KR100943923B1

KR100943923B1 - 킬레이팅 유기 고분자와 생물학적 금속으로 이루어진 나노입자, 그리고 ｅｐｒ 효과를 이용한 새로운 광범위 무독성항암제 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR100943923B1
Application number: KR1020060024629A
Authority: KR
Inventors: 홍순해; 정진혁
Original assignee: 홍순해; 정진혁
Priority date: 2006-03-17
Filing date: 2006-03-17
Publication date: 2010-02-24
Also published as: WO2007108618A1; KR20070094235A

Abstract

본 발명은 킬레이팅 유기 고분자와 생물학적 금속으로 이루어진 나노 입자, 그리고 EPR 효과를 이용한 새로운 광범위 무독성 항암제 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 금속 킬레이팅(multidentate metal chelating) 유기 고분자와 적어도 하나 이상의 금속으로 이루어지고, EPR(Enhanced Permeation and Retention) 효과를 통하여 항암 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 수용성 유기 금속 나노입자(organometallic nanoparticle)에 대한 것이다.

EPR 효과, 암, 항암, 산화스트레스, 고분자, 금속, B16F10 melanoma, C57BL

Description

킬레이팅 유기 고분자와 생물학적 금속으로 이루어진 나노 입자, 그리고 ＥＰＲ 효과를 이용한 새로운 광범위 무독성 항암제 및 그 제조 방법 {Composition and methods regarding the design and development of non-toxic and global anticancer drug that is achieved through organometallic nanoparticles with biologically active matals and enhanced permeation and retention effect}

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 입자의 크기 분포를 DLS를 이용하여 측정한 그래프이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 입자의 TEM 이미지이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 입자의 고해상도 TEM 이미지이다

도 4는 EDTA 처리를 하지 않은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 입자를 XRDF를 이용하여 무기원소 정성 분석한 그래프이다.

도 5는 EDTA 처리를 한 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 입자를 XRDF를 이용하여 무기원소 정성 분석한 그래프이다.

도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 입자로 처리한 B16/F10 멜라노마(melanoma) 세포의 상대적 생존율을 도시한 그래프이다.

도 7은 투석한 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 입자로 처리한 B16/F10 멜라노마(melanoma) 세포의 상대적 생존율을 도시한 그래프이다.

도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 입자를 경구섭취한 C₅₇BL 쥐에서의 항암 효과를 보여주는 사진이다.

도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 입자를 경구섭취한 C₅₇BL 쥐에서의 몸무게 증가 및 암세포 증가를 보여주는 그래프이다.

도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노 입자를 패시브(passive)하게 지속적으로 섭취한 C₅₇BL 쥐에서의 항암 효과를 보여주는 사진이다.

도 11은 피하이식모델에서 OFeCa-1의 주사하지 않은 C₅₇BL 쥐에서의 암 성장을 보여주는 사진이다.

도 12는 피하이식모델에서 OFeCa-1의 직접주사한 C₅₇BL 쥐에서의 항암 효과를 보여주는 사진이다.

현대사회에서 암은 세계 제 3대 사인 중의 하나로서 비정상세포의 무한정한 증식으로 정의되는 질병이다. 암은 뇌, 장, 위, 간, 폐, 피부 등을 비롯한 다양한 부위에서 여러 가지 유형으로 발명하며 많은 경우 고통을 유발하고, 종국에는 죽음을 초래하게 되는데 현재에는 조기 진단과 조기수술만이 낮은 확률이지만 치료의 유일한 방법으로 알려져 있다.

현재 이러한 암을 치료하려는 목적에서 많은 약들이 개발되었고, 또 지금도 개발되고 있는 중이지만 많은 경우 강한 독성 및 부작용, 한정적인 대상 또는 빠른 내성의 발현 등으로 인해 약물 치료만을 이용한 비 침습적인 치료는 불가능 하다는 것이 정설이다. 또한, 방사선 치료 및 수술과 함께 병행되다 하더라도 초기를 지난 경우 짧은 생명연장효과 이상을 기대하는 것은 어려운 것이 현실이다 (Hayman et al., "Cost-effectiveness of routine radiation therapy following conservative surgery for early-stage breast cancer", J Clin Oncol 16, 1022-9 (1998)).

더군다나 이미 많은 경우 암의 발병률이 나이와 환경 공해의 정도에 비례하여 기하급수적으로 증가한다는 연구결과를 살펴 볼 때에 개도국 및 선진국에서의 급속한 환경오염과 노령화 현상은 더 많은 수의 사람들이 이 질병의 위험에 노출될 것임을 의미한다 (Katanoda et al., "International Comparisons of Cumulative Risk of All-Site Cancer from Cancer Incidence in Five Continents Vol. VIII.", Jpn J Clin Oncol 36, 66-8 (2006)).

기존의 항암/치료제는 cytotoxin(세포독), enzyme inhibitor(항효소제), 그리고 호르몬 및 탄수화물 등을 포함하는 signal transducer(신호제) 등 대략 3 가지로 구분이 된다. 그러나 이러한 기존의 접근 방법은 강한 독성, 부작용, 한정된 대상과 빠른 내성의 출현, 그리고 마지막으로 암세포에 대한 선택적인 작용에 심각한 한계점을 보이는 관계로 그 사용이 제한적일 수 밖에 없었다. 이러한 문제점을 극복하고자 그동안 과학계에서는 효과적인 전달체에 관한 연구를 많이 해왔는데, 최근의 나노기술의 발전은 이러한 문제에 해답을 제시하였다.

