CN109939081B - F3多肽靶向的纳米有机金属框架材料(nMOFs)及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种F3多肽靶向的纳米有机金属框架材料(nMOFs)及其制备方法,通过过渡元素Zr和有机配体BDC‑N3合成纳米载体UIO‑66‑N3,再利用点击化学反应将两种末端炔基修饰的PEG加载在UIO‑66‑N3的表面,从而避免纳米粒子间的聚集,增加其长循环效果,随后将F3多肽缀合在UIO‑66‑N3的表面,以赋予UIO‑66‑N3靶向性。在整个化学转变过程中保留了UIO‑66‑N3的骨架的结构,通过装载DOX,作治疗用和荧光显像剂,所合成的DOX/UIO‑66‑PEG‑F3的纳米颗粒兼具治疗和靶向的作用,本发明具有潜在的临床应用价值,并为恶性肿瘤的治疗提供更多强有力的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及生物高分子材料与纳米技术的技术领域,尤其涉及一种肿瘤靶向性且具有环境PH刺激响应型药物控释纳米载体F3多肽靶向的纳米有机金属框架材料(nMOFs)及其制备方法。
背景技术
许多药物分子因具有较差的水溶性,较强的非特异性吸附、较低的进细胞效率以及较大的副作用等缺陷限制了其在生物医学领域中的应用。因此,如何将药物高选择性地递送至身体的病变组织或细胞以提高其诊断或治疗效果一直是生物医学领域的长期目标。利用纳米载体装载探针或药物分子并递送至靶部位,不仅可以有效克服药物或成像探针分子的上述缺陷,而且可以避免其在生物体内被迅速代谢或过早与生物环境发生作用,从而延长其在血液循环中的保留时间,因而可以极大地提高药物进入靶向组织或细胞的效率。
近年来,MOFs材料在生物医学领域也获得了越来越广泛的应用,尤其是一系列低生物毒性的有机-金属骨架材料(如UIO-66)的出现。此类材料作为新型的探针与药物分子载体在药物释放、生物传感以及多模式生物成像等研究中受到越来越多的关注。
MOFs材料在生物医学应用领域的发展不仅需要更为通用的功能分子装载方法,更为成熟纳米材料制备技术,也需要有效的表面功能化方法。经过人们不懈地研究,在材料制备技术与各类分子的装载方法上已经取得了一定地进展,但表面修饰技术依然是一个亟待解决的问题。
发明内容
基于以上现有技术的不足,本发明所解决的技术问题在于提供一种肿瘤靶向性且具有环境PH刺激响应型药物控释纳米载体,该纳米材料不仅具有肿瘤靶向给药,精准释药到癌症部位的特点,还兼具纳米给药技术能改善药物水溶性和稳定性,延缓释放,延长长循环,降低药物在体内的消除速度,改善药物在体内的分布等的优点。
为了解决上述技术问题,本发明提供一种F3多肽靶向的纳米有机金属框架材料(nMOFs)的制备方法,包含如下步骤:
一、有机配体BDC-N3(2-叠氮基对苯二甲酸二甲酯)的制备:
将2-氨基对苯二甲酸二甲酯分散于水中,冰水浴条件下,滴加浓盐酸,然后滴加亚硝酸钠水溶液,冰水浴至少30分钟后,缓慢滴加叠氮化钠水溶液,室温反应过夜,抽滤,收集固体,纯水洗涤至少3次,并干燥,所得的固体粉末为2-叠氮基对苯二甲酸二甲酯;
将2-叠氮基对苯二甲酸二甲酯溶于四氢呋喃中,并滴加氢氧化钾水溶液,室温反应过夜;TLC监测(100%的乙酸乙酯)反应是否结束;反应结束后,旋蒸除去THF,冰水浴条件下,用盐酸水溶液调节PH至3-4,析出固体,随后抽滤所得的白色固体,分别用水和己烷洗涤3-4次,真空干燥,得BDC-N3;其中盐酸水溶液的质量分数优选为17%;
二、UIO-66-N3纳米材料的制备:
将步骤一所得的BDC-N3溶于DMF中得到溶液a,将氯氧化锆八水合物溶于DMF得到溶液b,将溶液a和溶液b混合后加入醋酸,混合均匀,加热,产物用丙酮离心洗涤,收集固体,干燥得UIO-66-N3;
