DE60027039T2 - Cisplatin- und andere Wirkstoffe oder Gene eingekapselt in Liposomen zur menschlichen Krebstherapie - Google Patents

Cisplatin- und andere Wirkstoffe oder Gene eingekapselt in Liposomen zur menschlichen Krebstherapie Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft in Liposomen eingekapselte Wirkstoffe und Zufuhrsysteme, insbesondere in Liposomen eingekapseltes Cisplatin. Die Wirkstoffe sind nützlich, um Krebszellen in zahlreichen verschiedenen menschlichen Malignitäten nach intravenöser Injektion zu töten.
  • Hintergrund der Erfindung
  • In dieser gesamten Anmeldung werden auf verschiedene Publikationen, Patente und veröffentlichte Patentbeschreibungen mit Autor und Datum oder durch eine Identifikationspatentnummer Bezug genommen. Die vollständigen bibliographischen Angaben für die Publikationen werden innerhalb dieser Offenbarung oder unmittelbar vor den Ansprüchen bereitgestellt. Diese Publikationen, Patente und veröffentlichten Patentbeschreibungen sind hierin eingebunden, um den Stand der Technik des Gebiets, dem diese Erfindung angehört, ausführlicher zu beschreiben. cis-Diammindichlorplatin(II), cis-[Pt(NH3)2Cl2]2+, abgekürzt als Cisplatin oder cis-DDP ist einer der am umfassendsten eingesetzten antineoplastischen Wirkstoffe zur Behandlung von Hoden- und Ovarialkarzinomen und von Karzinomen von Kopf und Hals. Mehr als 90% der Hodenkarzinome werden durch Cisplatin geheilt. Die schwersten Nebenwirkungen sind Nephrotoxizität, Knochenmarktoxizität und Magendarmreizung (Oliver & Mead, 1993). Beidseitige optische Neuropathie wurde an einer Patientin beobachtet, die an Ovarialkarzinom erkrankt war, das mit 160 mg/m2 Cisplatin und 640 mg/m2 Carboplatin behandelt wurde (Garaceni et al., 1997). Orale Behandlung mit Hexamethylmelamin in einer Gruppe von 61 Patientinnen mit epithelialem Ovarialkarzinom mit Cis- oder Carboplatinresistenz (Rückfall innerhalb von 6 Monaten nach dem Ende dieser Therapie) zeigten eine objektive Remissionsrate von 14% (Vergote et al., 1992).
  • Kationische Cholesterinderivate wurden verwendet, um therapeutische Mittel zuzuführen. Beispielsweise wurden sie mit Phosphatidylethanolamin vermischt und beschallt, um kleine einschichtige Vesikel zu bilden, die mit DNA einen Komplex bilden und den Eintritt in das Cytosol aus dem Endosomkompartiment vermitteln können. Eine dieser Liposomformulierungen, DC-Chol-Liposomen, wurde bereits in einem klinischen Gentherapieversuch gegen Melanome eingesetzt. Das Gen für Human-Immunschwächevirus 1 transaktivierendes Protein wurde zusammen mit einem Reportergen unter der Steuerung der langen terminalen Wiederholung von HIV-1 zugeführt. Menschliche Tumorzellen, die auf Cisplatinresistenz selektiert oder aus Patienten isoliert wurden, bei denen eine Cisplatintherapie fehlschlug, waren mit kationischen Liposomen sehr gut transfizierbar. Diese Resultate ließen die Idee zu einem seriellen Therapieprotokoll mit Cisplatin und Gentherapie für Malignität entstehen (Farhood et al., 1994).
  • Verschiedene Platinkomplexe, die aus 2-Aminomethylpyrrolidin-Derivaten als Trägerliganden hergestellt wurden, wurden auf ihre Antitumoraktivität gegen Colon-26-Karzinom und P388-Leukämie unter Verwendung subkutaner und/oder intraperitonealer Injektionen in Mäuse getestet. 2-Aminomethylpyrrolidon erwies sich in Form seiner Aminderivate als am wirksamsten als Trägerligand (Morikawa et al., 1990).
  • Ein optimales Verfahren wurde durch orthogonale Tests zur Herstellung von Cisplatin-Albumin-Mikroperlen (Cis-DDP-AMS) mittels Emulsionserwärmungs-Stabilisierungsverfahren (mittlere Größe betrug 148 μm) entwickelt. Die Verteilungs- und Eliminierungs-Halbwertszeiten von Platin wurden nach hepatischer arterieller Chemoembolisation mit Cis-DDP-AMS gegenüber Cis-DDP um das 3,36fache bzw. 1,23fache verlängert (Zhang et al., 1995).
  • Im Rahmen der Suche nach Platin(II)-basierten Verbindungen mit verbesserten therapeutischen Eigenschaften sah man sich dazu veranlasst, eine neue Familie von wasserlöslichen Cis-Diamindichloroplatin(II)-Komplexen der dritten Generation, gebunden an Uracil und Uridin, zu entwerfen und synthetisieren. Keine der synthetisierten Verbindungen zeigte jedoch eine signifikante zytotoxische Aktivität gegen drei Zelllinien, die behandelt wurden (Kim et al., 1998).
  • Für das erst jüngst entwickelte, biologisch reduktive Mittel 4-[3-(2-Nitroimidazolyl)propylamino]-7-chlorchinolin-hydrochlorid (NLCQ-1) wurde erkannt, dass es die Antitumorwirkung der chemotherapeutischen Mittel Melphalan (L-PAM), Cisplatin (cisDDP) und Cyclophosphamid (CPM) ohne gleichzeitige Steigerung von Knochenmarktoxizität potenzierte. Die Potenzierung hing ganz stark vom Behandlungsplan ab, und die optimale Wirkung (1,5 bis 2 logarithmische Einheiten mehr Abtötung als im Fall von Additivität) wurde beobachtet, wenn NLCQ-1 45 min vor cisDDP verabreicht wurde. Diese Resultate untermauern die Klassifizierung von NLCQ-1, basierend auf klinischen Studien, als Chemosensitizer (Papadopoulou et al. 1998).
  • Eine Kombination aus Paclitaxel und Cisplatin als Second-line-Behandlung bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC), die bereits einer First-line-Therapie mit Cisplatin unterzogen worden waren, erzielte eine partielle Reaktion (40%) in 14 Patienten (Stathopoulos et al., 1999).
  • Abra et al. (US-Patent Nr. 5.945.122, ausgegeben am 31. August 1999) beschreiben eine Liposomenzusammensetzung, die eingefangenes, nicht-geladenes Cisplatin in zumeist neutralen Lipiden enthält. Das Verfahren von Abra et al. setzt jedoch neutrale Lipide anstelle des anionischen Lipids DPPG ein, das im vorliegenden Patent zum Einfangen von Cisplatin offenbart wird.
  • Das US-Patent Nr. 5.567.434 (Szoka, Jr.) beschreibt Liposomen- und Lipidpartikelformulierungen, die durch Auflösen von Verbindungen (z.B. Cisplatin) in einer Lösung von Liposomen-bildenden Lipiden in einem aprotischen Lösungsmittel wie DMSO, das gegebenenfalls eine Lipid-solubilisierende Menge eines niedereren Alkanols enthält, und Injizieren von entweder der resultierenden Lösung in eine wässrige Lösung oder einer wässrigen Lösung in die resultierende Lösung hergestellt werden. Das Cisplatin liegt nicht in seiner Aquaform vor.
  • Speelmans et al., Biochimica et Biophysica Acta, Bd. 1283, 60–66 (1996), beschreiben Untersuchungen an der Wechselwirkung zwischen Cisplatin und Phospholipiden von Modellmembranen.
  • Das US-Patent Nr. 5.945.122 (Abra et al.) beschreibt eine Liposomenzusammensetzung, die eine eingefangene Cisplatinverbindung enthält, sowie ein Verfahren zur Bildung solcher Zusammensetzungen durch Erhitzen einer wässrigen Lösung von Cisplatin, um seine Löslichkeit (z.B. um das 2- bis 8fache) zu steigern, und anschließendes Zusetzen von vesikelbildenden Lipiden.
  • Das US-Patent Nr. 5.795.589 (Mayer et al.) beschreibt Verfahren zur Einkapselung von antineoplastischen Mitteln in Liposome, das sich einen aktiven Mechanismus unter Verwendung eines Transmembranionengradienten, vorzugsweise eines Transmembran-pH-Gradienten, zu Nutzen macht.
  • Das US-Patent Nr. 5.908.777 (Lee et al.) beschreibt Verfahren zur Herstellung eines Lipidvektors zur Zufuhr von Nucleinsäure und anderen Molekülen mit therapeutischem Wert, die das Kontaktieren des Moleküls mit einem Polykation (z.B. einem Polylysinhydrobromidsalz), wodurch ein Komplex gebildet wird, und anschließend das Vermischen des Komplexes mit einem anionischen Lipidpräparat umfassen.
  • Das US-Patent Nr. 5.747.469 (Roth et al.) beschreibt die Verwendung von Tumorsuppressorgenen (z.B. auf S. 53) in Kombination mit einem DNA-zerstörenden Mittel (z.B. Cisplatin) zur Verwendung beim Abtöten von Zellen und in bestimmten Krebszellen.