보통 체내 세포는 10 내지 20 마이크로미터 단위이므로 나노 스케일의 항암제들은 세포의 기능이나 생체학적 특성들을 유지시키면서도 쉽게 세포 표면 및 세포 내의 생체분자와 비 침습적으로 상호 작용할 수 있다. 이러한 나노기술을 이용한 암세포에 대한 약물 표적화(targeting)는 직접적인 방법(active targeting)과 수동적인 방법(passive targeting) 두 가지 유형으로 적용이 가능하다.

먼저, 적극적인 약물 표적화는 종양, 개별적인 암 세포, 세포 내 세포기관, 또는 암 세포 내의 특이적인 분자 등과 직접적으로 작용하는 표적 그룹들을 나노입자에 접합시키고, 동시에 이 나노입자에 항암작용을 일으킬 수 있는 물질 역시 접합시킴으로서 암세포에 선택적인 항암요소를 전달하는 방식이다. 이와 같이 준비된 나노입자들은 일반 세포에는 크기 적인 요소로 인하여 쉽게 침투하기 어렵기 때문에 일반 세포에는 영향을 미칠 확률이 낮다는 점이 장점이다. 이와 같은 방법의 예로서 적극적 방법은 렉틴과 탄수화물(carbohydrate), 리간드와 수용체 및 항체와 항원과 같은 특이적인 상호 작용 반응에 기반을 두고 있다 (Farhan J. Ahmad, et al., "Nanotechnology:A Revolution in the making", The Pharma Review December 2005).

렉틴 단백질과 탄수화물의 결합의 이용은 약물 전달 시스템의 기존 방법 중의 하나이다. 렉틴은 세포 표면의 당 단백질을 인식하거나 결합할 수 있는 비면역성 단백질로서 렉틴과 특정 탄수화물과의 상호 작용은 매우 특이적으로 이루어진다. 따라서, 탄수화물 부위(carbohydrate moiety)는 약물 전달 시스템을 렉틴에 연결시키는데 사용되고(direct lectin targeting), 렉틴은 다시 목표로 하는 세포 표면 탄수화물에 연결시키는 표적화 부위(targeting moiety)로서 사용될 수 있다(reverse lectin targeting).

그러나 이러한 렉틴 단백질과 탄수화물을 이용하는 약물 전달 시스템은 주로 모든 기관을 그 대상으로 하기 때문에 정상 세포를 해칠 수 있다. 따라서, 대부분의 경우 표적화 부위(targeting moiety)를 암이 있는 부위의 플라즈마 막 등에 존재하는 특정 수용체나 항원에 맞게 디자인하여야 했다. 또한 암세포의 경우 빠른 성장과 분화로 인한 잦은 돌연변이의 출현으로 인해 이와 같이 특정 표적화 부위에 의존하는 방법은 목표에 대한 선택성은 높일지언정 내성을 지닌 암세포의 출현이나 전이된 암에는 취약점을 가진다.

수동적인 약물 표적화는 Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect라고 불리우는 현상을 이용한 방법이다. EPR 효과란 일반세포에서는 관찰되지 않는 암세포와 암세포로 인해 만들어지는 혈관(Angiogenesis)에서만 광범위하게 나타나는 현상으로 거대입자의 선택적인 흡수, 투과, 그리고 축적으로 요약된다. 이러한 현상을 이용하여 선택적인 암세포로의 전달을 이끌어내려면 대략 직경 10nm ~ 100nm 정도의 크기가 필요한 것으로 알려져 있는데 이는 장을 통한 흡수와 배출, 암세포에의 선택적 축적 등을 고려하여 최적화된 수치이다. 또한 이러한 나노 입자는 혈액에서의 응고/축적과 세망내피계의 식세포인 마크로파지 등에 의한 제거를 막기 위하여 친수성을 띠어야 한다 (Farhan J. Ahmad, et al., "Nanotechnology:A Revolution in the making", The Pharma Review December 2005).

이러한 EPR 효과를 이용하여 약물 수송을 하는 경우에는 적극적 약물 표적화 시스템과는 달리 암 세포에 특이적인 표적화 부위에 의존하지 않아 경구 또는 단순 혈액 내 투여 등을 통해서도 암 세포에만 특이적으로 약물을 수송할 수가 있다. 또한 같은 연유로 인해 이와 같은 방법은 광범위한 타게팅 및 전이/돌연변이 암세포에 관해서도 비교적 강점을 보인다.

실제로 최근 키토산 고분자의 표면에 가돌리늄(Gadolinium), 홀뮴(Holmium 166), 구리 등의 방사성/독성 중금속, 또는 기존의 독성 항암제를 접목한 항암제에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다 (H. Tokumitsu, et al., "Chitosan-gadopentetic acid complex nanoparticles for gadolinium neutron capture therapy of cancer: preparation by novel emulsion droplet coalescence technique and characterization", Pharm . Res . 16 (1999) 1830-1835, Kim JK, et al., "Long-term clinical outcome of phase llb clinical trial of percutaneous injection with holmium-166/chitosan comples(Milicam) for the treatment of small hepatocellular carcinoma" Clin Cancer Res. 2006 Jan, 15;12(2):543-8, Qi L, et al., "Cytotoxic activities of chitosan nanoparticle and copper-loaded nanoparticles", Bioorg Med Chem Lett . 2005 Mar, 1;15(5):1397-9).

