CN114306340B - 胆酸-季铵化壳寡糖-es2肽/喜树碱结合物的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种胆酸‑季铵化壳寡糖‑ES2肽/喜树碱结合物的制备方法及应用，属于生物医药技术领域。本发明通过控制ES2肽、CA和CPT的供给量，反应体系的pH，反应时间等条件，可以制备得到的CQE/CPT结合物。制备得到的胆酸‑季铵化壳寡糖‑ES2肽/喜树碱结合物与ES2肽相比，提高了ES2肽的稳定性、抗新生血管生成与抗肿瘤活性。此外，该结合物还增加了喜树碱的亲水性，并可以实现喜树碱的缓慢释放，从而减少喜树碱的细胞毒性，提高肿瘤靶向性，因此具有更好的使用效果和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物的制备方法及应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
ES2(IVRRADRAAVP)是ES结构中的一短肽段，是由11个氨基酸组成的多肽序列。ES2具有明显的抗新生血管生成活性和抗肿瘤活性，且更容易通过固相合成的方式获得。但ES2也存在稳定性差、细胞亲和力低、活性不稳定和半衰期短等缺点，研究表明，通过化学修饰的手段有望改善这些缺点。
喜树碱能选择性抑制拓扑异构酶Ⅰ(Topo Ⅰ)，与Topo Ⅰ-DNA形成的复合物结合，稳定此复合物，从而使断裂的DNA链不能重新接合，阻止DNA复制及RNA合成，属于细胞周期特异性抗肿瘤药物。同时，喜树碱存在着稳定性差、溶解性不佳、毒副作用明显等缺点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物的制备方法及应用。本发明通过优化控制反应相关参数和条件，从而成功制备得到胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽结合物以及胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物，其具有良好的稳定性和生物活性，因此具有良好的实际应用之价值。
本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供一种胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物，所述结合物中，ES2肽、季铵化壳寡糖(QCOS)、胆酸(CA)通过酰胺键连接，采用的超声-透析法将喜树碱(CPT)包载其中，结构式如下：
(ES2)n1-QCOS-(CA)n2/(CPT)n3；
式中，n1＝1～10，n2＝1～10，n3＝1～10；季铵化壳寡糖的分子量小于3000Da。
本发明提供了一种ES2肽的季铵化壳寡糖修饰物，针对ES2肽不稳定的缺陷，通过季铵化壳寡糖修饰改善了ES2肽的稳定性，并且具有良好的新生血管抑制作用，可应用于抗肿瘤药物或视网膜病变的治疗等。喜树碱能选择性抑制拓扑异构酶Ⅰ(Topo Ⅰ)，与Topo Ⅰ-DNA形成的复合物结合，稳定此复合物，从而使断裂的DNA链不能重新接合，阻止DNA复制及RNA合成，属于细胞周期特异性抗肿瘤药物，但溶解性不佳。本发明设计采用利用胆酸的疏水特性，对上述季铵化壳寡糖-ES2肽进行疏水性改造化学修饰，形成具有两亲性的聚合物胶束。利用胆酸的疏水性和季铵化壳寡糖-ES2的亲水性，在一定条件下并采用通过物理包埋自组装的方式将喜树碱包载其中，期望获得一种抗肿瘤效果更好的活性成分。该方案解决了喜树碱在溶解性方面的缺陷，并且控制了喜树碱的释放，从而在一定程度上改善了喜树碱的副作用。期望获得一种抗肿瘤效果更好的活性成分。经验证，上述结合物增加了ES2肽的稳定性和抗肿瘤效果，并且，经本发明验证，载有喜树碱的聚合物胶束，提高了喜树碱的溶解性，降低了药物毒性，延长了药物释放并增加了靶向性。
本发明第二方面，提供第一方面所述胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：活化ES2肽的羧基部分，碱性条件下加入季铵化壳寡糖(QCOS)反应得到QE结合物；将活化后的CA与QE结合物偶联得到CQE结合物；采用超声-透析法，将CQE结合物和喜树碱一起溶于二甲基亚砜(DMSO)中，在超声均化后置于透析袋(截留分子量1000)中透析，收集透析液并进行冷冻干燥，得到上述胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物(CQE/CPT)。
本发明第三方面，提供一种药物组合物，其包含所述胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物。
本发明第四方面，提供第一方面所述胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物、第三方面药物组合物在制备增强机体免疫力、抗氧化、抗炎、抗菌、抗新生血管生成和/或抗肿瘤等相关疾病的产品中的应用。
上述结合物中，ES2肽、壳寡糖的生理活性是多个方面的，包括机体免疫力调节、抗菌、抗炎，预防心血管疾病、肿瘤及改善胃肠道等。喜树碱作为一种抗肿瘤药物具有较强的细胞毒性，而上述结合物在物理性质方面能够改善喜树碱溶解度的缺陷，在生理活性方面还可以很好的弥补喜树碱带来的副作用，降低喜树碱带来的不良反应。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
