CN111909241B - 一种多肽纳米杂化物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽纳米杂化物及其制备方法和应用，该杂化物的通式为[Au‑S‑S‑peptide]n，该杂化物的制备方法，由以下步骤组成：选用半胱氨酸修饰的多肽拮抗剂，通过多米诺反应，将含有巯基的多肽与Au离子共聚以生成Au‑多肽前体，然后再加入预制的超小金核，通过溶液本身的还原环境，反应进一步表面还原，达到反应平衡后，即可多肽纳米杂化物；该杂化物用于抑制肿瘤的生长；本发明所获得的多肽纳米杂化物可以通过抑制或破坏β‑catenin和Bcl9之间相互结合，进而调节肿瘤细胞内的胞内蛋白‑蛋白相互作用，最终抑制肿瘤的生长；本发明的制备方法所制备的多肽纳米杂化物具有优秀的溶液稳定性以及药物负载容量大的优势。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种多肽纳米杂化物及其制备方法和应用。
背景技术
细胞内的蛋白质-蛋白质相互作用(PPIs)在所有生物系统中都起着关键的作用，并且在疾病中经常失调，这代表了一类重要但尚未被开发的治疗靶点。据估计，人类的生理活动涉及超过40万个细胞内蛋白-蛋白相互作用(PPIs)，这为针对多种疾病的药理干预提供了大量机会。然而，绝大多数的PPI不受小分子抑制，这主要是由于与具有亲和小分子的深槽(～300-500 A2)形成鲜明对比的是，PPI的界面(～800-2000 A2)普遍平坦且较大。幸运的是，随着多肽疗法的出现带来了希望：由于多肽自身具有更大的表面积，多肽可以很好地模拟蛋白质的拓扑结构。因此，多肽最有可能成为PPIs调节剂。
然而，在实际的多肽治疗中，特别是那些针对细胞内的PPIs，总是存在两个固有的缺陷：蛋白水解稳定性差和细胞膜通透性低。为了解决这些药理学障碍，越来越多的针对蛋白水解抗性的精心设计，如修饰和靶向递送载体，已经出现在肽的临床转化应用中。尽管这两种方法在优化多肽治疗方面取得了一些成功，但胞内PPI治疗转化应用仍具有挑战性，目前还没有任何药物被批准用于这一类的临床应用。
近年来，纳米技术提供了一种自下而上的方法，借助共价或非共价修饰方式使得多肽具有蛋白水解抗性和细胞膜穿透性的稳定结构。一些肽衍生纳米药物，包括脂质体/大分子来源的肽纳米微球、肽包被纳米颗粒和基于多肽的自组装纳米结构材料，具有延长循环时间、增强靶向疾病特异性、增强蛋白水解稳定性和优化治疗效果等优异的生物学优势。
随着纳米金颗粒(AuNp)偶联肽治疗技术的发展，越来越多的纳米金因其惰性的本质、毒性低和经济成本等内在优势被应用于临床试验。然而，肽的复杂化学性质(疏水性、电荷性和氧化还原性)总是不利于共轭后的胶体AuNp的稳定，导致在离子浓度升高的生理条件下，发生聚集甚至沉淀。此外，胶体稳定性的减弱往往伴随着治疗肽的提前释放和网状内皮系统吸收的增强，最终导致脱靶毒性和治疗失败。
多肽衍生的纳米复合材料已显示出卓越的生物性能，包括但不限于优异的生物相容性、生物降解性、靶向性和良好的治疗效果。虽然在基于多肽结构的纳米工程方面已经取得了一些成功，但在多肽纳米制剂的临床应用方面仍存在巨大的挑战，特别是在调节胞内蛋白-蛋白相互作用(PPIs)方面。
发明内容
本发明的目的是提供一种多肽纳米杂化物及其制备方法和应用，该杂化物能破坏或抑制β-catenin和Bcl9之间相互结合。
本发明采用以下技术方案：一种多肽纳米杂化物，其通式为[Au-S-S-peptide]n。
进一步地，其结构为：[Au-S-S-BBI]n，BBI的氨基酸序列为LEHRERSLQTLRDIQRMLFP。
进一步地，其结构为：[Au-S-S-PMI]n或[Au-S-S-DPA]n。
一种多肽纳米杂化物的制备方法，由以下步骤组成：选用半胱氨酸修饰的多肽拮抗剂，通过多米诺反应，将含有巯基的多肽与Au离子共聚以生成Au-多肽前体，然后再加入预制的超小金核，通过溶液本身的还原环境，反应进一步表面还原，达到反应平衡后，即可多肽纳米杂化物。
进一步地，多肽拮抗剂为十二聚体肽PMI-SH，其氨基酸序列为TSFAEYWALLSPC。
一种多肽纳米杂化物的应用，杂化物用于抑制肿瘤的生长。
进一步地，杂化物用于调节肿瘤细胞内的胞内蛋白-蛋白相互作用。
进一步地，杂化物用于抑制β-catenin和Bcl9之间的相互作用。
进一步地，杂化物用于抑制p53和MDM2的相互作用。
本发明的有益效果是：本发明所获得的多肽纳米杂化物可以通过抑制或破坏β-catenin和Bcl9之间相互结合，进而调节肿瘤细胞内的胞内蛋白-蛋白相互作用，最终抑制肿瘤的生长；本发明的制备方法所制备的多肽纳米杂化物具有优秀的溶液稳定性以及药物负载容量大的优势。