  • Das US-Patent Nr. 5.882.679 (Needham) beschreibt Liposomen, die aktive Mittel (z.B. Paclitaxel) enthalten, die mit einem Lipidtensid ein Aggregat bilden, und die Liposomenmembran wird so formuliert, dass sie Resistenz gegenüber den zerstörenden Wirkungen des darin enthaltenen Aggregats zeigen. Die Liposomenmembran enthält Polyethylenglykol in ausreichender Menge, um eine Fusion der Membran mit dem Wirkstoff/Tensid-Aggregat, das darin eingefangen ist, zu inhibieren.
  • Somit war, wenn auch die früheren Berichte darauf hinweisen, dass Liposomen-vermittelte Zufuhr von Cisplatin und anderen therapeutischen Wirkstoffen möglich ist, die therapeutische Effizienz durch die geringe Wasserlöslichkeit und geringe Stabili tät von Cisplatin stets begrenzt. Die therapeutische Wirksamkeit ist auch durch die hohe Toxizität des Wirkstoffs limitiert. Somit besteht Bedarf daran, den Schwierigkeiten beizukommen, die mit der Verarbeitung von Cisplatin-hältigen Wirkstoffen einhergehen, und die hohe Toxizität von Cisplatin, sofern es therapeutisch verwendet wird, zu reduzieren. Diese Erfindung wird diesen Anforderungen gerecht und stellt auch weitere Vorteile in diesem Zusammenhang bereit.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cisplatinmicellen, umfassend: a) das Kombinieren von: (i) Cisplatin; und (ii) einem Phosphatidylglycerinlipid-Derivat in einem Verhältnis Cisplatin:Lipidderivat von 1:1 bis 1:2, um ein Cisplatingemisch zu bilden; und b) das Kombinieren des Cisplatingemisches aus Schritt a) mit einer wirksamen Menge einer zumindest 30%igen Ethanollösung, um Cisplatinmicellen zu bilden, worin Cisplatin in seiner Aquaform vorliegt.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cisplatinmicellen, umfassend: a) das Kombinieren von: (i) Cisplatin; und (ii) einer wirksamen Menge einer zumindest 30%igen Ethanollösung; um eine Cisplatin/Ethanol-Lösung zu bilden; und b) das Kombinieren der Cisplatin/Ethanol-Lösung aus Schritt a) mit einem Phosphatidylglycerinlipid-Derivat in einem Verhältnis Cisplatin:Lipidderivat von 1:1 bis 1:2, um Cisplatinmicellen zu bilden, worin Cisplatin in seiner Aquaform vorliegt.
  • In einer Ausführungsform ist das Phosphatidylglycerinlipidderivat aus: Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG), Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG), Dicaproylphosphatidylglycerin (DCPG), Distearoylphosphatidylglycerin (DSPG) und Dioleylphosphatidylglycerin (DOPG) ausgewählt.
  • In einer Ausführungsform beträgt das Molverhältnis 1:1.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren weiters den Schritt des Kombinierens des Gemischs oder der Lösung aus Schritt a) mit einer wirksamen Menge eines freien fusogenen Peptids, eines fusogenen Peptid-Lipid-Konjugats oder eines fusogenen Peptid-PEG-hydriertes-Soja-Phosphatidylcholin-(-HSPC-)Konjugats; worin das fusogene Peptid mit einer Folge von 1–6 negativ geladenen Aminosäuren am N- oder C-Terminus derivatisiert ist und deshalb in der Lage ist, sich elektrostatisch an Cisplatin in seiner Aquaform zu binden.
  • In einer Ausführungsform umfasst das freie fusogene Peptid oder fusogene Peptid-Lipid-Konjugat Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE) oder DOPE/kationisches Lipid.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Entfernens von Ethanol aus den Cisplatinmicellen.
  • In einer Ausführungsform erfolgt das Entfernen von Ethanol durch Dialyse der Micellen durch permeable Membranen, um das Ethanol zu entfernen.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Cisplatinmicelle, die durch ein oben beschriebenes Verfahren erhältlich ist.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einkapseln von Cisplatinmicellen, umfassend das Vermischen einer wirksamen Menge eines vesikelbildenden Lipids mit den durch ein oben beschriebenes Verfahren erhaltenen Cisplatinmicellen.
  • In einer Ausführungsform ist das Lipid aus vorgefertigten neutralen Liposomen, bestehend aus 10–60% Cholesterin, 40–90% hydriertem Soja-Phosphatidylcholin (HSPC) und 1–7% Polyethylenglykol-hydriertes-Sojaphosphatidylcholin (PEG-HSPC), oder Lipiden in Lösung, Lipiden in Pulverform und Polyethylenglykol-Distearoylphosphatidylethanolamin (PEG-DSPE) ausgewählt.
  • In einer Ausführungsform umfasst das Lipid 10–60% Cholesterin.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eingekapseltes Cisplatin, das durch die oben beschriebenen Verfahren erhältlich ist.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Cisplatin/Lipid-Komplexes, der in der Lage ist, Makrophagen und Zellen des Immunsystems zu meiden, wenn er einem Patienten verabreicht wird, wobei das Verfahren das Vermischen einer wirksamen Menge von oben beschriebenen Cisplatinmicellen mit einer wirksamen Menge Polyethylenglykol-Distearoylphosphatidylethanolamin (PEG-DSPE), Polyethylenglykol-Distearoylphosphatidylcholin (PEG-DSPC) oder Hyaluronsäure-Distearoylphosphatidylethanolamin umfasst.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eingekapseltes Cisplatin, das durch das oben beschriebene Verfahren erhältlich ist.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, umfassend eingekapseltes Cisplatin wie zuvor beschrieben und ein Arzneimittel, das ausgewählt ist aus: Doxorubicin, Fluordesoxyuridin, Bleomycin, Adriamycin, Vinblastin, Prednison, Vincristin und Taxol.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zufuhr von Cisplatin zu einer Zelle, in vitro, umfassend das Kontaktieren der Zelle mit eingekapseltem Cisplatin wie zuvor beschrieben.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eingekapseltes Cisplatin wie zuvor beschrieben zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eingekapseltes Cisplatin wie zuvor beschrieben zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren zur Hemmung des Wachstums eines Tumors im menschlichen oder tierischen Körper.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eingekapseltes Cisplatin wie zuvor beschrieben zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren zum Zielen auf feste Tumoren und Metastasen durch intravenöse Verabreichung in den menschlichen oder tierischen Körper.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eingekapseltes Cisplatin wie zuvor beschrieben und ein Gen, ausgewählt aus der aus p53-, pax5- und HSV-tk-Genen bestehenden Gruppe, zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren zur Hemmung des Wachstums eines Tumors im menschlichen oder tierischen Körper.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eingekapseltes Cisplatin wie zuvor beschrieben; ein Gen, ausgewählt aus der aus p53-, pax5- und HSV-tk-Genen bestehenden Gruppe; und eine wirksame Menge eingekapseltes Ganciclovir; zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren zur Hemmung des Wachstums eines Tumors im menschlichen oder tierischen Körper.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eingekapseltes Cisplatin wie zuvor beschrieben und ein Gen, ausgewählt aus der aus p53-, pax5- und HSV-tk-Genen bestehenden Gruppe, zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren zur Hemmung des Wachstums eines Tumors im menschlichen oder tierischen Körper, worin die mit Cisplatin zu kombinierenden Gene beliebig ausgewählt sein können aus eingekapseltem IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α, RB, BRCA1, E1A, Cytosindesaminase in Kombination mit eingekapseltem 5-Fluorcytosin, blc-2, MDR-1, p21, p16, bax, bcl-xs, E2F, IGFI, VEGF und TGF-β oder Kombinationen davon sind.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von eingekapseltem Cisplatin wie zuvor beschrieben zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung zur Hemmung des Wachstums eines Tumors im menschlichen oder tierischen Körper.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von eingekapseltem Cisplatin wie zuvor beschrieben zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung von festen Tumoren und Metastasen im menschlichen oder tierischen Körper durch intravenöse Verabreichung.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von eingekapseltem Cisplatin wie zuvor beschrieben und eines Gens, ausgewählt aus der aus p53-, pax5- und HSV-tk-Genen bestehenden Gruppe, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung zur Hemmung des Wachstums eines Tumors im menschlichen oder tierischen Körper.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von eingekapseltem Cisplatin wie zuvor beschrieben; eines Gens, ausgewählt aus der aus p53-, pax5- und HSV-tk-Genen bestehenden Gruppe; und einer wirksamen Menge an eingekapseltem Ganciclovir; zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung zur Hemmung des Wachstums eines Tumors im menschlichen oder tierischen Körper.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von eingekapseltem Cisplatin und eines Gens, ausgewählt aus der aus p53-, pax5- und HSV-tk-Genen bestehenden Gruppe, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung zur Hemmung des Wachstums eines Tumors im menschlichen oder tierischen Körper, worin die mit Cisplatin zu kombinierenden Gene beliebig ausgewählt sind aus eingekapseltem IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α, RB, BRCA1, E1A, Cytosindesaminase in Kombination mit eingekapseltem 5-Fluorcytosin, blc-2, MDR-1, p21, p16, bax, bcl-xs, E2F, IGFI, VEGF und TGF-β oder Kombinationen davon sind.