上述技术方案制备的QE和CQE/CPT结合物与ES2肽相比，其稳定性更高，生物活性更强，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述QE结合物的核磁共振氢谱图；
图2为实施例1中所述CQE/CPT结合物的透射电子显微镜结果图；
图3为实施例1中所述CQE/CPT结合物的粒径结果图；
图4为实施例2中所述ES2、QE和CQE/CPT结合物抑制黑色素瘤细胞B16F10迁移的实验数据图。
图5为实施例3中所述CPT和CQE/CPT结合物对人胚肺成纤维细胞的细胞毒性实验结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，ES2作为一种抗新生血管生成药物，在稳定性等方面存在不足，为了解决如上的技术问题，本发明设计采用胆酸-季铵化壳寡糖修饰了ES2肽并联合应用喜树碱，提供了一种具有良好稳定及生物活性的结合物。
本发明第一方面，提供一种胆酸-季铵化壳寡糖修饰的ES2肽/喜树碱结合物，所述结合物中，ES2肽、季铵化壳寡糖(QCOS)、胆酸(CA)通过酰胺键连接，采用超声-透析法包载喜树碱(CPT)，其结构式如下：
(ES2)n1-QCOS-(CA)n2/(CPT)n3；
式中，n1＝1～10，n2＝1～10，n3＝1～10；季铵化壳寡糖的分子量小于3000Da。
优选的，所述季铵化壳寡糖的分子量为2000～3000Da。
优选的，所述季铵化壳寡糖的取代度为4～7，进一步的，为4或5或6，具体的，取代度为5。
优选的，所述ES2肽的氨基酸序列为：IVRRADRAAVP。
优选的，所述n1＝1～5；进一步，效果较好的实施方式中，所述结合物中，ES2的个数为2，3或4个；
所述n2＝1～5；进一步，效果较好的实施方式中，所述结合物中，CA的个数为2，3或4个；
所述n3＝1～5；进一步，效果较好的实施方式中，所述结合物中，CPT的个数为2，3或4个。
本发明第二方面，提供第一方面所述胆酸-季铵化壳寡糖修饰的ES2肽/喜树碱结合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：活化ES2肽的羧基部分，弱碱性条件下加入季铵化壳寡糖(QCOS)反应得到QE结合物；将活化后的CA后与QE结合物偶联得到CQE结合物；采用超声-透析法，将CQE结合物和喜树碱一起溶于二甲基亚砜(DMSO)中，在超声均化后置于透析袋(截留分子量1000)中透析，收集透析液并进行冷冻干燥，得到上述胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物(CQE/CPT)。
优选的，上述制备方法中，QE结合物的具体制备方法如下：向ES2的水溶液中加入1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺(EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为催化剂活化ES2中的羧基，活化完成后调节pH至弱碱性，然后缓慢加入QCOS溶液进行反应，反应完成后，反应产物经纯化即得QE结合物。
进一步的，EDCI和NHS催化剂的质量比为1～3：0.5～1.5。
进一步的，所述弱碱性为pH值7～8.0。
进一步的，所述QCOS溶液加入ES2水溶液后缓慢搅拌，反应20～25h后结束反应。
进一步的，所述纯化可采用柱色谱、透析等常规方式，具体的，采用截留分子量(MWCO)为1000Da的透析袋进行纯化得到QE结合物。
具体的实施方式中，所述QE结合物的制备方法如下：将ES2短肽溶于双蒸水中，获得ES2溶液，然后向其中加入EDCI和NHS催化剂，比例为2：1，混匀，于室温条件下缓慢搅拌1h；用双蒸水溶解QCOS，将ES2溶液逐滴加入到QCOS溶液中，缓慢搅拌反应24h，反应完成后，将反应液转移到截留分子量为1000Da的透析袋中用双蒸水透析两天，除去杂质；透析完成后，收集反应液放入冷冻干燥机中冻干，获得QE结合物。
优选的，上述制备方法中，所述CQE结合物的制备方法如下：向CA的水溶液中加入EDCI和NHS进行活化后，缓慢加入上述QE溶液继续反应，反应结束后，反应产物经纯化后即得CQE结合物。
进一步的，活化时间为0.8～1.2h。
进一步的，所述加入QE结合物溶液后室温条件下反应20～25h。
进一步的，所述纯化可采用柱色谱、透析等常规方式；具体的，采用截留分子量(MWCO)为1000Da的透析袋透析纯化得到CQE结合物。
具体的实施方式中，所述CQE结合物的制备方法如下：将CA溶于无水甲醇中，获得CA溶液，然后向其中加入EDCI和NHS催化剂，比例为2：1，混匀，于室温条件下缓慢搅拌1h；用双蒸水溶解QE，将QE溶液逐滴加入到CA溶液中，缓慢搅拌反应24h，反应完成后，将反应液转移到截留分子量为1000Da的透析袋中用双蒸水透析两天，除去杂质；透析完成后，收集反应液放入冷冻干燥机中冻干，获得CQE结合物。
优选的，上述制备方法中，所述CQE/CPT结合物的制备方法如下：将CQE和CPT溶于DMSO溶液中，超声均化后，透析三天，透析液经冷冻干燥后即得CQE/CPT结合物。