附图说明
图1为[Au-S-S-peptide]n合成的示意图；
图2为Au-S-S-PMI的制备和表征；
图2A为高效液相色谱(HPLC)分析和ESI-MASS三个峰的结果，表明成功合成了[Au-S-S-peptide]n；
图2B为通过Mark–Houwink–Sakurada方法测得的[Au-S-S-PMI]n聚合物的分子量分布，该方法它使用经验常数根据由散射光(DLS)自相关函数确定的扩散系数计算分子量。
图2C为Au-S-S-PMI和PMI的FT-IR光谱；
图2D为Au-S-S-PMI的UV-Vis吸收光谱；
图2E为Au-S-S-PMI的流体动力学直径分布和溶液照片；
图2F为Au-S-S-PMI的透射电子显微图像(TEM)；
图2G为在Au-S-S-PMI合成和离心分离后定量结果；
图3为[Au-S-S-peptide]n稳定且抗蛋白水解；
图3A为这三种肽的理化性质和三种杂化物的示意图；
图3B-D为在PBS(pH7.4)或包含20％FBS和50μMGSH(以模拟细胞外生理环境)的PBS中，[Au-S-S-peptide]n的尺寸随时间变化；
图3E-G为在含有10mM氧化型谷胱甘肽，10％血清和0.5mg/ml胰凝乳蛋白酶的PBS下，peptide，peptide-Au-NPs和[Au-S-S-peptide]n的蛋白水解抗性；
图4为三种杂化物可以穿过细胞膜和GSH响应性释放货物；
图4A为孵育6小时后，流式细胞术分析2μM FITCAu-S-S-PMI，FITCPMI，FITC Au-S-S-BBI，FITCBBI，FITCAu-S-S-DPA和FITCDPA对HCT116癌细胞的摄取；
图4B由细胞内谷胱甘肽(GSH)触发的[Au-S-S-peptide]n刺激响应释放的示意图；
图4C-E为在两种不同条件下，即含有5μMGSH的pH值为7.4的PBS模拟细胞外环境，含有5mM GSH的pH 7.4的PBS以模拟细胞内环境；通过HPLC对肽释放进行定量，并且数据通过平均值±SD显示；
图5为三种杂化物在体外恢复了PMI，BBI和DPA的抗癌活性；
图5A-C为PMI(A)，BBI(B)和DPA(C)的抗癌机制；
图5D为通过MTT测量Au-S-S-PMI，Ctrl Au-S-S-PMI(阴性对照)和PMI对细胞活力的影响；
图5E为通过MTT测量Au-S-S-BBI，Ctrl Au-S-S-BBI(阴性对照)和BBI对细胞活力的影响；
图5F为通过MTT测量对Au-S-S-DPA，Ctrl Au-S-S-DPA(阴性对照)和DPA对细胞活力的影响，数据通过平均值±SD显示；
图6为Au-S-S-PMI的体内生物分布和抗肿瘤活性；
图6A为Au-S-S-PMI的组织分布和安全性；
图6B为在1、2、4和24小时腹腔注射(200uL，1mM Au)[Au-S-S-peptide]n后，Au-S-S-PMI在肿瘤与正常组织含量之比，(n＝3/组，平均值±s.d.)；
图6C为在裸鼠的右侧皮下接种了1×106HCT116细胞，绘制小鼠的肿瘤生长曲线。
图6D为在实验结束时切除的肿瘤的重量；
图6E为12天治疗后HCT116实体肿瘤组织的H&E染色(×200)；
图6F为通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)拍摄的肿瘤组织Tunel染色的代表性图像(比例尺：60μm)；
图7为不同给药方式与Au-S-S-PMI的肿瘤特异性累积相容性；
图7A为通过灌胃的方式使得200μl Cy3Au-S-S-PMI进入含有HCT116肿瘤的荷瘤小鼠的胃中后的肿瘤特异性累积相容性；
图7B为腹腔注射药物，不同治疗给药组处理后，肿瘤体积大小比例曲线；
图7C为腹腔注射药物，肿瘤组织离体照片；
图7D为腹腔注射药物，不同治疗给药组处理后，肿瘤重量大小统计；
图7E为腹腔注射药物，不同治疗给药组处理后，肿瘤组织H&E染色；
图7F为腹腔注射药物，不同治疗给药组处理后，肿瘤组织Tunel染色；
图7G为灌胃给药，不同治疗给药组处理后，肿瘤体积大小比例曲线；
图7H为灌胃给药，肿瘤组织离体照片；
图7I为灌胃给药，不同治疗给药组处理后，肿瘤重量大小统计；
图7J为灌胃给药，不同治疗给药组处理后，肿瘤组织H&E染色；
图7K为灌胃给药，不同治疗给药组处理后，肿瘤组织Tunel染色；
图8为Au-S-S-PMI抑制肿瘤的分子机制；图8中PMI-Au-SNH就是Au-S-S-PMI，ctrlPMI-Au-SNH就是ctrl Au-S-S-PMI。