  • Diese Erfindung stellt ein Verfahren zum Einkapseln von Cisplatin und anderen, positiv geladenen Wirkstoffen in Liposome bereit, die eine unterschiedliche Lipidzusammensetzung zwischen ihren inneren und äußeren Membran-Doppelschichten aufwei sen und in der Lage sind, nach intravenöser Injektion in Tiere und Menschen primäre Tumoren und ihre Metastasen zu erreichen. In einem Aspekt umfasst das Verfahren Komplexbildung zwischen Cisplatin und DPPG (Dipalmitoylphosphatidylglycerin) oder anderen Lipidmolekülen, um Cisplatin durch Hydrolyse zu seiner Aquaform umzusetzen, die positiv geladen ist und die aktive Form von Cisplatin ist, die mit antineoplastischer Aktivität ausgestattet ist. In dieser Phase können Membranfusionspeptide und andere Moleküle mit fusogenen Eigenschaften zugesetzt werden, um Eintritt durch die Zellmembran des Komplexes hindurch zu verbessern. Die Aqua-Cisplatin-DPPG-Micellen werden durch Vermischen mit vesikelbildenden Lipiden wie etwa vorgefertigten Liposomen oder Lipiden und darauf folgende Dialyse und Abscheidung durch Membranen, die Cisplatin mit einer sehr hohen Ausbeute einfangen und einkapseln, zu Liposomen umgesetzt. Doxorubicin oder andere positiv geladene Verbindungen können anstelle von Cisplatin in diesen Formulierungen eingesetzt werden. Das eingekapselte Cisplatin zeigt hohe therapeutische Wirksamkeit beim Auslöschen zahlreicher verschiedener, menschlicher fester Tumoren, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich Brustkarzinom und Prostatakarzinom. Eine Kombination des eingekapselten Cisplatins mit eingekapseltem Doxorubicin oder mit anderen antineoplastischen Wirkstoffen wird als therapeutisch wertvoll erachtet. Auch wird beansprucht, dass Kombinationen aus eingekapseltem Cisplatin und zahlreichen krebsbekämpfenden Genen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf p53, IL-2, IL-12, Angiostatin und Oncostatin, eingekapselt in Liposomen, sowie Kombinationen aus eingekapseltem Cisplatin und HSV-tk plus eingekapseltes Ganciclovir für die Krebsbekämpfung therapeutischen Wert aufweisen.
  • Kurzbeschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt Cisplatin-Einkapselung.
  • 2 zeigt MCF7-Tumorregression in SCID-Mäusen nach 3–4 Injektionen von eingekapseltem Cisplatin.
  • 3 zeigt die Histologie von Tumoren in SCID-Mäusen mit oder ohne Behandlung mit Cisplatin. 3A zeigt nicht behandelte MCF-7-Tumoren, die in SCID-Mäusen wuchsen (40fache Vergrößerung). Besonderes Augenmerk ist auf das homogene Strukturenmuster zu legen, das für Tumorgewebe charakteristisch ist. 3B zeigt Cisplatin-behandelte Mäuse (4 Injektionen). Zellen sind apoptotisch, es gibt Gruppen von Zellen, die sich zu Strukturen ansammeln und deren Zellkerne größer und dunkler gefärbt sind, was charakteristisch für apoptotische Zellen ist. 3C zeigt Tumoren von nicht behandelten Tieren, die Muskelinvasion zeigen (20fache Vergrößerung). 3D zeigt Cisplatin-behandelte Mäuse. Es ist keine Invasion zu erkennen (20fache Vergrößerung).
  • 4 zeigt makroskopischen (sichtbaren) Unterschied der Tumorgröße zwischen einem mit eingekapseltem Cisplatin behandelten Tier (A) und einem nicht behandelten Tier (B).
  • Arten der Ausführung der Erfindung
  • Zur praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung werden, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Verfahren aus den Bereichen der Immunologie, Molekularbiologie, Mikrobiologie, Zellbiologie und DNA-Rekombination verwendet. Diese Verfahren werden in den folgenden Publikationen beschrieben. Siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989); Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology (1987); die Reihe Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); "PCR: A Practical Approach" (M. MacPherson et al., IRL Press at Oxford University Press (1991)); PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames & G. R. Taylor, Hrsg. (1995)); Antibodies, a Laboratory Manual (Harlow & Lane, Hrsg. (1988)); und Animal Cell Culture (R. I. Freshney, Hrsg. (1987)).
  • In der Beschreibung und in den Ansprüchen umfassen die Einzahlformen "ein/e/s" und "der/die/das" auch Pluralverweise, außer der Kontext legt die Bedeutung eindeu tig fest. Die Bezeichnung "eine Zelle" beispielsweise umfasst eine Vielzahl von Zellen, einschließlich Gemischen davon.
  • Das Verb "umfassen" bedeutet, dass die Zusammensetzungen und Verfahren die angeführten Elemente miteinschließen, ohne andere auszuschließen. "Im Wesentlichen bestehen aus", wenn es zur Definition von Zusammensetzungen und Verfahren gebraucht wird, soll andere Elemente ausschließen, die irgendeine wesentliche Bedeutung für die Kombination haben. Somit würde eine Zusammensetzung, die im Wesentlichen aus den Elementen wie hierin definiert besteht, Spuren von Verunreinigungen aus dem Isolierungs- und Reinigungsverfahren und pharmazeutisch annehmbare Träger, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Konservierungsmittel und dergleichen, nicht ausschließen. "Bestehen aus" soll mehr als Spurenelemente anderer Bestandteile und wesentliche Verfahrensschritte zur Verabreichung der Zusammensetzungen dieser Erfindung ausschließen. Ausführungsformen, die durch jeden dieser Begriffe definiert sind, liegen im Schutzumfang dieser Erfindung.
  • Die Bezeichnungen "Polynucleotid" und "Nucleinsäuremolekül" werden synonym gebraucht, um auf polymere Formen von Nucleotiden jeder beliebigen Länge Bezug zu nehmen. Die Polynucleotide können Desoxyribonucleotide, Ribonucleotide und/oder Analoga davon enthalten. Nucleotide können jede beliebige dreidimensionale Struktur aufweisen und können jegliche Funktion, bekannt oder unbekannt, erfüllen. Die Bezeichnung "Polynucleotid" umfasst beispielsweise einzel-, doppelsträngige und Tripelhelix-Moleküle, Gene oder Genfragmente, Exons, Introns, mRNA, tRNA, rRNA, Ribozyme, cDNA, rekombinante Polynucleotide, verzweigte Polynucleotide, Plasmide, Vektoren, isolierte DNA beliebiger Sequenz, isolierte RNA beliebiger Sequenz, Nucleinsäuresonden und Primer. Ein Nucleinsäuremolekül kann auch modifizierte Nucleinsäuremoleküle umfassen.
  • Ein "Gen" bezieht sich auf ein Polynucleotid, das zumindest einen offenen Leseraster enthält, der in der Lage ist, für ein bestimmtes Polypeptid oder Protein zu kodieren, nachdem er transkribiert und translatiert wurde.
  • Eine "Zusammensetzung" soll eine Kombination aus Wirkstoff und einer anderen Verbindung oder Zusammensetzung, inaktiv (beispielsweise ein nachweisbares Mittel oder ein pharmazeutisch annehmbarer Träger) oder aktiv, wie beispielsweise ein Adjuvans, bezeichnen.
  • Eine "pharmazeutische Zusammensetzung" soll die Kombination aus einem Wirkstoff und einem Träger, inaktiv oder aktiv, der die Zusammensetzung für diagnostische oder therapeutische Verwendung in vitro, in vivo oder ex vivo geeignet macht, umfassen.
  • Wie hierin verwendet umfasst die Bezeichnung "pharmazeutisch annehmbarer Träger" jeden beliebigen der herkömmlichen pharmazeutischen Träger, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Wasser und Emulsionen, wie Öl-in-Wasser- oder Waser-in-Öl-Emulsionen, sowie verschiedene Typen von Benetzungsmitteln. Die Zusammensetzungen können auch Stabilisatoren und Konservierungsmittel umfassen. Beispiele für Träger, Stabilisatoren und Adjuvanzien sind in Martin, Remington's Pharm. Sci., 15. Auflage, Mack Publ. Co., Easton (1975), zu finden.
  • Eine "wirksame Menge" ist eine Menge, die ausreicht, um günstige oder erwünschte Resultate zu erzielen. Eine wirksame Menge kann in einem oder mehreren Verabreichungsschritten, Anwendungen oder Dosierungen verabreicht werden.
  • Ein "Proband", "Individuum" oder "Patient" wird hierin synonym verwendet und bezieht sich auf ein Wirbeltier, vorzugsweise ein Säugetier, noch bevorzugter einen Menschen. Säugetiere umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Gattung der Murinen und Simianen, auf Menschen, Nutztiere, Sporttiere und Haustiere.
  • Eine "Kontrolle" ist ein alternativer Proband oder eine alternative Probe, der bzw. die in einem Versuch zu Vergleichszwecken verwendet wird. Eine Kontrolle kann "positiv" oder "negativ" sein. Ist der Zweck des Versuchs beispielsweise, eine Korrelation zwischen einem veränderten Expressionsniveau eines Gens und einem bestimmten Krebstyp zu bestimmen, so wird im Allgemeinen bevorzugt, eine positive Kontrolle (einen Probanden oder eine Probe aus einem Probanden, der bzw. die solch eine Veränderung in sich trägt und Syndrome aufweist, die für diese Erkrankung charakteristisch sind) und eine negative Kontrolle (einen Probanden oder eine Probe aus einem Probanden, dem bzw. der die veränderte Expression und das klinische Syndrom dieser Krankheit fehlen) zu verwenden.
