CN113135984B - 一种病理微环境响应的原位自组装多肽衍生物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体公开了一种病理微环境响应的原位自组装多肽衍生物及其应用。所述多肽衍生物具有如式(Ⅰ)所示的结构，其中：R₁代表常用的氨基酸封端，R₂和R₃代表相同或不同的亲水氨基酸侧链。所述多肽衍生物能够通过GSH响应实现纳米球到纳米纤维的形貌转换，增强药物在肿瘤细胞内的滞留，降低毒副作用，提高安全性；且具有诱导肿瘤细胞铁死亡能力，从而产生很强的癌细胞杀伤效果，可用于抗癌治疗以及指导铁死亡诱导剂的合成，具有很好的应用前景。此外，本发明所提供的多肽衍生物还同时具有荧光成像的功能，从而使其在荧光成像方面也有着广泛的应用前景。

Description

一种病理微环境响应的原位自组装多肽衍生物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种病理微环境响应的原位自组装多肽衍生物。

背景技术

随着发病率和死亡率的不断增加，癌症已经成为一个重大的全球公共卫生问题。目前癌症主要的治疗方式有手术、化疗、放疗、免疫治疗等，但是这些常用的治疗方式也存在着一些弊端，比如手术易复发，放疗因辐射抵抗的问题使得放疗效果并不理想，化疗因药物选择性差会带来严重的副反应。因此，生物治疗、光动力治疗、光热治疗等新兴的癌症治疗方式也在不断涌现。

铁死亡(Ferroptosis)是一种由铁依赖的脂质过氧化物的积累导致细胞死亡的新型程序性细胞死亡方式，由Brent R.Stockwell教授于2012年首次提出。近期研究表明，诱导铁死亡可以用于治疗癌症，尤其是在根除对传统疗法有耐药性的侵袭性恶性肿瘤。随着纳米生物技术的发展，基于铁死亡的抗癌纳米药物也取得了重要进展，主要分为铁基纳米材料和非铁基纳米材料两大类。

铁基纳米材料能够在细胞内富集铁离子，加快芬顿(Fenton)反应，从而提高细胞内活性氧(ROS)水平，诱导铁死亡。如Ma等构建的负载顺铂的氧化铁纳米前药(FePt-NP2)可以在肿瘤特定部位释放出顺铂和Fe²⁺/Fe³⁺，原位发生Fenton反应，显著提高细胞内ROS水平，从而诱导肿瘤细胞铁死亡，增强抗癌活性[Nano Letters,2017,17(2):928-937]。Pu等报道的铁螯合半导体多复合纳米颗粒(SPFeN)将光热疗法与铁死亡疗法相结合，加强了癌症治疗效果[doi:10.1002/anie.202003004]。但是，负载顺铂的氧化铁纳米前药和铁螯合半导体多复合纳米颗粒等铁基纳米材料虽然通过诱导铁死亡效应增强了抗肿瘤效果，但是往往需要使用较高的铁剂量或者与其他治疗方式联合使用，因此具有复杂的纳米结构和多金属成分，生物安全性不高。

非铁基纳米材料可以抑制谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)或者通过外源性调节增加肿瘤细胞脂质过氧化程度来诱导铁死亡。Gao等利用两亲性聚合物胶束递送GPX4抑制剂RSL3，通过GPX4抑制、谷胱甘肽(GSH)衰减及脂质过氧化三者协同诱导铁死亡逆转多药耐药[doi:10.1016/j.biomaterials.2019.119486]。Wang等制备的富精氨酸的锰硅纳米泡可以通过细胞内GSH耗竭作为铁死亡诱导剂实现肿瘤靶向诊疗[ACS Nano,2018,12(12):12380-12392]。然而，包载小分子铁死亡诱导剂的聚合物胶束以及CN111228513A公开的无定型碳酸钙复合纳米药物虽然可以通过诱导铁死亡有效逆转耐药或者联合化疗进一步杀伤肿瘤细胞，但是存在药物泄露与毒副作用的风险。具有GSH消耗能力的锰硅纳米泡虽然可以同时实现肿瘤的诊断与治疗，但只能针对精氨酸琥珀酸合成酶缺陷的肿瘤细胞，对肿瘤细胞不具有普适性。此外，体内残留的纳米材料可能存在长期毒性的风险等。

