CN111228514B - 脑靶向纳米制剂及左旋多巴和姜黄素在制备治疗帕金森病的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了脑靶向纳米制剂及左旋多巴和姜黄素在制备治疗帕金森病的药物中的应用。该脑靶向纳米制剂，是由脑靶向纳米载体和所述脑靶向纳米载体所装载的药物组成；所述脑靶向纳米载体由外壳和所述外壳包覆的内核组成，所述外壳为修饰有生物分子的脂质双分子层，所述生物分子为细胞穿透肽和乳铁蛋白；所述内核为介孔二氧化硅纳米粒。该脑靶向纳米制剂可实现左旋多巴和姜黄素共递送透过血脑屏障，可将左旋多巴及姜黄素富集于脑部，避免左旋多巴与外周组织的接触，防止左旋多巴于外周组织的降解，从而减少左旋多巴的毒副作用，降低药物的全身毒性，提高左旋多巴的生物利用效率，更有效地发挥左旋多巴治疗帕金森疾病的作用。

Description

脑靶向纳米制剂及左旋多巴和姜黄素在制备治疗帕金森病的 药物中的应用
本申请是申请号为201810348534.1、申请日为2018年04月18日、发明创造名称为“实现左旋多巴与姜黄素联合给药治疗帕金森病的脑靶向纳米制剂及其所用载体”的分案申请。
技术领域
本发明涉及纳米药物领域中实现左旋多巴与姜黄素联合给药治疗帕金森病的脑靶向纳米制剂及左旋多巴和姜黄素在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
背景技术
帕金森病是一种多发于中老年人的神经退行性疾病。据统计，在全球65岁以上的老人中，约有2-3％的老年人患有帕金森病。帕金森病临床特征多表现为静止性震颤、运动迟缓、肌肉僵直、姿势步态异常等。而其病理特征主要表现为中脑黑质多巴胺能神经元变性缺失以及残存神经元内路易小体的出现(Poewe W,Seppi K,Tanner C M,et al.Parkinsondisease[J].Nature Reviews Disease Primers,2017,3:17013)。目前，帕金森的发病机制尚未明了，但其可能与遗传因素、环境因素、年龄等多方面因素相关。
左旋多巴是目前治疗帕金森病疗效最佳的药物，被誉为治疗帕金森的“金标准”。左旋多巴可在大脑及外周组织中经多巴脱羧酶脱羧而转变成多巴胺。其作为多巴胺的前体药物，可以补充缺失的内源性多巴胺，明显改善帕金森症状(Olanow C W,Obeso J A,Stocchi F.Drug insight:Continuous dopaminergic stimulation in the treatmentof Parkinson's disease.[J].Nat Clin Pract Neurol,2006,2(7):382-392)。但是，长期服用左旋多巴的副作用也十分严重。首先，左旋多巴性状不稳定，在外周易发生脱羧、氧化等降解反应，生物利用率较低，仅有1％的左旋多巴可以进入中枢神经系统。其在外周的降解产物多巴胺等易造成恶心、呕吐、心律失常等机体副反应。另外，长期服用左旋多巴还易导致运动并发症，包括“开关现象”及不自主异动等。目前，研究者认为，服用左旋多巴这种有别于正常生理状态对多巴胺受体的波动性刺激是导致帕金森病运动并发症的重要原因(Jankovic J.Levodopa strengths and weakness[J].Neurology,2002,58(4Suppl 1):S19；Nyholm D.Pharmacokinetic optimisation in the treatment of Parkinson'sdisease-An update[J].Clinical Pharmacokinetics,1996,30(6):463)。与脱羧酶抑制剂联用对左旋多巴的上述副作用改善效果有限；且目前已有研究及应用的许多左旋多巴制剂均未能缓解帕金森病运动障碍，减缓或停止疾病进展。
另外，左旋多巴虽能够有效改善帕金森病的临床症状，但并不能阻断其致病突变，可谓“治标不治本”。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是如何提高脑组织和/或脑微血管内皮细胞对水溶性药物(如左旋多巴)的摄取量，以提高水溶性药物在脑组织中的生物利用率；同时降低水溶性药物(如左旋多巴)在外周的浓度，以改善其在外周降解所导致的严重机体不良反应。
为了解决以上技术问题，本发明提供了脑靶向纳米载体。
本发明所提供的脑靶向纳米载体，是脑靶向脂质-介孔二氧化硅纳米复合给药系统，简称为CPPs-Lf-Protocells，由外壳和所述外壳包覆的内核组成，所述外壳为修饰有生物分子的脂质双分子层，所述生物分子为细胞穿透肽和乳铁蛋白；所述内核为介孔二氧化硅纳米粒(MSNs)。
上述脑靶向纳米载体中，所述脂质双分子层可只修饰有上述生物分子，不进行其它任何修饰。
上述脑靶向纳米载体中，细胞穿透肽(cell penetrating peptides，CPPs)是一类能够通过多种细胞膜进入细胞的短肽(一般少于35个氨基酸残基)。表1列举了一些比较有代表性的CPPs。
表1具代表性的CPP
Figure BDA0002399593350000021
上述脑靶向纳米载体中，所述细胞穿透肽可为Tat，所述Tat是氨基酸序列为SEQID No.1的多肽。
上述脑靶向纳米载体中，所述乳铁蛋白可为哺乳动物的乳铁蛋白，如人乳铁蛋白。
上述脑靶向纳米载体中，所述修饰有生物分子的脂质双分子层中，所述细胞穿透肽和乳铁蛋白的配比本领域技术人员可根据脑微血管内皮细胞对所述脑靶向纳米载体装载的水溶性药物的摄取量确定，如所述细胞穿透肽和乳铁蛋白的摩尔比可为4:1。
上述脑靶向纳米载体中，CPPs-Lf-Protocells与Protocells(未修饰细胞穿透肽和乳铁蛋白的纳米载体)、CPPs-Protocells(只修饰有细胞穿透肽的纳米载体)和Lf-Protocells(只修饰有乳铁蛋白的纳米载体)这三种纳米载体相比，显著提高了脑微血管内皮细胞对其装载的水溶性药物摄取量，证明细胞穿透肽和乳铁蛋白在提高脑微血管内皮细胞对其装载的水溶性药物的摄取量方面产生了协同作用。Protocells、CPPs-Protocells、Lf-Protocells和CPPs-Lf-Protocells均是由外壳和所述外壳包覆的内核组成的纳米载体，所述内核均为介孔二氧化硅纳米粒，只是外壳有区别，Protocells与CPPs-Lf-Protocells的区别仅在于Protocells的外壳是没有进行生物分子修饰的脂质双分子层，CPPs-Protocells与CPPs-Lf-Protocells的区别仅在于CPPs-Protocells的外壳是只修饰有细胞穿透肽的脂质双分子层(未进行乳铁蛋白修饰)，Lf-Protocells与CPPs-Lf-Protocells的区别仅在于Lf-Protocells的外壳是只修饰有乳铁蛋白的脂质双分子层(未进行细胞穿透肽修饰)。
上述脑靶向纳米载体中，所述介孔二氧化硅纳米粒的粒径(直径)可为80-100nm；所述介孔二氧化硅纳米粒的粒径分布PDI可≤0.3(如≤0.2或≤0.15)；所述介孔二氧化硅纳米粒的Zeta电位可为-5至-25mV，如-8至-24mV。
上述脑靶向纳米载体中，所述介孔二氧化硅纳米粒可为大孔介孔二氧化硅纳米粒(简称LP-MSNs)或普通孔径介孔二氧化硅纳米粒(简称OP-MSNs)。所述大孔介孔二氧化硅纳米粒为孔径(直径)大于等于6nm的介孔二氧化硅纳米粒，所述普通孔径介孔二氧化硅纳米粒为孔径(直径)小于6nm的介孔二氧化硅纳米粒。
所述大孔介孔二氧化硅纳米粒可具有下述1)至3)三种结构参数：
1)粒径为80-100nm；
2)孔直径可为6-10nm(如6-8nm)；
3)BET比表面积可为500-600m2/g(如573m2/g)。
将具有上述1)至3)三种结构参数的介孔二氧化硅纳米粒命名为大孔介孔二氧化硅纳米粒(简称LP-MSNs)。试验证明，采用上述大孔介孔二氧化硅纳米粒作为内核的上述脑靶向纳米载体对水溶性药物的载药量显著大于采用普通孔径介孔二氧化硅纳米粒作为内核的上述脑靶向纳米载体对所述水溶性药物的载药量。所述普通孔径介孔二氧化硅纳米粒可为具有如下结构参数的介孔二氧化硅纳米粒：粒径可为大于等于80nm至小于100nm，孔直径可为大于等于2nm至小于6nm，BET比表面积可为700-800m2/g。
上述脑靶向纳米载体中，所述脑靶向纳米载体的直径可为120-180nm(如130-140nm、134-138nm)。
上述脑靶向纳米载体中，所述脑靶向纳米载体的粒径分布多分散系数(PDI)可≤0.3(如≤0.2或≤0.15)。
上述脑靶向纳米载体中，所述脑靶向纳米载体的Zeta电位可为-20至-50mV(如-22至-42mV或-32至-34mV)。
为了解决以上技术问题，本发明还提供了脑靶向纳米制剂。
本发明所提供的脑靶向纳米制剂，是由所述脑靶向纳米载体和所述脑靶向纳米载体所装载的药物组成。
上述脑靶向纳米制剂中，所述药物由脂溶性药物和水溶性药物组成；所述脂溶性药物由所述外壳装载，所述水溶性药物由所述内核装载。
本发明所要解决的另一个技术问题是如何提高帕金森病细胞的存活率。
为了解决该技术问题，本发明提供了治疗帕金森病的脑靶向纳米制剂。
本发明所提供的治疗帕金森病的脑靶向纳米制剂，是由所述脑靶向纳米载体和所述脑靶向纳米载体所装载的药物组成；所述药物由脂溶性药物和水溶性药物组成；所述脂溶性药物由所述外壳装载，所述水溶性药物由所述内核装载；所述脂溶性药物的活性成分可为姜黄素，所述水溶性药物的活性成分可为左旋多巴。
上述治疗帕金森病的脑靶向纳米制剂中，所述左旋多巴和姜黄素的配比本领域技术人员可根据治疗帕金森病的效果确定。所述水溶性药物中的所述左旋多巴和所述脂溶性药物中的姜黄素的配比可为20:1(摩尔比)，质量比为10:1。
上述脑靶向纳米制剂中，所述治疗帕金森病的脑靶向纳米制剂为能提高帕金森病细胞存活率的脑靶向纳米制剂。
本发明将水溶性药物(如左旋多巴)和脂溶性药物(如神经保护剂姜黄素)共载于同一种给药系统中，实现两种药物的联合用药和同步递送，不但能够治疗帕金森病的相关症状，所包载的神经保护剂(如姜黄素)还可发挥神经保护作用，提高帕金森病细胞的存活率，从而发挥左旋多巴“治标”和神经保护剂“治本”的结合优势。
为了解决提高帕金森病细胞的存活率这一技术问题，本发明还提供了治疗帕金森病的药物，以及左旋多巴和姜黄素在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
本发明所提供的治疗帕金森病的药物，其活性成分为左旋多巴和姜黄素。
上述左旋多巴和姜黄素在制备治疗帕金森病的药物中的应用中，所述治疗帕金森病的药物的活性成分为所述左旋多巴和姜黄素。
试验证明，左旋多巴和姜黄素联用在提高帕金森病细胞的存活率方面产生了协同作用。
上文中，所述治疗帕金森病的药物为能提高帕金森病模型细胞存活率的药物。
上述脑靶向纳米载体在制备治疗脑部疾病药物中的应用也属于本发明的保护范围。
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种治疗帕金森病的药物。
本发明所提供的治疗帕金森病的药物，其活性成分由左旋多巴和姜黄素组成。
上述脑靶向纳米制剂中所述细胞穿透肽和所述乳铁蛋白在制备增强脑组织和/或脑微血管内皮细胞对水溶性药物(如左旋多巴)的摄取量的脑靶向纳米载体或脑靶向纳米制剂中的应用也属于本发明的保护范围。
下述增强脑组织和/或脑微血管内皮细胞对水溶性药物(如左旋多巴)的摄取量的组合物也属于本发明的保护范围：增强脑组织和/或脑微血管内皮细胞对水溶性药物(如左旋多巴)的摄取量的组合物，所述组合物的活性成分为所述脑靶向药物纳米制剂中所述细胞穿透肽和所述乳铁蛋白。
上文中，所述细胞穿透肽和所述乳铁蛋白的配比本领域技术人员可根据脑组织和/或脑微血管内皮细胞对所述脑靶向纳米载体装载的水溶性物质的摄取量确定，如所述细胞穿透肽和乳铁蛋白的摩尔比可为4:1。
本发明以介孔二氧化硅纳米粒为内核，以修饰有细胞穿透肽和乳铁蛋白的脂质双分子层为外壳得到了名称为CPPs-Lf-Protocells的脑靶向纳米载体(即脑靶向脂质-介孔二氧化硅纳米复合给药系统)。试验证明，CPPs-Lf-Protocells提高了脑组织和/或脑微血管内皮细胞对水溶性药物的摄取量，细胞穿透肽和乳铁蛋白在提高脑组织和/或脑微血管内皮细胞对纳米载体装载的水溶性药物的摄取量方面产生了协同作用。