  • Ein "Genzufuhrvehikel" ist als ein Molekül definiert, das insertierte Polynucleotide in eine Wirtszelle tragen kann. Beispiele für Genzufuhrvehikel sind Liposomen, kationische Liposomen, Viren, wie Baculovirus, Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus und Retrovirus, Bakteriophage, Cosmid, Plasmid, Pilzvektoren und andere Rekombinationsvehikel, die auf dem Gebiet der Erfindung typischerweise verwendet werden, die zur Expression in zahlreichen verschiedenen eukaryotischen und prokaryotischen Wirten beschrieben wurden und für Gentherapie sowie für einfache Proteinexpression verwendet werden können.
  • Ein "Virusvektor" ist als ein rekombinant gebildetes Virus oder Viruspartikel definiert, das ein Polynucleotid umfasst, das es, entweder in vivo, ex vivo oder in vitro, in eine Wirtszelle zu befördern gilt. Beispiele für Virusvektoren umfassen Retrovirusvektoren, Adenovirusvektoren, Adeno-assoziierte Virusvektoren und dergleichen. In Aspekten, in denen Gentransfer von einem Retrovirus vermittelt wird, bezieht sich ein Vektorkonstrukt auf das das Retrovirusgenom oder einen Teil davon umfassende Polynucleotid und das insertierte Polynucleotid. Wie hierin verwendet tragen "retroviral vermittelter Gentransfer" und "Retrovirustransduktion" dieselbe Bedeutung und beziehen sich auf das Verfahren, durch das ein Gen oder Nucleinsäuresequenzen dadurch, dass das Virus in die Zelle eintritt und sein Genom in das Wirtszellengenom integriert, stabil in die Wirtszelle transferiert wird bzw. werden. Das Virus kann in die Wirtszelle über seinen normalen Infektionsmechanismus eintreten, oder es kann so modifiziert werden, dass es sich an einen anderen Wirtszelloberflächenrezeptor oder -liganden bindet, um so in die Zelle einzudringen. Wie hierin verwendet bezieht sich Retrovirusvektor auf ein Viruspartikel, das in der Lage ist, exogene Nucleinsäure durch einen viralen oder virusähnlichen Eintrittsmechanismus in eine Zelle einzuführen.
  • Retroviren tragen ihre genetische Information in Form von RNA; nachdem jedoch das Virus eine Zelle infiziert hat, wird die RNA zur DNA-Form revers transkribiert, die sich in die genomische DNA der infizierten Zelle integriert. Die integrierte DNA-Form wird als Provirus bezeichnet.
  • In Aspekten, in denen Gentransfer durch einen DNA-Virusvektor, wie beispielsweise ein Adenovirus (Ad) oder Adeno-assoziiertes Virus (AAV), vermittelt wird, bezieht sich ein Vektorkonstrukt auf das Polynucleotid, das das Virusgenom oder einen Teil davon umfasst, und ein zu insertierendes Polynucleotid. Adenoviren (Ads) sind eine relativ gut charakterisierte, homogene Gruppe von Viren, die über 50 Serotypen umfasst (siehe z.B. die WO 95/27071). Ads sind leicht zu züchten und erfordern keine Integration in das Wirtszellgenom. Rekombinante, von Ad abstammende Vektoren, insbesondere jene, die das Potenzial zu Rekombination und Bildung von Wildtypvirus reduzieren, wurden ebenfalls bereits konstruiert (siehe die WO 95/00655; WO 95/11984). Wildtyp-AAV zeigt hohe Infektiosität und Spezifität beim Integrieren in das Wirtszellgenom (Hermonat & Muzyczka, PNAS USA 81, 6466–6470 (1984); Lebkowski et al., Mol. Cell. Biol. 8, 3988–3996 (1988)).
  • Vektoren, die sowohl einen Promotor als auch eine Klonierstelle enthalten, an die ein Polynucleotid operativ gebunden werden kann, sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt. Solche Vektoren sind in der Lage, RNA in vitro oder in vivo zu transkribieren und sind im Handel bei Quellen wie Stratagene (La Jolla, CA) und Promega Biotech (Madison, VI) erhältlich. Um Expression und/oder In-vitro-Transkription zu optimieren, kann es erforderlich sein, 5'- und/oder 3'-untranslatierte Abschnitte der Klone zu entfernen, zuzusetzen oder zu verändern, um zusätzliche, potenzielle, ungeeignete alternative Translationsinitiationscodons oder andere Sequenzen, die Expression stören oder reduzieren können, entweder auf Transkriptions- oder Translationsebene zu eliminieren. Alternativ dazu können Consensus-Ribosomenbindungsstellen unmittelbar 5' vom Startcodon insertiert werden, um Expression zu steigern.
  • Genzufuhrvehikel umfassen auch mehrere nicht virale Vektoren, einschließlich DNA/Liposomen-Komplexe und gerichtete Virusprotein-DNA-Komplexe. Liposomen, die auch einen Target-Antikörper oder ein Fragment davon umfassen, können in den Verfahren dieser Erfindung verwendet werden. Um die Zufuhr zu einer Zelle zu steigern, kann/können die Nucleinsäure oder Proteine dieser Erfindung an Antikörper oder Bindungsfragmente davon konjugiert werden, die Zelloberflächenantigene binden, z.B. TCR, CD3 oder CD4.
  • Polynucleotide werden in Vektorgenomen unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren insertiert. Insert- und Vektor-DNA können beispielsweise unter geeigneten Bedingungen mit einem Restriktionsenzym kontaktiert werden, um komplementäre Enden an jedem Molekül zu schaffen, die sich jeweils miteinander paaren können und mittels einer Ligase miteinander verbunden werden können. Alternativ dazu können synthetische Nucleinsäurelinker an die Termini eines eingeschränkten Polynucleotids ligiert werden. Diese synthetischen Linker enthalten Nucleinsäuresequenzen, die einer bestimmten Restriktionsstelle in der Vektor-DNA entsprechen. Darüber hinaus kann ein Oligonucleotid, das ein Terminationscodon und eine geeignete Restriktionsstelle enthält, zur Insertion in einen Vektor, der beispielsweise einige oder alle der folgenden Elemente: ein selektierbares Markergen, wie z.B. das Neomycingen, zur Selektion stabiler oder vorübergehender Transfektanten in Säugetierzellen; Enhancer/Promotorsequenzen aus dem unmittelbar frühen Gen aus menschlichem CMV für hohe Transkriptionsniveaus; Transkriptionsterminations- und RNA-Verarbeitungssignale aus SV40 für mRNA-Stabilität; SV40-Polyoma-Replikationsursprünge und ColE1 für korrekte episomale Replikation; vielseitige Mehrfachklonierstellen; stabilisierende Elemente 3' zum insertierten Polynucleotid; und T7- und SP6-RNA-Promotoren für In-vitro-Transkription von Sense- und Antisense-RNA; enthält, ligiert werden. Andere Mittel sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt und erhältlich.
  • "Wirtszelle" soll hierin jegliche individuelle Zelle oder Zellkultur umfassen, die Rezipienten für Vektoren oder für die Inkorporation von exogenen Polynucleotiden, Polypeptiden und/oder Proteinen darstellen können oder dargestellt haben. Auch soll diese Bezeichnung die Nachkommenschaft einer einzelnen Zelle umfassen, und die Nachkommenschaft muss aufgrund von natürlicher, zufälliger oder beabsichtigter Mutation mit der ursprünglichen verwandten Zelle nicht notwendigerweise völlig identisch sein (bezüglich Morphologie oder genomischem oder Gesamt-DNA-Komplement). Die Zellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Bakterienzellen, Hefezellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Tierzellen und Säugetierzellen, z.B. Maus-, Ratten-, Affen- oder Menschenzellen.
  • Wie hierin verwendet beziehen sich die Bezeichnungen "neoplastische Zellen", "Neoplasie", "Tumor", "Tumorzellen", "Krebs" und "Krebszellen" (synonym gebraucht) auf Zellen, die relativ autonomes Wachstum aufweisen, sodass sie einen anormalen Wachstumsphänotyp aufweisen, der durch einen signifikanten Verlust der Kontrolle über Zellproliferation (d.h. deregulierte Zellteilung) gekennzeichnet ist. Neoplastische Zellen können bösartig oder gutartig sein.
  • Das "Unterdrücken" von Tumorwachstum bezieht sich auf einen Wachstumszustand, der im Vergleich zu Kontrollzellen eingeschränkt ist. Tumorzellwachstum kann mittels jeglichen Verfahrens nach dem Stand der Technik bewertet werden, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf das Messen der Tumorgröße, das Bestimmen, ob Tumorzellen unter Verwendung eines 3H-Thymidininkorporationstests proliferieren, oder das Zählen von Tumorzellen. "Unterdrücken" von Tumorzellwachstum bezeichnet jede beliebige oder alle der folgenden Zustände: Verlangsamen, Verzögern und Stoppen von Tumorwachstum sowie Tumorschwund.
  • Ausführungsformen der Erfindung
  • Micellen, Liposomen und Verfahren zu deren Gewinnung
  • Hierin beschrieben wird ein neues Verfahren zum Einfangen von Cisplatin in Lipide, das den Gehalt an Cisplatin pro Volumeneinheit erhöht, seine Toxizität reduziert, in der Lage ist, nach intravenöser Injektion auf Primärtumoren und ihre Metastasen zu zielen, und Tumorschwund und vollständige Therapie von SCID-Mäusen, die menschliche Tumoren in sich tragen, erzielt.