三、DOX/UIO-66-N3的制备:
将盐酸阿霉素溶于纯水中,加入三乙胺后将混合物进行第一次超声处理,然后加入UIO-66-N3的纯水分散液进行第二次超声处理,干燥后溶解于PH=7.0 的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液中,并用HEPES缓冲溶液洗涤至少三次,随后冷冻干燥,收集样品DOX/UIO-66-N3;通过VIS-UV测定洗涤上清液中未被加载的DOX的量。通过使用具有不同浓度(范围:2nM-2μM)的DOX 的标准溶液获得DOX的校准曲线,并通过线性回归拟合曲线。DOX包封效率由掺入UiO-66的药物量与加入的总药量的比率计算;
四、DOX/UIO-66-PEG的制备:
将步骤三所获得的纳米载体DOX/UIO-66-N3分散于纯水中,超声混合均匀,然后加入mPEG-Alkyne水溶液和MAL-PEG-Alkyne水溶液并混合均匀,加入抗坏血酸钠和7.5%的无水CuSO4水溶液,避光室温反应过夜;随后将混合物置于截留量15000Da的透析袋中,纯水透析48小时以上,冷冻干燥,产物即为 DOX/UIO-66-PEG;
五、DOX/UIO-66-PEG-F3纳米载体的制备:
将F3多肽和TCEP溶解于PH=7.0的HEPES缓冲溶液中搅拌1h-4h,随后加入DOX/UIO-66-PEG,并反应4h-18h,然后在截留分子量15000Da的透析袋中,纯水透析48小时,冷冻干燥,产物即为DOX/UIO-66-PEG-F3纳米载体。
作为上述技术方案的优选,本发明提供的F3多肽靶向的纳米有机金属框架材料(nMOFs)的制备方法进一步包括下列技术特征的部分或全部:
作为上述技术方案的改进,所述步骤一中,2-氨基对苯二甲酸二甲酯分散于水中,2-氨基对苯二甲酸二甲酯和水按照0.5-1g:20-30mL的比例混合。
作为上述技术方案的改进,所述步骤一中,2-氨基对苯二甲酸二甲酯、浓盐酸、叠氮化钠水溶液的比例范围为0.5-1g:10-20mL:10-20mL;所述叠氮化钠水溶液的溶度范围为0.04g/mL-1g/mL。
作为上述技术方案的改进,所述步骤一中,2-叠氮基对苯二甲酸二甲酯、四氢氟喃、氢氧化钾水溶液的比例范围为0.5-1g:10-20mL:10-20mL;氢氧化钾水溶液的质量分数为4%。
作为上述技术方案的改进,所述步骤二中,BDC-N3与DMF的比例范围为 40-50mg:2-8mL;氯氧化锆八水合物溶于DMF比例为30-52mg:6-10mL; BDC-N3与醋酸的比例范围为40-50mg:800-1000uL;所述加热温度为90℃ -120℃,加热时间为18h-24h;产物用丙酮离心洗涤至少3次。
作为上述技术方案的改进,所述步骤三中,DOX·HCL、纯水、TEA、 UIO-66-N3分散液的比例范围为3-6mg:3-5mL:10-20uL:10-40uL;所述 UIO-66-N3分散液是30mg的UIO-66-N3分散于20mL-50mL的纯水中制备而得;所述步骤三中,第一次超声处理时间为3分钟,第一次超声处理后搅拌至少1 小时;第二次超声处理时间为10分钟,第二次超声处理后搅拌至少4小时。
作为上述技术方案的改进,所述步骤四中,纳米载体DOX/UIO-66-N3、纯水、mPEG-Alkyne、MAL-PEG-Alkyne、抗坏血酸钠和7.5%的无水CuSO4水溶液的比例范围为3-8mg:7-10mL:10-20mg:10-15mg:20-25uL:20-30uL; mPEG-Alkyne水溶液的浓度为10-20mg/mL;所述MAL-PEG-Alkyne水溶液的浓度为10-15mg/mL;所述抗坏血酸钠的浓度为1mol/L;无水CuSO4水溶液的质量分数为7.5%。
