CN113456587B - 一种靶向乳腺癌干细胞的谷胱甘肽响应型纳米药物载体制备及应用 - Google Patents
一种靶向乳腺癌干细胞的谷胱甘肽响应型纳米药物载体制备及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113456587B CN113456587B CN202110638178.9A CN202110638178A CN113456587B CN 113456587 B CN113456587 B CN 113456587B CN 202110638178 A CN202110638178 A CN 202110638178A CN 113456587 B CN113456587 B CN 113456587B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hyaluronic acid
- cysteine
- drug carrier
- carrier
- water
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
- A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
- A61K31/26—Cyanate or isocyanate esters; Thiocyanate or isothiocyanate esters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/02—Inorganic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
- A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/14—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for lactation disorders, e.g. galactorrhoea
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
Abstract
本发明提出了一种靶向乳腺癌干细胞的谷胱甘肽响应型纳米药物载体制备及应用,具体地,本发明提出了一种药物载体,包括:疏水核心,所述疏水区包含十四烷基硫醇,亲水外壳,所述亲水区包含透明质酸和纳米磷酸钙;所述十四烷基硫醇与所述透明质酸通过半胱氨酸相连形成两亲性结合物。该药物载体具有合成步骤简单、稳定好、生物兼容性高、体内循环时间长、靶向性强和促进药物在靶点快速释放等诸多优点,极大地提高了癌干细胞的靶向治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域,具体地,本发明涉及靶向乳腺癌干细胞的谷胱甘肽响应型纳米药物载体制备及应用。
背景技术
乳腺癌是女性群体中高发的一种癌症,严重威胁人类身体健康。我国是乳癌发病率快速增加的国家之一。近几年,我国乳癌发病率以每年3%的速率递增,且发病年龄逐渐呈年轻化态势。化疗是乳腺癌治疗中的重要手段,在临床上取得较好的效果。但是随着化疗时间和化疗次数的增加,乳腺癌的侵袭性、转移性、耐药性及重发等问题成为当下亟待解决的问题。
研究认为乳腺癌干细胞是乳腺癌侵袭、转移、耐药和重发的根源,抑制乳腺癌干细胞能从根本上解决治疗乳腺癌的困境。乳腺癌干细胞具有多种类型的表面标识蛋白,其中CD44+/CD24-是当前公认的乳腺癌干细胞表型,所以靶向高表达CD44乳腺癌干细胞,成为治疗乳腺癌的重要方向,得到广泛关注。
目前靶向癌干细胞的药物载体较为空白,急需靶向药物载体的开发。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识做出的:
现有的纳米药物载体存在各种各样的问题,如缺乏对肿瘤微环境(微酸、高谷胱甘肽、低氧等)响应的基团,较难实现药物在靶点的快速释放,势必影响疗效,且大多合成步骤较为繁琐、反应条件要求高(如严格避光、隔绝氧气、加热等)、不够简便,能耗高,不利于规模化大生产。同时很多药物载体在稀释条件下,没有足够的稳定性,所以一旦注射入体内,经历了过量体液稀释后,容易失稳,导致药物的提前释放,失去靶向性,诱发药物副作用。基于上述问题的发现,发明人开发了一种合成方法简单,反应条件温和,可操作性强,载体胶束稳定性好,生物兼容性高、靶向性高多方面优势的药物载体。
在本发明的第一方面,本发明提出了一种药物载体。根据本发明的实施例,所述药物载体包括:疏水核心,所述疏水区包含十四烷基硫醇(TA),亲水外壳,所述亲水区包含透明质酸(HA)和磷酸钙(Ca3(PO4)2),所述十四烷基硫醇与所述透明质酸通过半胱氨酸(Cys)相连形成两亲性结合物(HA-SS-TA)。根据本发明实施例的药物载体分散性好、大小均匀、稳定性强、生物兼容性高,且载体表面的磷酸钙矿化层提高载体的稳定性和体内循环时间,又借助于透明质酸(HA)对CD44的特异识别性,靶向CD44高表达的细胞,特别是乳腺癌干细胞,同时利用磷酸钙的pH响应性、二硫键的谷胱甘肽响应性,实现包埋在该药物载体中的药物在癌干细胞内部释放。
根据本发明的实施例,上述药物载体进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述透明质酸与所述半胱氨酸通过酰胺键相连,所述酰胺键是由所述透明质酸上的羧基基团与所述半胱氨酸上的氨基基团缩合形成。
根据本发明的实施例,所述十四烷基硫醇与所述半胱氨酸通过二硫键(S-S)相连,所述二硫键是由所述半胱氨酸上的巯基基团与所述十四烷基硫醇上的巯基基团键合形成。
根据本发明的实施例,所述透明质酸中,每100个糖残基结合10-100个半胱氨酸。发明人发现,糖残基结合半胱氨酸的数量,会影响终产物中疏水性TA的多少。
根据本发明的实施例,所述透明质酸中,每100个糖残基结合3-60个十四烷基硫醇。
根据本发明的实施例,所述透明质酸的相对分子质量为4000-400000Da。发明人发现,透明质酸的分子量过大,构建的两亲性载体粒径过大,不利于提升载体在肿瘤位点的增强潴留和渗透效应。透明质酸的分子量过小,生成的载体粒径太小,容易被机体清除掉。