  • Cisplatin ist ein Schwermetallkomplex, der zwei Chloridatome und zwei Aminogruppen in der cis-Position, gebunden an ein Atom des Übergangsschwermetalls Platin in seiner zweiwertigen Form, enthält. Es ist ein bifunktionelles Alkylierungsmittel sowie ein DNA-Interkalator, der DNA-Synthese inhibiert. In einer Form ist Cisplatin ein gelbes Pulver mit einem Molekulargewicht von 300,1 und einer eingeschränkten Löslichkeit von 1 mg/ml in Wasser. Es wird umfassend zur Behandlung von Krebspatienten eingesetzt, insbesondere von jenen mit Hodenkarzinom, Lymphomen, Korpuskarzinom, Blasen-, Eierstock-, Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinomen, Brustkarzinomen und zahlreichen anderen Malignitäten, und dies häufig in Kombination mit Adriamycin, Vinblastin, Bleomycin, Prednison, Vincristin, Taxol und anderen antineoplastischen Wirkstoffen sowie mit Bestrahlungstherapie. Die hierin beschriebenen Verfahren ermöglichen eine Reduktion des gesamten, für eine Patientenbehandlung erforderlichen Cisplatinvolumens, da sie seine Löslichkeit in seiner in Lipid eingefangenen Form steigern.
  • Das für intravenöse Injektion verwendete Volumen ist üblicherweise groß (etwa 180 ml pro erwachsenem Patienten oder etwa 20–120 mg/m2) und wird in Form einer 24-h-Infusion verabreicht. Es wird in einer raschen Phase von 25–80 min, gefolgt von einer langsameren, sekundären Phase von 58–73 h, aus dem Plasma geklärt; es ist durch Plasmaproteine gebunden und wird aus den Nieren ausgeschieden (was die schwer wiegende Nierentoxizität in behandelten Patienten erklärt). Dosisgebundener Nephrotoxizität kann teilweise durch starke Hydratisierung, Mannit, Furosemid und andere Wirkstoffe beigekommen werden. Andere, durch Cisplatin hervorgerufene Toxizitäten umfassen Ototoxizität, Übelkeit und Erbrechen, Anämie und schwache Myelosuppression (The Merck Manual of Diagnosis and Therapy). Die vorliegende Erfindung schafft den Einschränkungen von Verfahren und Zusammensetzungen nach dem Stand der Technik Abhilfe.
  • Hierin beschrieben werden Verfahren zur Herstellung von Cisplatinmicellen durch Kombinieren von Cisplatin und einem Phosphatidylglycerinlipidderivat (PGL-Derivat) in einem Bereich von 1:1 bis 1:2,1, um ein Cisplatingemisch zu bilden. In alternativen Ausführungsformen liegt der Bereich von Cisplatin zu PGL-Derivat in den Bereichen 1:1,2; oder 1:1,4; oder 1:1,5; oder 1:1,6; oder 1:1,8; oder 1:1,9; oder 1:2,0; oder 1:2,1. Das Gemisch wird dann mit einer wirksamen Menge eines zumindest 20%igen organischen Lösungsmittels wie einer Ethanollösung kombiniert, um Cisplatinmicellen zu bilden.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet "Phosphatidylglycerinlipidderivat (PGL-Derivat)" jegliches Lipidderivat, das die Fähigkeit besitzt, Micellen zu bilden und eine eindeutig negativ geladene Hauptgruppe aufzuweisen. Dies umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG), Dimyristoylphosphatidylglycerin und Dicarpylphosphatidylglycerin. In einem Aspekt umfassen Phosphatidylderivate jene mit einer Kohlenstoffkette von 10 bis 28 Kohlenstoffatomen und mit einer ungesättigten aliphatischen Seitenkette. Die Komplexbildung von Cisplatin mit negativ geladenen Phosphatidylglycerinlipiden mit Variationen im Molverhältnis, die den Partikeln eine eindeutige positive (1:1), neutrale (1:2) oder leicht negative (1:2,1) Ladung verleihen, ermöglicht nach Verabreichung das Targeting verschiedener Gewebe im Körper. Es zeigte sich jedoch, dass die Komplexbildung von Cisplatin mit negativ geladenem PGL die Löslichkeit von Cisplatin steigert und dadurch das für wirksame antineoplastische Therapie erforderliche Wirkstoffvolumen reduziert. Darüber hinaus führt die Komplexbildung von Cisplatin und negativ geladenem PGL zu sehr hoher Einkapselungseffizienz, wodurch Wirkstoffverlust während des Herstellungsprozesses minimiert wird. Diese Komplexe sind stabil, bilden keine Niederschläge und behalten therapeutische Wirksamkeit auch nach zumindest viermonatiger Lagerung bei 4°C bei.
  • Wie hierin verwendet umfasst die Bezeichnung "Cisplatin" Analoga. Beispiele umfassen Carboplatin, Ormaplatin, Oxaplatin, 2-Aminomethylpyrrolidin (1,1-Cyclobutandicarboxylato)platin, Lobaplatin, 1-Cyclobutandicarboxylato(2-)-(2-methyl-1,4-butandiamin-N,N')platin, Zeniplatin, Enloplatin, 254-S-Nedaplatin und JM-216 (Bis-acetatoamindichlorocyclohexylaminplatin(IV)).
  • Es gilt zu verstehen, dass, auch wenn dies nicht stets explizit erwähnt wird, andere, positiv geladene Wirkstoffe, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, den antineo plastischen Wirkstoff Doxorubicin, anstelle von Cisplatin eingesetzt werden können. Alternativ dazu können andere Typen von Wirkstoffen, die neutral sind, bei der Umsetzung zu positiv geladenen Wirkstoffen durch Derivation mit positiv geladenen Gruppen verwendet werden. Modifikation eines neutralen oder negativ geladenen, krebsbekämpfenden Wirkstoff oder eines anderen Wirkstofftyps zu einem positiv geladenen Molekül kann durch zahlreiche Verfahren, die auf dem Gebiet der organischen Synthese durchwegs bekannt sind, erfolgen. Dies kann beispielsweise durch Ersetzen einer Hydroxylgruppe im Wirkstoff durch eine Aminogruppe oder durch eine Trimethylaminogruppe, wodurch eine positive Ladung in die Verbindung eingeführt wird, erreicht werden. Die Ersetzung einer Ring-Hydroxylgruppe durch eine Aminogruppe wird im US-Patent 5.837.868 von Wang et al., ausgegeben am 17. November 1998, erläutert.
  • Das obige Verfahren erfordert nicht, dass die einzelnen Schritte in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden. Beispielsweise kann das Verfahren durch Kombinieren von Cisplatin mit einer wirksamen Menge eines 20%igen, organischen Lösungsmittels, um eine Lösung zu bilden, durchgeführt werden. Die Lösung wird mit einem Phosphatidylglycerinlipid-(PGL-)Derivat in einem Bereich von 1:1 bis 1:2,1 kombiniert, um eine Cisplatinmicelle zu bilden. Wie oben liegt der Bereich von Cisplatin zu PGL-Derivat in den Bereichen 1:1,2; oder 1:1,4; oder 1:1,5; oder 1:1,6; oder 1:1,8; oder 1:1,9; oder 1:2,0: oder 1:2,1.
  • Jegliches organische Lösungsmittel oder jegliche Formulierung von Ethanol, oder jeglicher andere Alkohol, der kein Zweiphasensystem bildet, oder ein anderes organisches Lösungsmittel (d.h. Chloroform), das in einem 20%igen Alkohol mischbar ist, ist in den hierin beschrieben Verfahren nützlich. Die Alkohollösung kann beispielsweise jede beliebige mit zumindest 30%, 35%, 40%, 45% bis zu 90%, einschließlich jedes möglichen Prozentsatzes dazwischen, sein. Vorzugsweise ist die Alkohollösung 30% Ethanol für DPPG, und für andere Lipide kann der optimale Prozentsatz einen anderen Wert aufweisen.
  • In einer Ausführungsform ergibt teilweise Ersetzung von DPPG-Molekülen durch Peptide mit einer eindeutigen negativen Ladung Cisplatinkomplexe mit fusogenen Eigenschaften, die in der Lage sind, die Zellmembran des Targets zu durchwandern. Fusogene Peptide können, um besser präsentiert zu sein, auch kovalent an das freie Ende von PEG gebunden sein. Der Zusatz einer kleinen Menge von kationischen Lipiden, die positive Ladungen von Aqua-Cisplatin am endgültigen Cisplatin/DPPG-Komplex ersetzen, verleiht dem Komplex auch fusogene Eigenschaften; der Prozentsatz positiver Ladungen, die es durch kationische Lipide (z.B. DDAB, Dimethyldioctadecylammoniumbromid; DMRIE: N-[1-(2,3-dimydristyloxy)propyl]-N,N-dimethyl-N-(2-hydroxyethyl)ammoniumbromid; DMTAP: 1,2-Dimyristol-3-trimethylammoniumpropan; DOGS: Dioctadecylamidoglycylspermin; DOTAP: N-(1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammoniumchlorid; DPTAP: 1,2-Dipalmitoyl-3-trimethylammoniumpropan; DSTAP; 1,2-Distearoyl-3-trimethylammoniumpropan) zu substituieren gilt, ist aufgrund der Toxizität kationischer Lipide gering. Manche Formulierungen enthalten eine Menge des fusogenen amphipathischen Lipids DOPE in den Micellen.
  • In einem weiteren Aspekt werden die Cisplatinmicellen in vesikelbildende Lipide, beispielsweise zur Verwendung zur Wirkstoffzufuhr, eingekapselt.