因此，研究开发一种对肿瘤细胞具有普适性且无细胞毒性风险的非铁基纳米材料来诱导铁死亡，将具有良好的应用前景和广阔的适用性。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种病理微环境响应的原位自组装多肽衍生物及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种病理微环境响应的原位自组装多肽衍生物，所述多肽衍生物具有如下结构：

其中：R₁代表常用的氨基酸封端，R₂和R₃代表相同或不同的亲水氨基酸侧链；

所述多肽衍生物具有GSH响应性，在pH＝7.4且GSH存在的条件下自组装形成纳米纤维。

在本发明的一个具体实施方式中，考虑GSH响应过程具有一定浓度及时间依赖性(浓度越高，孵育时间越长，GSH响应更充分)，为了保证多肽分子尽可能充分的发生GSH响应，加入了过量的GSH(溶液中GSH终浓度为10mM)。

在本发明的另一个具体实施方式中，本发明所述多肽衍生物可在肿瘤细胞内发生原位自组装。

作为优选，R₁代表β-萘乙酸或N-9笏甲氧羰基，R₂和R₃分别代表缬氨酸和天冬氨酸或天冬氨酸和缬氨酸。

第二方面，本发明提供了所述多肽衍生物的制备方法。

所述制备方法涉及式(Ⅱ)的合成，合成方法如反应路线1所示。

所述制备方法还涉及式(Ⅲ)的合成。式(Ⅲ)的合成通过式(Ⅱ)和被Fmoc保护的氨基酸运用经典的Fmoc固相合成法进行。反应过程中，使用HBTU作为氨基酸羧基的活化剂，使用DIEA作为催化剂，使用哌啶脱除Fmoc保护基，从而裸露出氨基与已用HBTU活化的下一个氨基酸的羧基进行交联缩合反应，形成肽键。等到肽链全部完成时使用1％的三氟乙酸(TFA)将其从二氯树脂上切下来。

其中：R₁代表β-萘乙酸、笏甲氧羰基等其他常用的氨基酸封端；R₂’和R₃’分别代表侧链由叔丁基保护的天冬氨酸和缬氨酸等其他氨基酸的侧链。

所述制备方法还涉及式(Ⅳ)的合成，合成方法如反应路线2所示。

针对本发明式(Ⅰ)化合物的合成，由于BSO为水溶性小分子，在有机溶剂中溶解性差，而BSO侧链为亚砜亚胺基团，容易在碱性环境以及偶联剂的存在下与其他氨基酸反应，而对其侧链的保护方法对环境要求较高，故本发明采用两种方法进行式(Ⅰ)化合物的制备：

制备方法一：如反应路线3所示，式(Ⅰ)的合成需要式(Ⅲ)及丁硫氨酸-亚砜亚胺(BSO)等通过液相反应来完成。

先对式(Ⅲ)右侧裸露的羧基进行NHS活化酯修饰；再在DIEA催化作用下，与BSO反应；最后通过95％的强酸溶液脱去侧链保护基得到式(Ⅰ)。

制备方法二：采用固相合成法，使用式(Ⅱ)、式(Ⅳ)以及其他被Fmoc保护的氨基酸来进行合成，等到肽链全部完成时使用95％TFA将其从二氯树脂上切下来。

第三方面，本发明提供了所述多肽衍生物在制备癌症治疗药物中的应用。

所述癌症治疗药物具体可为一种肿瘤细胞铁死亡诱导剂，其含本发明所述的多肽衍生物，或由本发明所述的多肽衍生物制备而成。

所述癌症治疗药物具体还可为一种肿瘤细胞焦亡诱导剂，其含本发明所述的多肽衍生物，或由本发明所述的多肽衍生物制备而成。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种合成方法简单、生物相容性好、可生物降解的多肽衍生物，pH＝7.4的水溶液中自组装形成纳米球，GSH响应可实现纳米球到纳米纤维的形貌转变，增强药物在肿瘤细胞内的滞留，降低毒副作用，提高安全性。

经过试验研究发现，本发明多肽衍生物具有诱导肿瘤细胞铁死亡和焦亡的能力，能够产生很强的癌细胞杀伤效果，可用于抗癌治疗以及指导肿瘤治疗药物的合成，具有很好的应用前景。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明所述多肽衍生物的TOF-MS图谱。