进一步的，所述超声时间为20min～40min。
进一步的，所述透析时间为48h～96h。
具体的实施方式中，所述CQE/CPT结合物的制备方法如下：将CQE结合物和CPT溶于DMSO中，超声均化30min后置于截留分子量(MWCO)为1000Da的透析袋中，用双蒸水透析三天，第一天每隔3h换一次水。后两天每隔6h换一次水。透析完成后，用0.45μm滤膜除去反应液中的沉淀。收集透明溶液，放入冷冻干燥机中冻干，获得CQE/CPT结合物。
本发明第三方面，提供一种药物组合物，其包含所述胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物。
进一步的，所述药物组合物可进一步包含其他抗肿瘤活性成分，如细胞毒类药物、激素类药物、生物反应调节剂、单克隆抗体药物等。
进一步的，所述药物组合物还含有常用的辅料。
进一步的，所述药物组合物的剂型没有任何限制，可为固体制剂，液体制剂等，所述固体制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂等；液体制剂包括糖浆剂、注射剂等。介于本发明结合物中的多肽成分，上述结合物掺入组合物制备相应的制剂时，应当适当添加药学上可行的有机或无机载体以保持多肽活性。
一种实施方式中，所述药物组合物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。
又一种实施方式中，所述剂型为可注射埋植剂、乳剂、脂质体、微囊剂、微球剂、纳米粒等。
发明第四方面，提供第一方面所述胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物、或第三方面药物组合物在制备增强机体免疫力、抗氧化、抗炎、抗菌、抗新生血管生成和/或抗肿瘤等相关疾病的产品中的应用。
优选的，所述产品包括但不限于药物、保健品、功能性食品等；其中，保健品或功能性食品的功能包括但不限于增强机体免疫力、保肝护肝、调节肠胃、降血糖、降血脂、降胆固醇、减肥等。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1：
ES2肽的季铵化壳寡糖化修饰物(QE)的制备
取适量ES2肽(采用固相合成法合成)溶于双蒸水中，获得ES2溶液，然后向其中加入EDCI和NHS催化剂，比例为2：1，混匀，于室温条件下缓慢搅拌，搅拌完成后调pH值至7.40。用双蒸水溶解QCOS，将QCOS溶液逐滴加入到ES2溶液中，缓慢搅拌反应24h。反应完成后，将反应液转移到MWCO为1000Da的透析袋中用双蒸水透析两天，除去杂质。透析完成后，收集反应液放入冷冻干燥机中冻干，获得QE结合物。
采用1H NMR鉴定QE结构，结果如图1所示，已成功制备出QE结合物。胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物(CQE/CPT)的制备
(1)将CA溶于无水甲醇中，获得CA溶液。分别向其中加入EDCI和NHS，缓慢搅拌活化1h。取适量的QE溶于双蒸水中，并将此溶液逐滴加入到CA中，于室温条件下反应24h。反应完成后，用MWCO为1000Da的透析袋中用双蒸水透析两天，以除去杂质。透析完成后，收集反应液放入冷冻干燥机中冻干，获得CQE结合物。
(2)将适量的CQE和CPT溶解在DMSO中，超声均化30min。超声结束后，将溶液放入MWCO为1000Da的透析袋中用双蒸水透析三天。第一题每隔2h换一次水，后两天每隔6h换一次水。透析完成后，收集反应液置于冷冻干燥机内冻干，获得CQE/CPT结合物。
采用透射电子显微镜和动态光散射仪对CQE/CPT进行表征，结果如图2和图3所示，CQE/CPT结合物在水溶液中呈球形，且半径在100nm左右。
实施例2ES2肽、QE和CQE/CPT结合物对B16F10高转移黑色素瘤细胞迁移的抑制作用比较
(1)实验药物：ES2肽、实施例1制备的QE结合物、CQE/CPT结合物。
(2)实验方法：收集对数期生长的B16F10细胞，调整细胞悬液至合适浓度，并以每孔5×104个细胞接种到6孔板中，放入二氧化碳培养箱，在37℃下过夜培养6孔板至细胞贴壁。以直尺做对比，用200μL无菌枪头在每孔划3条线。轻轻吸走含有划痕脱落细胞的培养基，并用无菌PBS清洗2次。然后分别加入2ml的ES2、QE和CQE/CPT三种药物，药物浓度分别为100μg/mL，200μg/mL，500μg/mL(浓度以ES2浓度为标准)，每种药物每个浓度设置3个孔，将只含有1640培养基的孔设置为空白对照组。将加完药的6孔板置于二氧化碳培养箱中孵育24h。分别于0h和24h时将6孔板置于倒置显微镜下拍照，利用Image J软件对划痕面积进行计算。
抑制黑色素瘤细胞迁移实验结果见图4。可以看出，ES2组药物对抑制B16F10细胞的迁移没有太大影响，而QE和CQE/CPT两组药物均对B16F10细胞有明显的抑制作用，而且随着浓度的增加，细胞迁移面积也相应减小。同时发现，随着浓度的增加，CQE/CPT表现出比QE组更好的抑制作用。
实施例3CPT和CQE/CPT结合物对人胚肺成纤维细胞的细胞毒性测试
(1)实验药物：CPT和实施例1制备的CQE/CPT结合物。
