CN108721643B - 一种用于免疫化疗的pH敏感脂质体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于免疫化疗的pH敏感脂质体及其制备方法和应用,本发明选择二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和大豆卵磷脂(SPC)为磷脂双分子层的基础材料,琥珀酸胆固醇单酯(CHEMS)为pH敏感材料(化学结构为胆固醇上醇羟基与琥珀酸上的羧基反应形成的单酯,既能与胆固醇一样发挥稳定剂的作用,又兼具酸敏感的功能),该系统以pH敏感性脂质体为基础,疏水层内包载化疗药物多西他赛杀伤肿瘤细胞;脂质体外层PEG链上接PD‑L1单抗,同时起主动靶向和检查点抑制功能。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于免疫化疗的pH敏感脂质体,具体涉及一种以琥珀酸胆固醇单酯(CHEMS)为pH敏感材料用来共递送多西他赛(DTX)和PD-LI单克隆抗体的新型pH敏感脂质载药系统。
背景技术
癌症作为一个世界性的重大健康问题,一直以来威胁着人们的生命。近年来研究者们在实体瘤的化疗中发现,仅针对肿瘤组织的单一化治疗方案取得的疗效是有限的,肿瘤细胞所处的环境——肿瘤微环境得到越来越多的关注。一方面,肿瘤微环境中的低氧酸性等条件导致细胞增殖异常,使药物难以扩散进入肿瘤组织进而无法取得理想疗;另一方面,靶向肿瘤微环境中存在的各种细胞从遗传学角度更加稳定因此更不容易发生耐受现象。而癌症患者免疫功能低下现象也与其息息相关。
几十年来由于抗癌药物研究的重要进展,化疗已成为癌症治疗最主要的手段之一。但是大部分化疗药物存在水溶性较低、生物利用度较差、缺乏选择性、副作用等问题;同时,化疗手段本身也存在着许多限制,如药物耐受,体内循环差,全身毒性等,大大限制了其临床应用。其中典型的小分子化疗药物如多西他赛(Docetaxel),作为紫杉烷类的衍生物,现已广泛应用于乳腺癌,卵巢癌及非小细胞肺癌等癌症的临床治疗。其抗肿瘤机制是诱导微管蛋白的聚合和去多聚化,形成稳定非功能性的维管束,将细胞的有丝分裂阻断于G2/M阶段,阻断细胞的增殖。临床上市的制剂和中均存在以上提及的疗效低和副作用大等缺点。
而作为新兴治疗手段的免疫治疗在最近几年不断有重大突破。CAR-T疗法、检查点抑制剂、个性化疫苗的上市为癌症治疗提供了更多的可能性。其中PD1/PD-L1通路是肿瘤微环境中主要免疫抑制通路之一,该通路能够诱导肿瘤细胞的“免疫逃逸”现象,使免疫系统功能下调,阻碍机体对肿瘤组织的杀伤。PD-L1受体广泛表达于各类肿瘤细胞表面,可作为特异性的生物标记物,用于靶向定位。且通过与PD-L1受体结合来阻断抑制通路不会对机体自身免疫造成额外影响。目前已有FDA批准的PD1单抗、PD-L1单克隆抗体用于阻断该通路解除免疫抑制,并显示出良好的治疗效果。但该类药物也存在给药剂量大,个体选择性强,具有全身毒性等缺点。
针对以上两种药物的特点,通过纳米材料、生物技术和物理化学等多学科理论综合设计靶向的脂质体载体,实现肿瘤的精准靶向治疗,进一步提高药物疗效,降低毒副作用,具有极高的应用前景。
脂质体应用于多种药物与基因的递送系统,在临床治疗上显示出良好的治疗效果。其作为靶向给药系统,具有以下作用特点:
(1)生物相容性良好,对人体无免疫抑制作用;
(2)制备工艺简单,可分为注入法、薄膜分散法、复乳法、pH梯度法、醋酸铵梯度法等;
(3)既可以递送水溶性的药物和脂溶性的药物,又可以递送基因/多肽/蛋白质等生物大分子药物;
(4)适合口服、静脉注射、透皮吸收、局部等多途径给药;
(5)能有效地保护被包裹药物,避免药物被酶等物质降解、破坏,增加药物的体内外稳定性;
(6)降低体内消除速度,具有定向分布的靶向性特征,降低药物毒副作用,减轻机体的免疫反应及变态反应。
目前pH敏感脂质体用于肿瘤治疗的研究较为广泛,鉴于肿瘤组织的复杂性,仅负载化疗药物杀伤肿瘤细胞的单一载药体系无法满足实际需要,因此亟待一种可同时杀伤肿瘤细胞和调节肿瘤微环境的新型药物递送系统。
发明内容
针对上述现有技术,本发明提供了一种同时负载多西他赛(DTX)和PD-L1单抗的pH敏感脂质体,本发明所选用的载体材料为DOPE/SPC/CHEMS/DSPE-PEG-NHS,无毒性、无致热性、无致敏性、无致畸致癌作用,具有良好的生物相容性。内层包裹的多西他赛可直接对肿瘤细胞造成杀伤,外侧连接的PD-L1抗体在帮助脂质体更好靶向的同时也使机体恢复强大的免疫能力。
本发明的目的之一是提供一种pH敏感免疫脂质体。
本发明的目的之二是提供所述pH敏感免疫脂质体的制备方法。
本发明的目的之三是提供所述pH敏感免疫脂质体的一种应用。
为实现上述目的,本发明具体采用的技术方案如下:
首先,本发明提供了一种pH敏感免疫脂质体,是由以下物质的量的原料药和辅料制成的:二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE):大豆卵磷脂(SPC):琥珀酸胆固醇单酯(CHEMS):二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-PEG2000-NHS):多西他赛(DTX)=(80~120):(80~120):(80~120):(3~7):(4~8),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-m聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-mPEG-NHS)物质的量占脂质总物质的量的1~3%,其中,2000<m≤5000,二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-m聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-mPEG-NHS)与PD-L1的物质的量比为(8~12):(0.8~1.2)。
其次,本发明提供了一种所述pH敏感免疫脂质体的制备方法,该方法包括:
将设定比例的DOPE、SPC、CHEMS、DSPE-PEG2000-NHS、DTX溶于有机溶剂中,混匀后进行旋蒸去除有机溶剂,得到DOPE/SPC/CHEMS/DSPE-PEG2000-NHS/DTX反应体系;
然后向所述反应体系中加入磷酸盐缓冲溶液进行水化,即得到未修饰的脂质体;
将设定比例的DSPE-mPEG-NHS和PD-L1抗体混合避光搅拌,即得mPEG-抗体共聚物胶束;
最后将所述未修饰的脂质体和所述mPEG-抗体共聚物胶束混合搅拌,即得pH敏感免疫脂质体。
最后,本发明提供了一种所述pH敏感免疫脂质体在制备靶向治疗肿瘤细胞药物中的应用。
与现有技术相比,本发明的技术方案具有以下有益效果:
(1)本发明选择二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和大豆卵磷脂(SPC)为磷脂双分子层的基础材料,琥珀酸胆固醇单酯(CHEMS)为pH敏感材料(化学结构为胆固醇上醇羟基与琥珀酸上的羧基反应形成的单酯,既能与胆固醇一样发挥稳定剂的作用,又兼具酸敏感的功能),DSPE-PEG2000-NHS用于在血液循环中不被网状内皮系统识别吞噬从而起来长循环作用,该系统以pH敏感性脂质体为基础,疏水层内包载化疗药物多西他赛杀伤肿瘤细胞;脂质体外层mPEG链上接PD-L1单抗,同时起主动靶向和检查点抑制功能。当该脂质体进入肿瘤微环境,能够特异性的与肿瘤细胞表面PD-L1抗原结合并解除免疫系统的负反馈,同时通过受体介导的内吞作用进入细胞释放多西他赛致其凋亡,最终达到对肿瘤生长的多重抑制。
(2)该载药系统的优点是制备工艺简单,成功的将免疫治疗和化疗结合达到联合治疗的效果,增强了肿瘤细胞的响应性,最终达到精准治疗的目的。
(3)本发明的pH敏感免疫脂质体,可以达到缓释、长循环、提高疗效、降低副作用、达到联合治疗、精准医疗的目的。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为pH敏感免疫脂质体的粒径分布图。
图2为pH敏感免疫脂质体的透射电镜图。
图3为pH敏感免疫脂质体的体外释放曲线。
图4为pH敏感免疫脂质体的细胞毒性试验(24h)。
图5为pH敏感免疫脂质体的细胞毒性实验(48h)。
图6为pH敏感免疫脂质体的体内抑瘤率实验。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的,现有技术中负载化疗药物杀伤肿瘤细胞的单一载药体系无法满足实际需要,为了解决如上的技术问题,本发明提出了一种pH敏感免疫脂质体,是由以下物质的量的原料药和辅料制成的:二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE):大豆卵磷脂(SPC):琥珀酸胆固醇单酯(CHEMS):二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-PEG2000-NHS):多西他赛(DTX)=(80~120):(80~120):(80~120):(3~8)(4~8),二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-m聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-mPEG-NHS)的量占脂质(所述脂质为DOPE、SPC和CHEMS)总物质的量为1~3%,其中,m为聚乙二醇的聚合度,2000<m≤5000,二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-m聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-mPEG-NHS)与PD-L1的物质的量比为(8~12):(0.8~1.2)。
