CN113304119A - 一种外泌体联合索拉非尼脂质体的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种外泌体联合索拉非尼脂质体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将索拉非尼和磷脂加入有机溶剂中，溶解混匀，得到索拉非尼磷脂复合物，再加入乳化剂、聚合物胶束剂，作为油相；(2)将外泌体溶于磷酸盐缓冲液中，作为水相，将水相加入到步骤(1)制得的油相中，形成水/油稳定初乳；(3)将水/油稳定乳液后处理得到外泌体联合索拉非尼脂质体。通过本方法制备得到的外泌体联合索拉非尼脂质体，具有分散性良好、包封率高、载药高、肿瘤靶向性和治疗效果好、安全性好的特征。

Description

一种外泌体联合索拉非尼脂质体的构建方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及索拉非尼药用载体，更具体地，涉及一种外泌体联合索拉非尼脂质体的构建方法。
背景技术
原发性肝癌肿瘤是目前临床上最普遍的一种恶性肿瘤，根据临床研究结果表明，原发性肝癌中90％以上为肝细胞癌(HCC)，而在亚洲的肝细胞癌发病率和致死率都较高，严重影响到人们的生命健康。现在，外科手术治疗HCC是最有效的一种方式，然而，早期诊断HCC手术难度大，切除率低，而且癌细胞的复发和转移对治疗有严重影响HCC。大部分(85％)HCC我国患者在确诊时已错过最佳手术期。中国无论是癌症发生数还是死亡数均高居世界首位。
索拉非尼(SOR)是一种靶向的小分子服用抗癌药物，是首个被FDA批准用于治疗HCC的靶点抗肿瘤药物。它通过抑制丝氨酸-苏氨酸激酶、血管内皮生长因子受体和血小板源性生长因子受体来抑制肿瘤血管生成，并通过阻止信号传导路径抑制肿瘤细胞增殖，从而起到双重抑制和多靶点阻止抗肿瘤的作用。
尽管SOR治疗肝癌有一定作用，但SOR对酪氨酸激酶作用抑制了肿瘤的血管形成，导致了不良的治疗效果。SOR作为小分子药物疗效较好，纳米脂质体具有良好的肿瘤靶向性，两者结合可提高治疗效率和增加药物的稳定性。然而目前市场上的SOR剂型毒副作用大，体内新陈代谢较快，半衰期短，体内药物含量峰值效应明显，严重影响治疗疗效，SOR缺乏进入体内病灶部位选择性，故需要大剂量频繁给药，可能会导致严重耐药性。
近年来，外泌体(small ExtracellularVesicles,Exo)作为天然的细胞间信息传递载体，在肿瘤发生、发展、转移过程中发挥着重要作用，也已经被用于肿瘤无创诊断、靶向药物递送、肿瘤疫苗、膜蛋白递呈、免疫检查点治疗等领域。近年来，外泌体以“天然纳米粒子”作为药物的载体使用，已成为人们关注的焦点。国内外研究发现，向外泌体中载入相关的microRNA、siRNA，抗肿瘤药物等均表现出高效的靶向性及药物传递功能，为治疗各种疾病提供了有效的手段。有研究证实，在异种肿瘤移植的裸鼠肺癌模型中，以外泌体作为紫杉醇的药物载体进行干预，既明显抑制了肿瘤的生长，又显著降低了药物本身的毒性。通过基因工程使小鼠未成熟树突状细胞来源的外泌体表达一种特异性外泌体膜蛋白(Lamp2b)，使其与av整合素特异性IRGD肽融合或将其融合到神经元特异性RVG肽上，均表现出高效的靶向性及药物传递。间充质干细胞来源的外泌体表面有特殊的分子，可避免与抗体、凝血因子等产生作用，避免体内产生免疫反应，提高药物的安全性；4)由于外泌体具有递送生物分子的功能，可以与细胞膜融合，直接将药物输送到细胞质，通过逃避吞噬溶酶体，显著提高弱势分子传递的效率。此外，外泌体作为一种亚细胞成分的膜结构载体，与其它纳米载体相比，体积较小、易保存、高度稳定，具有极高的生物相容性和体内安全性；不易被单核吞噬细胞系统清除；极大地减少了非靶向的肝脏富集，从而可减少对肝脏的毒性及实现装载药物的有效利用。
基于上述背景，构建了一种全新的药物输送系统，提高局部药物浓度，使药物在局部缓慢释放，延长药物对肿瘤细胞的作用时间，同时增加药物的靶向作用和药物在肿瘤细胞的蓄积，提高肿瘤治疗的效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种提高局部药物浓度、延长药物对肿瘤细胞的作用时间、增强药物靶向作用、提高治疗肿瘤效果的药物输送系统的构建方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
首先，本发明提供一种外泌体联合索拉非尼脂质体的构建方法，包括以下步骤：
(1)将索拉非尼和磷脂加入有机溶剂中，溶解混匀，得到索拉非尼磷脂复合物，再加入乳化剂、聚合物胶束剂，作为油相，所述索拉非尼和磷脂的质量比为1:5～1:25，优选质量比1:15～1:20，最优选质量比1:15；所述有机溶剂为醇类或卤代烃或其混合溶剂，优选的，所述醇类溶剂选自甲醇或乙醇，所述卤代烃溶剂选自二氯甲烷或三氯甲烷；
(2)将外泌体溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，作为水相，将水相加入到步骤(1)制得的油相中，形成水/油稳定初乳；