根据本发明的实施例,所述载体外层的纳米磷酸钙赋予了载体对肿瘤内部微酸pH的响应性。根据本发明实施例的药物载体表面的磷酸钙矿化层提高载体的稳定性和体内循环时间,又借助于透明质酸(HA)对CD44的特异识别性,靶向乳腺癌干细胞,同时利用磷酸钙的pH响应性、二硫键的谷胱甘肽响应性,实现包埋药物在癌干细胞内部释放。
根据本发明的实施例,所述两亲性结合物上的羧基基团对应1-30摩尔的钙离子。发明人发现,羧基基团对应的钙离子过高,可能导致矿化度过度,矿化层太厚,降低了载体的靶向性;羧基基团对应的钙离子过低,过低矿化效果不好,降低矿化效应带来的提高胶束稳定性的效果。
在本发明的第二方面,本发明还提出了一种制备药物载体的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:1)将透明质酸与半胱氨酸进行缩合反应,以便获得透明质酸-半胱氨酸结合物(HA-Cys);2)将所述透明质酸-半胱氨酸结合物与十四烷基硫醇进行氧化反应,以便获得两亲性结合物(HA-SS-TA);3)所述两亲性结合物进行自组装,以便获得胶束;4)向所述胶束中依次加入磷酸铵和可溶性钙盐,以便获得所述药物载体。根据本发明实施例的方法合成条件温和、步骤简单、可操作性强、副产物少,且成本较低,利于规模化生产。
根据本发明的实施例,上述药物载体进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述透明质酸预先进行羧基活化。羧基活化能提高缩合反应的效率。
根据本发明的实施例,所述羧基活化是在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在的条件下进行的。进而催化酰胺反应。
根据本发明的实施例,所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与所述N-N-羟基琥珀酰亚胺的物质的量比(摩尔比)为1:8-4:1。
根据本发明的实施例,所述透明质酸中的羧基与所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与和所述N-N-羟基琥珀酰亚胺摩尔比分别为1:10-5:1。
根据本发明的实施例,所述羧基活化是在水溶液中进行2-8小时。
根据本发明的实施例,所述透明质酸中的羧基与所述半氨酸摩尔比为1:4-4:1。
根据本发明的实施例,所述十四烷基硫醇与所述透明质酸中羧基的摩尔比1:10-20:1。
根据本发明的实施例,所述氧化脱水反应是在二甲亚砜和水(DMSO/H2O)的混合溶剂中进行的;进而提供DMSO(氧化剂),促进了氧化反应的发生。
根据本发明的实施例,所述二甲亚砜与所述水的体积比为1:8-9:1。进而DMSO溶液能够缓慢的诱导氧化发生。过浓或者过稀都影响氧化速率。
根据本发明的实施例,所述氧化脱水反应的氧化剂为双氧水。双氧水发挥氧化作用后,变为水,不引入新的杂质,便于对合成物质纯化。
根据本发明的实施例,所述氧化脱水反应是在室温下进行12-48小时。
根据本发明的实施例,所述氧化脱水反应后、获得两亲性结合物前进一步包括进行透析。
根据本发明的实施例,所述透析的顺序为二甲亚砜、二甲亚砜/水、水,所述二甲亚砜/水中二甲亚砜与水的体积比为1:8-9:1。根据本发明的具体实施例,透析是将反应产物装入孔径为3500Da的透析袋中,在过量的透析液中,于常温下进行透析。
根据本发明的实施例,所述透析的时间为12-72小时。
根据本发明的实施例,所述自组装是在超声条件下进行的。
根据本发明的实施例,所述超声的时间为5-25min,超声的功率为50-200w,超声温度为冰浴;。
根据本发明的实施例,所述可溶性钙盐为硝酸钙。
根据本发明的实施例,所述硝酸钙的浓度为0.05-0.5M。
根据本发明的实施例,所述磷酸铵的浓度为0.01-0.6M。
根据本发明的实施例,所述可溶性钙盐中钙离子与所述透明质酸羧基的摩尔比为1:10-10:1。
根据本发明的实施例,所述磷酸铵和可溶性钙盐添加的时间间隔为1-25分钟,添加次数为5-30次。进而通过少量多次添加,实现磷酸钙在胶束表面的纳米级非晶型生长。
在本发明的再一方面,本发明还提出了一种药物载体的制备方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:1)室温下,在透明质酸的水溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-N-羟基琥珀酰亚胺进行羧基活化,所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-N-羟基琥珀酰亚胺的量比为1:8-4:1;所述透明质酸中羧基与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比分别为1:10-5:1,所述羧基活化的时间为2-8h;2)向步骤1)中羧基活化后的溶液中加入半胱氨酸进行缩合反应,所述缩合反应的时为8-32小时,所述透明质酸中羧基与半氨酸摩尔比为1:10-8:1;3)将步骤2)中缩合反应后的产物进行第一透析、冷冻、干燥以便获得透明质酸-半胱氨酸结合物,任选地,所述第一透析是在蒸馏水中进行12-48h;4)将所述透明质酸-半胱氨酸结合物于二甲亚砜与水混合液中,所述二甲亚砜与水的体积比为1:8-9:1,加入十四烷基硫醇、双氧水,室温下反应12-48小时,所述十四烷基硫醇与透明质酸中羧基的摩尔比1:10-20:1;5)将步骤4)中得到的产物进行第二透析、冷冻、干燥,以便得到两亲性结合物,所述第二透析的次序为二甲亚砜,二甲亚砜/水(体积比为1:8-9:1)和水,所述二甲亚砜/水中二甲亚砜与水的体积比为1:8-9:1;所述第二透析时间为12-72h;6)将步骤5)中获得的产物在超声条件下,进行自组装,然后依次多次滴加磷酸铵和硝酸钙,以便获得所述药物载体,所述超声的时间为5-25min,超声的功率为50-200w,超声温度为冰浴,所述硝酸钙的浓度为0.05-0.5M,磷酸铵的浓度为0.01-0.6M,所述硝酸钙与透明质酸羧基的摩尔比为1:10-10:1,所述依次滴加之间的间隔时间为1-25min,多次的次数为5-30次。根据本发明实施例的方法合成条件温和、步骤简单、可操作性强、副产物少,且成本较低,利于规模化生产。
根据本发明的实施例,上述方法进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述自组装中进一步加入活性药物,以便使得活性药物包载在药物载体内部。
