CN102552105B - 一种级联脑部靶向药物递送系统及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域，涉及一种级联脑部靶向药物递送系统及用途。本发明的级联靶向药物递送系统由第一级靶向功能分子、第二级靶向功能分子和药物载体构成；所述的级联靶向药物递送系统可通过第一级靶向功能分子特异性识别血脑屏障，通过第二级靶向功能分子特异性识别脑部病变部位而达到精确靶向的目的，并将成像分子或药物精确递送至脑部病变部位，达到良好的成像和治疗效果。本发明的级联脑部靶向药物递送系统可用于制备治疗或诊断脑部疾病如脑肿瘤神经系统疾病的制剂。

Description

一种级联脑部靶向药物递送系统及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及级联脑部靶向药物递送系统，具体涉及一种级联脑部靶向药物递送系统及其制备方法和用途，尤其涉及具有脑靶向递药特性的级联靶向系统，及其在制备治疗或诊断脑部疾病如脑肿瘤神经系统疾病制剂中的应用。

背景技术

随着人类社会的老龄化，脑部疾病的发病率正呈逐年上升的趋势，严重危害人类的生命和健康；已知脑部疾病包括中枢神经系统疾病(帕金森病、老年性痴呆)、脑肿瘤、脑血管病变、脑部病毒和细菌感染等疾病。目前，传统的药物治疗普遍存在效果不佳、毒副作用较大的缺点。

现有技术公开了血脑屏障(BBB)存在于血液与脑组织间的屏障系统；其能选择性透过脑部需要的氨基酸葡萄糖等营养物质，而将脑组织非必需或是有害的物质隔离在外，起到保护脑组织的作用。所述血脑屏障上的脑毛细血管内皮细胞和胶质细胞共同构成了紧密连接，成为药物经静脉注射后进入脑部的第一道屏障；一方面，在脑实质同样具有正常组织和病变组织，药物进入脑部后非选择性均匀分布同样会造成对正常组织的毒副作用，同时降低了进入病变组织药物的总量，使得治疗效果不佳；另一方面，分布于正常组织的影像分子使得病变组织成像背景提高，效果不佳。目前，传统的靶向递药系统通常采用一个靶向功能分子以达到靶向BBB或者病变组织的效果，然而，对于存在双重屏障的脑部疾病，该类靶向递药系统却不能同时靶向BBB和病变组织，从而无法有效的提高治疗或影像效果；因此，有必要构建能精确靶向至脑部病变部位或者特定部位的递药系统以达到良好的治疗和成像效果。

有研究显示，脑毛细血管内皮细胞膜上还特异性表达有许多受体或载体，上述受体或载体的特异性配体能作为靶向功能分子将药物或者药物递送系统靶向并转运至脑内；而病变组织相对于正常组织其细胞表面同样表达不同种类和程度的受体，其相关特异性配体可用于将药物、影像分子或递送系统靶向并转运至病变部位或细胞。

目前，有关脑靶向药物递送系统的专利主要是采用能够识别BBB的功能分子连接与脂质体、胶束等药物递送系统表面而达到靶向效果，无级联靶向和脑部特定部位精确靶向作用，如专利申请号200910051970.3，200810145690.4，201010106567.9，200610125443.9，200610116486.0，200310105969.7，200910141973.6，201010110665.X，201010111960.7等。有关疾病靶向尤其是肿瘤靶向等的专利主要是采用能够识别病变部位的功能分子连接与脂质体、胶束等药物递送系统表面而达到靶向效果，无级联靶向和脑靶向作用，如专利申请号200510013204.X，02105456.8，200310122830.3。有关双级靶向药物递送系统的专利中仅有采用单一功能分子或者两个同质化的功能分子修饰药物递送系统，无级联靶向作用，如专利申请号200910078359.X。

有关文献中仅本申请发明人发表了一篇探索性讨论级联靶向的文章“A cascadetargeting strategy for brain neuroglial cells employing nanoparticles modified withangiopep-2 peptide and EGFP-EGF1 protein”(Biomaterials，2011，32(33)：8669-8675)，但其中仅涉及关于靶向正常神经胶质细胞的研究，并无应用于疾病治疗和成像的报道。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的缺陷和不足，提供一种级联脑部靶向药物递送系统及其制备方法和用途。本发明能克服脑部疾病诊断和治疗面临双重屏障的困难，克服传统脑靶向或疾病靶向药物递送系统无法精确靶向脑部病变部位的问题，。本发明所述的递送系统可包载影像分子或药物以达到精确成像和治疗的目的。