图8A为PMI恢复p53活性功能的肿瘤治疗示意图；
图8B和C为上述不同治疗组中的小鼠肿瘤组织中p53蛋白的代表性IHC染色(B)和IHC得分(C)(比例尺：50μm)；
图8D和E为上述不同治疗组中的小鼠肿瘤组织中的p21蛋白的代表性IHC染色(D)和IHC评分(E)(比例尺：50μm)；
图8F和G为在上述不同治疗组中的小鼠肿瘤组织中ki67蛋白的代表性IHC染色(B)和IHC评分(C)(比例尺：50μm)；通过t检验计算p值(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)；
图9为Au-S-S-PMI的体内安全性评估；图9中PMI-Au-SNH就是Au-S-S-PMI，ctrlPMI-Au-SNH就是ctrl Au-S-S-PMI。
图9A为受益于Au-S-S-PMI二级靶向策略的肿瘤治疗安全性的示意图；
图9B为12天治疗后小鼠的肝脏重量；
图9C和D为上述不同治疗后，小鼠肝功能中的天冬氨酸转氨酶(AST(C))和丙氨酸转氨酶(ALT(D))的活性；
图9E和F为上述不同治疗后，小鼠肝脏(E)和肾脏(F)的代表性组织学H&E染色图像(比例尺：50μm)；
图9G-H为上述不同治疗后后，小鼠中肾功能指标的测量(BUN(G)，尿素氮；CRE(H)，肌酐)；
图9I为上述不同治疗后，小鼠的脾脏重量变化；
图9J为小鼠脾脏的代表性组织学H&E染色图像(比例尺：50μm)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明公开了一种多肽纳米杂化物，其通式为[Au-S-S-peptide]n，该杂化物的结构为：[Au-S-S-PMI]n、[Au-S-S-BBI]n或[Au-S-S-DPA]n，BBI的氨基酸序列为LEHRERSLQTLRDIQRMLFP，其中杂化物前体Au-S-S-peptide通过样品和温和反应原位还原于金纳米粒表面。杂化物前体Au-S-S-peptide被羟乙基哌嗪乙基磺酸(HEPES)在预制的超小金表面还原，如图1所示。值得注意的是，使用预制的纳米金作为内核，避开了金离子前体转化为金原子核苛刻反应条件，从而保证多肽的生物活性。
本发明还公开了一种多肽纳米杂化物的制备方法，由以下步骤组成：选用半胱氨酸修饰的多肽拮抗剂，通过多米诺反应，将含有巯基的多肽与Au离子共聚以生成Au-多肽前体，然后再加入预制的超小金核，通过溶液本身的还原环境，反应进一步表面还原，达到反应平衡后，即可多肽纳米杂化物，其中，MDM2拮抗剂为十二聚体肽PMI-SH，其氨基酸序列为TSFAEYWALLSPC。
本发明还公开了一种多肽纳米杂化物的应用，杂化物用于抑制肿瘤的生长，进一步，杂化物用于调节肿瘤细胞内的胞内蛋白-蛋白相互作用，在机理层面：当杂化物为BBI时，通过抑制β-catenin和Bcl9之间的相互作用抑制肿瘤的生长，当杂化物为PMI或DPA时，通过抑制p53和MDM2的相互作用抑制肿瘤的生长。下面对[Au-S-S-PMI]n进行验证试验：
表1实验试剂与生产商
| 试剂 | 生产商 |
| FBS | Gibco |
| 异硫氰酸荧光素(FITC) | Sigma-Aldrich |
| MTT | Dojindo |
| EDTA | Sigma-Aldrich |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich |
| HEPES | Sigma-Aldrich |
| Tween20 | Sigma-Aldrich |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich |
| 十二烷基磺酸钠(SDS) | Sigma-Aldrich |
| 30％丙烯酰胺 | Biorad |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich |
| Trizma base | Sigma-Aldrich |
| TEMED | Sigma-Aldrich |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich |
| 过硫酸铵 | Sigma-Aldrich |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich |
| Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> | Sigma-Aldrich |
| KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | Sigma-Aldrich |
| Horseradish标记羊抗鼠二抗 | Calbiochem |
| ECL底物 | Biorad |
| RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher |
| 抗β-catenin抗体 | Calbiochem |
| 抗actin抗体 | Sigma-Aldrich |
表2实验设备与生产商
1.[Au-S-S-PMI]n的合成。
大体上，形成Au-S-S-PMI的化学过程包括两个反应：1)含有巯基的肽与Au离子共聚以生成Au-肽前体的多米诺反应；2)在预制的超小金表面还原聚合前体，如图1所示。为了恢复p53活性，使用了半胱氨酸修饰的MDM2拮抗剂，即十二聚体肽PMI-SH，其氨基酸序列为：TSFAEYWALLSPC，以合成Au-S-S-PMI。
1.1多米诺反应
多米诺反应中，[Au-S-S-peptide]n络合物是由10ml的5-50mMHEPES缓冲液(pH7.4)与电离1ml的10mM的HAuCl4(Au3+)、1mg硫醇肽(peptide-SH)中的硫醇基团之间的配位产生的。
1.2液相色谱法证实[Au-S-S-peptide]n的形成
通过该方法，峰P3中产物的分子质量比峰P1中底物PMI的分子质量高196.1Da，表明存在Au+基团，如图2A所示。随后，Au-S-S-PMI在这种化学环境中会自发地开始聚合，因此无色的透明溶液变成乳白色。当浊度不加重时，几乎不能检测到任何中间物Au-S-S-peptide、PMI-S-S-PMI以及底物PMI，表明该多米诺反应的完全性。此时，可通过其分子量(如图2B所示)、傅里叶变换红外光谱(如图2C所示)和紫外可见光谱(如图2D所示)，来检测和证明聚合物[Au-S-S-peptide]n的存在，如图2C所示，PMI中2590cm-1处游离硫醇的特征峰消失了，在Au-S-S-PMI光谱中的2950cm-1处出现了新峰，如图2D所示，UV-Vis区域中330nm处的独特吸收峰是Au-S肽物质的吸收峰；这些结果证明形成了Au-S的化学键。
根据先前报道的反应机理，Au+离子通过二维化学链(如图1所示)，与peptide的巯基桥联，在[Au-S-S-PMI]n的样本中，在FT-IR的2950cm-1处(如2C图所示)，Au-S-S-PMI振动吸收峰显著增加，并在UV-vis中的330nm处出现了Au+-SR吸收的特征峰(如2D图所示)。
对于Au-S-S-PMI的第二步反应，将包含1mM金纳米颗粒(AuNp)的50mM HEPES换乘溶液(pH 7.4)添加到前体混合物中(如图1所示)。搅拌半小时后，反应混合物变回澄清透明，溶液颜色变成紫色预示Au-S-S-PMI的成功合成。如图2E所示的动态光散射(DLS)测量结果，Au-S-S-PMI的流体动力学直径为27.3±5.0nm，单峰分布和多分散指数为0.19证明了其尺寸分布均一。
此外，在透射电子显微镜(TEM)图像中，Au-S-S-PMI呈现的单分散球形结构，直径为22～30nm(如图2F所示)。为了确定PMI的加载效率，通过离心去除了纳米颗粒，并对上清液中残留的PMI进行了定量。未检测到PMI，如图2G所示，G1为液体上清液中残留的PMI的HPLC分析，G2是包含50mM二硫苏糖醇(DTT)的Au-S-S-PMI再溶解溶液的HPLC分析，G3是G2中峰的ESI-MASS结果，表明负载效率约为100％。
为了进一步定量，将离心的沉淀物冷冻干燥并称重，然后在50mM二硫苏糖醇(DTT)中还原以破坏Au-S-S-PMI中的Au-SH键。在随后的HPLC定量分析和鉴定中，PMI的回收率高达92±3％，Au-S-S-PMI中PMI的负载量为72±8％(wPMI/wAu-S-S-PMI)。值得注意的是，Au-S-S-PMI中治疗性肽的装载量远高于以前所报道的基于AuNp的纳米药物，这主要是由于巧妙地使用肽作为构建模块的一部分。
2.结果与讨论
2.1杂化物的设计与合成