在本发明的再一方面,本发明还提出了前面所述的药物载体或根据前面所述的方法制备的药物载体在靶向CD44蛋白过表达的细胞中的用途。根据本发明的实施例的药物载体分散性好、大小均匀、稳定性强、生物兼容性高,且借助于透明质酸(HA)对CD44的特异识别性,能靶向于CD44过表达的细胞,特别是靶向乳腺癌干细胞。
根据本发明的实施例,上述用途进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,上述细胞为癌干细胞,优选为乳腺癌干细胞。
在本发明的再一方面,本发明还提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例所述活性药物包裹在前面所述的药物载体或根据前面所述的方法制备的药物载体中。
根据本发明的实施例,上述药物组合物进一步包括如下附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述活性药物选自疏水性化学药物。
根据本发明的实施例,所述活性药物选自萝卜硫素。
在本发明的再一方面,本发明还提出了制备药物组合物或药物载体载药的方法。根据本发明的实施例,1)将透明质酸与半胱氨酸进行缩合反应,以便获得透明质酸-半胱氨酸结合物;2)将所述透明质酸-半胱氨酸结合物与十四烷基硫醇进行氧化反应,以便获得两亲性结合物;3)所述两亲性结合物、活性药物进行自组装,以便获得胶束,所述活性药物包裹在所述胶束之间;4)向所述胶束中依次加入磷酸铵和可溶性钙盐,以便获得所述药物载体。各步骤的反应条件如前面所定义。
在本发明的再一方面,本发明还提出了制备负载萝卜硫素(SFN)纳米药物的方法。根据本发明的实施例,吸取萝卜硫素(SFN)与蒸馏水混合,然后加入纳米胶束HA-SS-TA溶液中,于冰浴条件下避光超声10min。完成后将混合液离心,去除多余的萝卜硫素,然后依次滴加低浓度的磷酸铵和硝酸钙,形成矿化载萝卜硫素纳米药物。
需要说明是,本发明中两亲性结合物合成时所描述的透明质酸中羧基与其他物质的摩尔比是指,透明质酸中含有的每一个羧酸基团对应多少摩尔的其他物质,例如透明质酸中含有100个羧基,描述透明质酸中的羧基与半氨酸的摩尔比为1:10,则意味着半胱氨酸的需要1000摩尔。矿化时,两亲性结合物上的羧基基团对应1-30摩尔的钙离子是指,例如,两亲性结合物上的透明质酸含有1个游离羧基(两亲性结合物上的游离羧基是合成两亲结合物时,没有反应的羧基),则钙离子对应1-30摩尔。
需要说明的是,本申请所述的“物质的量的比”即为“摩尔比”。
根据本发明的实施例,本发明的技术方案能产生如下有益效果的至少之一:
(1)本发明的药物载体结合物合成步骤只需要两步(缩合反应、氧化反应)即能完成,合成条件温和、步骤简单、可操作性强、副产物少。
(2)本发明的药物载体,具有分散性好、大小均匀、稳定性强、生物兼容性高。
(3)本发明利用载体表面的磷酸钙矿化层提高载体的稳定性和体内循环时间,又借助于透明质酸(HA)对CD44的特异识别性,靶向乳腺癌干细胞,同时利用磷酸钙的pH响应性、二硫键的谷胱甘肽响应性,实现包埋药物在癌干细胞内部释放。
(4)以萝卜硫素为强疏水性的代表药物,本发明制备的载体药物包埋率高,稳定强,对乳腺癌干细胞特性抑制效果好。
(5)本发明所涉及的仪器设备价格低廉、制备过程简单可控,而且实验试剂均较为常见,成本较低,利于规模化生产。
附图说明
图1是根据本发明实施例的HA-SS-TA结合物的合成路线;
图2是根据本发明实施例的M-HA-SS-TA纳米载体的制备路线;
图3是根据本发明实施例的Cys,HA,HA-Cys(A)和HA,HA-SS-TA,TA(B)1H-核磁谱图;
图4是根据本发明实施例的HA-SS-TA和M-HA-SS-TA的透射电镜图;
图5是根据本发明实施例的M-HA-SS-TA的体外稳定性评价;
图6是根据本发明实施例的M-HA-SS-TA的体外癌干细胞靶向性;
图7是根据本发明实施例的M-HA-SS-TA的体内癌干细胞靶向性;
图8是根据本发明实施例的M-HA-SS-TA的体内循环时间分析;
图9是根据本发明实施例的M-HA-SS-TA对肿瘤微环境响应高浓度GSH(A)和微酸pH(B)响应性;
图10是根据本发明实施例的M-HA-SS-TA的体外细胞兼容性(A)和血液兼容性(B)评估;
图11是根据本发明实施例的SFN/M-HA-SS-TA纳米药物对乳腺癌干细胞自我更新的抑制;
图12是根据本发明实施例的SFN/M-HA-SS-TA纳米药物对CD44+/CD24-乳腺癌干细胞比例的抑制;
图13是根据本发明实施例的SFN/M-HA-SS-TA纳米药物对乳腺癌干细胞特性相关蛋白表达的抑制;
图14是根据本发明实施例的SFN/M-HA-SS-TA纳米药物对体内肿瘤生长的抑制。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
实施例1HA-SS-TA两亲性物质的合成(图1)和M-HA-SS-TA载体的制备(图2)
HA-SS-TA两亲性物质的合成(图1)
(1)称取250mg透明质酸(HA)(含羧基0.66mmol)溶解于30mL蒸馏水中,加入1.32mmol的EDC和NHS,室温反应3h。然后加入10mL含有2.64mmol的L-半胱氨酸(Cys)溶液,反应12h,得到的反应物用去离子水透析24h,6h换一次水,透析孔径(3500Da),将透析物进行冷冻干燥得到透明质酸-半胱氨酸结合物(HA-Cys)。
(2)称取100mg HA-Cys,溶于50mL DMSO/H2O(6:4,V:V)混合液中,然后加入250mg十四烷基硫醇(TA)(1mmol),在搅拌条件下逐滴加入5mL 2mM的H2O2,室温反应24h,然后将反应物在DMSO、DMSO/H2O(1:1,V:V)透析24h,然后在去离子水中透析48h,透析物进行冷冻干燥,得到HA-SS-TA两亲性结合物。
M-HA-SS-TA载体的制备(图2)
(3)称取20mg HA-SS-TA两亲性结合物,溶于20mL蒸馏水中,重复混匀后,在冰浴条件下,超声(100w)处理10min,得到HA-SS-TA胶束。
(4)在制备的HA-SS-TA胶束溶液中加入0.29M的硝酸钙溶液,搅拌10min,然后再加入0.24M的磷酸铵溶液,搅拌10min,该过程至少10次来获得矿化的纳米药物载体M-HA-SS-TA。其中确保钙离子与羧基的物质的量比为0.5:1.