本发明在CPPs-Lf-Protocells的外壳中装载脂溶性药物姜黄素，在CPPs-Lf-Protocells的内核中装载水溶性药物左旋多巴，实现左旋多巴与姜黄素共载药治疗帕金森病。试验证明，左旋多巴与姜黄素联用治疗帕金森病方面产生了协同作用。
本发明的名称为CPPs-Lf-Protocells的脑靶向纳米载体，理化性质优良，血液相容性良好，细胞毒性低，是一种生物安全性良好的靶向药物纳米递送系统，可实现左旋多巴和姜黄素共递送透过血脑屏障，可将左旋多巴及姜黄素富集于脑部，避免左旋多巴与外周组织的接触，防止左旋多巴于外周组织的降解，从而减少左旋多巴的毒副作用，降低药物的全身毒性，提高左旋多巴的生物利用效率，同时实现左旋多巴缓解帕金森病症状和姜黄素神经修复的作用结合，更有效地发挥治疗帕金森疾病的作用。
附图说明
图1为Tat和DSPE-PEG2000-NHS反应0小时的RP-HPLC色谱图。
图2为Tat和DSPE-PEG2000-NHS反应3小时的RP-HPLC色谱图。
图3为DSPE-PEG2000-NHS的核磁共振氢谱图。
图4为DSPE-PEG2000-Tat的核磁共振氢谱图。
图5为DSPE-PEG2000-MAL的核磁共振氢谱图。
图6为DSPE-PEG2000-Lf的核磁共振氢谱图。
图7为OP-MSNs(A)和LP-MSNs(B)的透射电镜(TEM)形貌表征照片。
图8为Tat-Lf-OP-Protocells(A)和Tat-Lf-LP-Protocells(B)的TEM形貌表征照片。
图9为红细胞分别和各浓度的LP-MSNs、Tat-Lf-LP-Protocells、Tat-LP-Protocells、Lf-LP-Protocells和LP-Protocells孵育后的溶血试验结果照片。
图10为LP-MSNs、Tat-Lf-LP-Protocells、Tat-LP-Protocells、Lf-LP-Protocells和LP-Protocells的溶血百分率。图中，每个浓度的5个柱状图从左至右依次为LP-Protocells、Tat-LP-Protocells、Lf-LP-Protocells、Tat-Lf-LP-Protocells和LP-MSNs。
图11为LP-MSNs和Tat-Lf-LP-Protocells对bEnd.3细胞和SH-SY5Y细胞的毒性(细胞存活率)。图中，LP-MSN-bEnd.3为LP-MSNs对bEnd.3的细胞毒性，Tat-Lf-LP-Protocells-bEnd.3为Tat-Lf-LP-Protocells对bEnd.3的细胞毒性，LP-MSN-SH-SY5Y为LP-MSNs对SH-SY5Y的细胞毒性，Tat-Lf-LP-Protocells-SH-SY5Y为Tat-Lf-LP-Protocells对SH-SY5Y的细胞毒性，control为阳性对照组。
图12为纳米载体RBITC-LP-MSNs(图中以“MSNs”表示)和纳米制剂RBITC–Protocells(图中以“Protocells”表示)、RBITC–Tat-Protocells(图中以“Tat-Protocells”表示)、RBITC-Lf-Protocells(图中以“Lf-Protocells”表示)、RBITC-Tat-Lf-Protocells(图中以“T&L-Protocells”表示)的脑微血管内皮细胞摄取试验结果图。图中，DAPI表示细胞核DAPI荧光定位图，RBITC表示纳米载体RBITC荧光定位图，Overlay表示细胞核与纳米载体荧光共定位图。
图13为外壳载香豆素6的纳米制剂Coumarin 6–Protocells(图中以“Protocells”表示)、Coumarin 6–Tat-Protocells(图中以“Tat-Protocells”表示)、Coumarin 6-Lf-Protocells(图中以“Lf-Protocells”表示)、Coumarin 6-Tat-Lf-Protocells(图中以“T&L-Protocells”表示)的脑微血管内皮细胞摄取试验结果图。图中，DAPI表示细胞核DAPI荧光定位图，Coumarin 6表示Coumarin 6染料荧光定位图，Overlay表示细胞核与Coumarin 6荧光共定位图。
图14为内核载钙黄绿素的纳米制剂Calcein-Protocells(图中以“Protocells”表示)、Calcein-Tat-Protocells(图中以“Tat-Protocells”表示)、Calcein-Lf-Protocells(图中以“Lf-Protocells”表示)、Calcein-Tat-Lf-Protocells(图中以“T&L-Protocells”表示)的脑微血管内皮细胞摄取试验结果图。图中，DAPI表示细胞核DAPI荧光定位图，Calcein表示Calcein染料荧光定位图，Overlay表示细胞核与Calcein荧光共定位图。
图15为活体成像结果。图中，MSNs表示Cy5-LP-MSNs，Peg-Protocells表示Cy5-LP-MSNs-Protocells，Tat-Protocells表示Tat-Cy5-LP-MSNs-Protocells，Lf-Protocells表示Lf-Cy5-LP-MSNs-Protocells，T&L Protocells表示Tat-Lf-Cy5-LP-MSNs-Protocells。
图16为不同浓度鱼藤酮溶液诱导的SH-SY5Y细胞形态。图中，A为浓度为0μmol/L鱼藤酮溶液的处理(阴性对照组)；B为浓度为0.5μmol/L鱼藤酮溶液的处理；C为浓度为1.0μmol/L鱼藤酮溶液的处理；D为浓度为2.0μmol/L鱼藤酮溶液的处理；E为浓度为4.0μmol/L鱼藤酮溶液的处理；F为浓度为10.0μmol/L鱼藤酮溶液的处理；G为浓度为20.0μmol/L鱼藤酮溶液的处理。
图17为不同浓度鱼藤酮溶液诱导的SH-SY5Y细胞的存活率。图中，A-G的含义同图16。“***”表示与阴性对照组相比具有极显著差异(p＜0.001)。
图18为不同浓度姜黄素和鱼藤酮处理的SH-SY5Y细胞的存活率。“***”表示与阴性对照组相比具有极显著差异(p＜0.001)。
图19为处理的SH-SY5Y细胞的存活率。“***”表示与阴性对照组相比具有极显著差异(p＜0.001)。
图20为各组小鼠自主活动行为学检测及统计所得5天内移动格子数。图中，DAY1、DAY2、DAY3、DAY4和DAY5分别为每只小鼠第1天、第2天、第3天、第4天和第5天天移动的格子数。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，DSPE-PEG2000-NHS和DSPE-PEG2000-MAL为艾伟拓(上海)医药科技有限公司产品；Tat(氨基酸序列是YGRKKRRQRRR(即SEQ ID No.1)的多肽)和人乳铁蛋白(lactoferrin，Lf)为上海强耀生物科技有限公司产品；透析袋(截留分子量MW为1000Da)和透析袋(截留分子量MW为3500Da)为北京索莱宝科技有限公司产品；Traunt’s试剂、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、正硅酸四乙酯(TEOS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、Brij58、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、异硫氰酸罗丹明B(RBITC)为上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品；L-半胱氨酸(Cys)、钙黄绿素为大连美仑生物技术有限公司产品；胆固醇(Chol)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和DSPE-PEG2000为艾伟拓(上海)医药科技有限公司产品；均三甲苯为Alfa Aesar产品；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)和胰酶TRYPSIN 0.25％EDTA为Gibco公司产品；MEM/F12培养基、bEnd.3细胞(小鼠微脑血管内皮细胞)和SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞)为上海柯雷生物科技有限公司产品；姜黄素为Alfa Aesar公司产品；左旋多巴为北京伊诺凯科技有限公司产品；香豆素6(Coumarin 6)为Sigma公司产品；抗荧光衰减封片剂(含DAPI)为北京索莱宝科技有限公司产品；鱼藤酮为大连美仑生物技术有限公司产品；MTT试剂为Sigma公司产品；Cy5-SE为美国MedChemExpress公司产品；MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)为大连美仑生物技术有限公司产品；比格犬为北京大学医学部试验动物中心产品；BALB/c-nu/nu小鼠为斯贝福(北京)生物技术有限公司产品；C57BL/6小鼠为斯贝福(北京)生物技术有限公司产品。
磷酸盐缓冲液的配制步骤：
母液A(0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液)配制：称取NaH2PO4·H2O 27.6g溶于1000ml蒸馏水中，配制得0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液。
母液B(0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液)配制：称取Na2HPO4·7H2O 53.6g溶于1000ml蒸馏水中，配制得0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液。
pH为7.0的PBS溶液的配制：取39.0ml母液A及61.0ml母液B，混合配制得pH＝7.0PBS溶液。
pH为8.0的PBS溶液的配制：取5.3ml母液A及94.7ml母液B，混合配制得pH＝8.0PBS溶液。
下述实施例中所用的仪器如下：冷冻干燥机EPSILON1-4型(Christ公司，德国)；高速离心机D3024R型(赛洛捷克公司，美国)；激光粒度及Zeta电位分析仪Nano-ZS 90型(马尔文公司，英国)；集热式恒温磁力搅拌浴HWCL-3型(郑州长城科工贸有限公司)；超声波清洗器2101TH型(上海安谱科学仪器有限公司)；透射电子显微镜JEM-100CX II型(日本电子株式会社)；比表面和孔径分布测定仪ASAP 2460型(Micromeritics公司，美国)；旋转蒸发仪RV10digital型(IKA公司，德国)；超声波细胞粉碎机scientz-950E型(宁波新芝生物科技股份有限公司)；酶标仪DNM-9206G型(北京普朗新技术有限公司)；高效液相色谱仪e2695型(Waters公司，美国)；色谱柱Eclipse XDB-C18 5μm,250*4.6mm(Agilent公司，美国)；二氧化碳培养箱WCI-180型(WIGGENS公司，德国)；激光共聚焦显微镜(徕卡公司，德国)；倒置显微镜DSZ2000X型(重庆澳浦光电技术有限公司)。
实施例1、脑靶向纳米载体CPPs-Lf-Protocells的制备与评价
本实施例以Tat作为细胞穿透肽为例，制备了名称为Tat-Lf-Protocells的一种脑靶向纳米载体CPPs-Lf-Protocells。
本实施例所提供的脑靶向纳米载体Tat-Lf-Protocells，由外壳和所述外壳包覆的内核组成，所述外壳为修饰有生物分子的脂质双分子层，所述生物分子为Tat(氨基酸序列为SEQ ID No.1的多肽)和乳铁蛋白；所述内核为介孔二氧化硅纳米粒(MSNs)。脑靶向纳米载体Tat-Lf-Protocells的所述脂质双分子层只修饰有上述生物分子，不进行其它任何修饰。