多肽衍生的纳米复合材料已显示出卓越的生物性能，包括但不限于优异的生物相容性、生物降解性、靶向性和良好的治疗效果。虽然在基于多肽结构的纳米工程方面已经取得了一些成功，但在多肽纳米制剂的临床应用方面仍存在巨大的挑战，特别是在调节胞内蛋白-蛋白相互作用(PPIs)方面。在此，本发明开发了一种将靶向胞内PPI的肽转化为生物可利用的杂化物的通用方法，其中杂化物前体Au-S-S-peptide通过样品和温和反应原位还原于金纳米粒表面。为了证明这一概念，三种不同理化性质的不可穿透细胞膜的多肽分别被成功地设计成稳定地、肿瘤特异性的杂化物，在体外激活它们的抗癌功能。紧接着，为了突出杂化物的优势，选择了一种可以恢复p53活性、疏水和易被酶解的PMI，来挑战杂化物在结肠肿瘤异种移植模型中的作用。与预期一致的是，经静脉注射、腹腔注射、灌胃三种方式分别给药后，[Au-S-S-PMI]n在体内有效抑制了肿瘤的生长，维持了良好的治疗安全性。总之，这种在治疗上可行的多肽纳米工程化策略将允许制造一系列的纳米药物来调节那些隐藏在胞内的活跃地致癌性PPIs，并极有可能重新激活针对多种人类疾病的多肽药物的发展。
3.验证试验
为了进一步验证上述模拟的结果，在验证设计研究中，三个不可穿膜抗癌肽与氯金酸共聚形成杂化物：
1)一种疏水且易被酶解的十二聚体，即p53活化剂，称为PMI。
2)一种亲水性二十聚体，即Wnt抑制剂，称为BBI。
3)1一种疏水且右旋的(proteolytic-resistive)p53活化剂，即十二聚体，称为DPA。
正如预期的那样，三种杂化物挽救了这三种本身并不能杀死癌细胞的多肽的生物功能。为了突出三种杂化物的优势，选择了三种多肽中疏水性最强和稳定性最弱的PMI，通过三种给药方式来挑战三种杂化物在结肠肿瘤异种移植模型中的疗效：静脉注射，腹腔注射和灌胃。充分证实了三种杂化物的设计，即将治疗性肽与潜在药物结合起来的通用且可行的纳米药物开发策略。
3.1三种杂化物的稳定性和蛋白质水解抗性
使用同样的方法，还成功地合成了Au-S-S-BBI和Au-S-S-DPA(如图3A所示)。为了比较三种杂化物的稳定性和抗蛋白水解酶性，采用常规方法制备了[Au-S-S-PMI]n、PMI-Au-NPs、[Au-S-S-BBI]n、BBI-Au-NPs、DPA-Au-NPs、[Au-S-S-DPA]n，其中肽Cys共价结合到直径约30nm的Au-Nps表面。
首先比较了PMI-Au-NPs、BBI-Au-NPs、DPA-Au-NPs和[Au-S-S-PMI]n、[Au-S-S-BBI]n、[Au-S-S-DPA]n在pH 7.4的PBS缓冲液中的稳定性，并通过DLS测定了它们随时间变化的水动力直径。如图所示3B-D所示，所有纳米颗粒在24小时内的流体动力学直径几乎保持不变。在添加20％FBS和50μMGSH后，破坏了PMI-Au-NPs(如图3B所示)、BBI-Au-NPs(如图3C所示)和DPA-Au-NPs(如图3D所示)的稳定性，使得它们从缓冲液中突然沉淀出来，而其他的则保持单分散。
据推测，这一原因可能是与疏水性肽的结合会损害胶体金的双电荷层，在离子浓度升高的条件下亚稳定性。与之形成鲜明对比的是，杂化物合成新方法避免了肽与形成的胶体颗粒之间的相互作用，从而保护了双电荷层的完整性。总的来说，这些结果表明，合成肽-Au纳米颗粒的常规方法仅与亲水性肽(如BBI)兼容，杂化物合成新方法可能适用于所有亲水性或疏水性肽。
线性肽在其自身的蒸汽下在水溶液中呈构象紊乱，因此易被蛋白酶水解。多肽与纳米颗粒的结合将改善对肽酶的空间位阻，从而提高对蛋白水解的抵抗力。通过HPLC定量分析，检测PMI-Au-NPs、BBI-Au-NPs、DPA-Au-NPs和[Au-S-S-PMI]n、[Au-S-S-BBI]n、[Au-S-S-DPA]n对胰凝乳蛋白酶的敏感性(如图3E-G所示)。
与常规Au-NPs，PMI-Au-NPs、DPA-Au-NPs和BBI-Au-NPs相比，Au-S-S-PMI和Au-S-S-BBI对胰凝乳蛋白酶介导的蛋白酶水解抗性要强得多(如图3E-3G所示)，这大概是因为Au-NPs将其所有货物暴露在了表面，相反的，杂化物对货物可以有效包裹以保护。值得注意的是，由于右旋肽固有的蛋白水解抗性，Au-S-S-DPA和DPA-Au-NPs均表现出针对胰凝乳蛋白酶的优异的抵抗力。
3.2杂化物可以穿过细胞膜和GSH响应性释放药物
为了确定杂化物的细胞膜穿透性，分别制备了FITC标记的Au-S-S-PMI，FITC标记的Au-S-S-BBI和FITC标记的Au-S-S-DPA，其中异硫氰酸荧光素(FITC)与该肽N端连接，并通过流式细胞仪检测细胞对这些载药系统的摄取。如图4A所示，杂化物以2μM的浓度有效地内化到HCT116细胞中(基于巯基裂解肽的定量)，而游离的FITC-PMI，FITC-BBI和FITC-DPA未能在相同的条件下穿过细胞膜。
靶向细胞内PPI的治疗性肽的治疗功效与细胞质中肽货物的有效浓度紧密相关，因此，杂化物的另一个必要功能设计是靶细胞内可控释放有效载荷。据报道，Au-SH键在细胞外生理条件下的化学连接是稳定的，但可被高浓度硫醇破坏。谷胱甘肽(GSH)是生物体内常见的非蛋白硫醇，在细胞内浓度可以达到毫摩尔级别，但在细胞外浓度以微摩尔级别存在。