(3)将步骤(2)制备的水/油稳定初乳后处理得到外泌体联合索拉非尼脂质体。
在具体的实施方案中，磷脂选自磷脂选自大豆磷脂、二月桂酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、蛋黄卵磷脂、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，优选为大豆磷脂、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，更优选二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
在具体的实施方案中，所述乳化剂选自胆固醇和PEG修饰的磷脂复合物。
在具体的实施方案中，所述聚合物胶束选自聚乙二醇、O-羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐、羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐、透明质酸、聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物；优选羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物的一种或两种，最优选羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐。
在具体的实施方案中，所述外泌体选自细胞培养上清、血清、血浆、脑脊液、组织样本，所述细胞来源于内皮细胞、免疫细胞、血小板、平滑肌细胞、干细胞，优选干细胞，最优选骨髓间充质干细胞(BMSC)。
在具体的实施方案中，所述有机溶剂为甲醇，优选甲醇和三氯甲烷混合液。
在具体的实施方案中，所述水化的时间为0.5-2小时，超声的时间为1～30分钟。
在具体的实施方案中，所述后处理为将水/油稳定初乳旋转蒸发，得到薄膜溶胀水合后所得悬浊液过滤得到外泌体联合索拉非尼脂质体。
在具体的实施方案中，本发明所述外泌体联合索拉非尼脂质体的构建方法，包括以下步骤：
(1)将1:15～1:20的索拉非尼和磷脂加入甲醇和三氯甲烷混合液中，溶解混匀，得到索拉非尼磷脂复合物，再加入胆固醇、PEG修饰的磷脂、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物和羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐，作为油相；
(2)将来源于骨髓间充质干细胞的外泌体溶于PBS中，作为水相，将水相加入到步骤(1)制得的油相中，水化超声混匀形成水/油稳定初乳；
(3)将水/油稳定乳液旋转蒸发，得到薄膜溶胀水合后所得悬浊液过滤得到外泌体@索拉非尼靶向缓释纳米脂质体。
在具体的实施方案中，本发明所述外泌体联合索拉非尼脂质体的构建方法，包括以下步骤：
(1)将1:15的索拉非尼和磷脂加入甲醇和三氯甲烷的混合液中，溶解混匀，得到索拉非尼磷脂复合物，再加入胆固醇、PEG修饰的磷脂、羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐，作为油相；
(2)将来源于骨髓间充质干细胞的外泌体溶于PBS中，作为水相，将水相加入到步骤(1)制得的油相中，水化1h，超声7min，混匀形成水/油稳定初乳；
(3)将水/油稳定乳液旋转蒸发，得到薄膜溶胀水合后所得悬浊液过滤得到外泌体联合索拉非尼脂质体。
本发明的另一个目的是提供一种使用上述方法制备得到的外泌体联合索拉非尼脂质体，所述外泌体联合索拉非尼脂质体具有分散性良好、包封率高、载药高、肿瘤靶向性和治疗效果好、安全性好的的特征。由该方法制得外泌体联合索拉非尼脂质体经检测，粒径为(118.3±2.14)nm，PDI为0.216±0.038，呈球状，包封率为(89.8±3.72)％，载药量为(18.45±0.14)％。
本发明与现有技术相比具有以下积极效果：
1、本发明充分发挥了长循环靶向载体的特点，合理整合了外泌体的索拉非尼纳米脂质体粒径介于110nm左右，具有极高的生物相容性和体内安全性；不易被单核吞噬细胞系统清除；极大地减少了非靶向的肝脏富集，从而可减少对肝脏的毒性及实现装载药物的有效利用。
2、本发明的外泌体联合索拉非尼脂质体所载药物的释放时间可长达数周，且可被配体及抗体修饰，从而增加载体的组织靶向性；载药范围广泛，既可承载疏水性药物，也可承载亲水性药物，有利于延长药物对肿瘤细胞的作用时间、增强药物靶向作用、提高治疗肿瘤效果。
3、本发明的外泌体联合索拉非尼脂质体制备工艺简单，具有分散性良好、包封率高、载药高、肿瘤靶向性和治疗效果好、安全性好的特征。
附图说明
图1为外泌体联合索拉非尼脂质体的粒径分布图
图2为大鼠骨髓间充质干细胞来源的外泌体透射电镜图
图3为大鼠骨髓间充质干细胞来源的外泌体粒径分布图
图4为Huh-7与不同剂型脂质体孵育72h后的细胞活性检测结果