(2)实验方法：收集对数期生长的MRC5细胞，调整细胞悬液至合适浓度，并以每孔5×103个细胞接种到96孔板中，放入二氧化碳培养箱，在37℃下过夜培养96孔板至细胞贴壁。然后分别加入CPT和CQE/CPT结合物两种药物，药物浓度分别为5μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL(浓度以CPT浓度为标准)，每种药物设置8个复孔。将只含有1640培养基的孔设置为空白对照组，有细胞且不加含药培养基的孔作为为阴性对照组。将96孔板置于二氧化碳培养箱中孵育48h，在避光条件下弃掉培养基，将CCK-8溶液加入到96孔板内，每孔10μL，将96孔板放置到培养箱中，培养基颜色变为橙色后取出，然后用酶标仪检测450nm波长条件下各孔的OD值，并计算细胞存活率计算公式如下：细胞存活率＝[(实验组-空白对照组)/(阴性对照组-空白对照组)]×100％。
细胞毒性实验结果见图5。由图5可以看出，和CPT组相比，CQE/CPT结合物组的MRC5细胞存活率明显增加，这表明喜树碱被胆酸-季铵化壳寡糖-ES2聚合物包载后，可以实现喜树碱的缓慢释放，从而降低其细胞毒性，在一定程度上减少毒副作用。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (33)
1.一种胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物，其特征在于，所述胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物中，ES2肽、季铵化壳寡糖（QCOS）、胆酸（CA）通过酰胺键连接，将喜树碱(CPT)包载其中，所述胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物的结构式如下：
(ES2)n1-QCOS-(CA)n2/(CPT)n3；
式中，n1＝1～10，n2＝1～10，n3＝1～10。
2.根据权利要求1所述的胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物，其特征在于，季铵化壳寡糖的分子量小于3000Da；所述季铵化壳寡糖的取代度为4~7。
3.根据权利要求2所述的胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物，其特征在于，所述季铵化壳寡糖的分子量为2000~3000Da；所述季铵化壳寡糖的取代度为4或5或6。
4.根据权利要求3所述的胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物，其特征在于，所述季铵化壳寡糖的取代度为5。
5.根据权利要求1所述的胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物，其特征在于，所述ES2肽的氨基酸序列为：IVRRADRAAVP；所述n1＝1～5；所述n2＝1～5；所述n3＝1～5。
6.根据权利要求5所述的胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物，其特征在于，n1为2，3或4；n2为2，3或4；n3为2，3或4。
7.一种根据上述权利要求任意一项所述胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：活化ES2肽的羧基部分，碱性条件下加入季铵化壳寡糖反应得到QE结合物；将活化后的胆酸与QE结合物偶联得到CQE结合物；采用超声-透析法，将CQE结合物和喜树碱一起溶于二甲基亚砜中，在超声均化后置于透析袋中透析，收集透析液并进行冷冻干燥，得到所述胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物；优选的，透析袋为截留分子量1000Da的透析袋。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，QE结合物的制备方法如下：向ES2肽的水溶液中加入1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺（EDCI）和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为催化剂活化ES2肽中的羧基，活化完成后调节pH至弱碱性，然后缓慢加入季铵化壳寡糖溶液进行反应，反应完成后，反应产物经纯化即得QE结合物。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，EDCI和NHS催化剂的质量比为1~3：0.5~1.5。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述弱碱性为pH值7~8.0。
11.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述季铵化壳寡糖溶液加入ES2肽水溶液后缓慢搅拌，反应20~25h后结束反应。
12.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述纯化采用柱色谱或透析。