将DPPC、Chol及不同功能脂材混合，通过旋转蒸发法制备不同组成的脂质双分子层。将脂质双分子层与不同孔径的MSNs(OP-MSNs和LP-MSNs)混合，通过探头超声法制备不同配体修饰的纳米载体，包括:Tat-Lf-LP-Protocells、Tat-LP-Protocells、Lf-LP-Protocells、LP-Protocells、Tat-Lf-OP-Protocells、Tat-OP-Protocells、Lf-OP-Protocells和OP-Protocells。具体方法如下：
一、脂质双分子层的制备
(一)两种功能脂材DSPE-PEG2000-Tat和DSPE-PEG2000-Lf的合成
本步骤通过Tat分子中的伯氨基(-NH2)与DSPE-PEG2000-NHS活化的-NHS基团发生亲核取代反应合成DSPE-PEG2000-Tat。通过高效液相色谱(HPLC)监测其反应进程，证明该反应3h可反应完全。通过核磁共振氢谱分析证明DSPE-PEG2000-NHS与Tat成功连接，得到合成产物DSPE-PEG2000-Tat。
通过Traunt’s试剂将Lf巯基化，并通过Ellman法对反应产物Lf-SH进行巯基含量测定，确定Lf与Traunt’s试剂反应的最佳反应摩尔比为1:60。通过Lf-SH分子中的巯基(-SH)与DSPE-PEG2000-MAL上的-MAL基团发生Michael加成反应合成DSPE-PEG2000-Lf，核磁共振氢谱分析证明DSPE-PEG2000-MAL与Lf成功连接，得到合成产物DSPE-PEG2000-Lf。
1.DSPE-PEG2000-Tat的合成
通过DSPE-PEG-NHS与Tat分子中的伯氨基(-NH2)发生亲核取代反应将DSPE-PEG-NHS中的NHS基团取代为Tat制备DSPE-PEG-Tat。具体方法如下：
DSPE-PEG2000-NHS与Tat(氨基酸序列为SEQ ID No.1的多肽)按照摩尔比为1.2:1的比例，分别精密称取二者适量，置西林瓶中，并向其中加入适量的pH 8.0PBS溶液，充分振摇使溶解，室温(20℃)下磁力搅拌反应。以HPLC法监测反应进程，当反应物Tat的色谱峰消失或不再减小时，即认为反应完全。其中，HPLC法采用高效液相色谱仪e2695型(Waters公司，美国)在如下色谱条件下进行：色谱柱：Platisil ODS C18色谱柱(250×4.6mm,5μm)(Dikma公司)；流动相A：0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液；流动相B：0.1％TFA乙腈溶液；检测波长：220nm；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；进样体积：20μl；梯度洗脱方案：流动相由流动相A和流动相B组成，0到11分钟流动相B由8％匀速增至22％。
试验结果表明，在上述色谱条件下，Tat与DSPE-PEG2000-NHS反应后，随反应时间增加，Tat的色谱峰保留时间tR值(约为7.8min)基本不变，而色谱峰面积逐渐减小，反应3h后峰面积基本不再变化，说明3h时反应结束(图1和图2)。
DSPE-PEG2000-NHS与Tat按照摩尔比为1.2:1的比例，分别精密称取二者适量，置西林瓶中，并向其中加入适量pH 8.0PBS溶液，充分振摇使溶解，室温(20℃)下磁力搅拌反应3小时结束反应，将反应后溶液置透析袋(截留分子量MW为1000Da)中，于去离子水中透析24h除盐。透析结束后，将透析袋内液体进行冷冻干燥处理，所得产物即为DSPE-PEG2000-Tat，置于-20℃冰箱中储存备用。
将DSPE-PEG2000-NHS和DSPE-PEG2000-Tat分别溶于D2O，进行核磁共振氢谱分析(1H-NMR)，DSPE-PEG2000-NHS及DSPE-PEG2000-Tat核磁共振氢谱图如图3和图4所示，DSPE-PEG2000-NHS核磁共振氢谱图中，δ2.80ppm处峰归属于NHS，而DSPE-PEG2000-Tat核磁共振氢谱图中该峰消失，证明DSPE-PEG2000-NHS与Tat成功连接，得到DSPE-PEG2000-Tat。
2.DSPE-PEG2000-Lf的合成
通过DSPE-PEG-MAL与巯基化Lf分子中的巯基发生Michael加成反应制备DSPE-PEG-Lf。具体方法如下：
2.1Lf的巯基化方法
采用Traunt’s试剂将Lf巯基化。精密称取适量Lf与Traunt’s试剂，溶解于pH 8.0硼酸钠缓冲溶液中，4℃反应2h。反应结束后，将反应后溶液置透析袋(截留分子量MW为3500Da)中，于去离子水中透析24h除盐。透析结束后，将透析袋内液体进行冷冻干燥处理，所得产物即为巯基化Lf(Lf-SH)。
2.2Ellman法巯基含量测定方法
2.2.1Ellman试剂配制
精密称取DTNB 39.6mg，置10ml量瓶中，加入pH 7.0Na2HPO4溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置100ml量瓶中，加入pH 8.0PBS溶液稀释至刻度，摇匀，即得Ellman工作液(0.1mmol/L)。
2.2.2Cys标准曲线绘制
精密称取Cys 12.12mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，得1mmol/L贮备液。分别量取该贮备液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00ml，置10ml量瓶中，分别加pH8.0PBS溶液稀释至刻度，制得浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.3mmol/L的标准溶液。
取上述各标准溶液1ml，分别加入5ml Ellman工作液，室温避光反应2h。反应结束后，于412nm处测定吸光度，绘制Cys浓度-吸光度标准曲线，得标准曲线方程为A＝2.066C-0.0009,R2＝0.9999，其中，C为Cys浓度，单位是mmol/L。Cys在0.025-0.3mmol/L浓度范围内，吸光度值与浓度之间呈良好的线性关系。
2.3Lf巯基化反应条件的筛选
Lf与Traunt’s试剂反应比例可控制Lf巯基化程度。设定Lf与Traunt’s试剂反应摩尔比分别为1:20、1:40、1:60、1:80进行反应，采用Ellman法对反应产物Lf-SH进行巯基含量测定。当Lf浓度与所测得巯基浓度之比在1:1-1.5之间时，视该Lf与Traunt’s试剂反应比为最佳。
不同比例Lf与Traunt’s试剂反应后，巯基与Lf摩尔比测定结果如表2所示。
表2.不同比例Lf与Traunt’s试剂反应得到的Lf-SH中巯基与Lf摩尔比
Lf与Traunt’s试剂反应摩尔比 Lf-SH中巯基(-SH)与Lf摩尔比
1:20 0.404
1:40 0.524
1:60 1.132
1:80 1.452
由上述结果可知，当Lf与Traunt’s试剂反应的摩尔比为1:60时，反应产物中Lf与巯基的摩尔比接近1:1，故确定最佳反应摩尔比为1:60。
2.4DSPE-PEG2000-Lf的制备
DSPE-PEG2000-MAL与Lf-SH按照摩尔比为1:1的比例，分别精密称取二者适量，置西林瓶中，向其中加入适量pH 7.0PBS溶液，充分振摇使溶解，4℃避光磁力搅拌反应24h。反应结束后，将反应后溶液置透析袋(截留分子量MW为3500Da)中，于去离子水中透析24h除盐。透析结束后，将透析袋内液体进行冷冻干燥处理，所得产物即为DSPE-PEG2000-Lf，置于-20℃冰箱中储存备用。
将DSPE-PEG2000-MAL和DSPE-PEG2000-Lf溶于D2O进行核磁共振氢谱分析，DSPE-PEG2000-MAL及DSPE-PEG2000-Lf核磁共振氢谱图如图5和图6所示，如DSPE-PEG2000-MAL核磁共振氢谱图所示，δ7.588ppm处峰归属于MAL基团，而DSPE-PEG2000-Lf核磁共振氢谱图中该峰消失，证明DSPE-PEG2000-MAL与Lf-SH成功连接，得到合成产物DSPE-PEG2000-Lf。
(二)脂质双分子层的制备
本步骤制备了四种脂质双分子层，分别是只修饰有Tat和乳铁蛋白的脂质双分子层(名称为Tat-Lf-BL)、只修饰有Tat的脂质双分子层(名称为Tat-BL)、只修饰有乳铁蛋白的脂质双分子层(名称为Lf-BL)和未进行修饰的脂质双分子层(名称为BL)。具体制备方法如下：
按表3所示摩尔比，分别称取DPPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Tat、DSPE-PEG2000-Lf，置100ml圆底烧瓶中，加入氯仿适量使溶解。通过旋转蒸发法除去氯仿，分别制得脂质双分子层BL、Tat-BL、Lf-BL和Tat-Lf-BL。
表3.制备各脂质双分子层的原料配比
Figure BDA0002399593350000091
Figure BDA0002399593350000101
二、介孔二氧化硅纳米粒的合成与表征
采用溶胶-凝胶相转变法制备了两种介孔二氧化硅纳米粒(MSNs)：大孔介孔二氧化硅纳米粒(简称LP-MSNs)和普通孔径介孔二氧化硅纳米粒(简称OP-MSNs)。氮气吸附脱附试验证明，在MSNs制备过程中加入扩孔剂均三甲苯，所制备的大孔介孔二氧化硅纳米粒可在粒径基本不变的同时增大孔径，更有利于药物的装载。
1.普通孔径介孔二氧化硅纳米粒(简称OP-MSNs)的制备
酸性乙醇溶液的配制：吸取2ml浓盐酸，加入150ml无水乙醇中，混匀即得。备用。
称取CTAB 0.40g，Brij58 0.50g，置于250ml圆底烧瓶中，向其中加入100ml pH＝7.0的PBS溶液，60℃水浴加热，磁力搅拌使溶解，20min后，缓慢加入TEOS 2.14ml，继续反应8h。
上述反应结束后，将反应液转移至离心管中，15000rpm离心10min，弃去上清液，所得沉淀以去离子水洗涤2次，再用无水乙醇洗涤2次。
将沉淀分散到60ml酸性乙醇溶液中，于78℃水浴加热回流8h后，将反应液转移到离心管中，15000rpm离心10min，弃去上清液，沉淀重新分散到60ml酸性乙醇溶液中，重复上述步骤加热回流3次，所得沉淀用无水乙醇洗涤3次，即得普通孔径介孔二氧化硅纳米粒(简称OP-MSNs)。
2.大孔介孔二氧化硅纳米粒(简称LP-MSNs)的制备
称取CTAB 0.40g，Brij58 0.50g，置于250ml圆底烧瓶中，向其中加入100ml pH＝7.0的PBS溶液，60℃水浴加热，磁力搅拌使溶解，20min后，缓慢加入均三甲苯4ml，60℃水浴继续加热60min后，缓慢加入TEOS 2.14ml，继续反应8h。
上述反应结束后，将反应液转移至离心管中，15000rpm离心10min，弃去上清液，所得沉淀以去离子水洗涤2次，再用无水乙醇洗涤2次。
将沉淀分散到60ml酸性乙醇溶液中，于78℃水浴加热回流8h后，将反应液转移到离心管中，15000rpm离心10min，弃去上清液，沉淀重新分散到60ml酸性乙醇溶液中，重复上述步骤加热回流3次，所得沉淀用无水乙醇洗涤3次，即得大孔介孔二氧化硅纳米粒(简称LP-MSNs)。
3.粒径及Zeta电位测定
将上述制备的OP-MSNs和LP-MSNs分散于水中，稀释成适宜浓度，采用Nano-ZS 90型激光粒度及Zeta电位分析仪测定两种纳米粒的粒径、粒径分布(以多分散系数PDI表示)及Zeta电位。样品粒径测定条件：激光波长设定为633nm，入射光与散射光夹角为90°，测定温度为25℃，每次测定20个循环，20次测定结果的平均值作为最后测定结果。
OP-MSNs和LP-MSNs的粒径、粒径分布及Zeta电位测定结果见表4。结果表明，OP-MSNs和LP-MSNs水化粒径均小于100nm，粒径分布均一性好，粒子表面呈电负性。
表4.OP-MSNs和LP-MSNs的理化特性
Figure BDA0002399593350000102
Figure BDA0002399593350000111
4.透射电子显微镜(TEM)形貌表征
采用透射电子显微镜(TEM)观察上述制备的OP-MSNs和LP-MSNs的表面结构特征。TEM检测用样品制备：将OP-MSNs和LP-MSNs分别均匀分散于去离子水中，调节至适当浓度，然后取微量样品点样于洁净的铜网上，并用滤纸吸干多余溶液，自然挥干后，置于样品室观察纳米粒的结构特征并拍照。