  • Das in Lipid eingekapselte Cisplatin weist eine hohe therapeutische Wirksamkeit zur Bekämpfung zahlreicher fester menschlicher Tumoren auf, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, Brustkarzinom, Prostatakarzinom, Glioblastoma multiforme, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom, Pankreaskarzinom, Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinom und T-Zelllymphome. Hierin wird ein Verfahren zur Behandlung zahlreicher verschiedener menschlicher Malignitäten unter Verwendung eines eingekapselten Cisplatins oder alternativ dazu anderer, positiv geladener, antineoplastischer Wirkstoffe in Liposomen mit einer unterschiedlichen Lipidzusammensetzung zwischen den inneren und äußeren Membran-Doppelschichten bereitgestellt. Die in Liposomen eingekapselten Wirkstoffe sind in der Lage, Primärtumoren und ihre Metastasen nach intravenöser Injektion in Tiere und Menschen zu erreichen.
  • Eine Kombination des eingekapselten Cisplatins mit Doxorubicin oder mit anderen antineoplastischen Wirkstoffen weist eine höhere therapeutische Wirksamkeit als Cisplatin alleine auf. Ebenfalls höhere therapeutische Wirksamkeit zur Krebsbekämpfung weisen Kombinationen von eingekapseltem Cisplatin mit mehreren krebsbekämpfenden Genen, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, p53, IL-2, IL-12, Angiostatin und Oncostatin, eingekapselt in einen ähnlichen Typ von Liposomen, sowie Kombinationen von eingekapseltem Cisplatin mit HSV-tk plus eingekapseltes Ganciclovir auf.
  • Auch hierin beschrieben wird eine Kombination des eingekapselten Cisplatins mit den folgenden Genen:
    • (i) Ein Wildtyp-(wt-)p53-cDNA-Expressionsvektor unter der Steuerung von CMV, β-Actin oder anderen Promotoren und menschliche Replikationsursprünge, die in der Lage sind, langfristige Expression des p53-Gens zu unterstützen; virale Replikationsursprünge, die virale Replikationsstartproteine wie T-Antigen für ihre Aktivierung benötigen, sind für den Transfer des p53-Gens nicht geeignet, da p53-Protein stark mit T-Antigen wechselwirkt.
    • (ii) Ein PAX5-cDNA-Expressionsvektor, der einzige Suppressor des p53-Gens (sowohl des wt- als auch mutierter 53-Gene), der dafür bekannt ist, mit einer kurzen (10 Nucleotide) Regulationsregion innerhalb von Intron 1 des p53-Gens wechselzuwirken. Ein zentraler Nachteil der p53-Gentherapie ist die Deaktivierung des wt-p53-Proteins durch die endogenen mutierten Formen von p53, die in Tumoren überexprimiert werden und die in der Lage sind, mit wt-p53-Protein zu tetramerisieren; die endogenen p53-Gene werden durch Expression von Pax5, einem starken Transkriptionssuppressor des p53-Gens, unterdrückt. Dem wt-p53-cDNA-Vektor fehlt Intron 1 und folglich die unterdrückende PAX5-Bindungsregion. Es ist wichtig, die Expression des endogenen mutierten p53-Gens zu unterdrücken und mutiertes p53 aus den Krebszellen zu eliminieren, um Induktion von Apoptose und Tumorsuppression zu potenzieren.
    • (iii) Das Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase-(HSV-tk-)Gen. Das Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase-(HSV-tk-)Suizidgen wird ebenfalls in Kombinationen von p53- und Pax5-Genen eingebunden und verursacht eine Unterbrechung von DNA-Synthese nach Ganciclovir-(GCV-)Behandlung des Tiermodells und des menschlichen Patienten; hiervon wird erwartet, dass es die Strangbrüche in den Krebszellen steigert und die Tumorsuppressorfunktionen von p53 potenziert, das dafür bekannt ist, sich an Strangbrüche und an beschädigte DNA-Stellen zu binden. In einer weiteren Ausführungsform wird Ganciclovir kombiniert und in Liposomen eingekapselt.
  • Gentherapie ist ein neues Gebiet für die biomedizinische Forschung und zielt darauf ab, therapeutische Gene in Somazellen von Patienten einzuführen (siehe Boulikas, 1998a; Martin & Boulikas, 1998). Zwei zentrale Hindernisse stehen einer erfolgreichen Anwendung von somatischem Gentransfer im Wege: (1) der geringe Prozentsatz transduzierter Zellen und (2) der Verlust des Transkriptionssignals des therapeutischen Gens nach etwa 3–7 Tagen nach der In-vivo-Injektion.
  • Das erste Problem tritt (i) aufgrund der Unfähigkeit der das Gen tragenden Zufuhrvehikel, die Targetzelloberfläche zu erreichen (die große Mehrheit von Liposomen-DNA-Komplexen werden rasch aus dem Blutkreislauf eliminiert); (ii) aufgrund der Schwierigkeit, die Zellmembran zu durchdringen und (iii) die DNA aus Endosomen nach Internalisierung durch die Zellen freizusetzen; und (iv) aufgrund des ineffizienten Imports in die Zellkerne auf. Andere verwendeten sterisch stabilisierte Liposomen (Martin & Boulikas, 1998a), die tagelang im Blutkreislauf bestehen bleiben und sich in Tumoren konzentrieren. Klassische, sterisch stabilisierte Liposomen werden jedoch von Krebszellen nicht aufgenommen. Hierin werden Vorgehensweisen offenbart, die dazu entworfen sind, Liposomeninternalisierung zu steigern (fusogene Peptide).
  • Das zweite Problem resultiert aus dem Verlust der Plasmide im Zellkern durch Nucleaseabbau und der Unfähigkeit, autonom zu replizieren, was zu ihrer Verdünnung während der Zellproliferation unter der Zellnachkommenschaft führt, oder durch Deaktivierung der Fremd-DNA nach der Integration in die Chromosomen der Wirtszelle.
  • Die Verwendung menschlicher Sequenzen, die in der Lage sind, extrachromosomale Replikation von Plasmiden über längere Zeiträume hinweg zu unterstützen (siehe das US-Patent Nr. 5.894.060 zum Thema "Klonierverfahren zum Einfangen menschlicher Replikationsursprünge" von Teni Boulikas), wird diesem Problem beikommen.
  • Ebenfalls hierin beschrieben werden Tumorregression und -reduktion des Tumormassenvolumens von Brustkrebs, Prostatakrebs und anderen Krebsarten in Tiermodellen und in Menschen nach der Zufuhr von eingekapseltem Cisplatin (bezeichnet als LipoplatinTM) oder eingekapseltem Doxorubicin und von Kombinationen dieser Wirkstoffe mit Genen, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf, p53, PAX5 und HSV-tk/eingekapseltes Ganciclovir, IL-2, IL-12, GM-CSF, Angiostatin, IL-4, IL-7, IFN-γ, TNF-α, RB, BRCA1, E1A, Cytosindeaminase in Kombination mit eingekapseltem 5-Fluorcytosin, bcl-2, MDR-1, p21, p16, bax, bcl-xs, E2F, IGF-I VEGF, TGF-β-Gene und dergleichen.
  • Ebenfalls hierin beschrieben wird ein Verfahren zur Zufuhr von Cisplatin oder einem anderen therapeutischen Mittel zu einer Zelle, umfassend das Kontaktieren der Zelle mit den eingekapselten Wirkstoffen oder anderen Zwischenprodukten, die durch die Verfahren dieser Erfindung erhältlich sind. Ebenfalls hierin beschrieben wird ein Verfahren zur Hemmung des Wachstums eines Tumors in einem Probanden, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge der eingekapselten Wirkstoffe, die durch die hierin beschriebenen Verfahren erhältlich sind, an den Probanden. Die Verfahren können in vitro, ex vivo oder in vivo praktiziert werden.
  • Ebenfalls hierin beschrieben wird eine Kombinationstherapie unter Verwendung eingekapselter Wirkstoffe und Polynucleotide. Wie hierin verwendet umfasst ein Polynucleotid, ist jedoch nicht beschränkt auf, Gene, die für Proteine und Polypeptide kodieren, sowie Sequenzen, die für Ribozyme und Antisense kodieren. Die Kombinationstherapie ist zur Bekämpfung von Krebs wirksamer als die einzelnen Behandlungen alleine, da sich die zwei Mechanismen voneinander unterscheiden und zu einem Synergismus führen können. Beispielsweise ist die Eigenschaft von p53-Protein be kannt, sich an beschädigte DNA-Regionen und freie Enden von DNA zu binden, und auch seine Eigenschaft, den Apoptosemechanismus in schwer beschädigten Zellen auszulösen (siehe Boulikas, 1998a). Es wird angenommen, dass freie DNA-Enden in Krebszellen nach der Beschädigung durch Cisplatin produziert werden, wodurch die Induktion eines apoptotischen Stoffwechselweges in diesen Zellen durch die Expression des transferierten wt p53 gesteigert wird (zahlreiche Tumoren weisen mutiertes p53 auf und könnten nicht in der Lage sein, diesen Stoffwechselweg wirksam zu induzieren). Das therapeutische Polynucleotid kann vor der Inkorporation in die Micelle in einen Gentransfervektor insertiert werden.