多肽纳米杂化物Au-S-S-peptide的解组装原理示意图如图4B所示，为了验证杂化物可以利用这种不同浓度的GSH来释放有效载荷，使用了HPLC监测[Au-S-S-PMI]n(如图4C所示)，[Au-S-S-BBI]n(如图4D所示)和[Au-S-S-DPA]n(如图4E所示)释放。
在pH 7.4的含有5μM GSH的PBS缓冲液中，在经过12小时的孵育后，所有三种杂化物均保持很好的完整性，货物释放<11％。与之形成鲜明对比的是，将GSH添加至5mM会在另外6小时内导致>90％的货物累积释放，表明在毫摩尔范围内GSH浓度依赖性货物释放。简而言之，这些数据验证了用于合成杂化物的化学方法是一种可以细胞内递送和GSH响应性释放治疗性肽的可行策略。
3.3杂化物可以在体外恢复PMI，BBI和DPA的抗癌活性
如先前的报道所述，PMI被设计用于竞争性拮抗MDM2以释放p53，从而重新激活p53的抗癌功能以杀死癌细胞(如图5A所示)。BBI致力于靶向β-catenin以干扰β-catenin/Bcl9的相互作用，从而抑制致癌的Wnt信号通路(如图5B所示)。此外，右旋肽DPA具有与PMI类似的功能来恢复p53活性(如图5C所示)。
不幸的是，由于蛋白水解稳定性差和/或膜通透性低，PMI，BBI和DPA无法在体外抑制癌细胞。为了确认杂化物可以恢复其抗癌活性，合成了三个阴性(非活性)对照Ctrl Au-S-S-PMI，Ctrl Au-S-S-BBI和Ctrl Au-S-S-DPA，其中将PMI，BBI或DPA中两个最关键的功能残基突变成丙氨酸。
首先评估了PMI，以PMI活性位点突变失活为Ctrl[Au-S-S-PMI]n，Ctrl[Au-S-S-PMI]n和[Au-S-S-PMI]n对携带野生型p53和过表达MDM2的三种细胞系的体外抗肿瘤活性：HCT116(结肠)，A375(黑色素瘤)和MCF-7(乳腺癌)。[Au-S-S-PMI]n以剂量依赖的方式抑制所有三种细胞系，而Ctrl Au-S-S-PMI和不含PMI则无抑制作用(如图5D所示)。此外，在含有突变体p53 SW480的结直肠癌细胞系中，发现Au-S-S-PMI的抑制作用明显下降。这些结果表明，Au-S-S-PMI以p53依赖性的方式抑制了癌细胞活力。
在三种Wnt异常活跃的癌细胞系：HCT116(结肠)，Hep3B(肝癌)和HepG2(肝癌)中测试了BBI，以BBI活性位点突变失活为Ctrl Au-S-S-BBI，Ctrl Au-S-S-BBI和Au-S-S-BBI的细胞毒性。如图5E所示，BBI和Ctrl Au-S-S-BBI几乎没有任何功效，相反，Au-S-S-BBI剂量依赖性地抑制癌细胞增殖。此外，Au-S-S-BBI对Wnt失活的A549(肺癌)没显示出抑制活性，表明Au-S-S-BBI依赖于Wnt。
对于[Au-S-S-DPA]n，在如图5F所示，可以发现与[Au-S-S-PMI]n相似的结果。这些结果证实，杂化物可以在体外恢复PMI，BBI和DPA的抗癌活性。
3.4Au-S-S-PMI的体内生物分布和抗肿瘤活性
为了进一步验证杂化物的功能，选择具有肽治疗所有缺点的PMI(包括蛋白水解稳定性差，膜渗透性低和疏水)，以评估其在纳米工程化后的体内肿瘤积累和治疗功效。在实体瘤中，广泛的不完整血管允许10到200nm的纳米颗粒离开血液并进入卵巢恶性肿瘤。同时，肿瘤内发育不足的淋巴管限制了颗粒的排斥，导致(被动靶向)纳米颗粒在肿瘤特异性的积聚，这一系列现象目前被称为增强的渗透性和保留效应(EPR效应)。
通过检查Au-S-S-PMI的器官特异性分布进行了药代动力学研究。为了用分光光度法监测携带HCT116肿瘤皮下异种移植物的小鼠中Au-S-S-PMI的分布，制备了Cy3Au-S-S-PMI，其中Cy3与肽C端缀合，腹腔注射(200μl注射，含1mM Au)，并使用定量体内光学成像系统在1、2、4和24小时对小鼠进行检测。如图6A所示，在1、2、4和24小时腹腔注射[Au-S-S-PMI]n(200uL，1mM Au)后，检测来自肿瘤和正常器官的荧光信号，Cy3[Au-S-S-PMI]n在肝，脾，肺和肾中的积累在注射1小时后迅速达到最大值，此后消退，并且在4小时内基本上不可见。