OP-MSNs和LP-MSNs的透射电镜(TEM)形貌表征结果见图7。结果表明，OP-MSNs和LP-MSNs均为球状纳米颗粒，粒径分布均一。LP-MSNs表面更为粗糙，其孔径大小明显大于OP-MSNs孔径。
5.氮气吸附脱附试验测定比表面积、孔径分布
采用吸附法测定比表面积、孔径和孔容积大小，根据静态法测定吸附-脱附等温曲线，由BET(Brunauer-Emmer-Teller)模型计算材料的比表面积、孔容积；根据BJH(Barrett-Joyner-Halenda)等效圆柱模型计算得到孔径分布。
OP-MSNs和LP-MSNs的比表面积及孔径、孔容积测试结果见表5。试验结果表明，MSNs的制备过程中加入均三甲苯后，孔径和孔容增大，比表面积减小，证实均三甲苯具有扩孔效果。
表5.OP-MSNs和LP-MSNs的孔结构参数
Figure BDA0002399593350000112
三、纳米载体的制备和表征
本步骤制备了8种纳米载体，分别是内核为LP-MSNs、外壳为只修饰有Tat(氨基酸序列为SEQ ID No.1的多肽)和乳铁蛋白的脂质双分子层的名称为Tat-Lf-LP-Protocells的纳米载体，内核为LP-MSNs、外壳为只修饰有Tat(氨基酸序列为SEQ ID No.1的多肽)的脂质双分子层的名称为Tat-LP-Protocells的纳米载体，内核为LP-MSNs、外壳为只修饰有乳铁蛋白的脂质双分子层的名称为Lf-LP-Protocells的纳米载体，内核为LP-MSNs、外壳为未进行任何修饰的脂质双分子层的名称为LP-Protocells的纳米载体，内核为OP-MSNs、外壳为只修饰有Tat(氨基酸序列为SEQ ID No.1的多肽)和乳铁蛋白的脂质双分子层的名称为Tat-Lf-OP-Protocells的纳米载体，内核为OP-MSNs、外壳为只修饰有Tat(氨基酸序列为SEQ ID No.1的多肽)的脂质双分子层的名称为Tat-OP-Protocells的纳米载体，内核为OP-MSNs、外壳为只修饰有乳铁蛋白的脂质双分子层的名称为Lf-OP-Protocells的纳米载体，内核为OP-MSNs、外壳为未进行任何修饰的脂质双分子层的名称为OP-Protocells的纳米载体。Tat-Lf-LP-Protocells和Tat-Lf-OP-Protocells的脂质双分子层只修饰有细胞穿透肽Tat和乳铁蛋白，不进行其它任何修饰。
1.纳米载体的制备
1.1Tat-Lf-LP-Protocells的制备
取10mg LP-MSNs加入铺有10mg脂质双分子层Tat-Lf-BL的圆底烧瓶中，另加入1ml生理盐水，于37℃水浴超声3min，使脂质双分子层分散于生理盐水中。将圆底烧瓶中液体转移至5ml离心管中，50w探头超声20min。15000rpm离心10min，弃去上清液，所得沉淀重新分散于去离子水中，制得名称为Tat-Lf-LP-Protocells的纳米载体，4℃保存备用。
1.2Tat-LP-Protocells、Lf-LP-Protocells和LP-Protocells的制备
将1.1的脂质双分子层Tat-Lf-BL分别替换为等质量的脂质双分子层Tat-BL、Lf-BL和BL，其它操作不变，分别得到名称为Tat-LP-Protocells(脂质双分子层为Tat-BL)、Lf-LP-Protocells(脂质双分子层为Lf-BL)和LP-Protocells(脂质双分子层为BL)的三种纳米载体。
1.3Tat-Lf-OP-Protocells的制备
取10mg OP-MSNs加入铺有10mg脂质双分子层Tat-Lf-BL的圆底烧瓶中，另加入1ml生理盐水，于37℃水浴超声3min，使脂质双分子层分散于生理盐水中。将圆底烧瓶中液体转移至5ml离心管中，50w探头超声20min。15000rpm离心10min，弃去上清液，所得沉淀重新分散于去离子水中，制得名称为Tat-Lf-OP-Protocells的纳米载体，4℃保存备用。
1.4Tat-OP-Protocells、Lf-OP-Protocells和OP-Protocells的制备
将1.3的脂质双分子层Tat-Lf-BL分别替换为等质量的脂质双分子层Tat-BL、Lf-BL和BL，其它操作不变，分别得到名称为Tat-OP-Protocells(脂质双分子层为Tat-BL)、Lf-OP-Protocells(脂质双分子层为Lf-BL)和OP-Protocells(脂质双分子层为BL)的三种纳米载体。
2.纳米载体的表征
2.1粒径及Zeta电位测定
将1.1至1.4制备的8种纳米载体分别分散于水中，稀释成适宜浓度，采用Nano-ZS90型激光粒度及Zeta电位分析仪测定各纳米载体的粒径、粒径分布(PDI)及Zeta电位。样品粒径测定条件：激光波长设定为633nm，入射光与散射光夹角为90°，测定温度为25℃，每次测定20个循环，20次测定结果的平均值作为最后测定结果。
结果如表6和7所示，表明本试验所制备的8种纳米载体水化粒径均在100-200nm范围内，粒径分布均一性好，粒子表面呈电负性。
表6.以OP-MSNs为内核的纳米载体的理化特性
Figure BDA0002399593350000121
表7.以LP-MSNs为内核的纳米载体的理化特性
Figure BDA0002399593350000122
2.2透射电子显微镜(TEM)形貌表征
采用透射电子显微镜(TEM)观察1.1至1.4制备的8种纳米载体的表面结构特征。TEM检测用样品制备：将纳米载体均匀分散于去离子水中，调节至适当浓度，然后取微量样品点样于洁净的铜网上，并用滤纸吸干多余溶液，自然挥干后，置于样品室观察纳米粒的结构特征并拍照。
1.1至1.4制备的8种纳米载体外层可见有脂质膜包覆层，证明纳米载体成功制备。1.1至1.4制备的8种纳米载体均为球状纳米颗粒，粒径分布均一(图8)。
四、纳米载体的体外安全性评价
(一)体外溶血试验
1.待测样品制备
将LP-MSNs、Tat-Lf-LP-Protocells、Tat-LP-Protocells、Lf-LP-Protocells和LP-Protocells分别分散于生理盐水中，并稀释至不同浓度(50、100、200、400、600、800、1000μg/ml)，得到待测样品。
2.红细胞悬液的制备
取比格犬静脉血2ml于肝素钠处理过的采血管中，1000rpm离心10min，弃去含纤维蛋白原等成分的上清液，收集下层血细胞，将所得到的红细胞沉淀用无菌生理盐水洗涤3次，最终稀释成2％(v/v)的红细胞悬液，备用。
3.溶血试验
阴性对照组(negative)选用与血液等张等渗的生理盐水，阳性对照组(positive)选用5％Triton X-100，另设多组试验组，每组各取0.8ml待测样品于1.5ml离心管中，再分别加入0.4ml红细胞悬液混合均匀后，于37℃水浴中孵育1h。拍照记录后，将孵育后的混合液于1000rpm离心3min，取上清液100μl转移至96孔板中。以酶标仪在450nm波长下检测吸光度，并用如下公式计算溶血百分率。
Figure BDA0002399593350000131
ODt——试验组吸光度值
ODnc——阴性对照组吸光度值
ODpc——阳性对照组吸光度值
试验平行重复三次。结果如图9所示，照片中，上清液颜色越深，表明红细胞破损越多，红色的血红蛋白进入溶液越多。体外溶血试验结果表明，LP-MSNs本身具有溶血效应，毒性较大，而当其包覆脂质双分子层形成纳米载体之后，其溶血效应显著降低，显著改善了载体材料的血液相容性。同时还发现，当LP-Protocells的脂质双分子层修饰Tat或Lf等功能性材料后，仍无溶血现象，血液相容性良好(图10)。
(二)细胞毒性评价
以细胞培养基(bEnd.3细胞采用含有10％FBS的DMEM培养基，SH-SY5Y细胞采用含有15％FBS的MEM/F12培养基)为溶剂，配制不同浓度的LP-MSNs和Tat-Lf-LP-Protocells溶液，作为试验样品液。
采用MTT法测定细胞存活率。将bEnd.3细胞或SH-SY5Y细胞以5×104个/ml的密度接种于96孔板中，每孔接种体积为100μL，以含有血清的细胞培养基于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，弃去细胞培养基，分别向其中加入各种试验样品液，作为试验组；不含试验样品液的空白细胞培养基作为阴性对照组；PBS溶液作为空白组。加样后将96孔板置于37℃，5％CO2的培养箱中继续培养24h。培养结束后，弃去上清液，每孔加入100μL 0.5mg/mlMTT溶液，继续培养4h后，每孔加入150μL DMSO，避光孵育4h，以酶标仪测定570nm波长处OD值，按下列公式计算细胞存活率，以评价材料的细胞毒性。
Figure BDA0002399593350000141
ODt——试验组吸光度值
ODnc——阴性对照组吸光度值
ODblank——空白组吸光度值
试验平行重复三次。结果如图11所示，表明LP-MSNs和Tat-Lf-LP-Protocells对两种细胞的毒性较低。
实施例2、纳米载体载药试验
(一)脑靶向纳米载体载左旋多巴试验
1.左旋多巴高效液相色谱(HPLC)分析方法的建立
1.1色谱条件的确定
色谱柱：Agillent Eclipse XDB-C18(4.6mm*250mm 5μm)，流动相：四氢呋喃：0.1％三氟乙酸水溶液＝3:97(体积比)，流速：1.0ml/min，检测波长：280nm，柱温：25℃，进样体积：20μL。
1.2左旋多巴标准曲线的绘制
以流动相为溶剂，分别配制浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0mg/ml的左旋多巴溶液，分别按照上述色谱条件进样分析，记录色谱图，量取左旋多巴峰面积。以左旋多巴的峰面积(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，按最小二乘法进行线性回归得标准曲线，方程为：A＝317.43C+2.7634(R2＝0.9999)。试验结果表明，左旋多巴浓度在0.005-4.0mg/ml范围内线性关系良好。
1.3载左旋多巴的纳米制剂中游离左旋多巴的浓度测定
将分散在水中的载左旋多巴的纳米制剂15000rpm离心10min，取上清液，以流动相定容为5ml作为供试液。按照上述1.1和1.2的HPLC法测定上清液中左旋多巴的浓度。
2.以OP-MSNs和LP-MSNs为内核所制备无配体修饰的纳米载体对左旋多巴载药量及包封率的测定
精密称取400mg左旋多巴溶于20ml pH＝1盐酸中，配制得20mg/ml左旋多巴储液。
分别取10mg实施例1制备的OP-MSNs或LP-MSNs与1ml左旋多巴储液室温共孵育24h。24h后，吸取全部溶液转移至铺有10mg实施例1制备的脂质双分子层(BL)的圆底烧瓶中，另加入1ml生理盐水，于37℃水浴超声3min，使脂质双分子层分散于介质中。将圆底烧瓶中液体转移至5ml离心管中，50w探头超声20min。15000rpm离心10min，收集上清液，通过步骤1的HPLC法测定上清液中游离左旋多巴的浓度，并计算出各组的左旋多巴载药量及包封率。所得沉淀重新分散于去离子水中，制得OP-MSNs组的载左旋多巴的纳米制剂(简称OP-MSNs组)和LP-MSNs组的载左旋多巴的纳米制剂(简称LP-MSNs组)。
载药量及包封率计算公式如下：
protocells载药质量＝投药量-上清液游离药物浓度*上清液体积
Figure BDA0002399593350000151
Figure BDA0002399593350000152
上述公式中，Protocells载药质量为纳米制剂所载入的药物的质量，Protocells质量为载入药物的纳米制剂的干重，投药量为所加入的药物质量。
OP-MSNs和LP-MSNs为内核所制备的纳米制剂对左旋多巴的载药量及包封率的比较结果表明，OP-MSNs经过扩孔形成LP-MSNs后，其对左旋多巴的载药量由(7.80±0.34)％提升至(10.80±0.47)％，证明LP-MSNs的扩孔可有效提高其对左旋多巴的载药量(表8)。表8.分别以OP-MSNs和LP-MSNs为内核所制备的纳米制剂对左旋多巴的载药量及包封率
组别 左旋多巴载药量(％) 左旋多巴包封率(％)
OP-MSNs组 7.80±0.34 7.80±0.34