实施例2HA-SS-TA两亲性物质的合成(图1)和M-HA-SS-TA载体的制备(图2)
(1)称取250mg透明质酸(HA)溶解于30mL蒸馏水中,加入2.64mmol的EDC和NHS,室温反应6h。然后加入10mL含有5.28mmol的L-半胱氨酸(Cys)溶液,反应18h,得到的反应物用去离子水透析48h,6h换一次水,透析孔径(3500Da),将透析物进行冷冻干燥得到透明质酸-半胱氨酸结合物(HA-Cys)。
(2)称取100mg HA-Cys,溶于50mL DMSO/H2O(8:2,V:V)混合液中,然后加入575mg十四烷基硫醇(TA),在搅拌调节下逐滴加入5mL 2mM的H2O2,室温反应48h,然后将反应物在DMSO、DMSO/H2O(8:2,V:V)透析24h,然后在去离子水中透析36h,透析物进行冷冻干燥,得到HA-SS-TA两亲性结合物。
M-HA-SS-TA载体的制备(图2)
(3)称取20mg HA-SS-TA两亲性结合物,溶于20mL蒸馏水中,充分混匀后,在冰浴条件下,超声(200w)处理20min,得到HA-SS-TA胶束。
(4)在制备的HA-SS-TA胶束溶液中加入0.5M的硝酸钙溶液,搅拌15min,然后再加入0.6M的磷酸铵溶液,搅拌15min,该过程重复12次来获得矿化的纳米药物载体M-HA-SS-TA。其中确保钙离子与羧基的物质的量比为1:1。
实施例3HA-SS-TA两亲性物质的合成(图1)和M-HA-SS-TA载体的制备(图2)
(1)称取250mg透明质酸(HA)溶解于30mL蒸馏水中,加入0.66mmol的EDC和NHS,室温反应2h。然后加入10mL含有0.66mmol的L-半胱氨酸(Cys)溶液,反应24h,得到的反应物用去离子水透析48h,6h换一次水,透析孔径(3500Da),将透析物进行冷冻干燥得到透明质酸-半胱氨酸结合物(HA-Cys)。
(2)称取100mg HA-Cys,溶于50mL DMSO/H2O(4:6,V:V)混合液中,然后加入143.75mg十四烷基硫醇(TA),在搅拌调节下逐滴加入5mL 2mM的H2O2,室温反应36h,然后将反应物在DMSO、DMSO/H2O(6:4,V:V)透析24h,然后在去离子水中透析24h,透析物进行冷冻干燥,得到HA-SS-TA两亲性结合物。
M-HA-SS-TA载体的制备(图2)
(3)称取20mg HA-SS-TA两亲性结合物,溶于20mL蒸馏水中,充分混匀后,在冰浴条件下,超声(50w)处理25min,得到HA-SS-TA胶束。
(4)在制备的HA-SS-TA胶束溶液中加入0.15M的硝酸钙溶液,搅拌15min,然后再加入0.12M的磷酸铵溶液,搅拌15min,该过程重复12次来获得矿化的纳米药物载体M-HA-SS-TA。其中确保钙离子与羧基的物质的量比为2:1。
对制备的M-HA-SS-TA进行表征研究
(1)对两亲性结合物HA-SS-TA及主要合成原料进行1H-核磁氢谱表征
实验结果表明,在两亲性结合物HA-SS-TA的1H-核磁氢谱中存在HA的特征质子峰(δ=1.93ppm,[3H,-COCH3-])和TA的特征质子峰(δ=0.88ppm,[3H,-CH3-]),说明HA-SS-TA合成成功(图3)。
(2)构建的纳米载体透射电镜图
实验结果表明,在矿化处理前,自主装形成的载体胶束HA-SS-TA呈现规则的球状,大小均匀,在矿化后,纳米载体表明呈现矿化斑点,成了粒径更小的纳米球,说明矿化后形成了更为紧致的纳米载体胶束,利用稳定其结构(图4)。
(3)对制备的载体进行体外稳定性分析
模拟正常体液环境(pH 7.4)将制备载体装载于稳定性分析仪中,连续监测72h,通过观察装载体玻璃仪器底端到顶端透光率的变化表征载体的稳定性。
实验结果表明,构建的M-HA-SS-TA纳米药物载体在实验周期内,玻璃仪器低端到顶端透光率保持一致,无明显波动,说明载体胶束没有出现下沉和上浮等不稳定现象,具有较好的稳定性,72h内能够保持其完整结构,在理论上能够保证包埋的药物不会因为失稳而提前释放(图5)。
(4)对制备的M-HA-SS-TA进行体外靶向性研究
以尼罗红为荧光探针,包埋于制备的纳米载体中得到载尼罗红的纳米颗粒,其中尼罗红的药量为0.3%。实验分为如下几组:(1)MDA-MB-231组(高表达CD44)(2)HA+MDA-231组(添加HA,竞争结合细胞表面的CD44)。各组细胞接种于6孔板中,在DMEM高糖+10%FBS培养,当细胞聚合度为70%时开始实验。首先配制含有载尼罗红的纳米颗粒的培养基(其中尼罗红的含量为200ng/mL),然后用新配置的该培养基换掉各组6孔板中的旧培养基,于37℃的二氧化碳培养箱中孵育8h(其中为了验证细胞是通过HA的受体介导的内吞作用吸收纳米载体,HA+MDA-231组中提前2h加入终浓度为10mg/mL HA,为细胞表面的CD44蛋白提供饱和的HA底物),然后用PBS清洗细胞3次,加入胰酶消化收集细胞,最后用在488/530nm波长处,用流式检测各组细胞的荧光强度。
实验结果表明,与对照组比较,添加了载尼罗红纳米颗粒组(Nile red/M-HA-SS-TA)胞内荧光强度显著提高,说明该纳米载体能够进入细胞内部。同时发现当用HA提前处理细胞之后再加入Nile red/M-HA-SS-TA纳米颗粒,尽管处理相同时间,该组胞内荧光强度显著低于Nile red/M-HA-SS-TA组。由于提前加入的HA优先与细胞表面的CD44蛋白结合,饱和了细胞表面的CD44蛋白,再加入纳米颗粒后,由于失去了CD44的特异性吸附和介导,载体难进入细胞内部,说明纳米载体进入细胞内部是借助于CD44介导的对载体表面HA特异吸附和细胞内吞效应,证明了该纳米载体对高表达CD44乳腺癌干细胞具有较好的靶向性(图6)。
(5)对制备的M-HA-SS-TA进行体内肿瘤靶向性和体内循环时间研究
用疏水性的Cy7近红外染料替代药物,包埋于M-HA-SS-TA载药系统中(载药量为0.5%)。以荷载MDA-MB-231细胞异体移植乳腺肿瘤的Balb/c裸鼠为实验对象,将该纳米胶束以5mg/kg的剂量通过静脉注射对实验动物给药。注射6h,24h后,用近红外生物呈相系统拍摄照片。以荧光光强度为指标,考察纳米载药系统释放的药物在生物体内情况。
