1h释放率约为20％左右，其后缓慢而持续的释放。其中，在pH 6.8的PBS中，7h～10h为释放高峰期，3h内释放了约30％；在pH 7.4的PBS中5～7h为释放高峰期，2h内释放了约25％。所得微球缓释效果明显，可有效确保小牛胸腺肽的肠道缓释，从而在一定程度上避免了胸腺肽被胃、肠蛋白酶的破坏，提高小牛胸腺肽的利用率及有效作用时间。

实施例2～实施例5中所用的无机盐NaCl可以替换成硫酸钠、氯化钾或硫酸钾；所用的乳化剂Span80可以替换成Span80与Tween80混合溶液、OP-10或JFC；所用的交联剂25％戊二醛可以替换成氧化葡萄糖、葡聚糖或氧化葡聚糖。这些替换对于本领域的技术人员来说，是显而易见的。

Claims (10)

1.一种新的胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂，其特征在于：利用壳聚糖对胸腺肽进行微胶囊化，获得胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂。

2.权利要求1所述的新的胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将壳聚糖溶于醋酸溶液中，配成壳聚糖醋酸溶液；

2)将无机盐和胸腺肽加入壳聚糖醋酸溶液中，搅拌至完全溶解，作为水相；

将含有乳化剂的液体石蜡，作为油相；

3)将水相逐滴加入到油相中，搅拌，形成W/O乳液；

4)向W/O乳液中，逐滴加入交联剂搅拌，进行交联固化；

5)将所得产物离心，洗涤，干燥。

3.按照权利要求2所述的新的胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂的制备方法，其特征在于：所述的壳聚糖醋酸溶液的浓度，按质量体积比为1～3％。

4.按照权利要求2所述的新的胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂的制备方法，其特征在于：无机盐、胸腺肽和壳聚糖的用量为，无机盐和胸腺肽按重量比为3∶1～1∶3；壳聚糖和胸腺肽按重量比为1∶1～1∶5。

5.按照权利要求2所述的新的胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂的制备方法，其特征在于：水相和油相的用量为，水相和油相按体积比为1∶2～1∶8。

6.按照权利要求2所述的新的胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂的制备方法，其特征在于：所述的无机盐是NaCl、硫酸钠、氯化钾或硫酸钾。

7.按照权利要求2所述的新的胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂的制备方法，其特征在于：油相中，按体积百分比，乳化剂的含量为3.5％～13％，乳化剂是Span80、Span80与Tween80混合溶液、OP-10或JFC。

8.按照权利要求2所述的新的胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂的制备方法，其特征在于：交联剂是25％戊二醛、氧化葡萄糖、葡聚糖或氧化葡聚糖。

9.按照权利要求2所述的新的胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂的制备方法，其特征在于：步骤4)中的搅拌时间是2～6小时。

10.权利要求1所述的新的胸腺肽壳聚糖微球口服药物制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将壳聚糖溶于醋酸溶液中，配成按质量体积比，浓度为1％的壳聚糖醋酸溶液；

2)NaCl和胸腺肽按重量比1∶1，壳聚糖和胸腺肽按重量比1∶1，将NaCl和胸腺肽加入壳聚糖醋酸溶液中，搅拌至完全溶解，作为水相；

按体积百分比，将含有7％Span80的液体石蜡，作为油相；

3)按水相和油相体积比为1∶2，将水相逐滴加入到油相中，搅拌，形成W/O乳液；

4)向W/O乳液中，逐滴加入25％戊二醛，搅拌4小时，进行交联固化；

5)将所得产物离心；洗涤，干燥。

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