이러한 방법들은 암세포의 사멸(necrosis), 성장억제(growth inhibition) 그리고 특히 암적 혈관 생성(angiogenesis)의 억제 등에 있어서, 나노 입자에 접목되지 않은 경우와 비교하여 크게 줄어든 독성들을 공통적으로 관찰할 수 있었는데, 이는 상당히 고무적인 결과이다.

그러나 이러한 경우에도 완벽한 독성의 완화는 불가능한 연유로 장기 복용이 어렵고 미약하게나마 존재하는 거대입자의 뇌/골수에의 축적효과 (K. Ringe, et al. "Nanoparticle Drug Delivery to the Brain", Encyclopedia of Nanotechnology volume 7: pages 91-104)로 인해 한계가 있다. 일반적으로 항암 치료 후 완치를 확인하는데 있어서 대략 5년의 잠복기를 감안하는 점을 생각한다면 이러한 한계 역시 큰 약점으로 작용한다.

따라서, 이러한 어려움들을 극복하여 광범위하고 효과적인 항암 효과를 가지면서도 독성이 없어 치료 또는 예방 목적을 위해 장기 복용이 가능한 항암제를 개발하는 것이 당업계에서 시급히 요구되고 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 금속 킬레이팅(multidentate metal chelating) 유기 고분자와 적어도 하나 이상의 금속으로 이루어지고, EPR(Enhanced Permeation and Retention) 효과를 통하여 항암 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 수용성 유기 금속 나노입자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 i) 금속 킬레이팅(multidentate metal chelating) 그룹을 갖는 적어도 2개 이상의 유기산 또는 아민산을 에스테르 고분자화(esterification-polymerization) 반응시키는 단계; 및 ii) 상기 제 1단계에서 얻어진 유기 고분자를 금속 성분과 융합시키는 단계를 포함하는 수용성 유기 금속 나노입자의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 유기 금속 나노입자는 금속 킬레이팅(multidentate metal chelating) 유기 고분자와 적어도 하나 이상의 금속으로 이루어지고, EPR(Enhanced Permeation and Retention) 효과를 통하여 항암 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.
EPR(enhanced permeability and retention effect) 효과란 정상적인 조직에서보다 종양(tumor) 조직에서 훨씬 더 축적되는 경향이 있는 리포솜(liposomes) 또는 마크로분자(macromolecular) 약제들과 같은 특정 크기의 분자들에 의한 특성이다. 이러한 현상이 일어나는 주된 이유는 종양 세포가 빠른 성장을 위하여 혈관(blood vessel) 생성을 촉진시켜야만 한다는 점에 있다. 150-200㎛ 정도 크기의 종양 세포 덩어리는 영양분 및 산소 공급을 위하여 신생혈관(neovasculature)에 의하여 이루어지는 혈액 공급에 의존하게 된다. 이렇게 새롭게 생긴 종양 혈관들은 형태나 구조에 있어서 보통 비정상적인 모습을 갖게 되는데 이 혈관들은 평활근(smooth muscle) 층이 결여된 넓은 천공들(fenestrations)을 가지고 있거나, 더 넓은 속도(lumen) 범위의 신경 감응(innervation)을 가지며, 앤지오텐신(angio tensin) II에 대한 손상된 기능적 수용기를 가진 불완전한 내피 세포들로 이루어진다. 또한, 종양 조직들은 일반적으로 효과적인 림파 배수(lymphatic drainage)가 이루어지지 않는다. 이러한 모든 요소들이 마크로분자 약제에 있어서 비정상적인 분자 및 유체 전달 역학을 야기하게 된다. 즉, 이러한 현상들은 고체 종양들에 있어서 마크로 분자들과 지질의 "향상된 투과성 및 보유 효과(enhanced permeability and retention effect, EPR effect)"를 가져오게 된다. 또한, 이러한 EPR 효과는 고체 종양 조직들에 있어서 마크로 분자들의 분출 향상과 관련된 많은 병리생리학 요소들, 예를 들어 브래디키닌(bradykinin), 산화 질소 (nitric oxide), 과산화 질산염(peroxynitrite), 프로스타글란딘 (prostaglandins), 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF)로 알려진 혈관 투과력 인자(vascular permeability factor), 종양 괴사 인자 및 그외 요소들에 의해서 더욱 향상된다.

본 발명의 나노입자는 EPR 효과를 통하여 암세포에만 선택적으로 축적되며, 종국적으로 암세포에 산화 스트레스를 가져와 암세포 특이적인 독성을 가지게 된다. 이러한 항암 기작을 가지는 본 발명의 나노 입자는 금속 킬레이팅 유기 고분자와 이에 접목되어 암세포에 산화 스트레스를 일으킬 수 있는 화학적으로 활성(active)을 가지는 다수의 미네랄들을 포함한다.