13. 根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，采用截留分子量为1000 Da的透析袋进行纯化得到QE结合物。
14. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述QE结合物的制备方法如下：将ES2短肽溶于双蒸水中，获得ES2溶液，然后向其中加入EDCI和NHS催化剂，比例为2：1，混匀，于室温条件下缓慢搅拌1h；用双蒸水溶解季铵化壳寡糖，将ES2溶液逐滴加入到季铵化壳寡糖溶液中，缓慢搅拌反应24h，反应完成后，将反应液转移到截留分子量为1000 Da的透析袋中用双蒸水透析两天，除去杂质；透析完成后，收集反应液放入冷冻干燥机中冻干，获得QE结合物。
15.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述CQE结合物的制备方法如下：向胆酸的水溶液中加入EDCI和NHS进行活化后，缓慢加入上述QE结合物溶液继续反应，反应结束后，反应产物经纯化后即得CQE结合物。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，活化时间为0.8~1.2h。
17.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述加入QE结合物溶液后室温条件下反应20~25h。
18.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述纯化采用柱色谱或透析。
19. 根据权利要求18所述的制备方法，其特征在于，采用截留分子量为1000 Da的透析袋透析纯化得到CQE结合物。
20. 根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述CQE结合物的制备方法如下：将胆酸溶于无水甲醇中，获得胆酸溶液，然后向其中加入EDCI和NHS催化剂，比例为2：1，混匀，于室温条件下缓慢搅拌1h；用双蒸水溶解QE结合物，将QE结合物溶液逐滴加入到胆酸溶液中，缓慢搅拌反应24h，反应完成后，将反应液转移到截留分子量为1000 Da的透析袋中用双蒸水透析两天，除去杂质；透析完成后，收集反应液放入冷冻干燥机中冻干，获得CQE结合物。
21.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物的制备方法如下：将CQE结合物和喜树碱溶于DMSO溶液中，超声均化后，透析三天，透析液经冷冻干燥后即得CQE/CPT结合物。
22.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述超声时间为20min~40min。
23.根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述透析时间为48h~96h。
24. 根据权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物的制备方法如下：将CQE结合物和喜树碱溶于DMSO中，超声均化30min后置于截留分子量为1000 Da的透析袋中，用双蒸水透析三天，第一天每隔3h换一次水；后两天每隔6h换一次水；透析完成后，用0.45μm滤膜除去反应液中的沉淀；收集透明溶液，放入冷冻干燥机中冻干，获得胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物。
25.一种药物组合物，其特征在于，其包含权利要求1-6任意一项所述胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物。
26.根据权利要求25所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含其他抗肿瘤活性成分；所述药物组合物还含有辅料；所述药物组合物为固体制剂或液体制剂。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其特征在于，所述其他抗肿瘤活性成分选自细胞毒类药物、激素类药物、生物反应调节剂、单克隆抗体药物。
28.根据权利要求26所述的药物组合物，其特征在于，所述固体制剂包为片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂中的一种。
29.根据权利要求26所述的药物组合物，其特征在于，所述液体制剂包括糖浆剂、注射剂中的一种。
30.根据权利要求26所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为固体口服制剂、液体口服制剂或注射剂。
31.根据权利要求26所述的药物组合物，其特征在于，所述剂型为可注射埋植剂、乳剂、脂质体、微囊剂、微球剂、纳米粒中的一种。
32.根据权利要求1-6任一项所述胆酸-季铵化壳寡糖-ES2肽/喜树碱结合物、或权利要求25-31任一项所述药物组合物在制备增强机体免疫力、抗氧化、抗炎、抗菌、抗新生血管生成和/或抗肿瘤的产品中的应用。
33.根据权利要求32所述应用，其特征在于，所述产品包括药物。
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