LP-MSNs组 10.80±0.47 10.80±0.47
3.配体修饰的纳米载体对左旋多巴载药量及包封率的测定
精密称取400mg左旋多巴溶于20ml pH＝1盐酸中，配制得20mg/ml左旋多巴储液。
分别取10mg实施例1制备的LP-MSNs与1ml左旋多巴储液室温共孵育24h。24h后，吸取全部溶液转移至分别铺有10mg实施例1制备的脂质双分子层BL、Tat-BL、Lf-BL和Tat-Lf-BL的圆底烧瓶中，另加入1ml生理盐水，于37℃水浴超声3min，使脂质双分子层BL、Tat-BL、Lf-BL和Tat-Lf-BL分散于介质中。将圆底烧瓶中液体转移至5ml离心管中，50w探头超声20min。15000rpm离心10min，收集上清液，通过步骤1的HPLC法测定上清液中游离左旋多巴的浓度，按照步骤2的方法测定和计算各组的左旋多巴载药量及包封率。所得沉淀重新分散于去离子水中，分别制得以LP-MSNs为内核载左旋多巴的纳米制剂：L-DOPA-LP-Protocells(脂质双分子层为BL)、L-DOPA-Tat-LP-Protocells(脂质双分子层为Tat-BL)、L-DOPA-Lf-LP-Protocells(脂质双分子层为Lf-BL)和L-DOPA-Tat-Lf-LP-Protocells(脂质双分子层为Tat-Lf-BL)。
表9.配体修饰的纳米载体对左旋多巴的载药量及包封率
Figure BDA0002399593350000153
配体修饰的纳米载体对左旋多巴的载药量及包封率的测定结果表明，纳米载体的脂质双分子层上Tat及Lf的修饰对左旋多巴载药量及包封率的影响不大，以LP-MSNs为内核制备的载左旋多巴LP-Protocells、Tat-LP-Protocells、Lf-LP-Protocells和Tat-Lf-LP-Protocells对左旋多巴的载药量均在10％左右，包封率均在10％左右。
(二)脑靶向纳米载体载姜黄素试验
1.姜黄素高效液相色谱(HPLC)分析方法的建立
1.1色谱条件的确定
色谱柱：Agillent Eclipse XDB-C18(4.6mm*250mm 5μm)，流动相：甲醇：4％醋酸溶液＝75:25(体积比)，流速：1.0ml/min，检测波长：430nm，柱温：25℃，进样体积：20μL。
1.2标准曲线的绘制
以流动相为溶剂，分别配制浓度为0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0、20.0、40.0、100.0μg/ml的姜黄素溶液，分别按照上述色谱条件进样分析，记录色谱图，量取姜黄素峰面积。以姜黄素的峰面积(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，按最小二乘法进行线性回归得标准曲线。方程为：A＝3.6947C-0.5219(R2＝0.9999)。试验结果表明，姜黄素浓度在0.5-100.0μg/ml范围内线性关系良好。
2.载姜黄素的纳米制剂的粒径及Zeta电位
通过对载姜黄素纳米制剂的粒径及Zeta电位测定，考察姜黄素载入量对纳米制剂理化性质的影响，以确定姜黄素的最大加入量。
精密称取50mg姜黄素溶于50ml氯仿中，配制得1mg/ml姜黄素储液。-20℃避光保存。
按表3中的Tat-Lf-BL列所示摩尔比，分别称取DPPC、Chol、DSPE-PEG2000-Tat和DSPE-PEG2000-Lf，置100ml圆底烧瓶中，DPPC、Chol、DSPE-PEG2000-Tat和DSPE-PEG2000-Lf的质量共计10mg，加入氯仿适量使溶解，并分别加入一定体积的姜黄素储液，使姜黄素的加入量分别为100μg、200μg和400μg。通过旋转蒸发法除去氯仿，分别制得100μg组载姜黄素脂质双分子层(姜黄素的加入量为100μg)、200μg组载姜黄素脂质双分子层(姜黄素的加入量为200μg)和400μg组载姜黄素脂质双分子层(姜黄素的加入量为400μg)。
取实施例1制备的LP-MSNs 10mg加入铺有10mg脂质双分子层(100μg组载姜黄素脂质双分子层、200μg组载姜黄素脂质双分子层或400μg组载姜黄素脂质双分子层)的圆底烧瓶中，另加入1ml生理盐水及1ml pH＝1盐酸，于37℃水浴超声3min，使载姜黄素脂质双分子层分散于介质中。将圆底烧瓶中液体转移至5ml离心管中，50w探头超声20min。15000rpm离心10min，弃去上清液，所得沉淀重新分散于去离子水中，分别制得纳米制剂：100μg组载姜黄素纳米制剂(脂质双分子层为100μg组载姜黄素脂质双分子层)、200μg组载姜黄素纳米制剂(脂质双分子层为200μg组载姜黄素脂质双分子层)和400μg组载姜黄素纳米制剂(脂质双分子层为400μg组载姜黄素脂质双分子层)，4℃保存备用。将上述制备的100μg组载姜黄素纳米制剂、200μg组载姜黄素纳米制剂和400μg组载姜黄素纳米制剂分别分散于水中，稀释成适宜浓度，采用Nano-ZS 90型激光粒度及Zeta电位分析仪测定粒径、粒径分布(以多分散系数PDI表示)及Zeta电位。样品粒径测定条件：激光波长设定为633nm，入射光与散射光夹角为90°，测定温度为25℃，每次测定20个循环，20次测定结果的平均值作为最后测定结果。结果如表10所示，表明随着姜黄素加入量的增大，载姜黄素纳米制剂的粒径逐渐增大，且PDI值逐渐升高，而Zeta电位未有明显变化。根据载姜黄素纳米制剂的粒径及Zeta电位测定结果，确定20mg纳米载体的姜黄素最大加入量为200μg，此时载姜黄素纳米制剂粒径小于200nm，且粒径分布均匀。
表10.各组载姜黄素纳米制剂的粒径、粒径分布及Zeta电位
Figure BDA0002399593350000161
Figure BDA0002399593350000171
3.载姜黄素的纳米制剂中姜黄素载药量及包封率的测定
精密称取50mg姜黄素溶于50ml氯仿中，配制得1mg/ml姜黄素储液。-20℃避光保存。
按表3各列所示摩尔比，分别称取DPPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Tat和DSPE-PEG2000-Lf，置100ml圆底烧瓶中，DPPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Tat和DSPE-PEG2000-Lf的质量共计10mg，加入氯仿适量使溶解，并分别加入0.2ml的姜黄素储液(姜黄素的加入量为200μg)。通过旋转蒸发法除去氯仿，分别制得载姜黄素脂质双分子层Cur-BL(DPPC、Chol、DSPE-PEG2000的摩尔比同表3中的BL)、Cur-Tat-BL(DPPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Tat的摩尔比同表3中的Tat-BL)、Cur-Lf-BL(DPPC、Chol、DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-Lf的摩尔比同表3中的Lf-BL)或Cur-Tat-Lf-BL(DPPC、Chol、DSPE-PEG2000-Tat和DSPE-PEG2000-Lf的摩尔比同表3中的Tat-Lf-BL)。
取实施例1制备的LP-MSNs 10mg分别加入铺有10mg载姜黄素脂质双分子层(Cur-BL、Cur-Tat-BL、Cur-Lf-BL或Cur-Tat-Lf-BL)的圆底烧瓶中，另加入1ml生理盐水及1ml pH＝1盐酸，于37℃水浴超声3min，使载姜黄素脂质双分子层分散于介质中。将圆底烧瓶中液体转移至5ml离心管中，50w探头超声20min。15000rpm离心10min，收集上清液，通过步骤1的HPLC法测定上清液中游离姜黄素的浓度，按照(一)中载药量及包封率的测定方法测定和计算各组的姜黄素载药量及包封率。所得沉淀重新分散于去离子水中，分别制得载姜黄素的纳米制剂：Cur-LP-Protocells(脂质双分子层为Cur-BL)、Cur-Tat-LP-Protocells(脂质双分子层为Cur-Tat-BL)、Cur-Lf-LP-Protocells(脂质双分子层为Cur-Lf-BL)和Cur-Tat-Lf-LP-Protocells(脂质双分子层为Cur-Tat-Lf-BL)，4℃保存备用。
实验结果表明，纳米制剂中的Tat、Lf修饰对其载姜黄素的载药量及包封率的总体影响不大。以LP-MSNs为内核制备的载姜黄素的纳米制剂Cur-LP-Protocells、Cur-Tat-LP-Protocells、Cur-Lf-LP-Protocells和Cur-Tat-Lf-LP-Protocells对姜黄素的载药量均在1.0％左右，包封率均高于85％。
表11.各种载姜黄素的纳米制剂中姜黄素的载药量和包封率
组别 Cur-LP-Protocells Cur-Tat-LP-Protocells Cur-Lf-LP-Protocells Cur-Tat-Lf-LP-Protocells
姜黄素的载药量(％) 0.966±0.001 0.977±0.001 0.867±0.002 0.900±0.002
姜黄素的包封率(％) 96.57±0.03 97.71±0.01 86.67±0.12 89.96±0.08
(三)配体修饰的纳米载体对左旋多巴和姜黄素载药量及包封率的测定
精密称取400mg左旋多巴溶于20ml pH＝1盐酸中，配制得20mg/ml左旋多巴储液。
分别取10mg实施例1制备的LP-MSNs与1ml左旋多巴储液室温共孵育24h。24h后，将全部溶液转移至分别铺有10mg步骤(二)制备的载姜黄素脂质双分子层(Cur-BL、Cur-Tat-BL、Cur-Lf-BL或Cur-Tat-Lf-BL)的圆底烧瓶中，另加入1ml生理盐水，于37℃水浴超声3min，使载姜黄素脂质双分子层分散于介质中。将圆底烧瓶中液体转移至5ml离心管中，50w探头超声20min。15000rpm离心10min，收集上清液，按照步骤(一)和步骤(二)的方法测定和计算各种载左旋多巴和姜黄素的纳米制剂中左旋多巴和姜黄素的载药量及包封率。所得沉淀重新分散于去离子水中，分别制得载左旋多巴和姜黄素的纳米制剂：L-DOPA-Cur-LP-Protocells、L-DOPA-Cur-Tat-LP-Protocells、L-DOPA-Cur-Lf-LP-Protocells和L-DOPA-Cur-Tat-Lf-LP-Protocells。4℃保存备用。
实验结果表明，左旋多巴、姜黄素两者双载药不会降低各自的载药量及包封率。各种载左旋多巴和姜黄素的纳米制剂中左旋多巴的载药量为10％左右，包封率为10％左右，姜黄素的载药量为1％左右，包封率为95％左右(表12和表13)。
表12.各种载左旋多巴和姜黄素的纳米制剂中左旋多巴的载药量和包封率
Figure BDA0002399593350000181
13.各种载左旋多巴和姜黄素的纳米制剂中姜黄素的载药量和包封率
Figure BDA0002399593350000182
实施例3、体外细胞摄取试验证明细胞穿透肽和乳铁蛋白在提高脑微血管内皮细胞对纳米制剂的摄取量方面产生了协同作用
1.纳米载体RBITC-MSNs及纳米制剂RBITC-Protocells、RBITC-Tat-Protocells、RBITC-Lf-Protocells、RBITC-Tat-Lf-Protocells的脑微血管内皮细胞摄取试验
1.1纳米载体RBITC-LP-MSNs的制备
RBITC-APTES的合成：吸取200μL APTES，加入2ml无水乙醇中。精密称取RBITC(红色荧光素罗丹明)8.6mg，加入上述溶液中，室温下避光搅拌反应24h，制备得到RBITC-APTES。
精密称取CTAB 0.437g，Brij58 0.472g，置于250ml圆底烧瓶中，向其中加入100mlpH＝7.0的PBS溶液，60℃水浴加热，磁力搅拌使溶解，20min后，缓慢加入均三甲苯4ml，60℃水浴继续加热60min后，缓慢加入TEOS 2.14ml，继续搅拌45min后，缓慢加入500μl RBITC-APTES继续反应8h。
上述反应结束后，将反应液转移至离心管中，15000rpm离心10min，弃去上清液，所得沉淀以去离子水洗涤2次，再用无水乙醇洗涤2次，收集沉淀。