본 발명의 금속 성분은 철분, 마그네슘, 망간, 은, 금, 니켈 등과 같이 비교적 독성이 적고 몸에서 쉽게 제거/해독될 수 있으며 직접적인 산화작용을 할 수 있는 금속류, 또는 칼슘과 아연과 같이 자체 독성은 없되 세포 내 생물학적 연쇄 반응(biological cascade)을 일으킴으로서 간접적 산화 스트레스를 일으킬 수 있는 미네랄들을 포함한다.

특히 철분의 경우에는 양이온 상태의 포피린(cationic porphyrin) 형태로 리포좀을 통해 세포에 적용될 시에 활성 산소(superoxide)를 통한 무독성의 항암작용을 한다는 것이 밝혀진 예가 있다(Yuasa M., et al., "Liposomal surface-loading of water-soluble cationic iron(III) porphyrins as anticancer drugs", Mol Pharm. 2004 Sep-Oct;1(5):387-9)

본 발명의 금속 킬레이팅 유기 고분자는 화합물 자체의 3차원적인 구조로 인하여 다수의 킬레이팅 자리를 가지며 이를 통하여 해당 미네랄들의 전달체로서 기능한다. 상기 고분자는 체내 또는 세포 내에서 쉽게 미네랄들을 뺏기지 않고 체내 또는 세포 내의 과다한 미네랄 축적을 방지하기 위하여 해당 미네랄들과 비교적 강한 친화성(affinity)을 가져야 하며, 해당 금속 및 미네랄들의 전체 또는 일부와 안정적인 복합체(complex)를 이룰 수 있어야 한다.

또한, 상기 유기 고분자는 체내 체류시간의 증가, 미네랄 축적의 방지 및 경구 투여 가능성 등을 위하여 수분과 산성에 안정적이어야 하고, 상기 유기 고분자의 분해 성분은 인체에 무해한 성분이어야 하며 배출이 용이하여야 한다.

따라서, 주로 체내/세포 내에서 쉽게 소화/배출이 가능한 유기산 (carboxylic acid), 유기 알코올(alcohol) 또는 아민(amine) 계열 물질 중 금속 킬레이팅 그룹(polydentate metal chelating group)을 다수 포함한 물질들로 한정된다. 그러나 이러한 물질들은 주로 에스테르 결합을 통해 만들어지는데(esterization), 에스테르 결합은 물, 산성, 염기성 등에 약하다는 단점이 있으므로 이러한 에스테르 결합들을 안정화시키고 해당 금속/미네랄 등과 안정적인 복합 체를 형성하도록 만드는 것이 중요하다.

한편 유기 고분자의 크기는 2 내지 300 nm 범위 내에서 유연하게 적용이 가능하지만 EPR 효과에 따른 선택적 암세포 축적을 최적화하기 위하여 10 내지 100 nm 범위의 크기가 바람직하다.

위와 같은 특성을 가지는 유기 고분자와 미네랄 원소들을 이용함으로서 기존의 수동적 EPR 효과에 의한 방법들의 장점을 그대로 가지면서도, 나노 입자가 적은 양이라도 일반 세포에 침투하는 경우에 인체에 전혀 해가 없어 부작용이 없다는 장점을 동시에 가질 수가 있다. 즉, 질병의 완치 및 효과적이고 광범위한 항암 작용이 가능해질 뿐만이 아니라 질병의 예방을 위한 부작용 없는 약물의 장기 복용이 가능해지게 되는 것이다.

이하에서는, 본 발명에 따른 나노 입자의 일 실시예인 OFeCa 1의 합성예 및 그 물리/화학적 특성을 보다 상세하게 알아본다. 또한 셀 모델 실험 및 쥐의 생체 실험을 통한 OFeCa-1의 항암 효과에 대한 분석 실시예들을 살펴본다. 그러나, 본 발명의 범주가 이하의 바람직한 실시 예에 한정되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 권리범위내에서 본 명세서에 기재된 내용의 여러 가지 변형된 형태를 실시할 수 있을 것이다.

[실시예 1] OFeCa -1의 제조 및 합성

아래 화학식 1의 유기산 또는 화학식 2의 아민화 유기산(carbonyl amine)을 섭씨 40도에서 pH가 1.5 ~ 2로 맞춰진 에테르에 포화상태까지 녹인다. 이때 사용 된 유기산의 R1, R2, L1, L2의 그룹은 각각 금속 킬레이팅 그룹 및 연결 그룹으로서 선택에 따라 고분자와 결합되는 금속/미네랄의 양과 비율, 그리고 나노 입자의 크기, 안정성이 결정되게 된다.

더욱 상세하게는, R1, R2 그룹은 금속 킬레이팅 그룹으로서 서로 같거나 다르게 알킬 카보닐(alkyl-carbonyl), 알킬 시아노(alkyl-cyano), 카르보닐(carbonyl), 시아노(cyano), 알킬 아민(alkyl-amine), 알킬-티오시아나이드(alkyl thiocyanide), 아민(amine), 티오시아나이드(thiocyanide), 알킬 카르보닐 아미드(alkyl-carbonyl-amide), 카르보닐 아미드(carbonyl-amide), 알킬-티올(slkyl-thiol), 알킬-알코올(alkyl-alcohol), 티올(thiol), 알코올(alcohol)로 이루어진 그룹에서 선택된다.