本发明采用能特异性识别BBB的配体作为一级靶向功能分子，以能特异性识别脑部病变部位的配体作为二级靶向功能分子，将其修饰于包载有成像分子如荧光探针、铁纳米粒、金纳米粒等或药物的递送系统包括脂质体、纳米粒、胶束、聚合物泡囊等表面，制成级联脑部靶向药物递送系统，使其达到精确靶向脑部病变部位、并清晰成像或准确治疗的目的。

具体而言，本发明的级联脑部靶向药物递送系统，其特征在于，由第一级脑靶向功能分子、第二级疾病靶向功能分子和载体系统构成；

所述的第一级脑靶向功能分子为可特异性识别BBB上受体或载体的分子，包括但不限于能够识别低密度脂蛋白受体的乳铁蛋白、短肽angiopep系列等，能识别转铁蛋白受体的转铁蛋白、转铁蛋白受体单克隆抗体等，能识别乙酰胆碱受体的RGD肽、KC2S肽等，能通过吸附介导透过BBB的阳离子白蛋白、苯甲酰胺类似物等，以及未发现明确受体的TGN噬菌体展示肽、缓激肽类似物RMP-7等；

所述的第二级疾病靶向功能分子为可特异性识别病变组织如脑肿瘤、阿尔茨海默症、帕金森症等特征的分子，包括但不限于叶酸、AS1411 aptamer，转铁蛋白、干扰素、穿膜肽、胰岛素等；

所述的载体系统(药物载体)为可包载药物或者影像分子的纳米级粒子，包括但不限于脂质体、纳米粒、胶束、聚合物泡囊等。

本发明的级联脑部靶向药物递送系统采用下述方法制备：

所述的靶向功能分子先与载体材料连接后再制备药物递送系统；

或，在制备药物递送系统后通过一定的反应将靶向功能分子连接于该递药系统表面；

制得的级联脑部靶向药物递送系统通过第一级靶向功能分子特异性识别血脑屏障，通过第二级靶向功能分子特异性识别脑部病变部位而达到精确靶向的目的，并将成像分子或药物精确递送至脑部病变部位，达到良好的成像和治疗效果。

进一步本发明的级联脑部靶向药物递送系统可用于制备治疗脑部疾病如脑肿瘤神经系统疾病的药物，或用于制备诊断脑部疾病如脑肿瘤神经系统疾病的制剂。

本发明进行了TGN和AS1411双修饰纳米粒药物递送系统对脑胶质瘤的治疗实验，结果显示，DTX和DTX-NP均未能显著提高荷瘤鼠的中位生存期，DTX在剂量为10mg/kg给药4次的情况下方能提高荷瘤鼠的中位生存期，而5mg/kg(累积给药剂量为20mg/kg)时相对生理盐水并未表现出显著性差异；在累积给药剂量为18mg/kg，剂量较低，因此并未表现出治疗效果；而AsNP和TNP能够有效提高荷瘤鼠的中位生存期，表明经修饰后一定程度上提高了纳米粒的靶向性；双修饰的AsTNP则显著提高了荷瘤鼠的中位生存期，相比生理盐水提高了88％，相比单修饰纳米粒组亦提高了28％；结果表明，双修饰的纳米粒能够有效的靶向至脑肿瘤部位，将有限的药物更多的递送至肿瘤并发挥其抗肿瘤效果。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的级联脑部靶向药物递送系统及用途进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1为本发明中纳米粒透射电镜图，其中，标尺为200nm。

图2显示了本发明中TGN和AS1411双修饰纳米粒对不同细胞的靶向性。

图3显示了本发明中TGN和AS1411双修饰纳米粒对脑胶质瘤的靶向性。

图4显示了本发明中TGN和AS1411双修饰纳米粒对脑胶质瘤的治疗效果。

具体实施方式

实施例1、构建TGN和AS1411双修饰纳米粒药物递送系统

纳米粒采用单次乳化法制备。28mg的聚乙二醇-聚己内酯(MPEG-PCL)，1mg的羧基修饰的PEG-PCL和1mg的马来酰亚胺修饰的PEG-PCL用1mL二氯甲烷溶解后加入到5mL 0.6％的胆酸钠溶液中；之后冰水浴5s/5s脉冲超声15次，功率为200W；旋转蒸发除去二氯甲烷后浓缩至合适浓度即得未修饰纳米粒(NP)；纳米粒表面的羧基采用EDC和NHS在MES缓冲液中活化半小时后采用Hitrap脱盐柱将外水相置换为pH 7.4的PBS，之后加入10 OD的AS1411避光搅拌4小时；之后再加入25μg的TGN避光充氮气反应6小时；之后过Sepharose CL-4B柱除去未结合的AS1411和TGN即可得到双修饰的纳米粒(AsTNP)。