图5为接种不同剂型脂质体14天后BALB/c裸鼠的相对肿瘤体积(n＝6)
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的外泌体装载索拉菲尼靶向缓释纳米脂质体进行详细说明。需要理解的是，这些实施例描述只是为进一步详细说明本发明的特征，而不是对本发明范围或本发明权利要求范围的限制。
实施例1：索拉菲尼靶向缓释纳米脂质体的制备(PEG-SOR-NP)
称取二油酰基卵磷脂、胆固醇、壳聚糖、PEG-DSPE和SOR(30:4.5:2.75:5:2.12)(单位：mg)于100ml圆底烧瓶中，加入45mL甲醇与三氯甲烷的混合溶液(V甲醇:V三氯甲烷＝1:4)溶解，待溶解后往圆底烧瓶中加入15mL溶有吐温80的PBS中(0.01M，pH 7.4)，于60℃恒温摇床(150rpm)中水化1h，再利用探头超声均质7min，形成均匀的乳液，于65℃恒温水浴中旋转蒸发去除甲醇与三氯甲烷，待薄膜溶胀水合后所得悬浊液依次分别用孔径为0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤，得到水溶性PEG-SOR-NP。经检测(具体见图1)，粒径为(123.2±0.14)nm，PDI为0.296±0.038，呈球状，包封率为(76.3±1.72)％，载药量为(8.45±0.13)％。
实施例2：BMEC-Exo的分离及特征
在DMEM中培养大鼠BMSC，并添加10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。用差速离心法分离细胞上清液中的外显子。用体外无血清培养基培养48h，在500g离心5min后，取含外显子的BMSC培养上清液，2000g离心30min，4℃下离心30min，然后将细胞培养上清液与16％聚乙二醇6000在4℃过夜。细胞培养上清液先以10000g离心60min，然后以10万g超离心70min，去除蛋白质污染。纯化的外显子悬浮在PBS中，并保持在-80℃下进行长期保存，或在-20℃下进行短期保存。
透射电镜分析显示，从大鼠骨髓间充质干细胞中分离出的外泌体几乎呈圆形。此外，主要粒子的大小在110nm范围内，这表明纳米囊泡主要是外泌体(图2-3)。此外，westernblot显示外泌体表达CD9、CD63和CD81的特征性表面标记，这些标记通常用作外泌体的表面标记。
实施例3：外泌体联合索拉菲尼脂质体的制备(PEG-BMEC-Exo@SOR-NP)
称取DOPC、胆固醇、羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐、PEG-DSPE和SOR(30:4.5:2.75:5:2.12)(单位：mg)于100ml圆底烧瓶中，加入45ml甲醇与三氯甲烷的混合溶液(V甲醇:V三氯甲烷＝1:4)溶解，待溶解后往圆底烧瓶中加入15ml溶有BMEC-Exo的PBS中(0.01M，pH 7.4)，于60℃恒温摇床中水化1h，再利用探头超声均质10min，形成均匀的乳液，于55℃恒温水浴中旋转蒸发去除甲醇与三氯甲烷，待薄膜溶胀水合后所得悬浊液依次分别用孔径为0.45μm和0.22μm的微孔滤膜过滤，得到水溶性PEG-BMEC-Exo@SOR-NP。经检测(具体见图2)，粒径为(118.3±2.14)nm，PDI为0.216±0.038，呈球状，包封率为(89.8±3.72)％，载药量为(10.45±0.14)％。
实施例4：不同剂型脂质体对肝癌细胞的抑制作用
首先将对数生长期的人肝癌Huh-7细胞接种(约5×103个/孔)至96孔板中，培养24h。然后分别用PBS、DMSO配置高浓度的含索拉菲尼的不同脂质体储存液，用培养基对上述溶液进行稀释后，分别吸取200μL加入至含有Huh-7细胞的96孔板中，加样孵育72h后，用CCK-8法检测细胞活性。移除96孔板中原有的培养基，加入200μL含有10％(v/v)CCK-8试剂的新鲜培养基，并在37℃条件下孵育2h。然后，移除含有CCK-8的培养基，并用无菌PBS溶液洗涤3次。使用酶标仪测定在波长450nm处每个孔的吸光度值(A)。根据测量结果，按如下公式计算细胞存活率。
Figure BDA0003107234160000051
由图4可知，与SOR组相比，PEG-SOR-NPS组和PEG-BMEC-Exo@SOR-NP组在相同浓度条件下的肝癌细胞活性均明显降低，说明游离药物SOR对肝癌细胞的生长抑制能力较差，但将其包装于脂质体中或装载了BMEC-Exo，显示出一定的肿瘤细胞生长抑制活性，提示脂质体更易于被肿瘤细胞摄取，能够增强对肝癌细胞的杀伤作用，从而递送药物进入细胞中，增加药物的靶向作用和药物在肿瘤细胞的蓄积，具有潜在提高肿瘤治疗的效果。
实施例5：不同剂型脂质体的体内抗肿瘤作用