또한, L1, L2는 연결 그룹(linkage group)으로서, 더욱 상세하게는 에테르(ether), 메틸렌(methylene) 또는 이들의 결합으로 구성될 수 있다.

화학식 1의 유기산을 Silica bead 와 같은 탈 수분 매체를 이용하여 고온에서 반응시켜 반응식 1의 에스테르 고분자화(esterification polymerization)를 유도한다. 이는 평형 상태에 있던 화학반응이 르 샤틀리에의 원리(Le Chatellier's Principle)에 의해 반응이 우측으로 유도되기 때문이다.

마찬가지로 화학식 2의 아민화 유기산(carbonyl amine)을 사용하는 경우에는 고온에서 진공상태를 만들어 암모니아 기체를 제거함으로서 반응식 2에 의한 에스테르 고분자화(esterification-polymerization)를 이룰 수 있는데, 이는 암모니아 기체를 제거하면 르 샤틀리에의 원리(Le Chatellier's Principle)에 의해 평형상태에서 반응이 우측으로 유도되기 때문이다.

위에서 준비된 유기고분자는 수분과 산, 염기에 민감함으로 안정화 작업을 거친 후, 고농축 액상 또는 고체 상태의 해당 금속/미네랄과 장시간에 걸쳐 천천히 융합시킨다. 이때, 액상의 금속을 사용할 경우에는 상기에서 설명한 바와 마찬가지로 탈수 요소를 필수적으로 사용하게 된다.

금속/미네랄과 융합된 상태의 안정된 유기고분자는 내수성과 내산성을 지니게 된다. 이는 고분자 골격(backbone)의 카르보닐 산소(carbonyl oxygen)가 금속/미네랄과 코디네이션(coordination)을 이루어 산소의 전자 밀도(electron density)가 금속/미네랄 쪽으로 이동을 함으로서 카르보닐 산소의 친핵성(nucleophilicity)가 감소하기 때문에 생기는 현상이다.

이렇게 준비된 유기고분자와 해당 금속/미네랄의 복합체(OFeCa-1)는 증발 온도에서 에테르를 제거하고 가루화(powder)한 후 물에 용해시키거나, 또는 반대로 물에 희석을 시켜 가열을 함으로서 에테르를 제거하여 수용액으로 만들 수 있다. 이렇게 만들어진 OFeCa-1 수용액은 킬레이트된 금속/미네랄의 산화와 고분자의 분해를 막기 위해 버퍼를 이용하여 pH 3.5-4로 조정되는데, 이 과정에서 투석 (dialysis) 등을 이용하여 원료 물질을 제거하고 초과 분량의 금속/미네랄들을 제거한다.

[실시예 2] OFeCa -1의 물리/화학적 특성

OFeCa-1은 본 발명에 따라 합성된 항암제의 일 실시예로서 주로 철분과 칼슘, 마그네슘 등을 포함하는 수용성 나노입자이다. 위의 방법으로 제조된 OFeCa-1을 무기물 분석하면 표 1과 같이 11% w/w의 수용액 상태로 있을 시 대략 각각 10,000ppm 정도의 철분, 칼슘, 그리고 마그네슘이 검출되며, 이외에도 비교적 적지만 니켈(Ni), 아연(Zn), 망간(Mn), 구리(Cu) 등도 검출된다(표1).

시험 항목	결과(ppm)
철(Fe)	10425.20
칼슘(Ca)	7086.86
마그네슘(Mg)	2572.65
니켈(Ni)	1.66
아연(Zn)	923.95
망간(Mn)	250.40
구리(Cu)	10.41

능동형 광산란 측정 방법(Dynamic light scattering)을 이용하여 OFeCa-1 나노입자의 크기를 측정한 결과 대략 40nm와 100nm의 바이노달 분포(binodal distribution)를 보였으며(도1), 투과전자현미경(Transmission Electron Microscopy:TEM)을 통해 측정한 결과 대략 50nm, 100nm 크기의 나노 입자 이외에도 10nm 내외의 나노입자 역시 관찰 할 수 있었다(도2).

TEM에서 나타난 OFeCa-1 입자들은 별도의 염색 요소(staining agent)가 사용되지 아니하였는데도 불구하고 강한 명도차를 나타내었는데 이는 OFeCa-1의 나노입자들이 금속과 같이 풍부한 전자와 함께 큰 질량을 가진 원소들을 다량 포함함을 의미하며 실제로 고해상도에서 나타나는 금속 특유의 공명현상으로 인한 빗살무뉘의 문양 또한 이러한 점을 보여준다(도3). 또한 도 3에서 여러 간격을 가진 빗살 무뉘가 나타나는 것은 OFeCa-1 가 여러 가지 종류의 금속들을 포함하고 있다는 것을 의미한다.

또한 이러한 TEM 이미지상에서 드러난 OFeCa-1 나노입자들은 어떠한 결정체의 특징적 구조 역시 보여주지 않는데 이는 이 입자들이 단순한 금속 결정체의 나노입자들이 아님을 보여준다. 표 2의 OFeCa-1의 유기분석 결과는 OFeCa-1 질량의 대략 25% 가량이 탄소임을 보여주는데, 이는 OFeCa-1의 나노입자가 유기물과 무기물의 결합체로 이루어져 있음을 보여주고 있다.