利用Cy7为近红外光谱染料探针,分别以HA-SS-TA和M-HA-SS-TA为载体,超声制备包埋Cy7的纳米胶束(载药量为0.5%)。将该纳米胶束以5mg/kg的剂量,通过尾部注入小鼠体内。并于注射后15min、1h、2h、4h、8h、12h和24h取血检测,在645nm处检测其荧光强度,与注射15min后血清的荧光强度比较,荧光强度下降50%的时间点为载体在体内的半衰期。实验结果表明,构建的纳米药物载体M-HA-SS-TA在注射体内6h后,能够靶向分布于肿瘤组织,并且在注射的24时内,靶向效果逐步提高(图7)。由于构建异体移植瘤模型选用的是高表达CD44的MDA-MB-231细胞,因此构建出的肿瘤同样高表达CD44,并呈现高度炎症微环境。HA能够靶向CD44,所以纳米载体能够直接靶向生成的肿瘤,并通过CD44介导的内吞效应进入肿瘤细胞内部,最终释放出包埋在内部的Cy7染料。此外,纳米载体的体内循环时间结果见图8。两种纳米载体在体内循环中的稳定性存在差异,且其稳定性随着时间的延长均呈现不同程度下降。其中HA-SS-TA的半衰期(相对荧光强度下降为50%)出现在8h左右,而M-HA-SS-TA的半衰期超过24h,说明M-HA-SS-TA的稳定性显著高于HA-SS-TA,表明矿化处理能够提高纳米载体的结构稳定性。
(6)对制备的M-HA-SS-TA进行肿瘤微环境响应研究
在体外模拟肿瘤微环境中高GSH环境,评价纳米载体对GSH的响应性。取5mL制备的纳米载体溶液,调整浓度至1mg/mL,加入GSH,使得溶液中GSH的浓度分别为0μM、10μM、10mM和20mM,将混合溶液置于37℃恒温摇床中,摇床速度为120rpm,持续孵育24h,在既定时间点(0h,1h,2h,3h,4h,5h,7h,12h和24h)取样检测纳米胶束粒径变化,以此表征载体对GSH的响应性。
在体外模拟肿瘤内部微酸环境,评价纳米载体对pH的响应性。取5mL制备的纳米载体溶液,调整浓度至1mg/mL,转移至透析袋中(MWCO 3500Da)。然后利用恒温摇床(37℃,100rpm)分别在pH 5、6.5和pH 7.4透析液中透析,于不同时间点(0h,1h,2h,3h,4h,5h,7h,8h和12h)取样检测纳米胶束粒径变化,以此表征载体对pH的响应性。
实验结果表明(图9中A),与对照组(GSH浓度为0μM)比较,当载体胶束置于正常体液(GSH浓度为10μM)时,载体胶束的粒径与对照组无显著差异(p>0.05),说明该胶束在正常体液环境下稳定。当载体置于模拟肿瘤微环境(GSH浓度分别为10mM和20mM)的体系时,发现载体胶束稳定较差,其中在前5-7h内载体胶束的粒径显著增加,且增加幅度较大;7h后粒径增幅减缓。24h后模拟肿瘤微环境组载体粒径显著高于正常组和对照组(p<0.01)。由此说明载体胶束对肿瘤内部的高还原环境(即GSH浓度较高时)具有明显响应性,有利于包埋药物在肿瘤内的靶向释放。
此外,如图9中B所示,在正常体液环境(pH 7.4)下,M-HA-SS-TA纳米载体胶束粒径无显著变化;在肿瘤微酸环境(pH 6.5和5)下,M-HA-SS-TA纳米载体胶束粒径出现显著增加,其中在pH 6.5组,6h内载体胶束粒径显著增加至181±2.31nm,与非矿化的载体胶束粒径相当,而在pH 5组载体对pH的响应性更为明显,4h内达到相同的效果,最终肿瘤微酸环境(pH 6.5和5)组载体胶束粒径显著高于正常体液组(pH 7.4)(p<0.01),由此说明M-HA-SS-TA纳米载体,对肿瘤微酸环境具有明显响应性,但在正常体液中保持稳定,有利于药物在肿瘤靶点的释放。
(7)对制备的M-HA-SS-TA进行体外细胞兼容性和血液兼容性评估
a、将MCF10A细胞以5000个/孔的密度接种于96孔板中,在恒温和饱和湿度的细胞培养箱中(37℃、5%CO2)培养24h,然后在各孔中分别加入不同浓度的HA-SS-TA载体胶束,分别于24h,48h和72h收获各组细胞。然后每孔加入10μL CCK8试剂,37℃孵育4h,然后利用多功能酶标仪于450nm处检测各孔吸光值,依照下列公式计算细胞的活力:
细胞活力(%)=(处理组吸光值/对照组吸光值)×100
注:处理组为添加了载体胶束的细胞;对照组为没有添加载体胶束的细胞。
b、
取250μL配置好的不同浓度载体胶束溶液于24孔板中,然后在各孔中分别加入250μL红细胞悬液,在37℃孵育2h后吸出混合溶液,于1000g离心5min,收集200μL上清液至96孔板中,利用酶标仪于545nm处检测吸光值。实验中以生理盐水作为阴性对照,以蒸馏水作为阳性对照,依照下列公式进行溶血率的计算:
溶血率(%)=(载体胶束组吸光值-阴性对照组吸光值)/(阳性对照组吸光值-阴性对照组吸光值)×100
实验结果表明,经过M-HA-SS-TA纳米载体处理后,MCF10A的活性无显著变化,其中以最高浓度1mg/mL处理72h,细胞的活力依然达到88%以上,其它浓度下细胞活力都在90%以上,由此说明M-HA-SS-TA纳米载体对正常乳腺细胞MCF10A活力基本无影响(图10中A)。由图10中B可知,随着载体浓度提高,该纳米载体的溶血率呈现上升趋势,但最终各浓度下载体的溶血率均低于5%。依照国家标准,溶血率低于5%,说明载体材料的血液相容性良好,无溶血毒性,能够安全用于药物的载体。
实施例4SFN/M-HA-SS-TA抑制乳腺癌干细胞特性实验
(1)SFN/M-HA-SS-T抑制乳腺癌干细胞自我更新研究
将乳腺癌细胞MDA-MB-231以细胞密度为2000个/孔接种于超低粘附六孔板中,培养基为添加了20ng/mL EGF,20ng/mL bFGF,5μg/mL胰岛素和2%B27无血清的DMEM/F-12培养基。24h后对向各组分别加入PBS(pH 7.4),阳性药物(Vismodegib),空载体M-HA-SS-TA,SFN(10μM)和SFN/M-HA-SS-TA纳米药物(SFN 10μM),继续培养7d后,在显微镜下观察各组乳腺微球形成大小和数量。
