CN104825394A - 靶向肿瘤相关成纤维细胞的脂质体载药系统 - Google Patents

Abstract

本发明属药物制剂领域，涉及一种靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，该脂质体表面用肿瘤相关成纤维细胞特异性表达蛋白的高亲和力配体修饰。本发明的靶向载药脂质体可以将药物靶向递送至肿瘤相关成纤维细胞内，通过作用于肿瘤相关成纤维细胞，进而对肿瘤微环境进行干预，实现肿瘤治疗作用。同时该肿瘤相关成纤维细胞靶向制剂还可与常规肿瘤细胞靶向纳米制剂联合用药，增强其抗肿瘤效果。

Description

靶向肿瘤相关成纤维细胞的脂质体载药系统

技术领域

本发明涉及药物制剂技术及肿瘤治疗领域，特别涉及一种肿瘤相关成纤维细胞靶向的脂质体载药系统。具体涉及将肿瘤相关成纤维细胞特异性表达蛋白高亲和力结合的多肽修饰包载肿瘤相关成纤维细胞选择性或者非选择性药物的脂质体，制备新型肿瘤相关成纤维细胞靶向载药脂质体及其医药用途。

背景技术

在抗肿瘤研究中，主动靶向脂质体给药系统的研究已经相当成熟，但在目前的研究中，绝大部分的靶向制剂均是靶向肿瘤细胞本身的。虽然靶向肿瘤细胞给药系统能够达到直接的肿瘤抑制作用，但是由于肿瘤是一个复杂而异质化组织，除了肿瘤细胞本身之外的成分在肿瘤的进展中发挥巨大的作用，特别是肿瘤微环境中的肿瘤相关成纤维细胞，都能够间接影响肿瘤增殖以及纳米制剂的抗肿瘤疗效。本发明通过构建针对肿瘤相关成纤维细胞的靶向载药脂质体，实现肿瘤的间接治疗作用。

肿瘤微环境，即肿瘤细胞产生和生活的内环境，其中包括了肿瘤细胞与其周围的成纤维细胞(肿瘤相关成纤维细胞)、免疫和炎症细胞(肿瘤相关巨噬细胞)、胶质细胞和肿瘤内皮细胞等基质细胞，同时也包括细胞外基质、肿瘤微血管等生物活性分子。肿瘤微环境中细胞‐细胞相互作用，细胞‐细胞基质相互作用能够诱导产生大量的生长因子、诱导因子和细胞因子等，在基质细胞在在肿瘤的发生发展中具有至关重要的作用，是肿瘤细胞赖以生存的物质基础。因此，以肿瘤微环境为治疗靶标成为新的抗肿瘤研究热点。

在实体肿瘤微环境的基质细胞中，数量最丰富的是肿瘤相关成纤维细胞。在肿瘤进展中，肿瘤相关成纤维细胞旁分泌多种细胞因子，作用于肿瘤细胞和肿瘤基质细胞：高表达固生蛋白C，增强癌细胞的侵袭性；分泌成纤维细胞活化蛋白，促进肿瘤的局部浸润等；分泌表皮生长因子等，诱导肿瘤细胞的耐药性。除此之外，肿瘤相关成纤维细胞还能通过合成大量胶原蛋白，形成致密的肿瘤组织，导致肿瘤内异常升高的间质压，为肿瘤细胞提供物理屏障作用，进一步削弱纳米制 剂在肿瘤内部的穿透性。这也是纳米制剂体内抗肿瘤疗效不佳的主要原因之一。

基于肿瘤相关成纤维细胞对肿瘤发生、发展以及纳米制剂肿瘤治疗效果的重要作用，借鉴传统靶向肿瘤细胞纳米制剂的思路，本发明拟构建一种新型主动靶向肿瘤相关成纤维细胞的纳米载药系统，采用肿瘤相关成纤维细胞高表达蛋白的高亲和力配体(例如，FHKHKSPALSPVGGG和SCDYNHHWC分别是肿瘤相关成纤维细胞特异性高表达的固生蛋白C和成纤维细胞活化因子的高亲和力配体)修饰脂质体，并包载肿瘤相关成纤维细胞选择性(Navitoclax)或者非选择性药物(阿霉素、紫杉醇等常见化疗药物)，可将药物靶向递送至肿瘤相关成纤维细胞内，靶向作用于肿瘤相关成纤维细胞，并发挥出抗肿瘤作用。同时，本发明的靶向脂质体，还可通过改善肿瘤微环境，增强化疗药物纳米制剂抗肿瘤药效的作用。

其中FHKHKSPALSPVGGG(FH多肽)是在2012年通过噬菌体筛选技术获得的，能够与肿瘤相关成纤维细胞特异性表达的固生蛋白(TNC)高亲和力结合的多肽配体(Mee Young Kim,Ok Ran Kim,et.al.(2012).Selection and Characterization of Tenascin C Targeting Peptide.Molecules and Cells.33.71-77)。

SCDYNHHWC(SC多肽)是在2012年通过噬菌体筛选技术得到的，能够与肿瘤相关成纤维细胞特异性表达的成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的多肽配体(一种结合FAP的多肽，刘敏，2012105258148)。

发明内容

本发明的目的是构建一种靶向肿瘤相关成纤维细胞的脂质体载药系统，以实现主动靶向的同时特异性抑制肿瘤相关成纤维细胞的目的。具体是将载药脂质体表面用肿瘤相关成纤维细胞特异性表达蛋白的高亲和力配体修饰。本发明的靶向肿瘤相关成纤维细胞的脂质体载药系统可以通过抑制肿瘤组织内肿瘤相关成纤维细胞直接发挥抗肿瘤作用，也可以通过改善肿瘤微环境，增强化疗药物纳米制剂的抗肿瘤药效。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

本发明提供一种靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，该脂质体表面用肿瘤相关成纤维细胞特异性表达蛋白的高亲和力配体修饰。

本发明提供的靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，修饰用的配体选自FHKHKSPALSPVGGG(FH多肽)、SCDYNHHWC(SC多肽)以及包括上述序列的线 性多肽、环状多肽。其中，FHKHKSPALSPVGGG多肽是通过噬菌体筛选技术得到的能够与肿瘤相关成纤维细胞特异性表达的固生蛋白高亲和力结合配体，SCDYNHHWC多肽也是通过噬菌体筛选技术得到的能够与肿瘤相关成纤维细胞特异性表达的成纤维活化蛋白高亲和力结合配体。根据本领域专业人员的常识，基于相同序列的线性肽和环肽修饰脂质体，都能实现脂质体对相应受体或蛋白的靶向作用。

本发明提供的靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，脂质体的组成包括磷脂、胆固醇、聚乙二醇修饰的磷脂和导向化合物。这些成份的使用量基于本领域中脂质体制备中各组份的常用使用范围。例如，脂质体各组分之间的摩尔比可为：磷脂:胆固醇＝5:1～1:5，磷脂:聚乙二醇修饰的磷脂＝1000:1～1000:100，磷脂:导向化合物＝1000:0.1～1000:100。

药物与脂质体的比例可为1:100～1：1。

本发明提供的靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，所述导向化合物是通过将配体连接在聚乙二醇修饰的磷脂的聚乙二醇末端或通过配体连接在磷脂上或通过配体修饰在胆固醇上得到的，优选是将配体连接在聚乙二醇修饰的磷脂的聚乙二醇末端。

本发明提供的靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，所述磷脂以及聚乙二醇修饰的磷脂中的磷脂可选自大豆磷脂(SPC)，二月桂酰卵磷脂(DLPC)、二肉豆蔻酰卵磷脂(DMPC)、二棕榈酰卵磷脂(DPPC)、二硬脂酰卵磷脂(DPPC)、二硬脂酰卵磷脂(DSPC)、1‐肉豆蔻酰‐2‐棕榈酰卵磷脂(MPPC)、1‐棕榈酰‐2‐肉豆蔻酰卵磷脂(PMPC)、1‐棕榈酰‐2‐硬脂酰卵磷脂(PSPC)、1‐硬脂酰‐2‐棕榈酰卵磷脂(SPPC)、蛋黄卵磷脂(EPC)、氢化豆磷脂(HSPC)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二棕榈脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸(DPPS)、脑磷脂酰丝氨酸(PS)、脑神经鞘磷脂(BSP)、二棕榈酰神经鞘磷脂(DPSP)、二硬脂酰神经鞘磷脂(DSSP)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、氢化大豆磷脂酰乙醇胺(HSPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)之一种或多种。其中，所述磷脂优 选为优选大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂和氢化大豆卵磷脂，所述聚乙二醇修饰的磷脂优选为二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、氢化大豆磷脂酰乙醇胺(HSPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、大豆磷脂酰乙醇胺(SPE)中的一种，更优选为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)。

本发明提供的靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，所述导向化合物是配体连接在二硬脂酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇的聚乙二醇末端得到的，连接方法一般是通过配体多肽末端氨基与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇活泼酯反应或通过本领域其它常见的合成方法，得到配体共价连接在二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇末端。其中，所述导向化合物优选为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇－FHKHKSPALSPVGGG。

本发明提供的靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，所述药物选自肿瘤相关成纤维细胞选择性作用药物或非选择性作用药物。其中按重量百分数计算，药物与总脂材的比例可为1:100～1：1，具体可根据脂质体处方所能包载药物的量以及药物的剂量等确定。肿瘤相关成纤维细胞选择性作用药物是指能够对肿瘤相关成纤维细胞产生选择性细胞杀伤作用，而对普通的成纤维细胞以及其他正常细胞没有作用或者毒性较低的药物；非选择性作用药物则是常规的细胞毒类药物，对肿瘤细胞、肿瘤相关成纤维细胞以及其他细胞均能产生杀伤抑制作用，不具有选择性。

本发明提供的靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，其中，所述肿瘤相关成纤维细胞选择性作用药物优选Navitoclax。Navitoclax能够选择性诱导肿瘤相关成纤维细胞的凋亡，但是对肿瘤细胞以及正常的成纤维细胞等毒性很低。

本发明提供的靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，其中，所述肿瘤相关成纤维细胞非选择性作用药物包括阿霉素、表阿霉素、顺铂、柔红霉素、紫杉醇、多西他赛、喜树碱或羟基喜树碱。

本发明还提供靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体的制备方法，包括本领域脂质体制备的常用方法，如薄膜超声法、主动载药法、逆相蒸发法和薄膜挤出法等，可以一步制备载药靶向脂质体，或先制备空白的靶向脂质体，通过本领域常规的方法装载到脂质体中。

特别地，本发明提供了一种靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体及其制备 方法，所述药物是Navitoclax，磷脂是蛋黄卵磷脂，导向化合物是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇－FHKHKSPALSPVGGG，所述制备方法包括以下步骤：a称取处方量的各组分于茄形瓶中，加入有机溶剂完全溶解后，20‐40℃下减压旋蒸，形成脂质薄膜；b用水浴至20‐40℃的磷酸盐缓冲液或葡萄糖溶液水化a步骤中得到的脂质薄膜，涡旋后进行水浴超声或者探头超声至形成蓝色乳光；c用Sephadex G‐50凝胶柱纯化b步骤得到的载药脂质体，并过0.22μm的过滤器，即得到脂质体。

步骤a所述的有机溶剂优选：氯仿、二氯甲烷、甲醇，更优选的是氯仿。

优选的，本发明载药脂质体的制备方法，包括以下步骤：

FH多肽-脂质体/Navitoclax(FH‐SSL‐Nav)

蛋黄卵磷脂/胆固醇/二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇/二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇‐FH多肽的摩尔比10:5:0.95:0.05。

按脂材：药物＝20：1(质量比)，精密称取各处方量的脂材及药物Navitoclax，用氯仿溶解于茄形瓶中，于37℃减压旋蒸，以除去有机溶剂形成薄膜。取适量37℃预热的磷酸缓冲液(pH＝7.4)加入茄形瓶中，涡旋振荡至膜完全脱落后，转移至EP管中，于冰水浴中进行探头超声。探头超声条件为33W,工作2s，间歇2s，超声5min至出现淡蓝色乳光即形成脂质体。用0.2μm滤膜过滤脂质体溶液后，再过Sephadex G-50凝胶柱，以磷酸缓冲液洗脱，除去未包载的游离Navitoclax。采用动态光散射法测定脂质体的粒径。

本发明还提供了所述载药脂质体在制备治疗抗肿瘤的药物中的应用。

本发明所形成的药物靶向脂质体可通过靶向作用肿瘤相关成纤维细胞单独发挥肿瘤治疗作用，也可与传统化疗药物纳米制剂联合用药，增强传统化疗药物纳米制剂的抗肿瘤药效。

其中所述的传统化疗药物纳米制剂，其特征在于，所述纳米制剂包括但不仅限于：脂质体、胶束、纳米粒、纳米囊、乳剂、微球、固体脂质体、树枝状大分子。所述的化疗药物包括但不限于：烷化剂、抗代谢药、蒽环类抗生素、抗肿瘤抗生素、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂、紫杉醇衍生物、单克隆抗体、光敏剂、激酶抑制剂和含铂化合物。本发明的靶向载药脂质体可增加这些纳米制剂向肿瘤深部的渗透。

本发明与现有技术相比，本发明的靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体具有以下优点：

1、本发明所针对的细胞为肿瘤相关成纤维细胞，在肿瘤的进展，特别是肿瘤转移、肿瘤耐药、肿瘤血管生成等方面中具有重要作用，通过靶向作用该细胞，可间接发挥抗肿瘤作用，并降低毒性。

2、肿瘤相关成纤维细胞与肿瘤细胞相比其遗传性质稳定而不宜产生耐药性，因此，靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体可发挥持续的和稳定的作用。

3、本发明能够改善肿瘤微环境，显著增强纳米制剂在肿瘤内的穿透性，从而增强化疗药物纳米制剂的抗肿瘤药效。

4、本发明所使用的配体FH多肽和SC多肽均是肿瘤相关成纤维细胞特异性表达的蛋白，将其作为配体对脂质体进行修饰，可以将所载药物主动靶向递送至肿瘤基质中的肿瘤相关成纤维细胞。目前还没有将其作为靶头配体对载药系统进行修饰。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为FH多肽-脂质体/Navitoclax(左图A)与脂质体/Navitoclax(右图B)的粒径分布图，两者的平均粒径在100nm左右，多分散系数均在0.15左右，FH多肽修饰对脂质体粒径基本无影响。

图2为FH多肽-脂质体/Navitoclax的透射电镜图(醋酸铀染色)。脂质体为球形或类球形结果，外观完整，粒径均匀。

图3为采用HPLC法检测LX-2细胞对不同脂质体的摄取结果。FH多肽-脂质体/Navitoclax的摄取量显著高于脂质体/Navitoclax，而且该作用可以被游离的FH多肽所拮抗。因此，FH多肽修饰的Navitoclax脂质体通过FH多肽与细胞表面受体的相互作用而对肿瘤相关成纤维细胞具有靶向性。

图4为不同Navitoclax主被动脂质体抑制肿瘤组织成纤维细胞的共聚焦图，不同Navitoclax制剂均能在不同程度上抑制瘤内的肿瘤相关成纤维细胞，其中FH修饰的靶向制剂具有最佳的肿瘤相关成纤维细胞抑制药效。

图5为靶向肿瘤相关成纤维细胞载药脂质体给药后，对DiR脂质体在荷Hep G2肿瘤裸鼠体内分布的活体成像结果。与生理盐水处理组相比，荧光信号在FH多 肽-脂质体/Naviticlax处理组的肿瘤组织内蓄积量显著增强，且在1小时即有明显的蓄积，说明靶向肿瘤相关成纤维细胞载药脂质体能够改善肿瘤组织的穿透性，促进纳米制剂在肿瘤内的蓄积及穿透。

图6为靶向肿瘤相关成纤维细胞载药脂质体与阿霉素脂质体体内单一或者联合给药，荷Hep G2肿瘤裸鼠的肿瘤相对体积时间变化图。肿瘤相关成纤维细胞靶向脂质体与阿霉素脂质体的联合给药能够显著抑制肿瘤的生长，达到最佳的疗效。(说明：**p<0.01vs.生理盐水组,##p<0.01vs.阿霉素脂质体组,^^p<0.01vs.主动Nav脂质体组,※※p<0.01vs.游离Nav+阿霉素脂质体组,♀p<0.05vs.被动Nav脂质体+阿霉素脂质体)

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明和解释本发明，但不作为本发明的限制。

实施例1、靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体的制备

1.导向化合物的合成

称取一定量NHS活泼酯化的聚乙二醇修饰的磷脂和多肽粉末(摩尔比为2：1)，分别溶解于无水二甲基甲酰胺中。待粉末完全溶解后，将多肽溶液先转移至茄形瓶中，在磁力搅拌下将NHS活泼酯化的聚乙二醇修饰的磷脂溶液逐滴加入至多肽溶液中。混合均匀后，再加入适量三乙胺，调节反应液pH至8.0～9.0，于室温下避光氮气保护下反应96h。在反应过程中，通过薄层色谱法跟踪反应进程。反应终点时，透析、冻干得到导向化合物。

其中NHS活泼酯化的聚乙二醇修饰的磷脂可以是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇‐NHS活泼酯、二油酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇‐NHS活泼酯、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇‐NHS活泼酯中的一种，多肽是FH多肽和SC多肽中的一种。

1.FH多肽-脂质体/Navitoclax的制备与表征 

脂质体/Navitoclax(SSL‐Nav)与FH多肽-脂质体/Navitoclax(FH‐SSL‐Nav)的处方分别为蛋黄卵磷脂/胆固醇/二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇(10:5:1,摩尔比)和蛋黄卵磷脂/胆固醇/二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇/二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇‐FH多肽(10:5:0.95:0.05,摩尔比)。按脂材：药物＝20：1(质量比)，精密称取各处方量的脂材及药物Navitoclax，用氯仿溶解于茄形瓶中，于37℃减压旋蒸，以除去有机溶剂形成薄膜。取适量37℃预热的磷酸缓冲液(pH＝7.4)加入茄形瓶中，涡旋振荡至膜完全脱落后，转移至EP管中，于冰水浴中进行探 头超声。探头超声条件为33W,工作2s，间歇2s，超声5min至出现淡蓝色乳光即形成脂质体。用0.2μm滤膜过滤脂质体溶液后，再过Sephadex G-50凝胶柱，以磷酸缓冲液洗脱，除去未包载的游离Navitoclax。采用动态光散射法测定脂质体的粒径。结果如图1所示，FH多肽-脂质体/Navitoclax(左图)与脂质体/Navitoclax(右图)的平均粒径在100nm左右，多分散系数均在0.15左右，FH多肽修饰对脂质体粒径基本无影响。采用醋酸铀复染法处理脂质体，用透射电镜观察脂质体的形态。结果如图2所示，脂质体为球形或类球形结果，外观完整，粒径均匀。

2.FH多肽-脂质体/阿霉素的制备 

脂质体/阿霉素(SSL-阿霉素)与FH多肽-脂质体/阿霉素(FH-SSL-阿霉素)的处方分别为氢化大豆卵磷脂/胆固醇/二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇(10:5:1,摩尔比)和氢化大豆卵磷脂/胆固醇/二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇/二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇‐FH多肽(10:5:0.9:0.1,摩尔比)。精密称取各处方量的脂材，用氯仿溶解于茄形瓶中，于37℃减压旋蒸，以除去有机溶剂形成薄膜。取适量60℃预热的123nM硫酸铵水溶液加入茄形瓶中，涡旋振荡至膜完全脱落后，进行60℃水浴超声至出现淡蓝色乳光即形成脂质体。用0.2μm滤膜过滤脂质体溶液后，再过Sephadex G-50凝胶柱，以磷酸缓冲液洗脱，使脂质体外相为磷酸盐缓冲液，内相为硫酸铵水溶液。按脂材：药物＝10：1(质量比)，加入阿霉素水溶液，于37℃、100rpm气浴摇床孵育20min，再过Sephadex G-50凝胶柱，以磷酸盐缓冲液洗脱，除游离阿霉素。

3.SC多肽-脂质体/顺铂的制备 

脂质体/顺铂与SC多肽-脂质体/顺铂的处方分别为氢化大豆卵磷脂/胆固醇/二油酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇(5:2:1,摩尔比)和氢化大豆卵磷脂/胆固醇/二油酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇/二油酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇‐SC多肽(5:2:0.9:0.1,摩尔比)。精密称取各处方量的脂材，用氯仿溶解于茄形瓶中，于37℃减压旋蒸，以除去有机溶剂形成薄膜。将顺铂溶于适量0.9％氯化钠‐5％甘露醇溶液中，并水浴至60℃。取适量预热的顺铂溶液(脂材与药物的质量比为10:1)加入脂质薄膜中，涡旋振荡至膜完全脱落后，转移至EP管中，于冰水浴中进行探头超声。探头超声条件为33W,工作2s，间歇2s，超声5min至出现淡蓝色乳光即形成脂 质体。用0.2μm滤膜过滤脂质体溶液后，再过Sephadex G-50凝胶柱，除去游离顺铂。

4.SC多肽-脂质体/表阿霉素的制备

脂质体/表阿霉素与SC多肽-脂质体/表阿霉素的处方分别为蛋黄卵磷脂/胆固醇/二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇(10:5:1,摩尔比)和蛋黄卵磷脂/胆固醇/二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇/二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇‐SC多肽(10:5:0.95:0.05,摩尔比)。精密称取各处方量的脂材，用氯仿溶解于茄形瓶中，于37℃减压旋蒸，以除去有机溶剂形成薄膜。取适量37℃预热的123nM硫酸铵水溶液加入茄形瓶中，涡旋振荡至膜完全脱落后，转移至EP管中，于冰水浴中进行探头超声。探头超声条件为33W,工作2s，间歇2s，超声5min至出现淡蓝色乳光即形成脂质体。用0.2μm滤膜过滤脂质体溶液后，再过Sephadex G-50凝胶柱，以磷酸缓冲液洗脱，使脂质体外相为磷酸盐缓冲液，内相为硫酸铵水溶液。按脂材：药物＝10：1(质量比)，加入表阿霉素水溶液，于37℃、100rpm气浴摇床孵育20min，再过Sephadex G-50凝胶柱，以磷酸盐缓冲液洗脱，除游离表阿霉素。

5.SC多肽-脂质体/紫杉醇的制备与表征

脂质体/紫杉醇与FH多肽-脂质体/紫杉醇的处方分别为大豆卵磷脂/胆固醇/二棕榈酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇(5:2:1,摩尔比)和大豆卵磷脂/胆固醇/二棕榈酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇/二棕榈酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇‐SC多肽(5:2:0.95:0.05,摩尔比)。按脂材：药物＝20：1(质量比)，精密称取各处方量的脂材及紫杉醇，用氯仿‐甲醇(3：1)混合溶剂溶解于茄形瓶中，于37℃减压旋蒸，以除去有机溶剂形成薄膜。取适量37℃预热的磷酸缓冲液(pH＝7.4)加入茄形瓶中，涡旋振荡至膜完全脱落后，转移至EP管中，于冰水浴中进行探头超声。探头超声条件为33W,工作2s，间歇2s，超声5min至出现淡蓝色乳光即形成脂质体。用0.2μm滤膜过滤脂质体溶液后，再过Sephadex G-50凝胶柱，以磷酸缓冲液洗脱，除去未包载的游离紫杉醇。

6.FH多肽-脂质体/柔红霉素的制备

脂质体/柔红霉素与FH多肽-脂质体/柔红霉素的处方分别为大豆卵磷脂/胆固醇/二棕榈酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇(10:5:1,摩尔比)和大豆卵磷脂/胆固醇/二 棕榈酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇/二棕榈酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇‐FH多肽(10:5:0.95:0.05,摩尔比)。精密称取各处方量的脂材，用氯仿溶解于茄形瓶中，于37℃减压旋蒸，以除去有机溶剂形成薄膜。将柔红霉素溶于适量磷酸盐缓冲液中，并水浴至37℃。取适量预热的柔红霉素溶液(脂材与药物的质量比为10:1)加入脂质薄膜中，涡旋振荡至膜完全脱落后，转移至EP管中，于37℃水浴超声至出现淡蓝色乳光即形成脂质体。用0.2μm滤膜过滤脂质体溶液后，再过Sephadex G-50凝胶柱，除去游离柔红霉素。

实施例2、FH多肽-脂质体/Navitoclax对体外肿瘤相关成纤维细胞的靶向性评价

采用HPLC测量LX‐2细胞对游离Navitoclax、脂质体/Navitoclax、FH多肽‐脂质体/Navitoclax及FH多肽+FH多肽‐脂质体/Navitoclax的摄取量。LX‐2细胞接种于24孔板中，孵育过夜至完全贴壁后，弃去原培养液，并用磷酸缓冲液清洗；分别在各孔中加入1ml不同的Navitoclax制剂(游离Navitoclax、脂质体/Navitoclax、FH多肽‐脂质体/Navitoclax及FH多肽+FH多肽‐脂质体/Navitoclax)，Navitoclax的终浓度为40μg/ml，于37℃孵箱中孵育3h；弃去药液，并用预冷磷酸缓冲液中止细胞摄取，随后加入0.2ml RIPA细胞裂解液，室温下裂解细胞5min；将细胞裂解液转移至1.5ml EP管中，并在每孔中加入0.3ml甲醇润洗，一并转移至相对应EP管中；14000rpm离心15min，沉淀蛋白；每孔取300μl于液相进样小瓶中，进样20ul检测Navitoclax浓度，根据标准曲线及峰面积计算细胞摄取量。结果如图3所示，不同实验组的Navitoclax摄取量顺序依次为：游离Navitoclax＞FH多肽‐脂质体/Navitoclax＞FH多肽+FH多肽‐脂质体/Navitoclax≈脂质体/Navitoclax，说明FH多肽的修饰能够促进LX‐2细胞对Navitoclax脂质体的摄取。实施例3、FH多肽-脂质体/Navitoclax体内抑制肿瘤相关成纤维细胞的评价

建立荷Hep G2肿瘤裸鼠模型，待肿瘤体积大小为200mm³，随机分为4组，分别尾静脉注射200μl的生理盐水、游离Navitoclax、脂质体/Navitoclax以及FH多肽-脂质体/Navitoclax。Navitoclax的剂量为5mg/kg，隔天给药，共给药三次。第三次给药后第三天将动物处死，制备肿瘤组织的冰冻切片。采用免疫荧光法标记肿瘤相关成纤维细胞：将肿瘤冰冻切片经冷风吹干，用4％多聚甲醛于室温下固定15min，用磷酸缓冲液清洗3次，每次5min，清洗完后在载玻片背面标记肿瘤区域；加0.1％TritonX‐100(磷酸缓冲液配制)，室温下通透5min后，再次用 大量PBS清洗三次，每次5min；加1％牛血清白蛋白与10％山羊血清混合液(磷酸缓冲液配制)，室温下孵育1h，以封闭非特异性结合位点；封闭结束后，甩去封闭液，用磷酸缓冲液清洗；在切片上滴加200μl用含1％牛血清白蛋白的磷酸缓冲液配制的成纤维细胞一抗(1:40)标记液，于4℃下孵育过夜(16h)，同时设置不加一抗的阴性对照组；甩去一抗，同样用磷酸缓冲液清洗三遍；滴加200μlFITC抗大鼠二抗(1:50)标记液(含1％牛血清白蛋白的磷酸缓冲液溶液配制)，室温下孵育2h；甩去二抗，磷酸盐缓冲液清洗后，滴加200μl Hoechst 33258(4μg/ml)，37℃孵育15min后，PBS清洗，并用抗荧光衰减封片液进行封片，于‐20℃避光保存。采用激光共聚焦显微镜进行观察肿瘤切片肿瘤相关成纤维的表达情况。结果如图4所示，其中白色代表肿瘤相关成纤维细胞。白色越少，说明制剂的肿瘤相关成纤维细胞抑制药效越好。图中肿瘤相关成纤维细胞的含量：生理盐水组＞游离Navitoclax组＞脂质体/Navitoclax＞FH多肽-脂质体/Navitoclax，说明FH多肽修饰的Navitoclax脂质体具有最佳的肿瘤相关成纤维细胞抑制效果。

实施例4、FH多肽-脂质体/Navitoclax体内增强纳米制剂肿瘤组织穿透性评价

建立荷Hep G2肿瘤裸鼠模型，待肿瘤体积大小为200mm³，随机分为2组，分别尾静脉注射200μl的生理盐水及FH多肽-脂质体/Navitoclax。Navitoclax的剂量为5mg/kg，隔天给药，共给药三次。第三次给药后第二天，尾静脉注射0.2ml的SSL‐DiR(5μgDiR/ml)。分别在给药后2h、24h时，用活体成像系统检测DiR脂质体的体内分布情况。与生理盐水处理组相比，荧光信号在FH多肽-脂质体/Naviticlax处理组的肿瘤组织内蓄积量显著增强，且在2小时即有明显的蓄积，说明靶向肿瘤相关成纤维细胞载药脂质体能够改善肿瘤组织的穿透性，促进纳米制剂在肿瘤内的蓄积及穿透。

实施例5、FH多肽-脂质体/Navitoclax与阿霉素脂质体的体内联合药效学评价

建立荷Hep G2肿瘤裸鼠模型，接种12天待肿瘤体积大小为100mm³，随机分为6组进行给药，每组6只，分别为：

生理盐水组：在12、13、15、16天尾静脉给予生理盐水，200μl/只；

阿霉素脂质体组：在13、16天尾静脉给予阿霉素脂质体，200μl/只，给药剂量：2mg/kg；

主动Nav脂质体组：在12、15天尾静脉给予FH多肽-脂质体/Navitoclax，200μl/只，给药剂量：5mg/kg；

游离Nav+阿霉素脂质体组：

在12、15天尾静脉给予游离Navitoclax，200μl/只，给药剂量：5mg/kg；

在13、16天尾静脉给予阿霉素脂质体，200μl/只，给药剂量：2mg/kg；被动Nav脂质体+阿霉素脂质体组：

在12、15天尾静脉给予脂质体/Navitoclax，200μl/只，给药剂量：5mg/kg；

在13、16天尾静脉给予阿霉素脂质体，200μl/只，给药剂量：2mg/kg；

主动Nav脂质体+阿霉素脂质体组：

在12、15天尾静脉给予FH多肽-脂质体/Navitoclax，200μl/只，给药剂量：5mg/kg；

在13、16天尾静脉给予阿霉素脂质体，200μl/只，给药剂量：2mg/kg。

自第12天开始给药后，每两天使用游标卡尺测量各组裸鼠肿瘤的长径(L)短径(r)，计算肿瘤体积V(V＝[L×(r)²]/2)及相对肿瘤体积V/V₀，绘制肿瘤相对体积-时间变化图。结果显示，FH多肽-脂质体/Navitoclax具有一定的抗肿瘤药效，联合给药组的药效均比单一阿霉素脂质体给药组的药效好。同时在联合给药组中，FH多肽-脂质体/Navitoclax与阿霉素脂质体的联合给药组达到最佳的抗肿瘤药效。

以上实验中，本发明仅仅是事例性的选取部分实施例中制备的脂质体作为实验用药，需要说明的是，本发明的其它靶向肿瘤相关成细胞的载药脂质体也能够靶向肿瘤相关成纤维细胞，并能够调控肿瘤微环境，最终发挥相同或相近的有益效果。

Claims (10)

1.一种靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，其特征在于，脂质体表面用肿瘤相关成纤维细胞高表达蛋白的高亲和力的配体修饰。

2.如权利要求1所述的靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，其特征在于，修饰用的配体选自FHKHKSPALSPVGGG、SCDYNHHWC以及包括上述序列的线性多肽、环状多肽。

3.如权利要求1所述的靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，其特征在于，脂质体的组成包括磷脂、胆固醇、聚乙二醇修饰的磷脂和导向化合物。

4.如权利要求3所述的靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，其特征在于，导向化合物是通过配体连接在聚乙二醇修饰的磷脂的聚乙二醇末端或通过配体连接在磷脂上或通过配体修饰在胆固醇上得到的。

5.如权利要求3所述的靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，其特征在于，其中所述磷脂选自大豆磷脂(SPC)，二月桂酰卵磷脂(DLPC)、二肉豆蔻酰卵磷脂(DMPC)、二棕榈酰卵磷脂(DPPC)、二硬脂酰卵磷脂(DPPC)、二硬脂酰卵磷脂(DSPC)、1‐肉豆蔻酰‐2‐棕榈酰卵磷脂(MPPC)、1‐棕榈酰‐2‐肉豆蔻酰卵磷脂(PMPC)、1‐棕榈酰‐2‐硬脂酰卵磷脂(PSPC)、1‐硬脂酰‐2‐棕榈酰卵磷脂(SPPC)、蛋黄卵磷脂(EPC)、氢化豆磷脂(HSPC)、二油酰基卵磷脂(DOPC)、二月桂酰磷脂酰甘油(DLPG)、二棕榈脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸(DPPS)、脑磷脂酰丝氨酸(PS)、脑神经鞘磷脂(BSP)、二棕榈酰神经鞘磷脂(DPSP)、二硬脂酰神经鞘磷脂(DSSP)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、氢化大豆磷脂酰乙醇胺(HSPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)之一种或多种；优选的，磷脂是蛋黄卵磷脂。

6.如权利要求3所述的靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，其特征在于，所述导向化合物是配体连接在二硬脂酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇的聚乙二醇末端得到的，优选为所述导向化合物是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇－FHKHKSPALSPVGGG。

7.如权利要求3所述的靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，其特征在于，所述药物选自肿瘤相关成纤维细胞选择性作用药物或非选择性作用药物，所述肿瘤相关成纤维细胞选择性作用药物是Navitoclax，所述肿瘤相关成纤维细胞非选择性作用药物包括阿霉素、表阿霉素、顺铂、柔红霉素、紫杉醇、多西他赛、喜树碱或羟基喜树碱。

8.如权利要求3所述的靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体，其特征在于，所述药物是Navitoclax，磷脂是蛋黄卵磷脂，聚乙二醇修饰的磷脂是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‐聚乙二醇，导向化合物是二硬脂酰磷脂酰乙醇胺－聚乙二醇－FHKHKSPALSPVGGG，和胆固醇。

9.权利要求1的载药脂质体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a称取处方量的各组分于茄形瓶中，加入有机溶剂完全溶解后，20‐40℃下减压旋蒸，形成脂质薄膜；

b用水浴至20‐40℃的磷酸盐缓冲液或葡萄糖溶液水化a步骤中得到的脂质薄膜，涡旋后进行水浴超声或者探头超声至形成蓝色乳光；

c用Sephadex G‐50凝胶柱纯化b步骤得到的载药脂质体，并过0.22μm的过滤器，即得到脂质体。

10.权利要求1所述的靶向肿瘤相关成纤维细胞的载药脂质体在制备抗肿瘤的药物中的应用。