분석 항목	C(%)	H(%)	N(%)	S(%)	O(%)
함량	3.1	8.4	-	-	70.2

<12% w/w OFeCa-1 수용액 내 유기 원소 분석>

상기 분석 실험은 C, H, N, S는 FIONS EA-1108 Elemental Analyzer를 이용하여 분석하였으며(N, S의 검출 한계는 0.1%), O는 Thermo Finnigan FLASH EA-1112 ElementalAnalyzer를 이용하여 분석하였다. 여기서 O와 H의 데이터는 OFeCa-1가 수용액 상태에서 검출되었기 때문에 상기 OFeCa-1의 화학적 성질을 나타내지 못한다.

마지막으로 현존하는 철분의 가장 강한 킬레이터(chelator) 중의 하나인 EDTA 10 mM로 pH 7.0에서 OFeCa-1을 3시간 가량 처리한 후 투석하여 OFeCa-1의 철분 및 마그네슘을 제거하는 실험을 수행하였다. 도 4와 도 5의 EDTA 처리 전의 OFeCa-1와 처리 후의 OFeCa-1의 철분 및 그 외의 금속 시그널을 비교해 보면, 그 차이가 약 20%~30%의 차이 정도임을 알 수 있다. 이러한 결과로부터 OFeCa-1이 철분, 칼슘, 마그네슘, 아연 등의 금속/미네랄 성분과 매우 안정적인 구조를 이룬다는 것을 알 수 있다.

[실시예 3] B16/F10 멜라노마 ( melanoma ) 세포에 대한 OFeCa -1의 항암 효과

OFeCa-1의 암세포 독성을 알아보기 위하여 B16/F10 멜라노마 세포를 24 well plate 에서 well 당 3 x 10⁴개체씩 사용하여 인공적으로 배양, 세포의 표면 안착을 유도한 후, 배양액(RPMI 1640 with 10% FBS) 1mL 당 0, 10, 20 및 40μL의 13% w/w OFeCa-1로 처리하였다. 그 후 B16/F10 멜라노마 임세포들의 시간에 따른 생존율을 조사하였다. 도면 6은 OFeCa-1으로 처리된 B16/F10 멜라노마 세포의 시간에 따른 상대적 생존율을 아무 처리도 하지 않은 B16/F10 멜라노마 세포와 비교하여 보여주고 있다.

40 μL/mL의 가장 많은 양의 OFeCa-1로 B16/F10 멜라노마 세포를 처리한 경우, OFeCa-1 처리 24시간 만에 암세포들의 완전 사멸을 관찰할 수 있었다. 20 μL/mL OFeCa-1로 암세포를 처리한 경우에는 40 μL/mL에서와 같이 시간에 따라 생존 암세포의 개체수가 꾸준히 감소하여 4일 후에는 대부분 사멸하는 것을 관찰할 수 있었다.

한편 10 μL/mL OFeCa-1로 B16/F10 멜라노마 세포를 처리한 경우에는 48시간까지는 개체수가 감소를 하였으나 72시간부터는 암세포가 도리어 크게 증가하여 아무 처리도 되지 않은 대조군에 비하여 20%가 넘는 성장율을 보였다. 이러한 반등 현상은 OFeCa-1가 EPR 효과를 인한 암세포 내의 금속/미네랄 축적과 그에 따른 산화 스트레스를 이용하기 때문에 OFeCa-1의 암세포 내 금속 농도 축적이 암세포의 분열 속도에 미치지 못하는 경우에는 세포 내 축적된 OFeCa-1의 양이 반감함에 따라 암세포에 치사량 미달의 산화 스트레스를 주게 되고, 치사량 미달의 산화 스트레스는 포유류 세포에서 성장/대사 촉진을 가져오게 되기 때문이다 (Burdon, et al., "Superoxide and hydrogen peroxide in relation to mammalian cell proliferation", Free Radic Biol Med 18, 775-94(1995)).

[실시예 4] 14,000 MWC 막으로 투석된 OFeCa -1을 이용한 세포 독성 실험

실시예 3의 세포 독성이 거대 입자(marcromolecule)로 인한 것임을 확인하기 위하여, 14,000 MWC 의 투석막을 이용하여 물로 투석된 OFeCa-1를 가지고 실시예 2와 같은 실험을 수행하였다.

이와 같이 투석된 OFeCa-1을 이용한 실험의 결과는 도면 7에서 볼 수 있듯이 실시예 3의 결과와 비슷한 효과를 나타내었다. 즉, OFeCa-1의 암세포에 대한 세포 독성이 거대 입자로 인한 것임을 보여주는 것이다.

[실시예 5] OFeCa -1의 경구섭취로 인한 C ₅₇ BL 쥐에서의 피하이식된 B16/F10 멜라노마의 성장 억제 효과

실시예 3과 4를 통하여 OFeCa-1가 암세포에 직접적인 항암효과가 있음을 확인한 후, 생체조건 하(in vivo)에서도 비슷한 결과가 나오는지 알아보기 위하여 암컷 C₅₇BL 쥐를 이용하여 피하에 이식된 B16/F10 의 성장억제효과를 관찰하였다.