取对数生长期的Hep G2细胞调整到细胞浓度为5×106/mL，取100μL接种到24只8周龄清洁级的BALB/c裸鼠右后肢，10天后，如果能在该部位摸到肿块，则可成功建立动物模型。将24只随机分为4组，每组6只，分别注射PBS、SOR、PEG-SOR-NP、PEG-BMEC-Exo@SOR-NP。每只动物每次给药100μL。连续两周每隔一天给药一次，仔细观察小鼠的情况。每隔一天给小鼠称重，用游标卡尺定期测量肿瘤大小。肿瘤的相对体积计算如下：
Figure BDA0003107234160000061
Figure BDA0003107234160000062
由图5可得，SOR组相对于PBS组，肝癌细胞的活性进一步降低，肝脏肿瘤体积有所减少，与SOR组相比，PEG-BMEC-Exo在相同条件下的肝脏肿瘤体积在接种6天后明显减小，说明载入了索拉菲尼的骨髓间充质干细胞外泌体(BMEC-Exo)还可显著改善肿瘤新生血管的形成，对肿瘤细胞生长产生了一定的抑制作用，增强了对肝癌细胞的杀伤作用，对肿瘤治疗起到一定的效果。

Claims (10)

1.一种外泌体联合索拉非尼脂质体的构建方法，包括以下步骤：
(1)将索拉非尼和磷脂加入有机溶剂中，溶解混匀，得到索拉非尼磷脂复合物，再加入乳化剂、聚合物胶束剂，作为油相，所述索拉非尼和磷脂的质量比为1:5～1:25，优选1:15～1:20；所述有机溶剂为醇类或卤代烃或混合溶剂，优选的，所述醇类溶剂选自甲醇或乙醇，所述卤代烃溶剂选自二氯甲烷或三氯甲烷；
(2)将外泌体溶于PBS中，作为水相，将水相加入到步骤(1)制得的油相中，水化超声混匀形成水/油稳定初乳；
(3)将步骤(2)制备的水/油稳定初乳后处理得到外泌体联合索拉非尼脂质体。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述磷脂选自大豆磷脂、二月桂酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、蛋黄卵磷脂、二油酰基卵磷脂、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，优选为大豆磷脂、二油酰基卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，更优选二硬脂酰磷脂酰乙醇胺。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇与三氯甲烷的混合溶剂。
4.根据权利要求1-3任一项所述的构建方法，其特征在于，所述乳化剂选自胆固醇和聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂复合物、磷脂/胆固醇复合物，最优选胆固醇和聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂复合物。
5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述聚合物胶束剂选自聚乙二醇、O-羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐、羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐、透明质酸、聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物，优选羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐和聚乳酸-聚乙醇酸共聚物的一种或几种，最优选羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐。
6.根据权利要求1-5任一项所述的构建方法，其特征在于，所述外泌体选自细胞培养上清、血清、血浆、脑脊液、组织样本，所述细胞来源于内皮细胞、免疫细胞、平滑肌细胞、干细胞，优选干细胞，最优选骨髓间充质干细胞(BMSC)。
7.根据权利要求1-6任一项所述的构建方法，其特征在于，水化的时间为0.5-2小时，超声的时间为1～30分钟。
8.根据权利要求1-7任一项所述的构建方法，其特征在于，所述后处理为将水/油稳定初乳旋转蒸发，得到薄膜溶胀水合后所得悬浊液过滤得到外泌体联合索拉非尼脂质体。
9.一种外泌体联合索拉非尼脂质体的构建方法，包括以下步骤：
(1)将质量比为1：15的索拉非尼和磷脂加入甲醇和三氯甲烷的混合液中，溶解混匀，得到索拉非尼磷脂复合物，再加入胆固醇和PEG修饰的磷脂复合物、羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐乳化剂，作为油相；
(2)将骨髓间充质干细胞的外泌体溶于PBS中，作为水相，将水相加入到步骤(1)制得的油相中，水化超声混匀，形成水/油稳定初乳；
(3)将水/油稳定乳液旋转蒸发，得到薄膜溶胀水合后所得悬浊液过滤得到外泌体联合索拉非尼脂质体。
10.一种外泌体联合索拉非尼脂质体，其特征在于，采用权利要求1-9任一项所述方法制备。
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