图2为本发明所述多肽衍生物在GSH响应前后的光学照片及透射电镜图。

图3为本发明所述多肽衍生物和不同对照化合物与4T1细胞(A)和B16细胞(B)共孵育36h后的细胞毒性结果。

图4为含有荧光分子的响应性自组装多肽衍生物与4T1细胞和B16细胞共孵育不同时间后的细胞摄取结果。

图5为B16细胞与本发明所述多肽衍生物和不同对照化合物共孵育6h和9h后的脂质ROS流式检测结果。

图6为B16细胞与本发明所述多肽衍生物和不同对照化合物共孵育10h后的代表性荧光成像照片，死细胞核用SYTOX Green核酸染料染色，黑色箭头指向肿胀出现大气泡的焦亡细胞。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1二硫键连接体Fmoc-CS(式Ⅱ化合物)的合成

在250mL圆底烧瓶中加入胱胺二盐酸盐(2.25g，10mmol)、NaHCO₃(2.52g，30mmol)、1,4-二氧六环(35mL)，以及适量水(50mL)，然后加入磁子搅拌，待溶液变澄清后加入丁二酸酐(1g，10mmol)，搅拌过夜。

向圆底烧瓶中继续加入NaHCO₃(840mg)，逐滴加入Fmoc-OSu(3.37g，10mmol)和丙酮(25mL)的混合溶液，继续搅拌过夜。

使用高速离心机离心(10000rpm，5min)后收集上清，并旋蒸除去有机溶剂，然后加入约200mL水混匀，再用1M HCl调pH至2～3，有白色产物析出，过滤收集白色固体，使用冻干机冻干，所得即为产物。

实施例2具有二硫键的侧链被保护的多肽衍生物Nap-^DF^DFY-CS-DEVD(tBu)(式Ⅲ化合物)的合成

称取0.5g二氯树脂于固相合成管中，加入约10mL二氯甲烷(DCM)后将固相合成管放置于摇床上溶胀5min，用洗耳球挤压出管中的溶剂。称取0.5mmol第一个氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH于20mL的西林瓶中，加入约10mL的DCM，随后加入1mmol(200μL)DIEA，用塑料滴管充分吹打使其完全溶解后加入到固相合成管中，室温下反应2h。反应后挤压出反应液，用DCM洗2次，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗3次，加入约10mL新鲜配制的甲醇溶液(DCM:CH₃OH:DIEA＝17:2:1)，以封闭二氯树脂上未反应完全的活性氯原子，室温反应30min。挤压出反应液，DMF洗5次，加入约8mL 20％哌啶，室温反应30min，以脱除第一个氨基酸氨基上的Fmoc保护基，使之裸露。挤压出哌啶反应液，用DMF洗5次以除去残余的哌啶，然后称取1mmol第二个氨基酸Fmoc-Val-OH和1mmol HBTU于西林瓶中，加入约10mL DMF和2mmol(400μL)DIEA，充分溶解后加入到固相合成管中，室温反应2h。(后续反应中均用HBTU做偶联剂，用DIEA做催化剂。)重复上述“洗涤-脱保护-洗涤-加氨基酸”的步骤，依次加入氨基酸(Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-CS、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-D-Phe-OH、β-萘乙酸)进行反应。待肽链氨基端最后一个封端的β-萘乙酸反应完成后挤压出反应液，用DMF洗5次以洗净未反应的氨基酸原料，再用DCM洗5次以洗净树脂上的DMF，然后加入新鲜配制的1％TFA溶液(TFA:DCM＝1:99)将肽链从树脂上切下来，并用1％TFA反复洗涤(10min/次，共6次)。收集反应液于茄形瓶中，用真空旋转蒸发仪旋蒸除去TFA，得到粘稠液体后，向茄形瓶中加入适量冰乙醚沉淀，室温静置一段时间后，小心倒去无水乙醚上清液，将剩余的固液混合物真空抽干，所得固体即为粗产品，于冰箱-20℃保存。