먼저 주사기를 이용하여 십만 개의 멜라노마 세포를 경부에 피하 주입하였다. 13 % w/w 액상 OFeCa-1 역시 같은 날부터 하루 1회 0.1 mL (T1), 하루 1회 0.2 mL (T2) 그리고 하루 2회 0.3 mL (T3: 즉 총 하루 0.6) 등 3개 스케줄에 따라 경구 투여되었다. 이후 33일간 암세포의 성장을 지켜본 후, 쥐들을 부검하여 쥐의 몸무게와 암세포의 무게등을 재는 방법으로 암세포의 성장 정도를 측정하였다 (도면 8).

C₅₇BL 쥐의 피하에 성장한 암세포의 크기를 각 군별로 비교해보면 T1>대조군>T2>T3의 순으로 뚜렷이 나타났으며 부검을 할 당시 암세포주변을 감싸고 있는 황색 투명액을 관찰할 수 있었다. 또한 해부 일까지 특별한 이상증상을 보이던 쥐가 없었고 이는 피하에 이식된 암세포가 쥐에게 특별히 다른 영향을 주지 않았음을 의미한다.

위에서 눈으로 관찰되었던 암의 크기와 분포는 해부를 통해 측정된 암세포의 무게와 쥐의 몸무게등을 통해 재확인하였는데, 그 이외에도 단순한 농도 의존성에 따른 암성장 억제효과 외에도 두 가지 중요한 점을 발견할 수 있었다 (도 9A, 9B).

우선 농도의존성에 따른 암성장 억제효과가 관찰됨에도 불구하고 T1에서는 도리어 암성장의 촉진을 유발시켰다는 점이다. 실시예 3의 세포실험에서도 이와 같은 현상이 관찰되었었는데 이와 같은 반등 현상은 이미 설명한 바와 같이 OFeCa-1가 EPR 효과를 인한 암세포 내의 금속/미네랄 축적을 이용하기 때문에 OFeCa-1의 암세포내 금속 농도 축적이 암세포의 분열 속도에 미치지 못하는 경우에는 오히려 암세포가 이를 자극으로 인식해 암세포의 성장이 촉진되기 때문이다.

그리고 두 번째로 쥐의 전체 체중과 암세포의 무게는 투여량이 증가되면서 성장억제효과가 나타나 포물선의 농도의존성을 나타낸 반면에 암세포를 제외한 쥐의 체중은 OFeCa-1의 투여량과 직접적인 연관성을 나타냈다는 점이다 (도 9C). 즉 이는 암세포의 크기와는 별개로 OFeCa-1의 투여량에 따라 쥐의 여타 일반조직이 보호받았음을 의미하고, 동시에 이는 OFeCa-1이 암세포에는 암성장 억제효과가 있음에도 불구하고 일반조직 세포에는 부정적인 효과가 없었음을 의미한다.

[실시예 6] 피하이식모델에서 OFeCa -1의 패시브(passive)하고 지속적인 투여를 통한 B16/F10 멜라노마 세포에 대한 성장억제 및 치유효과

OFeCa-1이 EPR 효과를 통한 금속의 축적을 통해서 작용하여 암세포 독성을 일으키는 것을 확인하기 위하여 매우 낮은 농도의 OFeCa-1를 지속적으로 쥐에게 주입시켜 그 효과를 알아보는 실험을 수행하였다. EPR 모델을 더욱 잘 적용시키기 위하여 전이성 암을 I.V (lung post intravenous injection) 모델에 사용하였다.

C₅₇BL 쥐들에게 I.V. 주입 이틀 전부터 13% OFeCa-1 용액(w/w)의 10%(v/v)를 포함하는 물을 수동적으로 먹게 하였다. I.V. 주입 시, 100,000개의 B16/F10 멜라노마 세포가 C₅₇BL 쥐의 꼬리 정맥에 주사되었다. I.V. 주입 후 14일 뒤에 쥐들을 해부하여 폐의 전이성 암의 콜로니를 관찰하였다(도 9). 쥐들이 패시브하게 마신 13%(w.w) OFeCa-1를 함유한 물의 하루 양은 약 2~3 ml 이었다.

도면 10에서 A는 OFeCa-1 용액이 포함된 물을 마시지 않은 대조군을 나타내며, B는 13% OFeCa-1 용액(w/w)의 10%(v/v)를 포함하는 물을 마신 실험군을 나타낸다. 아무런 처리도 되지 않은 대조군과 실험군을 비교하여 볼 때 대조군의 폐에 훨씬 더 많은 B16/F10 멜라노마 콜로니가 관찰되었다. 즉, 저농도 OFeCa-1의 지속적이고 수동적인 섭취가 C₅₇BL 쥐들의 폐 전이성 암 콜로니의 형성을 효과적으로 막는 것을 알 수 있다.

[실시예 7] 피하이식모델에서 OFeCa -1의 직접주사를 통한 성장억제 및 치유효과에 관한 실험

실시예 3의 세포 실험에서는 B16/F10 멜라노마 암세포의 사멸을 일으켰던 OFeCa-1이 실시예 5의 in vivo 실험에서는 암 성장 억제효과만을 보인 것은 gastro-intestinal tract에서의 흡수율 문제가 주된 원인으로 보고 피하이식모델에서 OFeCa-1을 피하암세포에 직접 주입시의 효과를 알아보고자 또 다른 피하이식 모델 실험을 하게 되었다.

군당 8마리의 암컷 C₅₇BL 마우스의 경부에 B16/F10 멜라노마를 피하이식을 하여 대략 쌀알크기로 성장시킨 후 50 μL의 13 % w/w OFeCa-1 수용액을 피하 암세포에 직접, 또는 그 근접 투여하였다. 이러한 직접 주사는 하루에 한번씩 연속 이틀간만 이루어졌고, 첫 주사후 4일후의 암세포의 크기를 사진으로 촬영하여 비교하였다.

먼저 암을 이식받고 약물투여를 받지 않은 대조군의 경우 암세포의 크기가 직경 1~2 cm의 크기로 자라있었다 (도 11). 반대로 OFeCa-1을 주사 받은 경우에는 다음과 같은 현상이 나타났다. 먼저 8마리 중 3마리의 경우에는 암세포를 찾아볼수 없었던 대신 암이 있었던 자리에서 상처, 또는 세포가 괴사한듯한 부위를 찾을 수 있었다(도 12). 나머지 중 3마리에서는 약물이 주사된 부위에서는 암세포를 찾아볼 수 없었던 반면 원래 이식된 부위에서 먼 부위에 암세포가 자라있었음을 확인해 볼 수 있었다(도 12). 그리고 마지막 2마리의 경우에는 약물 투여 후 3일째에 사망을 하였는데, 이는 과도한 양의 용액이 EPR효과를 통해 혈액에 직접유입됨으로 인해 pH 쇼크 또는 osmotic 쇼크 등으로 인하여 사망한 것으로 보인다.

본 발명의 나노 입자는 체내에 투여된 후 EPR(enhanced permeation and retention) 효과를 통해 암세포에만 특이적으로 축적됨으로써, 나노 입자에 킬레이팅된 금속들이 암세포에 직접/간접 산화 스트레스와 삼투압 스트레스를 일으켜 결 국엔 암세포 특이적인 독성 효과를 나타내도록 한다. 본 발명의 나노 입자는 암세포에 광범위한 독성 효과가 탁월할 뿐만 아니라 암세포에만 특이적으로 작용하여 암세포 외의 정상 세포에 대한 부작용이 거의 없으며 암세포 부위에 직접적으로 투여하거나 음료 등과 함께 지속적으로 섭취하는 등 여러 가지 방법으로 적용이 가능함으로 인해 그 활용도가 높다.

Claims

알킬 카보닐(alkyl-carbonyl), 알킬 시아노(alkyl-cyano), 카르보닐(carbonyl), 시아노(cyano), 알킬 아민(alkyl-amine), 알킬-티오시아나이드 (alkyl thiocyanide), 아민(amine), 티오시아나이드(thiocyanide), 알킬 카르보닐 아마이드(alkyl-carbonyl-amide), 카르보닐 아마이드(carbonyl-amide), 알킬-티올(slkyl-thiol), 알킬-알코올(alkyl-alcohol), 티올(thiol) 및 알코올(alcohol)로부터 선택되어지는 적어도 어느 하나의 금속 킬레이팅(multidentate metal chelating) 그룹을 가지는 유기산 (carboxylic acid), 유기 알코올(alcohol) 또는 아민(amine) 계열 물질의 유기 고분자와 철(Fe), 칼슘(Ca), 마그네슘(Mg), 아연(Zn) 및 이들의 동위원소로부터 선택되어지는 적어도 어느 하나의 금속으로 이루어지고, EPR(Enhanced Permeation and Retention) 효과를 통하여 항암 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 금속 킬레이팅 유기 나노입자(mutidentate metal chelating organometallic nanoparticle).
삭제
i) 금속 킬레이팅(multidentate metal chelating) 그룹을 갖는 적어도 2개의 유기산 또는 아민산을 에스테르 고분자화(esterification-polymerization) 반응시키는 단계; 및

ii) 상기 제 1단계에서 얻어진 유기 고분자를 금속 성분과 융합시키는 단계;를 포함하는 청구항 제1항의 금속 킬레이팅 유기 나노입자의 제조 방법.
제3항의 제조 방법에 있어서, 상기 금속 킬레이팅 그룹이 알킬 카보닐(alkyl-carbonyl), 알킬 시아노(alkyl-cyano), 카르보닐(carbonyl), 시아노(cyano), 알킬 아민(alkyl-amine), 알킬-티오시아나이드(alkyl thiocyanide), 아민(amine), 티오시아나이드(thiocyanide), 알킬 카르보닐 아마이드(alkyl-carbonyl-amide), 카르보닐 아마이드(carbonyl-amide), 알킬-티올(slkyl-thiol), 알킬-알코올(alkyl-alcohol), 티올(thiol), 알코올(alcohol) 그룹으로 이루어진 군에서 선택 되어지는 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 금속 킬레이팅 유기 나노입자의 제조 방법.