  • Der Transfer des Wildtyp-p53-Gens wurde in zahlreichen Studien erfolgreich verwendet, um Tumorzellproliferation in vivo und in Zellkultur zu verlangsamen. Für intratumorale Injektion unter Verwendung von Adenovirus/p53-Vektoren wurde gezeigt, dass sie in erst jüngst durchgeführten, klinischen Versuchen gegen Lungentumoren (Roth et al., 1996) und in Tiermodellen gegen Prostatatumoren (Boulikas, 1998a) wirksam war. Das intratumorale Injektionsverfahren kann jedoch bei Metastasen, die häufig mit späteren Stadien der Krebsentwicklung assoziiert sind, nicht anwendbar sein. Systemische Zufuhr des p53-Gens mit eingekapseltem Cisplatin und das Targeting von Tumoren in jeder beliebigen Region des Körpers ist eine wirksame Behandlung zur Heilung von Krebs. Hierin werden Vorgehensweisen zur Verbesserung oder teilweisen Lösung der vier zentralen Hindernisse für erfolgreichen somatischen Gentransfer unter Verwendung von Liposomenzufuhr von wt p53, pax5, HSV-tk, GM-CSF, IL-12, IL-2, IL-4, IL-7, IFN-γ, TNF-α, RB, BRCA1, E1A, Cytosindeaminase in Kombination mit eingekapseltem 5-Fluorocytosin, bcl-2, MDR-1, p21, p16, bax, bcl-xs, E2F, IGF-I VEGF, TGF-β, Angiostatin und anderen Genen in Kombination mit eingekapseltem Cisplatin und anderen Wirkstoffen zu zahlreichen menschlichen Krebsarten in Tiermodellen und in Patienten, die in klinischen Versuchen getestet werden, beschrieben. Diese umfassen: (i) Einengen und Einkapseln der Wirkstoff- und Gen-Bullets in Liposomen, wodurch ihre Toxizität reduziert wird; (ii) Targeting von festen Tumoren und Metastasen durch Beschichten der Oberfläche der Komplexe mit Polyethylenglykol (PEG), Hyaluronsäure oder anderen Polymeren; (iii) Steigern der Wirk stoff- und Plasmidaufnahme von Krebszellen aufgrund der fusogenen Peptide oder des geringen Prozentsatzes an kationischen Lipiden; und (iv) anhaltende Expression der Gene unter Verwendung menschlicher Replikationsursprünge (ORIs), die in der Lage sind, episomale Replikation oder langfristige Expression therapeutischer Gene und hohe Expressionsniveaus zu unterstützen.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfassen die Polynucleotide oder Gene weiters DNA-Regulationssequenzen, die Expression der Gene über Monate, und nicht nur über Tage, hinweg unterstützen. Dies ermöglicht weniger Behandlungen und bedeutet weniger Leiden für den Krebspatienten. Es kann aufgrund höherer Expressionsniveaus des krebsbekämpfenden Gens auch eine starke therapeutische Wirkung ausüben; dasselbe Gen, das unter die Steuerung schwacher Regulations-DNA gestellt wird, ist wirkungslos.
  • Es wurden mehrere experimentelle Vorgehensweisen zur Krebsbehandlung unter Verwendung von p53-Genzufuhr entworfen; die Neuheit liegt darin, dass die endogenen mutierten p53-Formen, die in über der Hälfte von menschlichen Prostata-Malignitäten überexprimiert werden, insbesondere in jenen von fortgeschrittenem Krebs, unter Verwendung des PAX5-Expressionsvektors unterdrückt werden. Mutierte Formen von p53 weisen Aminosäuresubstitutionen hauptsächlich in ihrer DNA-Bindungsdomäne auf, sind jedoch stets in der Lage mit der wt-p53-Form zu tetramerisieren; p53 wirkt als Tetramer, und die Gegenwart von hohen Konzentrationen von endogenem mutierten p53 in menschlichen Krebszellen stört die Tumorsuppressorfunktionen von wt p53, das es zuzuführen gilt.
  • PAX5 ist ein Homeodomänenprotein, das Körperstrukturen während der Entwicklung bestimmt; PAX5 wird in frühen Stadien der Säugetierentwicklung und im Erwachsenen während der Differenzierung in blutbildenden Stammzellen exprimiert; p53-Genexpression wird durch das PAX5-Suppressorprotein in frühen Entwicklungsstadien eliminiert, was es den Zellen ermöglicht, sich im entwickelnden Embryo rasch zu vermehren. PAX5 wird in späteren Stadien im gesamten Erwachsenenalter abgeschaltet, was es ermöglicht, dass p53 exprimiert wird und seine tumorunterdrückenden Funktionen ausübt, sowie dass es Apoptose insbesondere im blutbildenden Zellstammbaum reguliert.
  • Zahlreiche Zufuhrsysteme werden im somatischen Gentransfer verwendet, wobei jedes davon Vor- und Nachteile birgt. Rekombinante Adenoviren replizieren nicht wirksam; rekombinante murine Retroviren integrieren sich nach dem Zufallsprinzip und werden durch Chromatinumfeld deaktiviert; rekombinantes AAV integriert sich zufällig und kann keine höheren Titer, die für klinische Zwecke nützlich wären, erreichen. Alle weisen aufgrund von Packungseinschränkungen eine maximale Kapazität von 3,5–7,5 kb Fremd-DNA auf. Nackte DNA wird rasch (Halbwertszeit von 5 min) nach der systemischen Zufuhr abgebaut. Kationische Liposomen sind toxisch, überleben nicht länger als einen Herzschlag lang im Blutkreislauf und richten sich hauptsächlich auf das Endothel der Lunge, der Leber und des Herzens. Bis jetzt erwiesen sich nur "sterisch stabilisierte" Liposomen als fähig, sich in Tumorstellen (auch in Leber und Milz) zu konzentrieren und längere Phasen im Blutkreislauf zu überleben (z.B. einen Tag im Vergleich zu Minuten im Fall von neutralen, nicht sterisch stabilisierten Liposomen und einigen wenigen Sekunden im Fall von kationischen Liposomen). Sterisch stabilisierte Liposomen werden jedoch nicht leicht von Tumorzellen aufgenommen und verbleiben im extrazellulären Raum, wo sie ihre Ladung über Tage nach der Lyse hinweg freisetzen (siehe Martin & Boulikas, 1998); das nachstehend beschriebene Verfahren modifiziert sterisch stabile Liposomen mit fusogenen Peptiden oder durch Bereitstellen einer teilweise kationischen Lipidzusammensetzung oder von DOPE an ihrer inneren Doppelschicht, was ihnen die Fähigkeit verleiht, durch Verursachen einer Störung der Doppelschicht in die Tumorzellmembran einzudringen.
  • Nachdem die Konzentration und Aufnahme der Wirkstoff- und Gen-Bullets in feste Tumoren in Tieren mit sterisch stabilisierten Liposomen erreicht wurde, ist der zweite Schritt die Wirksamkeit des Wirkstoffs und der Gen-Targeting-Ansatz. Ein klinischer Versuch an Menschen, der am M. D. Anderson Cancer Center durchgeführt wurde, verwendet Transfer des Wildtyp-p53-Gens in Patienten, die an nicht-kleinzelligem Lungenkrebs leiden und für die gezeigt wurde, dass sie p53-Mutationen in ihren Tumoren aufweisen, unter Verwendung von örtlicher Injektion eines rekombinanten Ad5/CMV/p53-Adenovirus an der Tumorstelle in Kombination mit Cisplatin. Die ersten Resultate dieses klinischen Versuchs nach der intratumoralen Injektion von p53 sind ermutigend (Roth et al., 1996; zusammengefasst von Boulikas, 1998a). Lokale Injektion ist jedoch nicht an Metastasen anwendbar, die häufig mit fortgeschrittenen Stadien der Malignitäten assoziiert sind; insbesondere Prostatakrebs führt durch einen Mechanismus, der Stimulierung der Prostatatumorproliferation durch insulinähnlichen Wachstumsfaktor I (IGF-I) einbindet, der insbesondere in Knochenzellen sekretiert wird, zu Metastasen in Knochen. Daher behandelt das Zufuhrsystem, das hierin vorgeschlagen wird und das in der Lage ist, sich nach systemischer Injektion in der Tumorzellmasse zu konzentrieren, wahrscheinlich nicht nur den Primärtumor, sondern auch seine Metastasen.
  • Die vorgeschlagenen Cisplatinliposomen richten sich aufgrund der Beschaffenheit des Zufuhrsystems der Erfinder primär auf Tumoren. Die Gene in der Kombinationstherapie richten sich aufgrund der Verwendung von HSV-tk und Ganciclovir, das sich in replizierende DNA einbindet, primär auf sich teilende Zellen und auf primär vaskularisierende Tumoren aufgrund der Verwendung von sterisch stabilen Liposomen. Somit werden Leber- und Milzzellen, die ebenfalls durch sterisch stabilisierte Liposomen erreicht werden, nicht getötet.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfassen die hierin beschriebenen, in Liposomen eingekapselten Wirkstoffe weiters eine wirksame Menge eines fusogenen Peptids. Fusogene Peptide gehören zu einer Klasse von helikalen amphipathischen Peptiden, die durch einen Hydrophobizitätsgradienten entlang der langen helikalen Achse charakterisiert sind. Dieser Hydrophobizitätsgradient verursacht die geneigte Insertion der Peptide in Membranen, wodurch der Lipidkern destabilisiert wird und dadurch Membranfusion gesteigert wird (Decout et al., 1999).