作为上述技术方案的改进,所述步骤五中,F3多肽、TCEP、PH=7.0的HEPES 缓冲溶液、DOX/UIO-66-PEG的比例范围为1-5mg:0.2-0.9mg:2-8mL:10-15mg。
一种F3多肽靶向的纳米有机金属框架材料(nMOFs),所述的有机金属框架材料是在对苯二甲酸的邻位引入叠氮基团,形成2-叠氮对苯二甲酸作为有机配体,通过溶剂热的方法合成UIO-66-N3纳米颗粒,装载DOX作为抗癌的模板药物和荧光显像剂,随后选择Alkyne-PEG-MAL和MPEG-Alkyne,通过 UIO-66-N3表面的叠氮基团与PEG末端的炔基发生点击化学反应,共价修饰PEG 在UIO-66-N3的表面,随后选择F3多肽共价加载在UIO-66-PEG的表面得到。
一种F3多肽靶向的纳米有机金属框架材料(nMOFs),所述F3多肽靶向的纳米有机金属框架材料采用如权利要求1-8所述的方法制备而成。
与现有技术相比,本发明的技术方案具有如下有益效果:
本发明的目的是提供一种肿瘤靶向性且具有环境PH刺激响应性药物控释的纳米载体,该纳米材料不仅具有肿瘤靶向给药,精准释药到癌症部位的特点,还兼具纳米给药技术能改善药物水溶性和稳定性,延缓释放,延长长循环,降低药物在体内的消除速度,改善药物在体内的分布等的优点。使用靶向给药制剂,可以提高病变组织中的药物浓度和药物疗效,使给药载体顺利通过血液屏障,靶向到特定的细胞,同时也可以最大限度地降低药物的毒副作用,从而大幅度的提高患者的生存率。发明该纳米载药体系的目的在于,利用“靶向性”提高肿瘤的治疗效果,并在肿瘤部位递送的同时实现体内智能释药。
提升载药率本发明以合成的UIO-66-N3纳米体系为主体,目前,制约药物传递系统发展的困难之一就是载药量低,而nMOFs由于具有高度的多孔性和其内部的亲水亲油基团,而实现较高的载药量。这种材料与其他载体相比,除具有载药量高外,还具有其透膜能力强,载药量高,具有pH响应释放以及易于修饰,结构可设计性与粒径大小可调控性等优点。传统的多孔材料如聚合物材料的载药能力通常不高且包封的药物很难释放,而多孔nMOFs具有大体积的孔径和规则的结构,可达到高载药量和选择性释放药物的能力。此外,本发明通过改性2-氨基对苯二甲酸二甲酯为2-叠氮对苯二甲酸(BDC-N3),作为有机配体,所合成的UIO-66-N3,可以通过Click点击化学反应进行修饰和改造。
应用点击化学反应修饰UIO-66-N3,可以使PEG化更加可控,同时大幅度提升UIO-66-N3的生物利用度,并延长其长循环。在生物学应用方面,为防止粒子间的相互聚集,将纳米范围的MOFs粒子用多种聚合物包衣(如PEG)。本发明选择带有click化学键的PEG(Alkyne-PEG-MAL和MPEG-Alkyne),通过点击化学反应将叠氮基团与PEG上的炔基共价连接起来。应用点击化学反应具有产率高;副产物无害;反应的立体选择性强;反应条件简单;原料和反应试剂易得;合成反应快速;在水溶液中可反应;产物易通过结晶和蒸馏分离,无需层析柱分离;产物对氧气和水不敏感等的优点,应用点击化学反应也符合原子经济。
F3肽靶向适配体,有助于靶向定位滞留多功能纳米粒子于肿瘤及其周围环境。已有先前的多项研究证明了F3多肽可以特异性结合癌细胞表面的核仁素,随后通过核仁素的介导可以转运到细胞核和细胞质中,核仁素在细胞表面的高表达是各种癌细胞特别是乳腺癌的重要特征。我们将末端带有半胱氨酸残基的 F3多肽通过和Alkyne-PEG-Mal中的MAL基团反应修饰在UIO-66-N3的表面,从而介导DOX/UIO-66-PEG-F3纳米颗粒在癌细胞中特异性的积累和内化,达到靶向作用。由于肿瘤细胞膜上其独特的定位,细胞表面核仁素的特异性拮抗剂也成为肿瘤靶向的热点。