实验结果表明,与对照组比较(PBS组),SFN和SFN/M-HA-SS-TA纳米药物能显著抑制乳腺微球的形成数量和乳腺微球的大小,并且SFN/M-HA-SS-TA纳米药物的作用效果更强,但空载体组对乳腺微球形成基本无影响。同时与靶向癌干细胞的阳性药物Vismodegib比较,纳米药物对乳腺微球形成的抑制效应与其相当。由此说明SFN能够抑制乳腺癌干细胞的自我更新,而且在M-HA-SS-TA纳米载体包埋后,显著提高SFN对乳腺癌干细胞的抑制效应(图11)。
(2)SFN/M-HA-SS-T抑制乳腺癌干细胞比例研究
将MDA-MB-231细胞接种于6孔板中,24h后各组分别加入PBS(pH 7.4),阳性药物(Vismodegib),空载体M-HA-SS-TA,SFN(10μM)和SFN/M-HA-SS-TA纳米药物(SFN 10μM),处理48h后,收集细胞,用FITC-CD44和PE-CD24荧光染色后,采用流式细胞仪分析各组中呈现CD44+/CD24-表型乳腺癌干细胞比例。
实验结果表明,与对照组比较(PBS组),SFN和SFN/M-HA-SS-TA纳米药物均能显著降低MDA-MB-231细胞中乳腺癌干细胞的比例,并且SFN/M-HA-SS-TA纳米药物的作用效果更强,但空载体组对乳腺微球形成基本无影响。同时与靶向癌干细胞的阳性药物Vismodegib比较,纳米药物的抑制效果更好。由此说明SFN能够有效下调乳腺癌干细胞的比例,通过M-HA-SS-TA纳米载体包埋可以显著提高SFN对乳腺癌干细胞比例的下调效应(图12)。
(2)SFN/M-HA-SS-T抑制乳腺癌干细胞特性相关蛋白表达的研究
将MDA-MB-231细胞接种于6孔板中,用DMEM完全培养基培养24h后,分别加入PBS(pH 7.4),空载体M-HA-SS-TA,SFN(10μM)和SFN/M-HA-SS-TA纳米药物(SFN 10μM),处理48h后,收获细胞蛋白,然后利用western-blot检测乳腺癌干细胞特性相关蛋白(CD133,CD44,Bmi1)的表达。
实验结果表明,与对照组比较(PBS组),SFN和SFN/M-HA-SS-TA纳米药物能显著抑制CD133,CD44和Bmi1蛋白的表达,但空载体组对这些蛋白的表达基本无影响,由此说明SFN能够抑制乳腺癌干细胞特性相关蛋白的表达,而且在M-HA-SS-TA纳米载体包埋后,显著提高SFN对乳腺癌干细胞的抑制效应(图13)。
(3)SFN/M-HA-SS-T抑制体内肿瘤生长的研究
选用5周龄、体重16g的Balb/c裸鼠,无菌注射器吸取100-200μL细胞悬液(细胞量为5×106个),轻轻注入裸鼠腋窝下。当肿瘤体积达到50mm3时,对裸鼠进行分组。分别为对照组(0.9%NaCl溶液)、空载体组(M-HA-SS-TA)、萝卜硫素组(SFN)、载萝卜硫素纳米药物组(SFN/M-HA-SS-TA),依照50mg/kg/d的剂量,通过尾部静脉注射给药,2d一次。连续干预3周,期间正常饮食饮水,实验终点,通过脱颈椎杀死老鼠。剥除各组老鼠肿瘤,称重、拍照。
实验结果表明,与对照组比较,药物干预组肿瘤的生长得到显著抑制,其中纳米药物SFN/M-HA-SS-TA组的效果更为明显,说明通过包埋后提高了SFN的抑癌效果。同时发现,空载组与对照组肿瘤大小无显著差异,进一步说明载体对SFN药效的提升作用依赖于其对癌干细胞的靶向性(图14)。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (37)
1.一种药物载体,其特征在于,包括:
疏水核心,所述疏水区包含十四烷基硫醇,
亲水外壳,所述亲水区包含透明质酸和纳米磷酸钙,所述纳米磷酸钙由钙离子和磷酸根结合生成;
所述十四烷基硫醇与所述透明质酸通过半胱氨酸相连形成两亲性结合物,所述钙离子物质的量为两亲性结合物上的游离羧基基团1-30倍;
所述药物载体通过下述方法制备获得,包括
1)将透明质酸与半胱氨酸进行缩合反应,以便获得透明质酸-半胱氨酸结合物;
2)将所述透明质酸-半胱氨酸结合物与十四烷基硫醇进行氧化脱水反应,以便获得两亲性结合物;
3)所述两亲性结合物进行自组装,以便获得胶束;
4)向所述胶束中依次加入磷酸铵和可溶性钙盐,以便获得所述药物载体。
2.根据权利要求1所述的药物载体,其特征在于,所述透明质酸与所述半胱氨酸通过酰胺键相连。
3.根据权利要求1所述的药物载体,其特征在于,所述十四烷基硫醇与所述半胱氨酸通过二硫键相连。
4.根据权利要求1所述的药物载体,其特征在于,所述透明质酸中,每100个糖残基结合10-100个半胱氨酸。
5.根据权利要求1所述的药物载体,其特征在于,所述透明质酸中,每100个糖残基结合3-60个十四烷基硫醇。
6.根据权利要求1所述的药物载体,其特征在于,所述透明质酸的相对分子质量为4000-400000Da。
7.一种制备药物载体的方法,其特征在于,包括
1)将透明质酸与半胱氨酸进行缩合反应,以便获得透明质酸-半胱氨酸结合物;
2)将所述透明质酸-半胱氨酸结合物与十四烷基硫醇进行氧化脱水反应,以便获得两亲性结合物;
3)所述两亲性结合物进行自组装,以便获得胶束;
4)向所述胶束中依次加入磷酸铵和可溶性钙盐,以便获得所述药物载体。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述透明质酸预先进行羧基活化。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述羧基活化是在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺存在的条件下进行的。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与所述N-羟基琥珀酰亚胺的物质的量的比为1:8-4:1。
11.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述透明质酸中的羧基与所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:10-5:1。