经验证,加入的PD-L1抗体有70~90%可成功连接至脂质体表面。
在本发明一个优选的实施方式中,所述pH敏感免疫脂质体,是由以下物质的量的原料药和辅料制成的:二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE):大豆卵磷脂(SPC):琥珀酸胆固醇单酯(CHEMS):二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-PEG2000-NHS):多西他赛(DTX)=100:100:100:5:6,二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-m聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-mPEG-NHS)的量为2%,二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-m聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-mPEG-NHS)与PD-L1的物质的量比为10:1。经大量实验验证,选择上述比例的材料制成的pH敏感免疫脂质体粒径较小,粒径分布均匀,分散性好,包封率和载药率均较高。
在本发明一个优选的实施方式中,所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-mPEG-NHS)中的聚乙二醇聚合度为3400~5000;进一步优选的为DSPE-PEG3400-NHS。经大量实验验证,选择上述的DSPE-PEG3400-NHS制成的pH敏感免疫脂质体稳定性较高。
在本发明一个典型的实施方式中,提供一种所述pH敏感免疫脂质体的制备方法,该方法包括:
将设定比例的DOPE、SPC、CHEMS、DSPE-PEG2000-NHS、DTX溶于有机溶剂中,混匀后进行旋蒸去除有机溶剂,得到DOPE/SPC/CHEMS/DSPE-PEG2000-NHS/DTX反应体系;
然后向所述反应体系中加入磷酸盐缓冲溶液进行水化,即得到未修饰的脂质体;
将设定比例的DSPE-mPEG-NHS和PD-L1抗体混合避光搅拌,即得mPEG-抗体共聚物胶束;
最后将所述未修饰的脂质体和所述mPEG-抗体共聚物胶束混合搅拌,即得pH敏感免疫脂质体。
在本发明一个优选的实施方式中,所述有机溶剂为三氯甲烷。
在本发明一个优选的实施方式中,旋蒸速度为100~150rpm/min;进一步优选的,所述旋蒸速度为120rpm/min。
在本发明一个优选的实施方式中,水化温度为35~45℃,水化时间为0.5~1.5h;进一步优选的,水化温度为40℃,水化时间为1h。
在本发明一个优选的实施方式中,避光搅拌时间为3~5h;进一步优选的,所述避光搅拌时间为4h。
在本发明一个优选的实施方式中,所述未修饰的脂质体和所述mPEG-抗体共聚物胶束混合搅拌温度为55~60℃,搅拌时间为3~5h;进一步优选的,所述未修饰的脂质体和所述mPEG-抗体共聚物胶束混合搅拌温度为59℃,搅拌时间为4h。
本发明从磷脂双分子层材料、pH敏感材料、组成配比、制备工艺等方面,全面考察了脂质体的稳定性、包封率、载药率、体外释放曲线、体内抑瘤率等,设计和筛选获得了性质稳定、包封率高、治疗效果好等的pH敏感免疫脂质体。具体到脂质成分而言,本发明筛选优化得到,二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和大豆卵磷脂(SPC)为磷脂双分子层的基础材料,琥珀酸胆固醇单酯(CHEMS)为pH敏感材料,DSPE-PEG2000-NHS用于在血液循环中不被网状内皮系统识别吞噬从而起来长循环作用;以pH敏感性脂质体为基础,疏水层内包载化疗药物多西他赛杀伤肿瘤细胞;脂质体外层PEG链上接PD-L1单抗,同时起主动靶向和检查点抑制功能。
本发明通过选择适当的材料成分,采用合适的制备工艺,所制备得到的pH敏感免疫脂质体粒径小(120nm左右),粒径大小分布均匀,包封率大于90%。
在本发明一个典型的实施方式中,提供了一种所述pH敏感免疫脂质体在制备靶向治疗肿瘤细胞药物中的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
按DOPE:SPC:CHEMS:DSPE-PEG2000-NHS:DTX=100:100:100:5:6的的摩尔比将上述材料溶于氯仿中,以120rpm/min的转速置于旋转蒸发仪上进行旋蒸,待蒸干溶剂后继续旋转15min以去除残留溶剂,即得均匀透亮的脂质薄膜。
然后向瓶内加入磷酸盐缓冲溶液(PBS)后置于40℃水浴中以12000rpm/min搅拌水化1h,即得均一的脂质体溶液。
预先将DSPE-PEG3400-NHS与抗体以10:1的摩尔比混合于室温下避光搅拌4h,得PEG-抗体共聚物胶束。
将该PEG-抗体共聚物胶束与脂质体溶液以1:100的摩尔比混合,于59℃水浴4h即得抗体修饰的免疫脂质体。所制得的pH敏感免疫脂质体平均粒径为126.8nm,如图1所示,透射电镜照片如图2所示,脂质体分散性好。
实施例2
按DOPE:SPC:CHEMS:DSPE-PEG2000-NHS:DTX=100:100:100:6:6的的摩尔比将上述材料溶于氯仿中,以120rpm/min的转速置于旋转蒸发仪上进行旋蒸,待蒸干溶剂后继续旋转15min以去除残留溶剂,即得均匀透亮的脂质薄膜。
然后向瓶内加入磷酸盐缓冲溶液(PBS)后置于40℃水浴中以12000rpm/min搅拌水化1h,即得均一的脂质体溶液。
预先将DSPE-PEG5000-NHS与抗体以10:1的摩尔比混合于室温下避光搅拌4h,得PEG-抗体共聚物胶束。
将该PEG-抗体共聚物胶束与脂质体溶液以1:100的摩尔比混合,于59℃水浴4h即得抗体修饰的免疫脂质体。
实施例3
按实施例1制得pH敏感免疫脂质体。利用离心法将脂质体与游离DTX分离,通过高效液相测定其包封率(EE%)和载药量(DL%),所得结果如表1所示。
由表1可知,脂质体包封率高达90%,证明该载体系统能够有效的包载药物,从而使更多的药物进入到靶向部位发挥作用。
表1 pH敏感免疫脂质体的包封率和载药量
实施例4
按实施例1制得pH敏感免疫脂质体。利用动态膜透析法,分别考察游离DTX和脂质体在pH7.4和pH5.0磷酸盐缓冲液中的释放规律,所得释放曲线如图3所示。
由图3可知,在pH7.4的PBS中,该脂质体比游离药物释放速率要慢,在72h时累计释放率才为62.41%,明显延长药物释放行为,保证了到达靶组织前脂质体的稳定性;在pH7.4和pH5.0两种释放介质中的释放特性相比较,游离药物体外释放无pH敏感性,而该脂质体的体外释放具有明显的pH敏感性,在pH5.0介质中药物能较快速地从脂质体中释放出来,72h释放量可达90.03%,高于在pH7.4介质中的释放量,说明制剂在理想的靶向部位可快速释放药物,从而发挥后续作用。由此说明该脂质体制剂可以延长药物的作用时间,对酸性环境相应能力较好,能够提高治疗效果。
实施例5
按实施例1制得pH敏感免疫脂质体。取对数生长期的B16-F10细胞,分别经胰蛋白酶消化收集离心,用含10%小牛血清的相应培养基稀释成6×104个/mL的细胞混悬液,每孔100μL接种到96孔板中,37℃,5%CO2培养过夜。制备游离DTX和载DTX得脂质体用相应培养基稀释至0.002,0.02,0.2,2,20μg/mL的浓度,制剂对照组为同浓度范围的多西他赛溶液组DTX-sol(用含0.3%DMSO的培养液稀释),对照组为空白细胞培养液(不含多西他赛),每组各浓度均平行6孔,每孔加样100μL。培养24h,48h后,然后,加入CCK-8溶液培养1h,设定450nm为检测波长,用酶联免疫仪测定各孔吸光度值。计算相应的细胞存活率与抑制率(公式如下):
细胞活力(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(未加药)-A(空白)]×100
A(加药):具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度
A(空白):具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度
A(未加药):具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度测定不同浓度DTX和脂质体对B16-F10的细胞毒性如图4所示。
由图4可知,不同浓度的游离DTX和脂质体对B16-F10细胞毒性均有明显剂量和时间依赖性,且脂质体的细胞抑制率较游离DTX组高。免疫脂质体显著提高细胞毒性,抑制肿瘤细胞生长。
实施例6
按实施例1制得pH敏感免疫脂质体。在6-8周得C57BL/6雌性小鼠皮下左前肢皮下注射1x106个B16-F10黑色素瘤细胞,待肿瘤长到100mm3时,将荷瘤小鼠随机分为5组:PBS组、Isotype组、单独给与DTX组、联合给与游离药物组、免疫脂质体组。给药剂量为10mg/kg,每三天尾静脉给药一次。5次给药后给与所有小鼠安乐死。肿瘤大小在每次给药时用游标卡尺测量,其体积由以下公式计算:肿瘤体积=0.5×肿瘤长度×肿瘤宽度2。测定结果如图5和图6所示。
由图5可知,直接给与两种游离药物的联合比单独给与DTX的肿瘤抑制率高,表明抗体确实能够增强小鼠的抗肿瘤免疫,抑制肿瘤生长。但观察免疫脂质体的曲线可以看出,该组的抑瘤率明显高于其他组,肿瘤体积在实验结束时几乎没有增大,进一步验证了制剂的强肿瘤抑制效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1.一种pH敏感免疫脂质体,其特征是,pH敏感免疫脂质体由两部分组成:未修饰的脂质体和mPEG-抗体共聚物胶束;
其中,未修饰的脂质体是由以下物质的量的原料药和辅料制成的:二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE):大豆卵磷脂(SPC):琥珀酸胆固醇单酯(CHEMS):二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-PEG2000-NHS):多西他赛(DTX)=80~120:80~120:80~120:3~7:4~8;
mPEG-抗体共聚物胶束包含设定比例的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-m聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-mPEG-NHS)和PD-L1抗体,其中,DSPE-mPEG-NHS物质的量占脂质总物质的量的1~3%,2000<m≤5000,DSPE-mPEG-NHS与PD-L1的物质的量比为8~12:0.8~1.2;
所述pH敏感免疫脂质体的制备方法为:
将设定比例的DOPE、SPC、CHEMS、DSPE-PEG2000-NHS、DTX溶于有机溶剂中,混匀后进行旋蒸去除有机溶剂,得到DOPE/SPC/CHEMS/DSPE-PEG2000-NHS/DTX反应体系;
然后向所述反应体系中加入磷酸盐缓冲溶液进行水化,即得到未修饰的脂质体;
将设定比例的DSPE-mPEG-NHS和PD-L1抗体混合避光搅拌,即得mPEG-抗体共聚物胶束;
最后将所述未修饰的脂质体和所述mPEG-抗体共聚物胶束混合搅拌,即得pH敏感免疫脂质体。
2.如权利要求1所述的pH敏感免疫脂质体,其特征是:二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE):大豆卵磷脂(SPC):琥珀酸胆固醇单酯(CHEMS):二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-PEG2000-NHS):多西他赛(DTX)=100:100:100:5:6;
二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-m聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-mPEG-NHS)物质的量占脂质总物质的量的2%,二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-m聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-mPEG-NHS)与PD-L1的物质的量比为10:1。
3.如权利要求1所述的脂质体,其特征是:所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-m聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-mPEG-NHS)中的聚乙二醇聚合度为3400~5000。
4.如权利要求3所述的脂质体,其特征是:所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-m聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-mPEG-NHS)中的聚乙二醇聚合度为3400。
5.如权利要求1所述的脂质体,其特征是:所述有机溶剂为三氯甲烷。
6.如权利要求1所述的脂质体,其特征是:旋蒸速度为100~150rpm/min。
7.如权利要求6所述的脂质体,其特征是:旋蒸速度为120rpm/min。
8.如权利要求1所述的脂质体,其特征是:水化温度为35~45℃,水化时间为0.5~1.5h。
9.如权利要求8所述的脂质体,其特征是:水化温度为40℃,水化时间为1h。
10.如权利要求1所述的脂质体,其特征是:避光搅拌时间为3~5h。
11.如权利要求10所述的脂质体,其特征是:避光搅拌时间为4h。
12.如权利要求1所述的脂质体,其特征是:所述未修饰的脂质体和所述mPEG-抗体共聚物胶束混合搅拌温度为55~60℃,搅拌时间为3~5h。
13.如权利要求1所述的脂质体,其特征是:所述未修饰的脂质体和所述mPEG-抗体共聚物胶束混合搅拌温度为59℃,搅拌时间为4h。
14.权利要求1~13任一项所述的pH敏感免疫脂质体在制备靶向治疗肿瘤细胞药物中的应用。
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