将沉淀分散到60ml酸性乙醇溶液中，于78℃水浴加热回流8h后，将反应液转移到离心管中，15000rpm离心10min，弃去上清液，沉淀重新分散到60ml酸性乙醇溶液中，重复上述步骤加热回流3次，所得沉淀用无水乙醇洗涤3次，即得纳米载体RBITC-LP-MSNs。
1.2纳米制剂RBITC-Protocells、RBITC-Tat-Protocells、RBITC-Lf-Protocells、RBITC-Tat-Lf-Protocells的制备
取10mg RBITC-LP-MSNs加入铺有10mg脂质双分子层(实施例1制备的BL、Tat-BL、Lf-BL或Tat-Lf-BL)的圆底烧瓶中，另加入1ml生理盐水，于37℃水浴超声3min，使脂质双分子层分散于生理盐水中。将圆底烧瓶中液体转移至5ml离心管中，50w探头超声20min。15000rpm离心10min，弃去上清液，所得沉淀以去离子水洗涤2次，制得名称分别为RBITC-Protocells(脂质双分子层为BL)、RBITC-Tat-Protocells(脂质双分子层为Tat-BL)、RBITC-Lf-Protocells(脂质双分子层为Lf-BL)、BITC-Tat-Lf-Protocells(脂质双分子层为Tat-Lf-BL)的纳米制剂，4℃保存备用。
1.3脑微血管内皮细胞摄取试验
取对数生长期的bEnd.3细胞，以4×105个/皿接种于激光共聚焦培养皿中，以含有10％FBS的DMEM培养基于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，弃去培养液，PBS洗涤2次。分别加入1ml以培养基配制的纳米制剂(RBITC-LP-MSNs、RBITC-Protocells、RBITC-Tat-Protocells、RBITC-Lf-Protocells或RBITC-Tat-Lf-Protocells)含量为200μg/ml的液体，于37℃二氧化碳培养箱中培养。分别于4h取出，弃去培养液，PBS洗涤3次，4％多聚甲醛4℃条件下固定30min，弃去固定液，再用PBS洗涤2次，加入50μl含DAPI封片剂，置于共聚焦显微镜下观察。结果如图12所示，bEnd.3细胞经RBITC-LP-MSNs处理后，检测到较弱的红色荧光；bEnd.3细胞经RBITC-Protocells处理后，与RBITC-LP-MSNs处理后相比，红色荧光进一步减弱(几乎看不到)；bEnd.3细胞经RBITC-Lf-Protocells、RBITC-Tat-Protocells和RBITC-Tat-Lf-Protocells处理后，均检测到了明显的红色荧光，且bEnd.3细胞经RBITC-Tat-Lf-Protocells处理后所发出的红色荧光强度显著高于bEnd.3细胞经RBITC-Tat-Protocells和RBITC-Lf-Protocells处理后所发出的红色荧光强度，表明bEnd.3细胞对RBITC-LP-MSNs的摄取量较低，而当RBITC-LP-MSNs包膜形成纳米制剂RBITC-Protocells后，几乎不被bEnd.3细胞所摄取。而当纳米制剂的脂质双分子层修饰Tat或Lf配体后，bEnd.3细胞对其摄取量显著提高，且对双修饰的RBITC-Tat-Lf-Protocells摄取量高于单修饰的RBITC-Tat-Protocells和RBITC-Lf-Protocells。
实施例4、脑微血管内皮细胞对纳米制剂装载的水溶性药物和脂溶性药物的摄取
本实施例以香豆素6(Coumarin 6)模拟脂溶性药物，钙黄绿素模拟水溶性药物，测定脑微血管内皮细胞对脑靶向纳米载体所装载的脂溶性药物和水溶性药物的摄取量。
1.外壳载香豆素6的纳米制剂Coumarin 6-Protocells、Coumarin 6-Tat-Protocells、Coumarin6-Lf-Protocells、Coumarin 6-Tat-Lf-Protocells的脑微血管内皮细胞摄取试验
1.1外壳载香豆素6的纳米制剂Coumarin 6-Protocells、Coumarin 6-Tat-Protocells、Coumarin 6-Lf-Protocells、Coumarin 6-Tat-Lf-Protocells的制备
精密称取5mg Coumarin 6溶于10ml氯仿中，配制得0.5mg/ml Coumarin 6储液。-20℃避光保存。
按表3所示摩尔比，分别称取DPPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Tat、DSPE-PEG2000-Lf，置100ml圆底烧瓶中，DPPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Tat和DSPE-PEG2000-Lf的质量共计10mg，加入适量氯仿使溶解，然后加入100μl Coumarin 6储液，即50μg Coumarin 6。通过旋转蒸发法除去氯仿，分别制得载香豆素6脂质双分子层Coumarin 6-BL(DPPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Tat和DSPE-PEG2000-Lf的摩尔比同表3中的BL)、Coumarin 6-Tat-BL(DPPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Tat和DSPE-PEG2000-Lf的摩尔比同表3中的Tat-BL)、Coumarin 6-Lf-BL(DPPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Tat和DSPE-PEG2000-Lf的摩尔比同表3中的Lf-BL)或Coumarin 6-Tat-Lf-BL(DPPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Tat和DSPE-PEG2000-Lf的摩尔比同表3中的Tat-Lf-BL)。
取10mg实施例1制备的LP-MSNs加入铺有10mg脂质双分子层(Coumarin 6-BL、Coumarin 6-Tat-BL、Coumarin 6-Lf-BL或Coumarin 6-Tat-Lf-BL)的圆底烧瓶中，另加入1ml生理盐水，于37℃水浴超声3min，使脂质双分子层分散于生理盐水中。将圆底烧瓶中液体转移至5ml离心管中，50w探头超声20min。15000rpm离心10min，弃去上清液，所得沉淀以去离子水洗涤2次，分别制得名称为Coumarin 6-Protocells(脂质双分子层为Coumarin 6-BL)、Coumarin 6-Tat-Protocells(脂质双分子层为Coumarin 6-Tat-BL)、Coumarin 6-Lf-Protocells(脂质双分子层为Coumarin 6-Lf-BL)、Coumarin 6-Tat-Lf-Protocells(脂质双分子层为Coumarin 6-Tat-Lf-BL)的外壳载香豆素6的纳米制剂，4℃保存备用。
1.2脑微血管内皮细胞摄取试验
取对数生长期的bEnd.3细胞，以4×105个/皿接种于激光共聚焦培养皿中，以含有10％FBS的DMEM培养基于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，弃去培养液，PBS洗涤2次。分别加入1ml以培养基配制的外壳载香豆素6的纳米制剂(Coumarin 6-Protocells、Coumarin6-Tat-Protocells、Coumarin 6-Lf-Protocells或Coumarin 6-Tat-Lf-Protocells)的含量为200μg/ml的液体，于37℃二氧化碳培养箱中培养。分别于4h取出，弃去培养液，PBS洗涤3次，4％多聚甲醛4℃条件下固定30min，弃去固定液，再用PBS洗涤2次，加入50μl含DAPI封片剂，置于共聚焦显微镜下观察。结果如图13所示，结果表明bEnd.3细胞经外壳载香豆素6的纳米制剂Coumarin 6-Protocells、Coumarin 6-Tat-Protocells、Coumarin 6-Lf-Protocells和Coumarin 6-Tat-Lf-Protocells处理后，均检测到了绿色荧光，且各处理组的绿色荧光强度没有显著差异。说明外壳载香豆素6的纳米制剂Coumarin 6-Protocells、Coumarin 6-Tat-Protocells、Coumarin 6-Lf-Protocells、Coumarin 6-Tat-Lf-Protocells的脂质双分子层中所载的脂溶性荧光物质Coumarin 6均可被bEnd.3细胞高效摄取，Tat或Lf配体的修饰并不会增加bEnd.3细胞对Coumarin 6的摄取量。
2.内核载钙黄绿素的纳米制剂Calcein-Protocells、Calcein-Tat-Protocells、Calcein-Lf-Protocells和Calcein-Tat-Lf-Protocells的脑微血管内皮细胞摄取试验
2.1内核载钙黄绿素的纳米制剂Calcein-Protocells、Calcein-Tat-Protocells、Calcein-Lf-Protocells和Calcein-Tat-Lf-Protocells的制备
载钙黄绿素的纳米颗粒的制备：取3ml浓度为14mg/ml的实施例1的LP-MSNs水溶液与9ml浓度为2mg/ml的钙黄绿素水溶液混合，室温避光搅拌48h，得到载钙黄绿素的纳米颗粒Calcein-LP-MSNs溶液。4℃保存待用。
取上述Calcein-LP-MSNs溶液(相当于10mg LP-MSNs的量)分别加入铺有10mg实施例1制备的脂质双分子层(BL、Tat-BL、Lf-BL或Tat-Lf-BL)的圆底烧瓶中，另加入1ml生理盐水，于37℃水浴超声3min，使脂质双分子层分散于介质中。将圆底烧瓶中液体转移至5ml离心管中，50w探头超声20min。15000rpm离心10min，弃去上清液，所得沉淀以去离子水洗涤2次，制得名称分别为Calcein-Protocells(脂质双分子层为BL)、Calcein-Tat-Protocells(脂质双分子层为Tat-BL)、Calcein-Lf-Protocells(脂质双分子层为Lf-BL)和Calcein-Tat-Lf-Protocells(脂质双分子层为Tat-Lf-BL)的内核载钙黄绿素的纳米制剂，4℃保存备用。
2.2内核载钙黄绿素的纳米制剂的细胞摄取试验
取对数生长期的bEnd.3细胞，以4×105个/皿接种于激光共聚焦培养皿中，以含有10％FBS的DMEM培养基于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，弃去培养液，PBS洗涤2次。分别加入1ml以培养基配制的内核载钙黄绿素的纳米制剂(Calcein-Protocells、Calcein-Tat-Protocells、Calcein-Lf-Protocells、Calcein-Tat-Lf-Protocells)含量为200μg/ml的液体，于37℃二氧化碳培养箱中培养。分别于4h取出，弃去培养液，PBS洗涤3次，4％多聚甲醛4℃条件下固定30min，弃去固定液，再用PBS洗涤2次，加入50μl含DAPI封片剂，置于共聚焦显微镜下观察。结果如图14所示，结果表明bEnd.3细胞经内核载钙黄绿素的纳米制剂Calcein-Protocells处理后没有检测到绿色荧光，bEnd.3细胞经内核载钙黄绿素的纳米制剂Calcein-Tat-Protocells、Calcein-Lf-Protocells和Calcein-Tat-Lf-Protocells处理后，均检测到了绿色荧光，且bEnd.3细胞经内核载钙黄绿素的纳米制剂Calcein-Tat-Lf-Protocells处理后的绿色荧光强度显著高于bEnd.3细胞经内核载钙黄绿素的纳米制剂Calcein-Tat-Protocells处理后的绿色荧光强度和bEnd.3细胞经内核载钙黄绿素的纳米制剂Calcein-Lf-Protocells处理后的绿色荧光强度。
试验证明，相同数目的脑微血管内皮细胞对相同质量的Calcein-Tat-Lf-Protocells所载钙黄绿素的摄取量(UTat-Lf)高于对相同质量的Calcein-Tat-Protocells所载钙黄绿素的摄取量(UTat)和对相同质量的Calcein-Lf-Protocells所载钙黄绿素的摄取量(ULf)之和，即UTat-Lf＞UTat+ULf。
试验证明，未修饰细胞穿透肽Tat和乳铁蛋白(Lf)的纳米载体对bEnd.3细胞的入胞效率低，因此难以通过血脑屏障；而修饰有细胞穿透肽Tat和乳铁蛋白的脑靶向纳米载体Tat-Lf-Protocells自身及其所携载水溶性药物及脂溶性药物均能够有效进入bEnd.3细胞内，提高药物尤其是水溶性药物入胞的效率。
试验证明，Tat-Lf-Protocells(脂质双分子层只修饰有细胞穿透肽Tat和乳铁蛋白，不进行其它任何修饰的纳米载体)与Protocells(未修饰细胞穿透肽Tat和乳铁蛋白的纳米载体)、Tat-Protocells(只修饰有细胞穿透肽Tat的纳米载体)和Lf-Protocells(只修饰有乳铁蛋白的纳米载体)这三种纳米载体相比，显著提高了脑微血管内皮细胞对其装载的水溶性药物摄取量，证明细胞穿透肽Tat和乳铁蛋白在提高脑微血管内皮细胞对其装载的水溶性药物的摄取量方面产生了协同作用。Protocells、Tat-Protocells、Lf-Protocells和Tat-Lf-Protocells均是由外壳和所述外壳包覆的内核组成的纳米载体，所述内核均为介孔二氧化硅纳米粒，只是外壳有区别：Tat-Lf-Protocells的外壳为只修饰有细胞穿透肽Tat和乳铁蛋白的脂质双分子层，该脂质双分子层不进行其它任何修饰；Protocells与Tat-Lf-Protocells的区别仅在于Protocells的外壳是没有进行生物分子修饰的脂质双分子层；Tat-Protocells与Tat-Lf-Protocells的区别仅在于Tat-Protocells的外壳是只修饰有细胞穿透肽的脂质双分子层(未进行乳铁蛋白修饰)，Lf-Protocells与Tat-Lf-Protocells的区别仅在于Lf-Protocells的外壳是只修饰有乳铁蛋白的脂质双分子层(未进行细胞穿透肽修饰)。
实施例5、纳米制剂的动物体内靶向性试验
将荧光物质包载于纳米载体的脂质双分子层中并进行小鼠活体成像试验，结果表明Lf修饰的纳米载体具有一定脑靶向性，而双配体Tat和Lf修饰的纳米载体脑靶向能力进一步增强。
1.Cy5标记的纳米载体的制备
Cy5-APTES的合成：吸取200μL APTES，加入2ml DMSO中，得到APTES溶液。同时称取Cy5-SE 2.5mg，加入上述APTES溶液中，室温下避光搅拌反应24h，制备得到Cy5-APTES。
精密称取CTAB 0.437g，Brij58 0.472g，置于250ml圆底烧瓶中，向其中加入100mlpH为7.0的PBS溶液，60℃水浴加热，磁力搅拌使溶解，20min后，缓慢加入均三甲苯4ml，60℃水浴继续加热60min后，缓慢加入TEOS 2.14ml，继续搅拌45min后，缓慢加入1ml Cy5-APTES，继续反应8h。
上述反应结束后，将反应液转移至离心管中，15000rpm离心10min，弃去上清液，所得沉淀以去离子水洗涤2次，再用无水乙醇洗涤2次。
将沉淀分散到60ml酸性乙醇溶液中，于78℃水浴加热回流8h后，将反应液转移到离心管中，15000rpm离心10min，弃去上清液，沉淀重新分散到60ml酸性乙醇溶液中，重复上述步骤加热回流3次，所得沉淀用无水乙醇洗涤3次，即得Cy5-LP-MSNs。
按照实施例1步骤三的方法，将实施例1步骤三的LP-MSNs替换为Cy5-LP-MSNs，其它操作不变，得到如下四种纳米制剂：分别是内核为Cy5-LP-MSNs、外壳为只修饰有Tat(氨基酸序列为SEQ ID No.1的多肽)和乳铁蛋白的脂质双分子层的名称为Tat-Lf-Cy5-LP-MSNs-Protocells的纳米制剂，内核为Cy5-LP-MSNs、外壳为只修饰有Tat(氨基酸序列为SEQID No.1的多肽)的脂质双分子层的名称为Tat-Cy5-LP-MSNs-Protocells的纳米制剂，内核为Cy5-LP-MSNs、外壳为只修饰有乳铁蛋白的脂质双分子层的名称为Lf-Cy5-LP-MSNs-Protocells的纳米制剂，内核为Cy5-LP-MSNs、外壳为未进行任何修饰的脂质双分子层的名称为Cy5-LP-MSNs-Protocells的纳米制剂。4℃保存备用。
2.纳米制剂的动物体内靶向性评价
取5只BALB/c-nu/nu小鼠，分别腹腔注射200μL用去离子水配制的纳米制剂含量为5mg/ml的液体，纳米制剂为Cy5-LP-MSNs、Cy5-Tat-Lf-LP-MSNs-Protocells、Cy5-Tat-LP-MSNs-Protocells、Cy5-Lf-LP-MSNs-Protocells或Cy5-LP-MSNs-Protocells，在注射后不同时间点用3％异氟烷气体麻醉小鼠，用活体成像系统进行成像分析。
活体成像结果如图15所示。结果表明，腹腔注射30min后，各试验组动物腹腔注射部位(小鼠右后腿上方)均有较强的荧光，而Cy5-Lf-LP-MSNs-Protocells组脑部已有微弱荧光分布；60min后，各试验组动物腹腔注射部位仍有一定强度荧光，Cy5-Tat-Lf-LP-MSNs-Protocells组荧光明显向身体各部位扩散，Cy5-Tat-LP-MSNs-Protocells、Cy5-Lf-LP-MSNs-Protocells、Cy5-Tat-Lf-LP-MSNs-Protocells组动物脑部均有荧光分布，且Cy5-Tat-Lf-LP-MSNs-Protocells组脑部荧光强度高于Cy5-Tat-Lf-LP-MSNs-Protocells及Cy5-Lf-LP-MSNs-Protocells组；120min后，Cy5-LP-MSNs-Protocells组动物荧光仍主要分布在腹部(肝脏)，Cy5-Tat-LP-MSNs-Protocells组、Cy5-Lf-LP-MSNs-Protocells组和Cy5-Tat-Lf-LP-MSNs-Protocells组动物脑部荧光强度进一步增强，且Cy5-Tat-Lf-LP-MSNs-Protocells组脑部荧光强度高于Cy5-Tat-LP-MSNs-Protocells及Cy5-Lf-LP-MSNs-Protocells组，Cy5-Tat-LP-MSNs-Protocells组全身均有较强荧光分布，无特定靶向性，而Cy5-Lf-LP-MSNs-Protocells和Cy5-Tat-Lf-LP-MSNs-Protocells组荧光分布具有较好的脑靶向性；180min后，Cy5-LP-MSNs-Protocells组荧光主要分布于肝脏及脑部，Cy5-Tat-LP-MSNs-Protocells组荧光于全身均有分布，Cy5-Lf-LP-MSNs-Protocells、Cy5-Tat-Lf-LP-MSNs-Protocells组荧光分布具有较好的脑靶向性，且Cy5-Tat-Lf-LP-MSNs-Protocells荧光强度高于Cy5-Lf-LP-MSNs-Protocells组。Cy5-LP-MSNs组在整个测试时间内荧光一直富集于腹腔部位，不具有脑靶向性。由上述结果可见：Cy5-Tat-LP-MSNs-Protocells以较高浓度分布于全身包括脑部，未表现出特定的脑靶向性分布；Cy5-Lf-LP-MSNs-Protocells在小鼠体内的分布具有特定脑靶向性，但到达脑部的浓度较低；而采用Tat和Lf双配体修饰的Cy5-Tat-Lf-LP-MSNs-Protocells表现出以较高浓度分布于脑部，从而实现了良好的脑靶向性分布。证明细胞穿透肽和乳铁蛋白在提高药物入脑量方面产生了协同作用。
实施例6、左旋多巴与姜黄素联用治疗帕金森病方面产生了协同作用
利用鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞所构建的帕金森病体外细胞模型，进行了体外药效学试验，证明了左旋多巴与姜黄素联用在提高帕金森病细胞的存活率方面产生了协同作用。
1.鱼藤酮诱导帕金森细胞模型的建立
1.1鱼藤酮溶液的配制
精密称取一定质量的鱼藤酮粉末溶解于DMSO中，配制得10mmol/L鱼藤酮储液，-20℃储存备用。临用前，用空白细胞培养基(含有15％FBS的MEM/F12培养基)将鱼藤酮储液稀释得0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L鱼藤酮溶液。
1.2细胞形态观察及细胞存活率测定
将SH-SY5Y细胞以5×104个/ml的密度接种于96孔板中，每孔体积为100μL，以含有15％FBS的MEM/F12培养基于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，弃去细胞培养基，分别向每孔加入100μL不同浓度的鱼藤酮溶液(0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L)，作为试验组；不含试验样品液的空白细胞培养基(0μmol/L鱼藤酮溶液)作为阴性对照组；每孔加入100μL的pH为7.0的PBS溶液作为空白组。加样后将96孔板置于37℃，5％CO2的培养箱中继续培养36h后，弃去上清液，每孔加入100μL 0.5mg/mlMTT溶液，继续培养4h后，每孔加入150μL DMSO，避光孵育4h，以酶标仪测定570nm波长处OD值，按下列公式计算细胞存活率。确定适宜的鱼藤酮诱导浓度。试验重复三次，每次每个处理重复6个孔。
Figure BDA0002399593350000231
ODt——试验组吸光度值
ODnc——阴性对照组吸光度值
ODblank——空白组吸光度值
各浓度鱼藤酮溶液诱导SH-SY5Y细胞形态学发生变化结果如图16所示：阴性对照组细胞生长密集，神经突起明显而细长；0.5μmol/L鱼藤酮组(每孔加入100μL的浓度为0.5μmol/L鱼藤酮溶液)细胞形态与阴性对照组无明显差异；随着鱼藤酮浓度的增加，细胞开始发生肿胀，1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L鱼藤酮组(每孔分别加入100μL的浓度为1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L鱼藤酮溶液)细胞均有不同程度的肿胀、圆缩现象；10.0μmol/L鱼藤酮组细胞肿胀现象更加严重，未见神经突起明显的细胞；20.0μmol/L鱼藤酮组细胞变得稀少，细胞肿胀，未见神经突起明显的细胞，且细胞轮廓模糊。
各浓度鱼藤酮溶液诱导后，SH-SY5Y细胞活性测定结果如图17所示。细胞存活率测定结果表明，各浓度鱼藤酮均可诱导SH-SY5Y细胞死亡，且SH-SY5Y细胞的存活率呈现鱼藤酮浓度依赖性，随鱼藤酮浓度提高，细胞存活率下降。该试验结果说明4.0μmol/L鱼藤酮溶液可以成功诱导帕金森细胞模型。
2.姜黄素对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞死亡的保护作用
2.1姜黄素溶液的配制
精密称取一定质量的姜黄素粉末溶解于DMSO中，配制得10mmol/L姜黄素储液，-20℃储存备用。临用前，用空白细胞培养基将姜黄素储液稀释至所需浓度。
2.2细胞存活率测定
设定以下对照组及试验组：
A.鱼藤酮组(阴性对照组)；每孔加入200μL的4μmol/L鱼藤酮溶液；
B.Control组(阳性对照组)：每孔加入200μL空白培养基；
C1.姜黄素毒性-1组：每孔加入200μL的1.0μmol/L姜黄素溶液；
C2.姜黄素毒性-2组：每孔加入200μL的2.0μmol/L姜黄素溶液；
C3.姜黄素毒性-3组：每孔加入200μL的4.0μmol/L姜黄素溶液；
D1.姜黄素治疗-1组：每孔加入100μL 8μmol/L的鱼藤酮溶液和100μL的2.0μmol/L姜黄素溶液；
D2.姜黄素治疗-2组：每孔加入100μL 8μmol/L的鱼藤酮溶液和100μL的4.0μmol/L姜黄素溶液；
D3.姜黄素治疗-3组：每孔加入100μL 8μmol/L的鱼藤酮溶液和100μL的8.0μmol/L姜黄素溶液。
将SH-SY5Y细胞以5×104个/ml的密度接种于96孔板中，每孔体积为100μL，以含有血清的细胞培养基于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，弃去细胞培养基，分别按上述所列各组条件进行处理，于37℃，5％CO2的培养箱中继续培养36h后，弃去上清液，每孔加入100μL 0.5mg/ml MTT溶液，继续培养4h后，每孔加入150μL DMSO，避光孵育4h，以酶标仪测定570nm波长处OD值，按照步骤1的公式计算细胞存活率。试验重复三次，每次每个处理重复6个孔。
采用MTT法对不同浓度姜黄素和鱼藤酮处理的SH-SY5Y细胞活性测定结果如图18所示。细胞存活率测定结果表明，1～4μmol/L姜黄素对SH-SY5Y细胞无明显毒性作用，但随着姜黄素浓度的提高，其本身对SH-SY5Y细胞的毒性将增大。姜黄素在1～4μmol/L浓度范围内，对鱼藤酮所诱导的SH-SY5Y细胞死亡具有保护作用，显著提高了SH-SY5Y细胞的存活率。
3.左旋多巴及左旋多巴与姜黄素联用对鱼藤酮所诱导SH-SY5Y细胞死亡的保护作用
3.1左旋多巴溶液的配制
精密称取一定质量的左旋多巴粉末溶解于PBS中，配制得10mmol/L左旋多巴储液，-20℃储存备用。临用前，用空白细胞培养基将左旋多巴储液稀释至所需浓度。
3.2细胞存活率测定
设定以下对照组及试验组：
A.鱼藤酮组(阴性对照组)；每孔加入200μL的4μmol/L鱼藤酮溶液，即4μmol/L鱼藤酮溶液的处理；
B.Control组(阳性对照组)：每孔加入200μL空白培养基；
C.姜黄素治疗组：每孔加入100μL 8μmol/L的鱼藤酮溶液和100μL的4μmol/L姜黄素溶液，即4μmol/L鱼藤酮溶液和2μmol/L姜黄素溶液的处理。
D1.左旋多巴治疗-1组：每孔加入100μL 8μmol/L鱼藤酮溶液和100μL的40μmol/L左旋多巴溶液，即4μmol/L鱼藤酮溶液和20μmol/L左旋多巴溶液的处理；
D2.左旋多巴治疗-2组：每孔加入100μL 8μmol/L鱼藤酮溶液和100μL的80μmol/L左旋多巴溶液，即4μmol/L鱼藤酮溶液和40μmol/L左旋多巴溶液的处理；
E1.左旋多巴与姜黄素联合治疗-1组：每孔加入100μL 8μmol/L鱼藤酮溶液、50μL的80μmol/L左旋多巴溶液和50μL的8μmol/L姜黄素溶液，即4μmol/L鱼藤酮溶液、20μmol/L左旋多巴溶液和2μmol/L姜黄素溶液的处理；
E2.左旋多巴与姜黄素联合治疗-2组：每孔加入100μL 8μmol/L鱼藤酮溶液、50μL的160μmol/L左旋多巴溶液和50μL的8μmol/L姜黄素溶液，即4μmol/L鱼藤酮溶液、40μmol/L左旋多巴溶液和2μmol/L姜黄素溶液的处理；
F1.左旋多巴毒性-1组：每孔加入200μL的20μmol/L左旋多巴溶液；
F2.左旋多巴毒性-2组：每孔加入200μL的40μmol/L左旋多巴溶液；
将SH-SY5Y细胞以5×104个/ml的密度接种于96孔板中，每孔体积为100μL，以含有血清的细胞培养基于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后，弃去细胞培养基，分别按上述所列各组条件进行处理，于37℃，5％CO2的培养箱中继续培养36h后，弃去上清液，每孔加入100μL 0.5mg/ml MTT溶液，继续培养4h后，每孔加入150μL DMSO，避光孵育4h，以酶标仪测定570nm波长处OD值，按照步骤1的公式计算细胞存活率。试验重复三次，每次每个处理重复6个孔。
采用MTT法对不同处理条件下SH-SY5Y细胞活性测定结果如图19所示，细胞存活率测定结果表明，低浓度(20～40μmol/L)的左旋多巴对SH-SY5Y细胞无明显毒性作用。左旋多巴在20～40μmol/L浓度范围内，对鱼藤酮所诱导的SH-SY5Y细胞死亡具有保护作用，显著提高了SH-SY5Y细胞的存活率。当各浓度左旋多巴与2μmol/L姜黄素联合使用时，与单独使用左旋多巴或单独使用姜黄素相比，其对鱼藤酮所诱导的SH-SY5Y细胞死亡具有更好的保护作用。鱼藤酮组(A，阴性对照组，即4μmol/L鱼藤酮溶液的处理)的细胞存活率为49.8％±4.6％；左旋多巴治疗组中最佳疗效组——左旋多巴治疗-2组(D2，即4μmol/L鱼藤酮溶液和40μmol/L左旋多巴溶液的处理)的细胞存活率为81.0％±4.7％，与鱼藤酮组相比，细胞存活提高率为62.7％((81.0％-49.8％)/49.8％＝62.7％))；姜黄素治疗最佳疗效组(C，即4μmol/L鱼藤酮溶液和2μmol/L姜黄素溶液的处理)的细胞存活率为82.6％±5.6％，与鱼藤酮组相比，细胞存活提高率为65.9％((82.6％-49.8％)/49.8％＝65.9％))；而左旋多巴与姜黄素联合治疗-1组(E1，即4μmol/L鱼藤酮溶液、20μmol/L左旋多巴溶液和2μmol/L姜黄素溶液处理)的细胞存活率为97.5％±10.9％，与鱼藤酮组相比，细胞存活提高率为95.8％((97.5％-49.8％)/49.8％＝95.8％))；左旋多巴与姜黄素联合治疗-2组(E2，即4μmol/L鱼藤酮溶液、40μmol/L左旋多巴溶液和2μmol/L姜黄素溶液处理)的细胞存活率为89.7％±4.4％，与鱼藤酮组相比，细胞存活提高率为80.1％((89.7％-49.8％)/49.8％＝80.1％))。可见，左旋多巴与姜黄素联合治疗组的细胞存活提高率远高于单独姜黄素治疗和单独左旋多巴治疗最佳疗效的细胞存活提高率，说明左旋多巴与姜黄素联用治疗帕金森病方面产生了协同作用。
实施例7、载左旋多巴及姜黄素的纳米制剂对帕金森动物模型的治疗
1.载左旋多巴及姜黄素的纳米制剂的制备
精密称取50mg姜黄素溶于50ml氯仿中，配制得1mg/ml姜黄素储液。-20℃避光保存。
按照实施例1的表3中Tat-Lf-BL列所示摩尔比，分别称取DPPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Tat和DSPE-PEG2000-Lf，置100ml圆底烧瓶中，DPPC、Chol、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Tat和DSPE-PEG2000-Lf的质量共计10mg，加入适量氯仿使溶解，并加入1.0ml的姜黄素储液(姜黄素的加入量为1mg)。通过旋转蒸发法除去氯仿，制得载姜黄素脂质双分子层Cur-Tat-Lf-BL。
精密称取400mg左旋多巴溶于20ml pH＝1盐酸中，配制得20mg/ml左旋多巴储液。
取10mg实施例1制备的LP-MSNs与0.7ml左旋多巴储液(14mg左旋多巴)室温共孵育24h。24h后，将全部溶液转移至铺有10mg上述载姜黄素脂质双分子层Cur-Tat-Lf-BL的圆底烧瓶中，另加入1ml生理盐水，于37℃水浴超声3min，使载姜黄素脂质双分子层分散于介质中。将圆底烧瓶中液体转移至5ml离心管中，50w探头超声20min。15000rpm离心10min，弃去上清液，所得沉淀以去离子水洗涤2次，制得载左旋多巴和姜黄素的纳米制剂L-DOPA-Cur-Tat-Lf-Protocells。100mg的L-DOPA-Cur-Tat-Lf-Protocells中装载10mg左旋多巴和1mg姜黄素。4℃保存备用。
2.C57BL/6小鼠帕金森疾病模型的建立及给药
依据文献(Li X L,Xu X F,Bu Q X,et al.Effect of total flavonoids fromScutellaria baicalensis on dopaminergic neurons in the substantia nigra[J].Biomedical Reports,2016,5(2):213.)报道的方法，采用MPTP诱导小鼠帕金森疾病模型，并采用疾病模型建立和治疗同时进行的方法。
将MPTP溶于生理盐水，得到MPTP溶液。左旋多巴溶于生理盐水，得到左旋多巴溶液。姜黄素溶于生理盐水，得到姜黄素溶液。将L-DOPA-Cur-Tat-Lf-Protocells溶于生理盐水，得到L-DOPA-Cur-Tat-Lf-Protocells溶液。
将40只10周龄健康雄性C57BL/6小鼠随机分成4组：生理盐水组，MPTP组，左旋多巴+姜黄素治疗组，左旋多巴/姜黄素双载药双靶头Protocells治疗组，每组10只。各组均采用腹腔注射给药，每天1次，连续5天。具体处理方案如下：
MPTP组(MPTP)：每只小鼠腹腔注射MPTP溶液，使MPTP的给药剂量为20mg/kg体重；
左旋多巴+姜黄素治疗组(MPTP+L-DOPA+Cur)：每只小鼠腹腔注射MPTP溶液、姜黄素溶液和左旋多巴溶液，使MPTP的给药剂量为20mg/kg体重，使左旋多巴的给药剂量为10mg/kg体重，使姜黄素的给药剂量为1mg/kg体重；
左旋多巴/姜黄素双载药双靶头Protocells治疗组(MPTP+Protocells)：每只小鼠腹腔注射MPTP溶液和L-DOPA-Cur-Tat-Lf-Protocells溶液，使MPTP的给药剂量为20mg/kg体重，使左旋多巴的给药剂量为10mg/kg体重，使姜黄素的给药剂量为1mg/kg体重；
生理盐水组(Control)：腹腔注射与治疗组等体积的生理盐水。
3.小鼠自主活动行为学检测
制作24cm*24cm*10cm的敞口有机玻璃箱，箱底部划出6cm*6cm的格子，待小鼠腹腔注射后30min，在安静，光线较暗的环境中，计数5min内小鼠在有机玻璃箱中移动的格子数，重复计数5天。将各组小鼠每天移动格子的平均数进行累加，小鼠自主活动行为学检测及统计结果如图20所示。
小鼠自主活动行为学检测及统计结果表明，左旋多巴/姜黄素双载药双靶头Protocells治疗组对MPTP所诱导的小鼠行动迟缓的治疗效果优于游离药物治疗组(左旋多巴+姜黄素治疗组)：游离药物治疗组(左旋多巴+姜黄素治疗组)5天内对MPTP所诱导的小鼠行动迟缓没有缓解作用，左旋多巴/姜黄素双载药双靶头Protocells治疗组对MPTP所诱导的小鼠行动迟缓的缓解效果明显，该组每只小鼠5天内的移动格子数为162±31格，是MPTP组(每只小鼠5天内的移动格子数为107±30格)的1.51倍，是左旋多巴+姜黄素治疗组(每只小鼠5天内的移动格子数为101±48格)的1.60倍。
序列表
<110> 中国医学科学院医药生物技术研究所
<120> 脑靶向纳米制剂及左旋多巴和姜黄素在制备治疗帕金森病的药物中的应用
<130> GNCFH200655
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10

Claims (6)

1.脑靶向纳米制剂，是由脑靶向纳米载体和所述脑靶向纳米载体所装载的药物组成；所述脑靶向纳米载体的名称为CPPs-Lf-Protocells，所述CPPs-Lf-Protocells由外壳和所述外壳包覆的内核组成，所述外壳为修饰有生物分子的脂质双分子层，所述生物分子为细胞穿透肽和乳铁蛋白；所述内核为介孔二氧化硅纳米粒；
所述药物由脂溶性药物和水溶性药物组成；所述脂溶性药物由所述外壳装载，所述水溶性药物由所述内核装载；所述脂溶性药物的活性成分为姜黄素，所述水溶性药物的活性成分为左旋多巴；所述水溶性药物中的所述左旋多巴和所述脂溶性药物中的姜黄素的质量比为10:1。
2.根据权利要求1所述的脑靶向纳米制剂，其特征在于：所述细胞穿透肽为Tat，所述Tat是氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1的多肽。
3.根据权利要求1或2所述的脑靶向纳米制剂，其特征在于：所述介孔二氧化硅纳米粒具有下述1)至3）中的三种结构参数：
1）粒径为80-100nm；
2）孔径为6-10nm；
3）BET比表面积是500-600m2/g。
4.根据权利要求1或2所述的脑靶向纳米制剂，其特征在于：所述脑靶向纳米制剂为治疗帕金森病的脑靶向纳米制剂。
5.权利要求1-3中任一所述的脑靶向纳米制剂中所述的脑靶向纳米载体。
6.权利要求5所述的脑靶向纳米载体在制备治疗脑部疾病药物中的应用。
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