12.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述透明质酸中的羧基与所述N-羟基琥珀酰亚胺摩尔比为1:10-5:1。
13.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述羧基活化是在水溶液中进行2-8小时。
14.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述透明质酸中的羧基与所述半胱氨酸摩尔比为1:4-4:1。
15.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述十四烷基硫醇与所述透明质酸中羧基的摩尔比1:10-20:1。
16.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述氧化脱水反应是在二甲亚砜和水的混合溶剂中进行的。
17.根据权利要求16所述的方法,其特征在于,所述二甲亚砜与所述水的体积比为1:8-9:1。
18.根据权利要求16所述的方法,其特征在于,所述氧化脱水反应的氧化剂为双氧水。
19.根据权利要求16所述的方法,其特征在于,所述氧化脱水反应是在室温下进行12-48小时。
20.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述氧化脱水反应后、获得两亲性结合物前进一步包括进行透析。
21.根据权利要求20所述的方法,其特征在于,所述透析的顺序为二甲亚砜、二甲亚砜/水、水,所述二甲亚砜/水中二甲亚砜与水的体积比为1:8-9:1。
22.根据权利要求20所述的方法,其特征在于,所述透析的时间为12-72小时。
23.根据权利要求20所述的方法,其特征在于,在二甲亚砜中透析12-24 h,在二甲亚砜/水中透析24-48 h,在蒸馏水中透析12-24 h。
24.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述自组装是在超声条件下进行的。
25.根据权利要求24所述的方法,其特征在于,所述超声的时间为5-25 min,超声的功率为50-200 w,超声温度为冰浴。
26.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述可溶性钙盐为硝酸钙。
27.根据权利要求26所述的方法,其特征在于,所述硝酸钙的浓度为0.05-0.5 M。
28.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述磷酸铵的浓度为0.01-0.6 M。
29.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述磷酸根与钙离子的物质的量比为3:2。
30.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述可溶性钙盐中钙离子与所述透明质酸羧基的摩尔比为1:10-10:1。
31.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述磷酸铵和可溶性钙盐添加的时间间隔为1-25分钟,添加次数为5-30次。
32.一种药物载体的制备方法,其特征在于,
1)室温下,在透明质酸的水溶液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺进行羧基活化,所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的量比为1:8-4:1;所述透明质酸中羧基与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:10-5:1,所述羧基活化的时间为2-8 h;
2)向步骤1)中羧基活化后的溶液中加入半胱氨酸进行缩合反应,所述缩合反应的时间为8-32小时,所述透明质酸中羧基与半胱氨酸摩尔比为1:4-4:1;
3)将步骤2)中缩合反应后的产物进行第一透析、冷冻、干燥以便获得透明质酸-半胱氨酸结合物;
4)将所述透明质酸-半胱氨酸结合物于二甲亚砜与水混合液中,所述二甲亚砜与水的体积比为1:8-9:1,加入十四烷基硫醇、双氧水,室温下反应12-48小时,所述十四烷基硫醇与透明质酸中羧基的摩尔比1:10-20:1;
5)将步骤4)中得到的产物进行第二透析、冷冻、干燥,以便得到两亲性结合物,所述第二透析的次序为二甲亚砜,二甲亚砜/水和水,所述二甲亚砜/水中二甲亚砜与水的体积比为1:8-9:1;所述第二透析时间为12-72h;
6)将步骤5)中获得的产物在超声条件下,进行自组装,然后依次多次滴加磷酸铵和硝酸钙,以便获得所述药物载体,所述超声的时间为5-25 min,超声的功率为50-200 w,超声温度为冰浴,所述硝酸钙的浓度为0.05-0.5 M,磷酸铵的浓度为0.01-0.6 M,所述硝酸钙与透明质酸羧基的摩尔比为1:10-10:1,所述依次滴加之间的间隔时间为1-25 min,多次的次数为5-30次。
33.根据权利要求32所述的方法,其特征在于,所述第一透析是在蒸馏水中进行12-48h。
34.权利要求1-6中任一项所述的药物载体或根据权利要求7-33任一项所述的方法制备的药物载体在制备靶向CD44蛋白过表达细胞的载体的用途。
35.一种药物组合物,其特征在于,活性药物包裹在权利要求1-6中任一项所述的药物载体或根据权利要求7-33任一项所述的方法制备的药物载体中。
36.根据权利要求35所述的药物组合物,所述活性药物选自疏水性化学药物。