相反，随着时间的推移，肿瘤中积聚的Cy3Au-S-S-PMI含量显著上升，并且仅在24小时时才下降。器官特异性和时间依赖性差异积累的定量表明，Cy3[Au-S-S-PMI]n优先在肿瘤中积累而不是在肝，脾，肾或肺中(如图6B所示)，在1、2、4和24小时腹腔注射(200uL，1mMAu)[Au-S-S-PMI]n后，[Au-S-S-PMI]n在肿瘤与正常组织含量之比，(n＝3/组，平均值±s.d.)；通过t检验计算p值(*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001)；与其他器官相比，肿瘤中Cy3[Au-S-S-PMI]n的积累比率随着时间的推移逐渐增加。
为了评估Au-S-S-PMI在体内的治疗功效，使用异种移植肿瘤模型，其中将HCT116p53+/+细胞皮下接种到BALB/c裸鼠的侧腹。进行12天治疗方案，包括每隔一天腹腔注射Au-S-S-PMI，多柔比星(DOX)，游离PMI，Ctrl Au-S-S-PMI，Nutlin3和生理盐水，剂量为2.5mg/kg。使用DOX(一线化疗药物)和Nutlin3(MDM2的小分子拮抗剂)作为阳性对照。
使用非参数Kruskal-Wallis检验进行统计分析，在裸鼠的右侧皮下接种了1×106HCT116细胞，绘制小鼠的肿瘤生长曲线，数据表示为平均值±s.e.(n＝5)；如图6C所示，Au-S-S-PMI比DOX以及Nutlin3更具活性并有效抑制动物的肿瘤生长，而游离PMI和CtrlAu-S-S-PMI如预期的那样无活性；从统计治疗结束时处死的小鼠切除肿瘤重量分析同样证实了这一结果(如图6D所示)。
为了进一步表征Au-S-S-PMI在组织病理学水平上的体内抗肿瘤活性，使用H&E染色和TUNEL来分析肿瘤组织。正如预期，与PMI和Ctrl Au-S-S-PMI处理组形成对比，Au-S-S-PMI处理显著增加癌细胞凋亡水平(如图6E和6F所示)。总的来说，在体内肿瘤抑制中，Au-S-S-PMI比Nutlin3和DOX效果更显著。值得注意的是，Au-S-S-PMI在静脉注射相同剂量时也是有效的(如图7A-F所示)，展示了一种适用于不同位置肿瘤的多功能治疗方法。
3.5通过灌胃给药的方式，Au-S-S-PMI是有效的
尽管某些纳米药物正在临床试验中进行测试或已被批准，但目前仅有41种纳米药物适合于肠胃外方法。至于癌症治疗，口服给药可以长期连续给药，已经证明其比目前通过注射或输注的间歇疗法更安全和更有效。由于稳定性和粘膜通透性差，纳米颗粒在消化道吸收之前总是倾向于降解。幸运的是，杂化物具有直径为30nm的稳定球形结构，有利于通过肠上皮细胞之间的细胞旁通道，从而跨过胃肠道屏障。为了证实这一点，通过灌胃的方式使得200μl Cy3Au-S-S-PMI进入含有HCT116肿瘤的荷瘤小鼠的胃中。4小时后，仅在肿瘤中发现明亮的荧光(如图7A所示)，表明胃内给药方式与Au-S-S-PMI的肿瘤特异性累积相容。
使用携带HCT116肿瘤的小鼠来研究腹腔施用的Au-S-S-PMI的治疗功效，如图7B所示，在12天治疗方案期间，腹腔组的Au-S-S-PMI对肿瘤抑制率为75％。在实验结束时，收集所有肿瘤并称重(如图7C和7D所示)。肿瘤重量的统计数据再次得到支持。对肿瘤组织进行染色处理，如图7E和7F所示。
此外，与Ctrl Au-S-S-PMI处理组相比，Au-S-S-PMI处理显著增加细胞凋亡水平(如图7C和7D所示)。总的来说，Au-S-S-PMI通过腹腔给药也是有效的，证明杂化物适合腹腔注射。
再次使用携带HCT116肿瘤的小鼠来研究胃内施用的Au-S-S-PMI的治疗功效，在12天治疗方案期间，灌胃组的Au-S-S-PMI对肿瘤抑制率为72.6％(如图7G所示)。在实验结束时，收集所有肿瘤并称重(如图7H和7I所示)。
此外，与Ctrl Au-S-S-PMI处理组相比，Au-S-S-PMI处理显著增加细胞凋亡水平(如图7J和7k所示)。总的来说，Au-S-S-PMI通过胃内给药也是有效的，证明杂化物适合口服使用。
3.6Au-S-S-PMI在体内可以恢复了p53活性
p53通过p21有效的诱导生长抑制，并通过BH3蛋白参与凋亡，并在预防肿瘤发生中发挥关键作用(如图8A所示)。在人类所有恶性肿瘤中，超过三分之一涉及MDM2和/或MDMX对p53的功能抑制。为探讨Au-S-S-PMI抑制肿瘤的机制，在实验第12天收集所有肿瘤。p53和p21的半定量免疫组织化学分析显示：在用Au-S-S-PMI处理组中，p53和p21的水平均显著增加，但PMI和Ctrl Au-S-S-PMI处理的小鼠的肿瘤组织中并没有(如图8B-E所示)。与此发现一致的是，Au-S-S-PMI治疗显着降低了肿瘤进展标志ki67的水平(如图8F和8G所示)。
3.7Au-S-S-PMI的体内安全性评估