实施例3氨基被Fmoc保护的BSO(式Ⅳ化合物)的合成

在100mL茄形瓶中加入丁硫氨酸亚砜亚胺(1.11g，5mmol)和NaHCO₃(840mg，10mmol)，用适量水溶解后，冷却至0℃。取Fmoc-OSu(1.69g，5mmol)溶解于1,4-二氧六环(20mL)中，滴加到上述体系中，冰浴反应1h，再室温反应3h。待反应完毕，倒入200mL水中，用乙醚萃取两次，并用1M HCl调节pH至2左右，再用乙酸乙酯萃取三次，旋蒸除去溶剂后，冻干即可。

实施例4基于BSO的响应性多肽衍生物Nap-^DF^DFY-CS-DEVD-BSO(式Ⅰ化合物)的合成

方法一：将实施例2化合物(80mg)、DCC(20.6mg)、NHS(11.5mg)溶于DMF中，加入磁子，搅拌过夜。使用过滤器将反应溶液过滤后，加入适量甲醇溶液，再加入BSO水溶液(22.2mg)，并用DIEA调pH至8～9，室温反应过夜。旋蒸除去甲醇，加入新鲜配制的95％TFA溶液(TFA:TIS:H₂O＝95:2.5:2.5)，室温反应30min。再用旋蒸除去TFA，用冰乙醚沉淀，离心收集白色析出，即为粗产物。以适量DMSO溶解上述粗品，然后利用高效液相色谱仪(HPLC)纯化，收集产物峰并冻干，冻干粉于冰箱-20℃保存。注：由于BSO分子在有机溶剂中溶解性差，需要先用适量水将其溶解后再滴加入以甲醇为溶剂的反应体系中，该方法会导致部分与甲醇反应的副产物产生。

方法二：称取0.5g二氯树脂于固相合成管中，加入约10mL DCM后将固相合成管放置于摇床上溶胀5min。将实施例3化合物作为第一个氨基酸，称取0.5mmol于西林瓶中，加入约10mL的DCM，随后加入200μL DIEA，完全溶解后加入到固相合成管中，室温下反应2h。反应后挤压出反应液，用DCM洗2次，DMF洗3次，加入约10mL新鲜配制的甲醇溶液，室温反应30min。挤压出反应液，DMF洗5次，加入约8mL20％哌啶，室温反应30min。挤压出哌啶反应液，用DMF洗5次，然后称取1mmol第二个氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH和1mmol HBTU于西林瓶中，加入约10mL DMF和400μL DIEA，充分溶解后加入到固相合成管中，室温反应2h。重复上述“洗涤-脱保护-洗涤-加氨基酸”的步骤，依次加入氨基酸(Fmoc-Val-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-CS、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-D-Phe-OH、Fmoc-D-Phe-OH、β-萘乙酸)进行反应。待肽链氨基端最后一个封端的β-萘乙酸反应完成后挤压出反应液，用DMF洗5次，再用DCM洗5次，然后加入新鲜配制的95％TFA溶液，室温反应30min。收集反应液于茄形瓶中，用真空旋转蒸发仪旋蒸除去TFA，得到粘稠液体后，向茄形瓶中加入适量冰乙醚沉淀，室温静置一段时间后，小心倒去无水乙醚上清液，将剩余的固液混合物真空抽干，所得固体即为粗产品，然后利用HPLC纯化，收集产物峰并冻干，冻干粉于冰箱-20℃保存。注：由于BSO侧链的亚砜亚胺基团容易在碱性环境以及偶联剂存在情况下与其他氨基酸反应，故该方法得到的产物中含有其他多肽副产物，导致产率降低。

进一步，对方法一和方法二制备获得的产物进行质谱检测，检测方法如下：

称取1mg所得产物于1.5mL EP管中，用1mL甲醇溶解后再稀释100倍，得到10μg/mL的该化合物甲醇溶液，用0.45μm有机滤膜过滤后，使用飞行时间质谱(TOF MS)进行质谱检测。

获得TOF-MS图谱，如图1所示，图中显示分子量与实施例4化合物理论分子量相同，验证了化合物分子的成功合成。

实施例5含有荧光分子的响应性多肽衍生物Rho-^DF^DFY-CS-DEVD(式V化合物)的合成

称取0.5g二氯树脂于固相合成管中，加入约10mL DCM后将固相合成管放置于摇床上溶胀5min，用洗耳球挤压出管中的溶剂。称取0.5mmol第一个氨基酸Fmoc-Asp(OtBu)-OH于西林瓶中，加入约10mL的DCM，随后加入200μL DIEA，完全溶解后加入到固相合成管中，室温下反应2h。反应后挤压出反应液，用DCM洗2次，DMF洗3次，加入约10mL新鲜配制的甲醇溶液，室温反应30min。挤压出反应液，DMF洗5次，加入约8mL 20％哌啶，室温反应30min。挤压出哌啶反应液，用DMF洗5次，然后称取1mmol第二个氨基酸Fmoc-Val-OH和1mmol HBTU于西林瓶中，加入约10mL DMF和400μL DIEA，充分溶解后加入到固相合成管中，室温反应2h。重复上述“洗涤-脱保护-洗涤-加氨基酸”的步骤，直至最后一个封端化合物罗丹明B(Rho B)。待反应完成后挤压出反应液，用DMF洗5次，再用DCM洗5次，然后加入新鲜配制的95％TFA溶液，室温反应30min。收集反应液于茄形瓶中，用真空旋转蒸发仪旋蒸除去TFA，得到粘稠液体后，向茄形瓶中加入适量冰乙醚沉淀，室温静置一段时间后，小心倒去无水乙醚上清液，将剩余的固液混合物真空抽干，所得固体即为粗产品，然后利用HPLC纯化，收集产物峰并冻干，冻干粉于冰箱-20℃保存。

实施例6基于BSO的响应性多肽衍生物的自组装

称取2mg实施例4化合物于干净的透明玻璃小瓶中，加入640μLPBS溶液使固体分散，并用50mg/mL Na₂CO₃溶液(约4当量)调pH至7.4左右，充分混匀得到澄清透明溶液。

实施例7基于BSO的响应性自组装肽的GSH响应性形貌转换

取285μL实施例6中澄清透明溶液，加入15μL GSH水溶液(200mM)混匀，立即置于37℃培养箱中孵育。分别取加入GSH之前和加入GSH之后0.5h和24h的溶液进行拍照，并制备透射电镜样品。

透射电镜样品制备过程如下：用生物专用自锁镊子小心夹取铜网边缘，正面朝上，吸取15μL溶液滴加于铜网正面，静置2min。随后用滤纸条从边缘将铜网表面多余的液体吸走，再在铜网表面滴加15μL醋酸铀溶液，静置2min。然后用滤纸条从液滴边缘吸走多余液体，将铜网正面朝上放置于干净的滤纸片上，转移至干燥器中干燥过夜，等待检测即可。

本发明所述多肽衍生物在GSH响应前后的光学照片及透射电镜结果拍照及电镜检测结果如图2所示。

实施例8基于BSO的响应性自组装肽的细胞毒性检测

取对数生长期的小鼠乳腺癌4T1细胞和小鼠黑色素瘤B16细胞，分别以每孔6000个的密度接种到96孔板中，置于37℃二氧化碳培养箱中培养24h。弃去原有培养液，分别加入100μL含有梯度浓度的实施例4化合物和对照化合物(Nap-^DF^DFY-HDA-DEVD-BSO与BSO)的培养液，置于培养箱中继续孵育36h。在避光条件下向每孔中加入10μL CCK-8溶液，置于培养箱中继续培养2h。在摇床上充分震荡60s后，使用全波长酶标仪检测450nm波长下的吸光度。根据公式计算相应浓度下的细胞存活率，结果如图3所示。由图可知，不具有GSH响应性的多肽衍生物只在高浓度下对4T1细胞有一定杀伤作用，实施例4多肽衍生物对4T1和B16细胞均具有很好的肿瘤杀伤作用，且其抗癌活性远大于游离的BSO小分子。

实施例9含有荧光分子的响应性自组装肽的细胞摄取

取对数生长期的小鼠乳腺癌4T1细胞和小鼠黑色素瘤B16细胞，分别以30万/皿的密度接种于共聚焦培养皿中，置于37℃二氧化碳培养箱中培养24h。弃去原有培养液，加入1mL含有100μM实施例5多肽衍生物的培养液，置于培养箱中继续孵育0.5h、1h、2h。在相应时间点从培养箱中取出细胞，用PBS洗2遍，加入4％多聚甲醛，室温固定30min。用PBS洗2遍，再用1mL PBS浸润，然后使用共聚焦显微镜进行成像，结果如图4所示。由图可知，随着细胞与实施例5多肽衍生物孵育时间延长，荧光信号逐渐增强，说明细胞对其摄取增加。而且在共孵育2h时，能够明显观察到丝状物质，说明实施例5多肽衍生物在胞内发生了GSH响应性形貌转变，形成了纤维。

实施例10基于BSO的响应性自组装肽处理后细胞脂质ROS检测

取对数生长期的小鼠黑色素瘤B16细胞，以30万/孔的密度接种于六孔板中，置于37℃二氧化碳培养箱中培养24h。弃去原有培养液，分别加入1mL含有400μM实施例4化合物和对照化合物(Nap-^DF^DFY-HDA-DEVD-BSO与BSO)的培养液，置于培养箱中继续孵育。孵育6h和9h后，用PBS洗1遍，各加入1mL 2.5μM C11-BODIPY探针，37℃孵育30min。弃去上清，用PBS洗1遍，然后用胰酶消化细胞，离心收集细胞于1.5mL EP管中，加入400μL PBS重悬，然后使用流式细胞仪进行检测，结果如图5所示。由图可知，与不具有GSH响应性的多肽衍生物和游离的BSO小分子相比，实施例4化合物能够明显提高B16细胞的脂质ROS水平，从而诱导铁死亡。

实施例11基于BSO的响应性自组装肽处理后细胞焦亡观察

取对数生长期的小鼠黑色素瘤B16细胞，以30万/孔的密度接种于六孔板中，置于37℃二氧化碳培养箱中培养24h。弃去原有培养液，分别加入1mL含有10μM实施例4化合物和对照化合物(Nap-^DF^DFY-HDA-DEVD-BSO与BSO)的培养液，置于培养箱中继续孵育。使用倒置显微镜观察细胞形态变化，于共孵育10h时，向培养基中加入SYTOX Green核酸染料(终浓度为10nM)，室温孵育10min后，使用活细胞工作站进行荧光成像和明场成像，结果如图6所示。由图可知，B16细胞与实施例4化合物共孵育10h后，部分细胞出现肿胀，细胞膜形成大气泡，发生细胞焦亡。而与对照化合物共孵育的B16细胞则没有出现细胞焦亡相关形态特征。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种病理微环境响应的原位自组装多肽衍生物，其特征在于，所述多肽衍生物具有如下结构：

其中：R₁代表β-萘乙酸或N-9笏甲氧羰基；

R₂代表缬氨酸的侧链、R₃代表天冬氨酸的侧链；

所述多肽衍生物具有GSH响应性，在pH＝7.4且GSH存在的条件下自组装形成纳米纤维。

2.权利要求1所述多肽衍生物的制备方法，其特征在于，所述制备方法为如下(1)或(2)：

(1)采用固相合成法，利用式(Ⅱ)和其他被Fmoc保护的氨基酸合成式(Ⅲ)；式(Ⅲ)中，R₂’和R₃’分别代表侧链由叔丁基保护的亲水氨基酸的侧链；

之后，对式(Ⅲ)右侧裸露的羧基进行NHS活化酯修饰；再在DIEA的催化作用下，与L-丁硫氨酸-亚砜亚胺反应；最后通过95％的强酸溶液脱去侧链保护基获得式(Ⅰ)所示的多肽衍生物；

(2)采用固相合成法，利用式(Ⅱ)、式(Ⅳ)以及其他被Fmoc保护的氨基酸合成式(Ⅰ)所示的多肽衍生物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，式(Ⅱ)的合成方法如下：

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，式(Ⅳ)的合成方法如下：

5.权利要求1所述的多肽衍生物在制备癌症治疗药物中的应用。

6.一种肿瘤细胞铁死亡诱导剂，其特征在于，含有权利要求1所述的多肽衍生物，或由权利要求1所述的多肽衍生物制备而成。

7.一种肿瘤细胞焦亡诱导剂，其特征在于，含有权利要求1所述的多肽衍生物，或由权利要求1所述的多肽衍生物制备而成。

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