通过物理吸附的方法装载Doxorubicin(DOX)到UiO-66-N3的孔隙中,以充当模型抗癌药物和荧光剂用于确定这些纳米载体UIO-66缀合物的位置。阿霉素(DOX)广泛用于癌症化疗,因为它可以通过DNA内插入诱导细胞凋亡。DOX的抗瘤谱较广,且具有较强的癌细胞灭活效果,但是其较强的心脏毒性,使其逐渐成为二级抗癌药。DOX/UIO-66-PEG-F3纳米载体的合成能极大的提高 DOX的生物利用度,并大大减小对正常组织的毒副作用。在进入肿瘤组织后,由于DOX/UIO-66-PEG-F3纳米载体的PH敏感性,其在肿瘤组织的微酸环境下解体,而在正常的组织的PH下不释放DOX,,从而实现抗癌药物的智能控制释放。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,而可依照说明书的内容予以实施,并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂,以下结合优选实施例,详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例的附图作简单地介绍。
图一为DOX/UIO-66-PEG-F3纳米载体的核磁共振(1H NMR)图谱;
图二为动态光散射的DLS的粒径分布图;
图三为纳米载体DOX/UIO-66-PEG-F3的TEM图像;
图四为纳米载体DOX/UIO-66-PEG-F3在不同PH条件下的体外药物释放趋势图;
图五为UIO-66-PEG-F3纳米载体的热重分析(TGA)图;
图六为UIO-66-N3,UIO-66-PEG-F3和DOX/UIO-66-PEG-F3的氮吸附-解吸等温线(BET)图;
图七为细胞在荧光显微镜下的荧光图片(蓝色荧光:DAPI(细胞核染色),红色荧光:DOX荧光);图七(1-1)为DOX/UIO-66-PEG-F3纳米载体在 MDA-MB-231细胞中孵育后,由共聚焦荧光显微镜拍摄的细胞摄取图;图七 (2-1)为DOX/UIO-66-PEG纳米载体在MDA-MB-231细胞中孵育后,由共聚焦荧光显微镜拍摄的细胞摄取图;图七(3-1)为DOX/UIO-66-PEG-F3+blocking 纳米载体在MDA-MB-231细胞中孵育后,由共聚焦荧光显微镜拍摄的细胞摄取图;图七(1-2)为DOX/UIO-66-PEG-F3纳米载体在正常L929细胞中孵育后,由共聚焦荧光显微镜拍摄的细胞摄取图,图七(2-2)为DOX/UIO-66-PEG纳米载体在正常L929细胞中孵育后,由共聚焦荧光显微镜拍摄的细胞摄取图,图七 (3-2)为DOX/UIO-66-PEG-F3+blocking纳米载体在正常L929细胞中孵育后,由共聚焦荧光显微镜拍摄的细胞摄取图。
具体实施方式
下面详细说明本发明的具体实施方式,其作为本说明书的一部分,通过实施例来说明本发明的原理,本发明的其他方面、特征及其优点通过该详细说明将会变得一目了然。
材料和试剂:2-氨基对苯二甲酸二甲酯购自能源化学(中国上海).37%HCl,亚硝酸钠,氢氧化钾,叠氮化钠,四氢呋喃,无水硫酸铜,三乙胺(TEA),二甲基甲酰胺(DMF)均购自国药化学试剂有限公司(中国北京),未进一步纯化。从阿拉丁(中国上海)订购八水合氯化锆和抗坏血酸钠;从北京华丰联合技术公司(北京,中国)获得盐酸多柔比星(DOX·HCl);MAL-PEG-Alkyne和 mPEG-Alkyne购自Toyongbio(中国上海).F3多肽(MW:3536.23)获自ChinaPeptides(中国上海)。
DOX/UIO-66-PEG-F3纳米前药的制备
(1)有机配体2-叠氮基对二甲酸的合成:利用购买的2-氨基对苯二甲酸二甲酯,通过重氮化反应将邻位的氨基转化为叠氮基团,随后,在4%的KOH 溶液中进行脱甲酯化反应,最终获得2-叠氮基对二甲酸(BDC-N3)
称取1g 2-氨基对苯二甲酸二甲酯,分散于约25mL水中,冰水浴条件下,滴加10mL浓盐酸,将0.4g的亚硝酸钠溶于约10mL的水中,并滴加进上述混合液中,冰水浴30分钟后,缓慢滴加1g叠氮化钠水溶液,室温反应过夜,抽滤,收集固体,纯水洗涤3次,并干燥所得的固体粉末(2-叠氮基对苯二甲酸二甲酯)。
将2-叠氮基对苯二甲酸二甲酯溶于26mL的四氢氟喃中,并滴加17mL4%的氢氧化钾水溶液,室温反应过夜。TLC监测(100%的乙酸乙酯)反应是否结束。反应结束后,悬蒸除去THF,冰水浴条件下,用17%的盐酸水溶液调节PH至3-4,有固体析出,随后抽滤所得的白色固体,分别用水和己烷洗涤 3-4次,真空干燥,得0.9g BDC-N3。
(2)纳米载体UIO-66-N3的制备:通过溶剂热法,利用有机配体和元素锆 Zr间的配位键自组装合成具有分子内孔隙的nMOFs。
称取约50mg BDC-N3,溶于约2mLDMF中,在另一个单独的小瓶中,将约 52mg的氯氧化锆八水合物溶于6mL的DMF。将二者混合于耐压管中,加800uL 的醋酸于混合物中,混合均匀,90摄氏度中加热18h,得到UIO-66-N3,通过丙酮离心洗涤3次,收集固体,干燥得UIO-66-N3 42.4mg。
(3)DOX的装载:将购买的盐酸多柔比星(DOX·HCl),在TFA弱碱条件下,脱盐酸处理,再通过物理吸附的方法将DOX装载在UIO-66-N3的孔隙中。
将3mg的DOX.HCL溶于3mL的纯水中,加约15uL的TEA,并将混合物超声处理3分钟并搅拌1小时。随后,加入30mg的UIO-66-N3(分散于约20mL 的纯水中)超声处理10分钟,并搅拌4小时。将混合物干燥,并将混合物重新溶解于HEPES(PH=7.0)中,并洗涤三次。通过Vis-UV测定洗涤上清液中未被加载的DOX的量。
(4)利用click化学反应形成1,2,4三唑环,共价加载PEG于DOX/UIO-66-N3纳米粒表面。
称取5mg的DOX/UIO-66-N3,分散于5mL的纯水中,超声混合均匀,称取 10mg的mPEG-Alkyne和13mg的MAL-PEG-Alkyne,分别溶解于1mL的水中,将上述3者混合均匀,加入1M的抗坏血酸钠22uL,和7.5%的无水CuSO4水溶液28uL,避光室温反应过夜。随后将混合物置于截留量15000Da的透析袋中,纯水透析48小时,冷冻干燥,收集样品。
(5)F3多肽靶向配体的装载:
将约1mg的F3多肽,和约0.7mg的TCEP溶解于约5mL的HEPES缓冲溶液(PH=7.0)中搅拌1h,随后15mg DOX/UIO-66-PEG被加入,并反应4h,最后在截留分子量15000Da的透析袋中,纯水透析48小时,冷冻干燥,收集样品。
DOX/UIO-PEG-F3纳米前药的表征
以UIO-66-N3为纳米载体,制备DOX/UIO-66-PEG-F3纳米前药,并对反应原料药和每步反应产物进行核磁共振(1H NMR)表征;(如图1),1H NMR (400MHz,D2O)δ8.19ppm归属于DOX的峰,3.61ppm归属于PEG峰,4.7ppm 归属于D2O峰,7.6ppm归属于苯环上的峰,8.34ppm归属于三唑环峰,δ1.15-1.25ppm,δ1.8ppm归属于F3多肽峰。以上结果很好的证明了PEG和F3 多肽共价结合到UIO-66表面的成功性。
载阿霉素DOX纳米粒制备和性能研究
将所制备的DOX/UIO-66-PEG-F3纳米载体的冻干粉末配成0.05mol/l纳米粒溶液,采用动态光散射测定平均粒径,使用Nano-ZS 90(Malvern,UK)马尔文粒度分析仪进行测定,温度设置为25℃,测量模式设置为自动,测得的平均粒径结果为188nm左右,如图2所示。
采用扫描电镜(SEM)观察纳米粒表面形貌特征;SEM测试图(图三) 显示纳米粒的平均粒径约为20nm,形态均一稳定,通过DLS和SEM的测试结果可以看到制备的DOX/UIO-66-PEG-F3纳米粒的尺寸范围在纳米级别。
本发明所制备的纳米靶向给药递送系统其载药量和体外释药性能的研究。
将3mg的DOX·HCL溶于3mL的纯水中,加约15uL的TEA,并将混合物超声处理3分钟并搅拌1小时。随后,加入30mg的UIO-66-N3(分散于约20mL 的纯水中)超声处理10分钟,并搅拌4小时。将混合物干燥,并将混合物重新溶解于HEPES(PH=7.0)中,并洗涤三次。通过Vis-UV测定洗涤上清液中未被加载的DOX的量。通过使用具有不同浓度(范围:2nM-2μM)的DOX的标准溶液获得DOX的校准曲线,并通过线性回归拟合曲线。DOX包封效率由掺入UiO-66-N3的药物量与加入的总药量的比率计算得到DOX的载药量为9%。
采用紫外标准曲线法测定DOX/UIO-66-PEG-F3纳米载体在体外不同PH释放介质的环境中的释放性能。在37℃的条件下,在乙酸盐缓冲液(pH=5.0),磷酸盐缓冲液(pH=6.8)和磷酸盐缓冲液(pH=7.4)中分别进行,分别用于模拟肿瘤细胞内环境,细胞外介质和生理条件,通过测定一定时间内DOX的药物释放量,考察PH值对载DOX纳米体系的影响。
DOX的释放效率随着PH的减小一直增加,在7.4的PH值下,101个小时后DOX释放量为44.3%,然而,在PH值为5.0和6.8,释放DOX量101小时后约为63.1%和55.7%,上述结果证明,所制备的DOX/UIO-66-PEG-F3纳米载体在正常生理条件下较稳定,证明了本发明所制备的DOX/UIO-66-PEG-F3纳米粒在癌症部位(PH=5.0左右)具有智能释药的特点。(如图4)
热重分析(TGA)
TGA(图五)测试结果显示nMOFs的框架在300℃稳定,在300℃时残留质量达到约85wt%,由于PEG结合到nMOFs上,而nMOF/PEG降解开始于 300℃,在600℃时的残留质量约35wt%,这些结果清楚地表明大约45%的PEG 被加载到nMOFs上。
氮吸附-解析等温线(BET)(图六)
UIO-66-N3,UIO-66-PEG-F3,DOX/UIO-66-PEG-F3的BET表面积和孔径由76.33K的氮气吸附等温线来提供。在等温分析前,样品在50℃的高真空条件下预处理24h。UIO-66-N3等温线在低压区表现出较强的N2气体吸收,具有I 型等温线,表明材料具有永久的微孔性。UIO-66-N3的比表面积为 (936.372)m2g-1,孔径为(0.3-1.3)nm,这证实它适合于装载各种货物。在聚乙二醇化过程和F3多肽和DOX装载后,观察到表面积显着降低至(17.3926)m2g-1,表明PEG链强烈覆盖UIO-66-N3的表面,同时也很好的证明了DOX装载的成功。
体为细胞实验的评价
所制备的基于UIO-66-N3纳米载体的细胞摄取行为和细胞内分布同时使用激光共聚焦分析激光扫描显微镜检测分析,选用的是MDA-MB-231(核仁蛋白+) 和L929细胞(核仁蛋白-)的对比,待细胞培养24小时,铺满孔底后,吸弃培养基,用PBS洗涤除去游离的死细胞,加入1mL样品溶液,分别继续培养0, 0.5,1,2,4h,移弃培养基,用PBS缓冲液洗涤3次后,用4%聚甲醛固定细胞30min后,PBS再洗涤3次,加入200uL DAPI染料对细胞核进行染色,时长 10min,用PBS洗涤3次,置于倒置荧光显微镜下观察细胞摄取情况。
图七:细胞在共聚焦荧光显微镜下的细胞摄取图:图七(1-1)为 DOX/UIO-66-PEG-F3纳米载体在MDA-MB-231细胞(核仁蛋白+)中的细胞摄取图;图七(2-1)为DOX/UIO-66-PEG纳米载体在MDA-MB-231细胞(核仁蛋白 +)中的细胞摄取图;图七(3-1)为DOX/UIO-66-PEG-F3+blocking纳米载体在 MDA-MB-231细胞(核仁蛋白+)中的细胞摄取图;图七(1-2)为DOX/UIO-66-PEG-F3纳米载体在L929细胞(核仁蛋白-)中的细胞摄取图;图七(2-2)为DOX/UIO-66-PEG纳米载体在L929细胞(核仁蛋白-)中的细胞摄取图;图七(3-2)为DOX/UIO-66-PEG-F3+blocking纳米载体在L929细胞(核仁蛋白-)中的细胞摄取图。
从荧光图像图七(1-1)和图七(2-1)中可以看出,在MDA-MB-231细胞(核仁蛋白+)中,纳米载体DOX/UIO-66-PEG-F3的分布比纳米载体 DOX/UIO-66-PEG在MDA-MB-231细胞中的分布更广泛,很好的说明了本发明所制备的DOX/UIO-PEG-F3纳米载体具有增强的靶向特异性。同时,通过纳米载体DOX/UIO-66-PEG-F3在MDA-MB-231细胞和L929细胞荧光显微镜对比图图七(1-1)和图七(1-2)对比中的分布,可以发现纳米载体DOX/UIO-66-PEG-F3 仅在MDA-MB-231细胞中分布,而在正常细胞L929细胞中几乎不分布,这一现象也可以很好的证明纳米载体对于癌细胞的靶向特异性,从而较好的减轻对正常细胞的伤害。通过图七(1-1)和图七(3-1)的对比,可以看出加F3多肽阻断剂的纳米载体DOX/UIO-66-PEF-F3+blocking在MDA-MB-231细胞中几乎不分布,很好的证明了纳米载体进入癌细胞MDA-MB-231主要跟F3多肽的介导有关。图七(1-2),图七(2-2),图七(3-2)的较少荧光,是因为正常成纤维细胞L929几乎不摄取纳米载体,因而不产生荧光,很好的说明了对正常细胞而言,所制备的纳米载体DOX/UIO-66-PEG-F3具有减小对正常细胞副作用的功效。综上所述,所制备的纳米载体DOX/UIO-66-PEG-F3具有癌症治疗的增强的靶向特异性,因而很好的减小了对正常细胞的副作用。
本发明所列举的各原料,以及本发明各原料的上下限、区间取值,以及工艺参数(如温度、时间等)的上下限、区间取值都能实现本发明,在此不一一列举实施例。
以上所述是本发明的优选实施方式而已,当然不能以此来限定本发明之权利范围,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和变动,这些改进和变动也视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种F3多肽靶向的纳米有机金属框架材料(nMOFs)的制备方法,其特征在于,包含如下步骤:
一、有机配体BDC-N3的制备:
将2-氨基对苯二甲酸二甲酯分散于水中,冰水浴条件下,滴加浓盐酸,然后滴加亚硝酸钠水溶液,冰水浴至少30分钟后,缓慢滴加叠氮化钠水溶液,室温反应过夜,抽滤,收集固体,纯水洗涤至少3次,并干燥,所得的固体粉末为2-叠氮基对苯二甲酸二甲酯;
将2-叠氮基对苯二甲酸二甲酯溶于四氢呋喃中,并滴加氢氧化钾水溶液,室温反应过夜;TLC监测反应是否结束;反应结束后,旋蒸除去THF,冰水浴条件下,用盐酸水溶液调节PH至3-4,析出固体,随后抽滤所得的白色固体,分别用水和己烷洗涤3-4次,真空干燥,得BDC-N3;
二、UIO-66-N3纳米材料的制备:
将步骤一所得的BDC-N3溶于 N,N-二甲基甲酰胺中得到溶液a,将氯氧化锆八水合物溶于DMF得到溶液b,将溶液a和溶液b混合后加入醋酸,混合均匀,加热,产物用丙酮离心洗涤,收集固体,干燥得UIO-66-N3 ;
三、DOX/UIO-66-N3的制备:
将盐酸阿霉素溶于纯水中,加入三乙胺后将混合物进行第一次超声处理,然后加入UIO-66-N3的纯水分散液进行第二次超声处理,干燥后溶解于PH=7.0的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液中,并用HEPES缓冲溶液洗涤至少三次,随后冷冻干燥,收集样品DOX/UIO-66-N3;
四、DOX/UIO-66-PEG的制备:
将步骤三所收集的纳米载体DOX/UIO-66-N3分散于纯水中,超声混合均匀,称取MAL-PEG-Alkyne,随后加水溶解,将上述PEG溶液加入纳米载体DOX/UIO-66-N3的水分散液中,并混合均匀,加入抗坏血酸钠和7.5%的无水CuSO4水溶液,避光室温反应过夜;随后将混合物置于截留量15000Da的透析袋中,纯水透析48小时以上,冷冻干燥,产物即为DOX/UIO-66-PEG;
五、DOX/UIO-66-PEG-F3纳米载体的制备:
将F3多肽和TCEP溶解于PH=7.0的HEPES缓冲溶液中搅拌1h-4h,随后加入DOX/UIO-66-PEG,并反应4h-18h,然后在截留分子量15000Da的透析袋中,纯水透析48小时,冷冻干燥,产物即为DOX/UIO-66-PEG-F3纳米载体;
所述步骤一中,2-氨基对苯二甲酸二甲酯分散于水中,2-氨基对苯二甲酸二甲酯和水按照0.5-1g:20-30mL的比例混合;2-氨基对苯二甲酸二甲酯、浓盐酸、叠氮化钠水溶液的比例范围为0.5-1g:10-20mL:10-20mL;所述叠氮化钠水溶液的溶度范围为0.04g/mL-1g/mL;2-叠氮基对苯二甲酸二甲酯、四氢呋喃、氢氧化钾水溶液的比例范围为0.5-1g:10-20mL:10-20mL ;氢氧化钾水溶液的质量分数为4%;
所述步骤二中,BDC-N3与DMF的比例范围为40-50mg :2-8mL;氯氧化锆八水合物溶于DMF30-52mg:6-10mL;BDC-N3与醋酸的比例范围为40-50mg :800-1000uL;所述加热温度为90℃-120℃,加热时间为18h-24h;产物用丙酮离心洗涤至少3次;
所述步骤三中,DOX·HCL、纯水、TEA、UIO-66-N3分散液的比例范围为3-6mg:3-5mL:10-20uL:10-40mL;所述UIO-66-N3分散液是30mg的UIO-66-N3分散于20mL-50mL的纯水中制备而得;所述步骤三中,第一次超声处理时间为3分钟,第一次超声处理后搅拌至少1小时;第二次超声处理时间为10分钟,第二次超声处理后搅拌至少4小时;
所述步骤四中,纳米载体DOX/UIO-66-N3、纯水、MAL-PEG-Alkyne、1mol/L抗坏血酸钠和7.5%的无水CuSO4水溶液的比例范围为3-8mg:7-10mL: 10-15mg:20-25uL:20-30uL;mPEG-Alkyne的水溶液浓度为10-20mg/mL;所述MAL-PEG-Alkyne的水溶液浓度为10-15mg/mL;所述抗坏血酸钠的浓度为1mol/L ;无水CuSO4水溶液的质量分数为7.5%;
所述步骤五中,F3多肽、TCEP、PH=7.0的HEPES缓冲溶液、DOX/UIO-66-PEG的比例范围为1-5mg:0.2-0.9mg:2-8mL:10-15mg。
2.一种F3多肽靶向的纳米有机金属框架材料(nMOFs),其特征在于:所述的有机金属框架材料,是在对苯二甲酸的邻位引入叠氮基团,形成2-叠氮对苯二甲酸作为有机配体,通过溶剂热的方法合成UIO-66-N3纳米颗粒,装载DOX作为抗癌的模板药物和荧光显像剂,随后选择Alkyne-PEG-MAL,通过UIO-66表面的叠氮基团与PEG末端的炔基发生点击化学反应,共价修饰PEG在UIO-66-N3的表面,随后选择F3多肽共价加载在UIO-66-PEG的表面得到。
3.一种F3多肽靶向的纳米有机金属框架材料(nMOFs),其特征在于:所述F3多肽靶向的纳米有机金属框架材料采用如权利要求1所述的方法制备而成。
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