为了减轻药物毒性，在杂化物中采用两阶段靶向策略。如上所述，在EPR效应(第一次靶向)的帮助下，Au-S-S-PMI可以浓缩至肿瘤并保留至少24小时。此外，治疗性肽PMI特异性靶向MDM2(第二靶向，如图9A所示)，其仅在癌细胞中过表达，进一步保证了Au-S-S-PMI的安全性。
为了评估Au-S-S-PMI的毒性，包括体内肾毒性，同样使用含有HCT116肿瘤的皮下异种移植模型进行了全面的毒性研究。Au-S-S-PMI每隔一天腹腔，静脉注射或灌胃，持续12天，剂量为2.5mg/kg，盐水，Ctrl Au-S-S-PMI和DOX作为对照。观察到Ctrl Au-S-S-PMI和模拟处理组之间的体重差异很小，表明Ctrl Au-S-S-PMI对动物缺乏急性毒性。正如化疗药物所预期的那样，在DOX治疗组中DOX导致小鼠体重显著下降。
相比之下，不管给药途径如何，Au-S-S-PMI治疗组中的小鼠都随着时间的推移而体重增加，这大概是由于肿瘤生长的抑制和体内Au-S-S-PMI的毒性作用缺乏所致。Au-S-S-PMI和Ctrl Au-S-S-PMI的安全性以及DOX的毒性通过肝脏和肾脏功能的改变或缺失(如图9B-H所示)，脾重和脾的H&E染色(如图9I&J所示)以及白细胞和血小板的数目得到了进一步证实。此外，心脏功能，红细胞水平和肺的H&E染色同样支持上述发现，并得出结论：Au-S-S-PMI足够安全且具有巨大的治疗潜力。
4.结论
杂化物的设计是一类常规且可行的肽纳米工程策略，可以将靶向胞内PPI的肽转化为潜在药物。将工程肽纳米工程化为稳定的纳米结构，不仅将大大扩展纳米技术的范围，而且对于克服多肽药物开发的药学障碍也具有重要意义。通过克服多肽药理学上的不足，杂化物成功地恢复了PMI，BBI和DPA的抗癌活性，而后者本身无法杀死癌细胞。更重要的是，当进行腹腔，静脉内或灌胃给药时，杂化物在体内显示出良好的肿瘤特异性和抑癌功效，显示出适用于肿瘤的通用治疗。由于具有优越的治疗安全性，这种从头开发的肽纳米工程策略在临床转化中显示出巨大潜力。简而言之，本发明可以提供一种新的可行策略，以弥合肽发现与临床应用之间的距离，这种将纳米工程肽转变为可预测的纳米结构的通用策略填补了这些空白，并成功克服了治疗性肽的药物障碍，尤其是靶向PPI的肽。并加速细胞内PPI靶标向治疗剂的转化。
序列表
<110> 西安交通大学第一附属医院
<120> 一种多肽纳米杂化物及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Leu Glu His Arg Glu Arg Ser Leu Gln Thr Leu Arg Asp Ile Gln Arg
1 5 10 15
Met Leu Phe Pro
20
Claims (2)
1.一种多肽纳米杂化物的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：选用半胱氨酸修饰的多肽拮抗剂，通过多米诺反应，将含有巯基的多肽与Au离子共聚以生成Au-多肽前体，然后再加入预制的超小金核，通过溶液本身的还原环境，反应进一步表面还原，达到反应平衡后，即可多肽纳米杂化物，其中所述多肽纳米杂化物的结构为：[Au-S-PMI]n或[Au-S-DPA]n。
2.根据权利要求1所述的一种多肽纳米杂化物的制备方法，其特征在于，所述多肽拮抗剂为十二聚体肽PMI，其氨基酸序列为TSFAEYWALLSPC。
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| Self-Assembly of Therapeutic Peptide into Stimuli-Responsive Clustered Nanohybrids for Cancer-Targeted Therapy;Wangxiao He,等;《ADVANCED FUNCTIONAL MATERIALS》;20190307;第29卷(第10期);第2页左栏第4段、第3页图1、第2-3页 2.2.TME响应pCluster的制备 * |
| Wangxiao He,等.Self-Assembly of Therapeutic Peptide into Stimuli-Responsive Clustered Nanohybrids for Cancer-Targeted Therapy.《ADVANCED FUNCTIONAL MATERIALS》.2019,第29卷(第10期), * |
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