37.根据权利要求35所述的药物组合物,其特征在于,所述活性药物选自萝卜硫素。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110638178.9A CN113456587B (zh) | 2021-06-08 | 2021-06-08 | 一种靶向乳腺癌干细胞的谷胱甘肽响应型纳米药物载体制备及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110638178.9A CN113456587B (zh) | 2021-06-08 | 2021-06-08 | 一种靶向乳腺癌干细胞的谷胱甘肽响应型纳米药物载体制备及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113456587A CN113456587A (zh) | 2021-10-01 |
CN113456587B true CN113456587B (zh) | 2022-10-04 |
Family
ID=77869402
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110638178.9A Active CN113456587B (zh) | 2021-06-08 | 2021-06-08 | 一种靶向乳腺癌干细胞的谷胱甘肽响应型纳米药物载体制备及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113456587B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115919766B (zh) * | 2022-12-27 | 2023-10-24 | 国科宁波生命与健康产业研究院 | 一种复合纳米胶束及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006098415A1 (ja) * | 2005-03-16 | 2006-09-21 | Oxygenix Co., Ltd. | 薬物運搬体 |
US11638717B2 (en) * | 2017-03-29 | 2023-05-02 | Shionogi & Co., Ltd. | Complex of nucleic acid medicine and multibranched lipid |
-
2021
- 2021-06-08 CN CN202110638178.9A patent/CN113456587B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113456587A (zh) | 2021-10-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111265533A (zh) | 一种基于脂质膜和金属有机框架的核壳纳米颗粒的制备方法 | |
CN110408047B (zh) | 纳米配位聚合物及其制备方法和应用 | |
CN106074451B (zh) | 含碳纳米笼的还原刺激响应药物载体及制备方法和应用 | |
CN113559064B (zh) | 一种新型自供氧脂质体纳米粒及其制备方法与应用 | |
CN111135296A (zh) | 一种白蛋白结合型吲哚菁绿抗肿瘤光热制剂及其制备方法 | |
Yin et al. | Hypoxia-alleviated sonodynamic therapy based on a hybrid protein oxygen carrier to enhance tumor inhibition | |
KR100943923B1 (ko) | 킬레이팅 유기 고분자와 생물학적 금속으로 이루어진 나노입자, 그리고 epr 효과를 이용한 새로운 광범위 무독성항암제 및 그 제조 방법 | |
CN103446588B (zh) | 靶向型诊疗联用药物及其制备方法和应用 | |
CN113456587B (zh) | 一种靶向乳腺癌干细胞的谷胱甘肽响应型纳米药物载体制备及应用 | |
CN104208704B (zh) | 一种pH敏感的碳纳米管靶向递药体系的制备方法 | |
CN109200021B (zh) | 一种溶酶体靶向的pH敏感性纳米粒及其制备方法与应用 | |
CN111450252B (zh) | 一种用于靶向堵塞肿瘤血管的药物及其制备方法与应用 | |
CN110917349B (zh) | 一种碗状isp复合功能性纳米粒子及其制备方法和应用 | |
CN115192708B (zh) | 负载抗肿瘤药物的纳米复合材料、纳米载药体系及制备与应用 | |
CN110251672B (zh) | 一种纳米诊疗剂及其制备方法与应用 | |
CN114437357B (zh) | 一种分级释药的肿瘤高渗透聚合物及其制备方法与应用 | |
CN105037739A (zh) | 具有精氨酸穿膜作用的还原敏感型聚合物及其制备方法与应用 | |
CN112426537A (zh) | 一种多肽纳米胶束及其制备方法和应用 | |
CN115093573B (zh) | 钽锆双金属有机框架材料及制备方法和应用 | |
CN115089726B (zh) | 一种肿瘤靶向诊疗探针及其制备方法和应用 | |
CN117085147B (zh) | 一种负载阿霉素的碳基给药系统及其制备方法和应用 | |
CN117045604B (zh) | 一种用于光动力学疗法的肿瘤靶向脂质体、制备方法及其应用 | |
CN116077684A (zh) | 一种组装纳米颗粒PM-HMSN/Arg及制备方法及应用 | |
CN117442749A (zh) | 一种rvg15肽修饰的脑靶向性金属有机框架药物载体及其制备方法和应用 | |
Wang et al. | Study on Multifunctional MOF Nano Drugs Toxicity for Targeted Diagnosis and Treatment of Colorectal Cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |