CN107811972B - 一种阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统及制备方法 - Google Patents

一种阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统及制备方法。所述共输送纳米载药系统为TPGS修饰的共载阿霉素和基因药物的阳离子脂质体，所述阳离子脂质体的膜材包括1,2‑二油酰基‑3‑三甲基铵‑丙烷或其氯化盐、二棕榈酰磷脂酰胆碱、TPGS和胆固醇。本发明制备的共输送纳米载药系统具有较高的阿霉素包封率，提高了共输送纳米脂质体的稳定性，同时仅通过调整处方就可实现肿瘤细胞外排泵的彻底抑制，实现了同时抑制肿瘤药物外排和抗凋亡两种耐药机制的目的，可以更加彻底有效地逆转肿瘤多药耐药。

Description

一种阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统及制备方法
技术领域
本发明涉及制药技术领域，具体涉及一种阿霉素和基因药物共输送逆转肿瘤耐药的纳米载药系统及制备方法。
背景技术
目前，肿瘤治疗的主要手段为化疗，但患者化疗中容易产生多药耐药(multidrugresistance,MDR)的问题，导致化疗难以取得良好的疗效。临床上使用联合化疗或化疗药物与其他干预药物联用来进一步提高化疗疗效，减少肿瘤耐药的发生。共输送纳米载药系统可实现多种药物的共载，具有药物释放行为稳定、肿瘤靶向、毒副作用小等优点，已成为近年来抗肿瘤药物研究的热点。
阿霉素脂质体
Figure BDA0001456751520000011
作为首个被FDA批准的纳米药物，临床应用确实显著提高了化疗疗效，降低了毒副作用，但肿瘤化疗中依然会产生耐药的问题。肿瘤MDR的发生通常是多种耐药机制共同作用的结果，仅通过抑制单一细胞耐药途径无法有效克服肿瘤细胞对化疗药物产生耐药的问题。因此，能够兼具传递化疗药物和抑制多种耐药途径的多功能药物传递系统是治疗肿瘤多药耐药性的优先选择。
采用共输送纳米载药系统共输送化疗药物和抑制某一种耐药机制的化疗增敏剂发挥协同作用来逆转肿瘤MDR是解决耐药性的方法之一。阳离子脂质体被比较广泛的应用于药物载体和基因载体。但是目前的化疗药物和基因药物共输送阳离子脂质体仅仅利用基因药物抑制肿瘤细胞某一种MDR相关蛋白的表达，无法彻底有效地逆转肿瘤MDR。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统，引入阳离子脂质1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)及将P糖蛋白(P-gp)抑制剂聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)作为脂质体膜材参与脂质体的构建，形成的共输送纳米载药系统包埋率高，稳定性好。该系统可以同时抑制P糖蛋白的药物外排和基因药物表达这两种肿瘤关键耐药机制，可更加彻底地逆转肿瘤MDR，提高化疗疗效。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统，所述共输送纳米载药系统为TPGS修饰的共载阿霉素和基因药物的阳离子脂质体，所述阳离子脂质体的膜材包括1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷氯化盐、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、TPGS和胆固醇。
优选的，所述基因药物为抗凋亡蛋白基因药物，更优选为Bcl-2siRNA。
优选的，所述阳离子脂质体中，以空白阳离子脂质体总脂质浓度计算，1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷氯化盐的摩尔百分含量为15～40％，二棕榈酰磷脂酰胆碱的摩尔百分含量为32～60％，胆固醇的摩尔百分含量为2～20％，TPGS的摩尔百分含量为0.5～8％。
优选的，所述阳离子脂质体的粒径为30～300nm，zeta电位为+20～+50mV。
本发明还提供了上述阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷氯化盐、二棕榈酰磷脂酰胆碱、TPGS和胆固醇用薄膜水化法制备脂质体初乳，将得到的脂质体初乳过100nm聚碳酸酯膜进行整粒，得到TPGS修饰的空白阳离子脂质体；
(2)将得到的TPGS修饰的空白阳离子脂质体透析置换外水相，使脂质体内外形成硫酸铵梯度后，将TPGS修饰的空白阳离子脂质体与盐酸阿霉素溶液混合孵育，得到TPGS修饰的阿霉素阳离子脂质体；
(3)将TPGS修饰的阿霉素阳离子脂质体与基因药物以4:1的氮磷比混合孵育，得到TPGS修饰的共载阿霉素和基因药物的阳离子脂质体。
优选的，步骤(1)中，制备所述脂质体初乳的步骤具体为：将1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷氯化盐、二棕榈酰磷脂酰胆碱、TPGS和胆固醇溶于氯仿，减压条件下除去氯仿形成脂质干膜，在所述脂质干膜中加入硫酸铵溶液，40～50℃水浴下水化形成脂质体初乳。
优选的，所述TPGS修饰的空白阳离子脂质体的质量浓度为2～15mg/mL。
优选的，步骤(2)中，所述盐酸阿霉素溶液的浓度为10～20mg/ml，所述孵育的药脂比为1:5～1:10。
本发明还提供了上述阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明构建的阳离子脂质体共输送纳米载药系统，膜材中引入阳离子脂质1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷氯化盐，使载药系统带正电荷，使其具有荷载基因药物的能力，实现了基因药物和化疗药物的共载。本发明的共输送纳米载药系统引入P糖蛋白抑制剂TPGS作为脂质体膜材参与脂质体的构建，可仅通过调整脂质体中处方用量就可以彻底抑制P-gp的外排作用。通过抑制P-gp的药物外排和基因药物的表达这两种肿瘤关键耐药机制，增敏化疗药物对肿瘤细胞的毒性作用，更加彻底地逆转肿瘤MDR，提高化疗疗效。
本发明的膜材中包括TPGS，TPGS作为一种良好的乳化剂和稳定剂，有利于脂质体的形成，提高荷载基因药物后脂质体的稳定性。本发明将含有TPGS的膜材用薄膜水化法制备脂质体初乳，经聚碳酸酯膜整粒后得到TPGS修饰的空白阳离子脂质体，透析置换外水相后与盐酸阿霉素溶液混合孵育，实现硫酸铵梯度载药，包封率可达95％。与基因药物混合孵育后得到TPGS修饰的共载阿霉素和基因药物的阳离子脂质体：基因药物-Dox/TPGS-LPs。本发明的方法具有较高的阿霉素包封率，提高了共输送纳米脂质体的稳定性，同时仅通过调整处方就可实现肿瘤细胞外排泵的彻底抑制，实现了同时抑制肿瘤药物外排和抗凋亡两种耐药机制的目的，可以更加彻底有效地逆转肿瘤多药耐药。
附图说明
图1为共输送纳米载药系统中脂质体siRNA-Dox/TPGS-LPs的透射电镜照片；
图2为共输送纳米载药系统中脂质体siRNA-Dox/TPGS-LPs的粒径分布图；
图3为耐药肝癌细胞Bel7402/5-FU对Dox摄取量图；
图4为各种Dox制剂对Bel7402细胞(A)和Bel7402/5-FU细胞存活率图。
具体实施方式
本发明提供一种阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统，该共输送纳米载药系统为TPGS修饰的共载阿霉素和基因药物的阳离子脂质体。TPGS中文名称为聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯，为一种P糖蛋白抑制剂，能够达到抑制P糖蛋白药物外排的作用。阿霉素为一种抗肿瘤抗生素。本发明通过TPGS修饰阳离子脂质体，共载阿霉素与基因药物，实现了多种肿瘤的抑制途径，减少了肿瘤MDR的产生。
本发明中，基因药物可以为DNA药物、siRNA或miRNA等多种可调控肿瘤耐药相关蛋白的基因药物，所述基因药物优选为抗凋亡蛋白基因药物，进一步优选为Bcl-2siRNA。通过siRNA调控抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的过量表达，从而促进肿瘤细胞凋亡，达到控制肿瘤细胞增殖的效果。
本发明的阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统中，阳离子脂质体的膜材包括1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷的氯化盐，其可以使体系带正电荷，具有荷载基因药物的能力。本发明中，以空白阳离子脂质体总脂质浓度计算，1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷氯化盐的摩尔百分含量优选为15～40％，更优选为20～36％。该比例能使脂质体具有合适的表面正电荷，优选正电荷为+20～+50mV，进一步优选为+30～+45mV。
本发明的阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统中，阳离子脂质体的膜材包括二棕榈酰磷脂酰胆碱，作为脂质体的骨架膜材参与脂质双分子层的形成和稳定。本发明中，以空白阳离子脂质体总脂质浓度计算，二棕榈酰磷脂酰胆碱的摩尔百分含量优选为32～60％，更优选为40～53％。该比例能使脂质体具有合适的粒径，及保证脂质体的稳定性。本发明的阳离子脂质体粒径优选为30～300nm，更优选为50～200nm，进一步优选为100～150nm。
本发明的阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统中，阳离子脂质体的膜材包括胆固醇。胆固醇一般嵌在磷脂双分子层之间，具有稳定脂质体结构的作用。本发明中，以空白阳离子脂质体总脂质浓度计算，胆固醇的摩尔百分含量优选为2～20％，更优选为10～16％。该比例下脂质体具有合适的粒径及稳定性。
本发明的阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统中，阳离子脂质体的膜材包括TPGS，TPGS作为脂质体中的乳化剂和稳定剂，有利于脂质体的形成，提高荷载siRNA后脂质体的稳定性。本发明中，以空白阳离子脂质体总脂质浓度计算，TPGS的摩尔百分含量优选为0.5～8％，更优选为1％～4％。该比例可有效抑制耐药肿瘤细胞的表面P糖蛋白的药物外排，同时TPGS分子的聚乙二醇(PEG)链在脂质体表面形成的亲水壳层，对基因药物如siRNA起到保护和稳定的作用。
本发明还提供了上述阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
首先用薄膜水化法将膜材制备成脂质体初乳。本发明对薄膜水化法的具体操作步骤没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。在本发明中，优选所述脂质体初乳的步骤具体为：将1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷的氯化盐、二棕榈酰磷脂酰胆碱、TPGS和胆固醇按照上述处方比例溶于氯仿，减压条件下除去氯仿形成脂质干膜，在所述脂质干膜中加入硫酸铵溶液，40～50℃水浴下水化形成脂质体初乳。
本发明中，对膜材与氯仿的混合比例没有特殊限定，上述膜材能够充分溶于氯仿中的所有混合比例均在本发明的保护范围之内。
本发明中，除去氯仿的减压条件优选为0.08～0.1MPa，更优选为0.09MPa。
本发明中，优选硫酸铵溶液的浓度为120～180mM，更优选为123mM。优选脂质干膜中加入硫酸铵溶液的体积为0.5～2ml，更优选为1ml。本发明优选脂质干膜与硫酸铵水溶液在水浴条件下水化。水化温度优选为40～50℃，更优选为43～48℃；水化时间优选为0.5～2h，更优选为1h。
水化完成后，通过聚碳酸酯膜整粒得到TPGS修饰的空白阳离子脂质体(TPGS-LPs)。本发明的聚碳酸酯膜整粒方式为本领域技术人员众所周知的。在本发明具体实施例中，优选用100nm的聚碳酸酯膜进行整粒。
本发明优选得到TPGS-LPs的质量浓度为优选为2～15mg/mL，更优选为5～10mg/mL，进一步优选为8～10mg/mL。上述浓度对有利于使Dox载药量提高至95％以上。
将得到的空白阳离子脂质体透析置换外水相，使脂质体内外形成硫酸铵梯度后，再与盐酸阿霉素溶液混合孵育，得到TPGS修饰的阿霉素脂质体(Dox-TPGS-LPs)。
本发明中，优选用0.9％氯化钠溶液透析置换外水相，使脂质体内外形成硫酸铵梯度。本发明对透析置换的具体操作方式没有特殊限定，采用本领域技术人员众所周知的操作方法。
本发明中，优选用盐酸阿霉素溶液与TPGS-LPs进行孵育，实现阿霉素的负载。本发明对盐酸阿霉素的来源没有特殊限定，采用本领域中的市售商品即可。本发明所用盐酸阿霉素溶液的浓度优选为10～20mg/ml，更优选为12～17mg/ml。本发明中，优选盐酸阿霉素溶液与阳离子脂质体混合孵育的药脂比为1:5～1:10，更优选为1:6～1:9。此药脂比为下可使阿霉素脂质体的包封率达到90％以上。
本发明中，盐酸阿霉素溶液与TPGS-LPs优选在40～60℃水浴下进行孵育，更优选为45～56℃。孵育的时间优选为15～30min，更优选为18～24min。
孵育完成后，得到TPGS修饰的阿霉素脂质体Dox-TPGS-LPs。
将Dox-TPGS-LPs与基因药物混合孵育，通过静电吸附作用将基因药物荷载到Dox-TPGS-LPs上，得到本发明的阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统。
本发明中，所述基因药物优选为抗凋亡蛋白基因药物，更优选为Bcl-2siRNA。
本发明中，Dox-TPGS-LPs与基因药物混合孵育的氮磷比(即脂质体中阳离子脂质DOTAP的摩尔量与基因药物所含磷酸基团的摩尔量之比)为4：1，可以使siRNA的荷载效率达到95％以上。本发明中，Dox-TPGS-LPs与基因药物优选在常温下静置孵育，孵育的时间优选为30～60min，更优选为40～50min。孵育完成后，得到TPGS修饰的共载阿霉素和siRNA的阳离子脂质体siRNA-Dox/TPGS-LPs。
本发明将TPGS引入阳离子脂质体及良好的基因转染纳米载药系统中。TPGS作为一种乳化剂有助于脂质体的稳定性，还可以有效抑制耐药肿瘤细胞表面P糖蛋白介导的药物外排作用，显著提高肿瘤细胞内的化疗药物蓄积。同时共输送Bcl-2siRNA入胞可以下调肿瘤细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，这种在不同层次调节肿瘤细胞耐药的载药体系，可更加彻底逆转肿瘤多药耐药。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明以下实施例中DOTAP均是指的1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷的氯化盐。
实施例1
TPGS含量为1％的空白阳离子脂质体(TPGS-LPs)的制备
将4.22mg DOTAP、4.44mg DPPC、0.23mg TPGS以及1.11mg胆固醇溶于4mL氯仿置于50mL圆底烧瓶中，在0.1MPa减压状态和40℃水浴下旋蒸除去氯仿形成脂质干膜；加入1mL的123mM的硫酸铵溶液，40℃水浴下水化1小时得到脂质体初乳；使用微型脂质体挤出装置使脂质体初乳通过100nm聚碳酸酯膜19次，得到1％TPGS-LPs空白脂质体，以总脂质摩尔百分比计TPGS含量为1％。
实施例2
TPGS含量为2％的空白阳离子脂质体(TPGS-LPs)的制备
将4.15mg DOTAP、4.36mg DPPC、0.45mg TPGS以及1.04mg胆固醇溶于4mL氯仿置于50mL圆底烧瓶中，在0.1MPa减压状态和40℃水浴下旋蒸除去氯仿形成脂质干膜；加入1mL的123mM的硫酸铵溶液，40℃水浴下水化1小时得到脂质体初乳；使用微型脂质体挤出装置使脂质体初乳通过100nm聚碳酸酯膜19次，得到2％TPGS-LPs空白脂质体，以总脂质摩尔百分比计TPGS含量为2％。
实施例3
TPGS含量为4％的空白阳离子脂质体(TPGS-LPs)的制备
将4.02mg DOTAP、4.22mg DPPC、0.87mg TPGS以及0.89mg胆固醇溶于4mL氯仿置于50mL圆底烧瓶中，在0.1MPa减压状态和40℃水浴下旋蒸除去氯仿形成脂质干膜，加入1mL的123mM的硫酸铵溶液，40℃水浴下水化1小时得到脂质体初乳，进一步使用微型脂质体挤出装置使脂质体初乳通过100nm聚碳酸酯膜19次，得到4％TPGS-LPs空白脂质体，以总脂质摩尔百分比计TPGS含量为4％。
实施例4
TPGS含量为6％的空白阳离子脂质体(TPGS-LPs)的制备
将3.89mg DOTAP、4.09mg DPPC、1.26mg TPGS以及0.76mg胆固醇溶于4mL氯仿置于50mL圆底烧瓶中，在0.1MPa减压状态和40℃水浴下旋蒸除去氯仿形成脂质干膜，加入1mL的123mM的硫酸铵溶液，40℃水浴下水化1小时得到脂质体初乳，进一步使用微型脂质体挤出装置使脂质体初乳通过100nm聚碳酸酯膜19次，得到6％TPGS-LPs空白脂质体，以总脂质摩尔百分比计TPGS含量为6％。
实施例5
TPGS含量为8％的空白阳离子脂质体(TPGS-LPs)的制备
将3.77mg DOTAP、3.97mg DPPC、1.63mg TPGS以及0.63mg胆固醇溶于4mL氯仿置于50mL圆底烧瓶中，在0.1MPa减压状态和40℃水浴下旋蒸除去氯仿形成脂质干膜，加入1mL的123mM的硫酸铵溶液，40℃水浴下水化1小时得到脂质体初乳，进一步使用微型脂质体挤出装置使脂质体初乳通过100nm聚碳酸酯膜19次，得到8％TPGS-LPs空白脂质体，以总脂质摩尔百分比计TPGS含量为8％。
实施例6
1)将实施例1～5制备的TPGS-LPs转移至截留分子量为3000Da的透析袋中，并将两端用透析袋夹封紧，置于500mL的0.9％氯化钠溶液中室温下透析2小时，每隔1小时将透析介质更换为新鲜的0.9％氯化钠溶液。
2)取800μL步骤1)中透析后得到的空白脂质体，向其中加入10mg/mL的盐酸阿霉素水溶液80μL，40℃水浴下避光孵育30min，得到含1％～8％TPGS的阿霉素脂质体Dox-TPGS-LPs。
3)将步骤2)制备得到的含TPGS的阿霉素脂质体Dox-TPGS-LPs稀释液150μL加入到150μL Bcl-2siRNA稀释液中，脂质体与siRNA保持氮磷比为4:1混合，室温下孵育30min，得到TPGS修饰的共载阿霉素和siRNA的阳离子脂质体，即siRNA-Dox/TPGS-LPs。
对比例
常规载阿霉素阳离子脂质体(Dox-LPs)的制备
将4.14mg DOTAP、4.35mg DPPC、0.42mg DSPE-PEG2000以及1.09mg胆固醇溶于4mL氯仿置于50mL圆底烧瓶中，在0.1MPa减压状态和40℃水浴下旋蒸除去氯仿形成脂质干膜，加入1mL的123mM的硫酸铵溶液，40℃水浴下水化1小时得到脂质体初乳，进一步使用微型脂质体挤出装置使脂质体初乳通过100nm聚碳酸酯膜19次，得到常规空白阳离子脂质体，以总脂质浓度计算，水化后脂质体浓度为10mg/mL。
按照实施例6步骤2)中的硫酸铵梯度法制备常规阿霉素阳离子脂质体Dox-LPs。
实施例7
将Dox-TPGS-LPs脂质体用超纯水稀释至总磷脂浓度为1mg/mL，通过动态光散射法(DLS)测定其粒径分布和平均粒径以及Zeta电位。
将50μL实施例6步骤2)中得到的阿霉素脂质体Dox-TPGS-LPs加在Sephadex G50凝胶柱顶部，用0.9％氯化钠溶液洗脱，流速为1mL/min，收集脂质体部分洗脱液，采用荧光分光光度法测定阿霉素的浓度，计算阿霉素脂质体的包封率，结果见表1。
表1 TPGS处方含量对阿霉素脂质体粒径、Zeta电位和包封率影响
Figure BDA0001456751520000091
由表1可知，TPGS摩尔百分含量为1％时，其粒径较较小，仅为109.1nm，TPGS摩尔百分比由2％增至8％，粒径基本稳定在130nm左右。脂质体处方中TPGS摩尔百分含量为1％或2％时，Zeta电位在+43mV以上，当TPGS摩尔百分比大于等于4％时，Zeta电位显著降低。为了利于siRNA的荷载，本发明最终制剂中的TPGS摩尔百分含量优选不低于4％。本发明采用硫酸铵梯度法载阿霉素可实现阿霉素脂质体高效荷载，TPGS修饰的阿霉素脂质体包封率均在95％左右，从表1可以看出TPGS处方量对包封率影响不大。
实施例8
用透射电镜(TEM)观察实施例6制备得到的siRNA/Dox-TPGS-LPs纳米颗粒的形貌特征，见图1。从图1中可以看出，制得的siRNA/Dox-TPGS-LPs的粒径在100～200nm之间，图1中的放大图像显示，该共输送脂质体呈内外两层结构，内部为荷载阿霉素，siRNA结合在脂质体外层与TPGS共同形成脂质体外壳。
用动态光散射法测定siRNA/Dox-TPGS-LPs溶液中纳米颗粒的均一性和平均粒径。如图2所示，本发明共输送脂质体siRNA/Dox-TPGS-LPs粒径均一性良好，平均粒径为160.1nm。
实施例9
使用制备实施例6中制备的含1％～8％TPGS的阿霉素脂质体Dox-TPGS-LPs进行细胞摄取试验。
以P糖蛋白高表达的耐5-氟尿嘧啶的人肝癌Bel7402/5-FU细胞作为实验研究细胞模型。Bel7402/5-FU细胞以2×105cells/孔的细胞密度接种于12孔板，培养基为含10％FBS(胎牛血清)的DMEM完全培养基，孵育24h待细胞贴壁后，旧培养基用含相同浓度Dox 5μg/mL的Dox-LPs、Dox-1％TPGS-LPs、Dox-2％TPGS-LPs、Dox-4％TPGS-LPs、Dox-6％TPGS-LPs和Dox-8％TPGS-LPsDMEM完全培养基替代，置于细胞培养箱中37℃培养孵育。药物孵育12h后，用冷PBS洗涤细胞3次，每孔加入300μL 0.5％TritonX-100，4℃下裂解细胞1小时，用超声细胞破碎仪匀浆后，10000g离心5min，取200μL上清稀释至1mL，采用荧光分光光度法测定阿霉素浓度；另取20μL上清于96孔板中，加入200μLBCA工作液37℃孵育1小时，570nm处测吸光度值计算蛋白质浓度。
实验中，用5μg/mL相同Dox浓度的不同TPGS处方含量的Dox-TPGS-LPs处理P糖蛋白高表达的肿瘤耐药细胞Bel7402/5-FU，如图3所示，Bel7402/5-FU细胞对常规阳离子脂质体Dox-LPs的摄取量显著低于Dox-1％TPGS-LPs、Dox-2％TPGS-LPs以及Dox-4％TPGS-LPs，TPGS修饰(1～4％)使细胞摄取量提高了50％左右，说明阳离子脂质体中引入TPGS可以抑制耐药细胞表面P糖蛋白的外排作用，提高胞内Dox的蓄积量。当TPGS含量高于4％时，Bel7402/5-FU细胞对Dox-TPGS-LPs摄取量并未出现显著提升，这与Dox-TPGS-LPs脂质体表面正电荷显著降低，减弱了Dox-TPGS-LPs与细胞的相互作用有关。
实施例10
使用含实施例6步骤2)制备的4％TPGS的阿霉素脂质体Dox-TPGS-LPs、实施例6步骤3)制备的siRNA-Dox/4％TPGS-LPs以及对比例中制备的常规阿霉素脂质体Dox-LPs进行如下体外逆转肿瘤多药耐药试验。
Bel7402和Bel7402/5-FU细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)以5×103cells/孔的细胞密度接种于96孔板，培养基为含10％FBS(胎牛血清)的DMEM完全培养基，孵育24h待细胞贴壁后，旧培养基分别换成Dox浓度范围从0.02～20μg/mL的游离阿霉素(Free Dox)，Dox-LPs，Dox-TPGS-LPs以及siRNA-Dox/TPGS-LPs的DMEM完全培养基。以不含样品的培养基作为对照，以空白孔调零，每个浓度设置平行5个副孔。培养一定时间后，每孔中加25μL MTT(5mg/mL)溶液继续培养4h，用注射器吸尽96孔板中的培养基，每孔加入150μL DMSO，震荡10min,使产生的甲瓒充分溶解。酶标仪测定各孔在570nm的光密度(OD)，计算细胞存活率(胞存活率(％)＝OD药物/OD对照)。各组Dox制剂的半数抑制浓度(IC50)通过GraphPadprism 6来计算。
实验中，用Dox浓度为0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的siRNA-Dox/TPGS-LPs处理Bel7402/5-FU细胞48h后,分别与使用同浓度的Dox-LPs和Dox-TPGS-LPs相比，细胞的存活率均显著降低。如图4所示，当Dox浓度为0.2μg/mL时，Bel7402细胞四组Dox制剂的48h的细胞存活率均低于20％，Bel7402/5-FU细胞中游离Dox、Dox-LPs、Dox-TPGS-LPs和siRNA/Dox-TPGS-LPs组48h的细胞存活率却分别为104.16％、98.72％、79.08％以及49.66％，说明Bel7402/5-FU细胞对游离阿霉素和Dox-LPs有较高的耐药性，以及Dox-TPGS-LPs难以彻底逆转肿瘤耐药，而本发明的siRNA-Dox/TPGS-LPs对肿瘤耐药细胞具有良好的抑制效果。
表2各种Dox制剂对Bel7402和Bel7402/5-FU细胞的IC50值
Figure BDA0001456751520000111
由表2可知，siRNA-Dox/TPGS-LPs对Bel7402/5-FU细胞48h的IC50仅为0.18μg/mL，与对Bel7402细胞的IC50(0.09μg/mL)较为接近，表明本发明的siRNA-Dox/TPGS-LPs即使在低于0.2μg/mL的Dox浓度下也可以对肿瘤耐药细胞产生有效杀伤作用，从而逆转肿瘤耐药。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统，其特征在于，所述共输送纳米载药系统为TPGS修饰的共载阿霉素和基因药物的阳离子脂质体，所述阳离子脂质体的膜材包括1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷的氯化盐、二棕榈酰磷脂酰胆碱、TPGS和胆固醇；所述阳离子脂质体中，以空白阳离子脂质体总脂质浓度计算，1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷氯化盐的摩尔百分含量为15～40％，二棕榈酰磷脂酰胆碱的摩尔百分含量为32～60％，胆固醇的摩尔百分含量为2～20％，TPGS的摩尔百分含量为0.5～8％；
所述共输送纳米载药系统由以下步骤制备而成：
(1)将1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷氯化盐、二棕榈酰磷脂酰胆碱、TPGS和胆固醇用薄膜水化法制备脂质体初乳，将得到的脂质体初乳过100nm聚碳酸酯膜进行整粒，得到TPGS修饰的空白阳离子脂质体；所述TPGS修饰的空白阳离子脂质体的质量浓度为2～15mg/mL；
(2)将得到的TPGS修饰的空白阳离子脂质体透析置换外水相，使脂质体内外形成硫酸铵梯度后，将TPGS修饰的空白阳离子脂质体与盐酸阿霉素溶液混合孵育，得到TPGS修饰的阿霉素阳离子脂质体；所述盐酸阿霉素溶液的浓度为10～20mg/ml，所述孵育的药脂比为1:5～1:10；
(3)将TPGS修饰的阿霉素阳离子脂质体与基因药物以4:1的氮磷比混合孵育，得到TPGS修饰的共载阿霉素和基因药物的阳离子脂质体。
2.根据权利要求1所述的共输送纳米载药系统，其特征在于，所述基因药物为抗凋亡蛋白基因药物。
3.根据权利要求2所述的共输送纳米载药系统，其特征在于，所述抗凋亡蛋白基因药物为Bcl-2siRNA。
4.根据权利要求1所述的共输送纳米载药系统，其特征在于，所述阳离子脂质体的粒径为30～300nm，zeta电位为+20～+50mV。
5.权利要求1～4任意一项所述阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)将1 ,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷氯化盐、二棕榈酰磷脂酰胆碱、TPGS和胆固醇用薄膜水化法制备脂质体初乳，将得到的脂质体初乳过100nm聚碳酸酯膜进行整粒，得到TPGS修饰的空白阳离子脂质体；
(2)将得到的TPGS修饰的空白阳离子脂质体透析置换外水相，使脂质体内外形成硫酸铵梯度后，将TPGS修饰的空白阳离子脂质体与盐酸阿霉素溶液混合孵育，得到TPGS修饰的阿霉素阳离子脂质体；
(3)将TPGS修饰的阿霉素阳离子脂质体与基因药物以4:1的氮磷比混合孵育，得到TPGS修饰的共载阿霉素和基因药物的阳离子脂质体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述脂质体初乳的制备方法包括以下步骤：将1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷氯化盐、二棕榈酰磷脂酰胆碱、TPGS和胆固醇溶于氯仿，减压条件下除去氯仿形成脂质干膜，在所述脂质干膜中加入硫酸铵溶液，40～50℃水浴下水化形成脂质体初乳。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述TPGS修饰的空白阳离子脂质体的质量浓度为2～15mg/mL。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述盐酸阿霉素溶液的浓度为10～20mg/ml，所述孵育的药脂比为1:5～1:10。
9.权利要求1～4任意一项所述阿霉素和基因药物共输送纳米载药系统或由权利要求5～8任意一项所述方法制备的纳米载药系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
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