所得纳米粒粒径为170.6nm，zeta电位为-8.79mV，透射电镜结果如图1所示。

实施例2、TGN和AS1411双修饰纳米粒药物递送系统对不同细胞的靶向性

将C6细胞和bEnd.3细胞(正常大鼠脑毛细血管内皮细胞株)以2×10⁴细胞每孔的浓度接种至24孔板中；24小时后细胞用HBSS孵育5分钟，之后每个孔分别加入1mL含100μg/mL香豆素-6的NP、AS1411单修饰NP(AsNP)、AS1411和TGN双修饰NP(AsTNP)或TGN单修饰(TNP)；1小时后细胞用冰冷PBS冲洗4次，之后直接用荧光显微镜观察或将其消化下来用流式细胞仪检测。

如图2所示，在bEnd.3细胞中，TGN可显著提高纳米粒的摄取，而AS1411单修饰的AsNP相比NP摄取并未有明显升高；与此相反，在C6细胞中，AS1411修饰的AsNP以及AsTNP相较NP摄取均有显著升高，TGN单修饰的TNP并无升高。

上述结果表明，TGN能够识别内皮细胞并促进细胞对纳米粒的摄取，而AS1411能够识别肿瘤细胞，二者联合能够提高两种细胞对纳米粒的摄取。

实施例3、TGN和AS1411双修饰纳米粒药物递送系统对脑胶质瘤的靶向性

构建荷原位C6脑胶质瘤的小鼠模型。接种8天后，分别给予载荧光探针DiR的NP、AsNP、AsTNP和TNP，于一定时间点观察动物的荧光分布，并于24h取出大脑观察脑部的离体荧光分布。

如图3所示，未修饰的纳米粒在脑部分布很少，而AS1411单修饰的AsNP也只有少量进入脑部，且离体图片显示出主要分布于脑肿瘤部位；而修饰TGN后脑部分布大为增加，在各个时间点脑部荧光的分度均强于NP和AsNP；但是，离体脑部荧光分布显示，TGN单修饰的TNP在脑部呈现弥散性分布，并无明确的选择性，而AS1411和TGN双修饰的AsTNP则在脑肿瘤部位有很强分布，且明显强于脑部其他部位。

上述结果进一步证实TGN能够携带纳米粒透过血脑屏障而进入脑部，AS1411则可携带纳米粒靶向至脑肿瘤。

实施例4、TGN和AS1411双修饰纳米粒药物递送系统对脑胶质瘤的治疗效果

构建荷原位C6脑胶质瘤小鼠。接种肿瘤第8天，将小鼠随机分为6组：生理盐水组，DTX组、NP组、AsNP组、AsTNP组以及TNP组，给药剂量为6mg/kg(以DTX计)，三天给药一次，给药三次，观察荷瘤鼠的生存情况，并采用SPSS10.0进行分析，结果如图5和表1所示。

结果显示，DTX和DTX-NP均未能显著提高荷瘤鼠的中位生存期，虽然之前的研究证实DTX能够有效抑制C6细胞的生长，然而本发明人之前的研究发现DTX在剂量为10mg/kg给药4次的情况下方能提高荷瘤鼠的中位生存期，而5mg/kg(累积给药剂量为20mg/kg)时相对生理盐水并未表现出显著性差异。在本发明中累积给药剂量为18mg/kg，剂量较低，因此并未表现出治疗效果；而AsNP和TNP能够有效提高荷瘤鼠的中位生存期，表明经修饰后一定程度上提高了纳米粒的靶向性；双修饰的AsTNP则显著提高了荷瘤鼠的中位生存期，相比生理盐水提高了88％，相比单修饰纳米粒组亦提高了28％；结果表明，双修饰的纳米粒能够有效的靶向至脑肿瘤部位，将有限的药物更多的递送至肿瘤并发挥其抗肿瘤效果。

表1、荷脑胶质瘤小鼠经不同制剂治疗后的中位生存期

^ap＜0.05 vs saline，^bp＜0.05 vs DTX，^cp＜0.05 vs NP，^dp＜0.05 vs AsNP，^ep＜0.05 vs TNP。

Claims (3)

1.一种级联脑部靶向药物递送系统，其特征在于，由第一级脑靶向功能分子、第二级疾病靶向功能分子和载体系统构成；所述的第一级脑靶向功能分子为TGN；所述的第二级疾病靶向功能分子为AS1411；所述的载体系统为纳米粒。

2.权利要求1的级联脑部靶向药物递送系统的制备方法，其特征在于，所述的靶向功能分子先与载体材料连接后再制备药物递送系统；或，在制备药物递送系统后通过一定的反应将靶向功能分子连接于该递药系统表面，制得级联脑部靶向药物递送系统。

3.权利要求1的级联脑部靶向药物递送系统在制备治疗脑胶质瘤制剂中的用途。

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