  • Hämagglutinin (HA) ist ein homotrimeres Oberflächenglykoprotein des Influenza-Virus. Bei Infektionen induziert es Membranfusion zwischen viralen und endosomalen Membranen bei geringem pH. Jedes Monomer besteht aus der Rezeptor-Bin dungs-HA1-Domäne und der Membran-Wechselwirkungs-HA2-Domäne. Die NH2-terminale Region des HA2-Domäne (Aminosäuren 1 bis 127), das so genannte "Fusionspeptid", insertiert in die Targetmembran und spielt eine maßgebliche Rolle bei der Auslösung von Fusion zwischen den viralen und endosomalen Membranen. Aufgrund der Substitution von acht Aminosäuren in der Region 5–14 durch Cysteine und Spinmarkierungs-Elektronenspinresonanz wurde geschlossen, dass sich die Peptidformen einer α-Helix etwa 25° von der horizontalen Ebene der Membran neigten, und dies bei einer maximalen Tiefe von 15 Angstrom (Å) von der Phosphatgruppe (Macosko et al., 1997). Die Verwendung fusogener Peptide aus Influenza-Virus-Hämagglutinin HA-2 erhöhte umfassend die Effizienz der Aufnahme des Transferrin-Polylysin-DNA-Komplexes durch die Zellen; in diesem Fall war das Peptid an Polylysin gebunden, und der Komplex wurde durch die Transferrinrezeptor-vermittelte Endocytose zugeführt (zusammengefasst von Boulikas, 1998a). Dieses Peptid wies die Sequenz GLFEAIAGFIENGWEGMIDGGGYC (Seq.-ID Nr. 1) auf und war in der Lage, die Freisetzung des fluoreszierenden Farbstoffs Calcein aus Liposomen, die mit Eidotter-Phosphatidylcholin, das einen höheren sauren pH hatte, hergestellt wurden, zu induzieren; dieses Peptid war auch in der Lage, die Anti-HIV-Potenz von Antisense-Oligonucleotiden, bei einer Konzentration von 0,1–1 mM unter Verwendung von CEM-SS-Lymphozyten in Kultur, um das 10fache zu steigern. Dieses Peptid verändert die Konformation bei der leicht saureren Umgebung des Endosoms, wodurch die endosomale Membran destabilisiert und aufgebrochen wird (siehe Boulikas, 1998a).
  • Die Gegenwart von negativ geladenen Lipiden in der Membran ist für die Manifestation der fusogenen Eigenschaften mancher Peptide wichtig, von anderen jedoch wiederum nicht; während die fusogene Wirkung eines Peptids, das eine mutmaßliche Fusionsdomäne von Fertilin, einem Spermien-Oberflächenprotein, das in die Fusion zwischen Spermium und Ei eingebunden ist, aufweist, von der Gegenwart negativ geladener Lipide abhing. Für jene des HIV2-Peptids galt dies jedoch nicht (Martin & Ruysschaert, 1997).
  • Um die zwei Domänen an den fusogenen Peptiden von Influenza-Virus-Hämagglutinin HA zu analysieren, wurden HA-Chimären entworfen, in denen das zytoplasmati sche Ende und/oder die Transmembrandomäne von HA durch die entsprechenden Domänen des fusogenen Glykoproteins F von Sendai-Virus ersetzt wurde(n). Konstrukte von HA wurden hergestellt, in denen das zytoplasmatische Ende durch Peptide aus menschlichem Neurofibromin Typ 1 (NF1) (Reste 1441 bis 1518) oder c-Raf-1 (Reste 51 bis 131) ersetzt wurde. Die Konstrukte wurden unter Verwendung des Vakziniavirus-T7-Polymerase-Übergangsexpressionssystems in CV-1-Zellen exprimiert. Membranfusion zwischen CV-1-Zellen und gebundenen menschlichen Erythrozyten (RBCs), vermittelt durch parentale oder chimäre HA-Proteine, zeigte, dass, nachdem der pH gesenkt wurde, ein Fluss des wässrigen Fluorophorcalceins aus vorgeladenen RBCs in das Zytoplasma der Protein-exprimierenden CV-1-Zellen stattfand. Dies zeigte, dass Membranfusion beide Einzelschichten der Lipid-Doppelschicht einbindet und zur Bildung einer wässrigen Fusionspore führt (Schroth-Diez et al., 1998).
  • Eine bemerkenswerte Entdeckung ist, dass das TAT-Protein von HIV in der Lage ist, Zellmembranen zu durchwandern (Green & Loewenstein, 1988), und dass eine 36-Aminosäuren-Domäne von TAT, sofern sie chemisch mit heterologen Proteinen vernetzt ist, die Fähigkeit verleiht, in Zellen zu transduzieren. Es gilt anzumerken, dass das 11 Aminosäuren umfassende, fusogene Peptid von TAT (YGRKKRRQRRR) (Seq.-ID Nr. 2) ein Nukleolenlokalisierungssignal ist (siehe Boulikas, 1998b).
  • Ein anderes Protein von HIV, das Glykoprotein gp41, enthält fusogene Peptide. Unverzweigte Peptide, die aus der proximalen Membranregion der gp41-Ectodomäne stammen, können möglicherweise als Anti-HIV-Mittel eingesetzt werden und die Infektiosität durch Annehmen einer helikalen Konformation inhibieren (Judice et al., 1997). Die 23 Aminosäurereste umfassende, N-terminale Peptid von HIV-1 gp41 hat die Fähigkeit, negativ geladene, große einschichtige Vesikel zu destabilisieren. In Abwesenheit von Kationen war die Hauptstruktur eine porenbildende α-Helix, während in Gegenwart von Ca2+ die Konformation zu einer fusogenen, überwiegend auseinandergezogenen β-Typ-Struktur überging. Die Fusionsaktivität von HIV(ala) (das die R22(A-Substitution in sich trug) wurde um 70% reduziert, während die Fusogeni tät vollständig eliminiert war, wenn eine zweite Substitution (V2(E) eingebunden wurde, was dafür spricht, dass es keine α-helikale, sondern eine auseinandergezogene Struktur war, die vom HIV-1-Fusionpeptid angenommen wurde, das Cholesterin-hältige, elektrisch neutrale Membranen aktiv destabilisierte (Pereira et al., 1997).
  • Die C-terminalen Fragmente des Alzheimer-Amyloidpeptids (Aminasäuren 29–40 und 29–42) weisen Eigenschaften auf, die jenen der Fusionspeptide von viralen Proteinen ähnlich sind, einschließlich Fusion von Liposomen in vitro. Diese Eigenschaften könnten eine direkte Wechselwirkung zwischen dem Amyloidpeptid und Zellmembranen vermitteln und teilweise für die Zytotoxizität des Amyloidpeptids verantwortlich sein. In Anbetracht der epidemiologischen und biochemischen Verbindungen zwischen Alzheimer-Krankheit und Apolipoprotein-E-(apoE-)Polymorphismus zeigte eine Untersuchung der möglichen Wechselwirkung zwischen den drei üblichen apoE-Isoformen und den C-terminalen Fragmenten des Amyloidpeptids, dass nur apoE2 und apoE3, nicht aber apoE4, potente Inhibitoren der fusogenen und aggregatbildenden Eigenschaften von Amyloidpeptid sind. Es wurde angenommen, dass die schützende Wirkung von apoE gegen die Bildung von Amyloidaggregaten durch die Bildung stabiler apoE/Amyloidpeptidkomplexe vermittelt wurde (Pillot et al., 1997a; Lins et al., 1999).
  • Die fusogenen Eigenschaften eines amphipathischen, eindeutig negativen Peptids (WAE 11), bestehend aus 11 Aminosäureresten, wurden stark gefördert, wenn das Peptid an einer Liposomenmembran verankert wurde; die Fusionsaktivität des Peptids schien von pH und Membranverschmelzung unabhängig zu sein, und die Targetmembranen erforderten eine positive Ladung, die durch Inkorporieren von Lysin-gebundenem Phosphatidylethanolamin (PE-K) bereitgestellt wird. Während das gebundene Peptid Vesikelaggregation über nicht spezifische, elektrostatische Wechselwirkung mit PE-K verursachen konnte, konnte das freie Peptid Aggregation von PE-K-Vesikeln nicht induzieren (Pecheur et al., 1997).
  • Zahlreiche Studien schlagen vor, dass Stabilisierung einer α-helikalen, sekundären Struktur des Peptids nach Insertion in Lipid-Doppelschichten in Membranen von Zellen oder Liposomen für die Membranfusionseigenschaften von Peptiden verantwortlich ist; Zn2+ steigert die fusogene Aktivität von Peptiden, da es die α-Helixstruktur stabilisiert. Die HEXXH-Domäne des antimikrobiellen Speichelpeptids, angeordnet in der C-terminalen, funktionellen Domäne von Histatin-5, ein anerkanntes Zink-Bindungsmotiv, liegt in einer schraubenförmigen Konformation vor (Martin et al., 1999; Melino et al., 1999; Curtain et al., 1999).
  • Fusionspeptide wurden mit DNA-Plasmiden formuliert, um Peptid-basierte Genzufuhrsysteme zu schaffen. Eine Kombination des YKAKnWK-Peptids, das verwendet wurde, um Plasmide zu 40- bis 200-nm-Nanopartikel zu verdichten, mit dem amphipathischen Peptid GLFEALLELLESLWELLLEA (Seq.-ID Nr. 3), das ein pH-empfindliches, lytisches Mittel ist, entworfen, um die Freisetzung des Plasmids aus Endosomen zu erleichtern, förderte Expressionssysteme, die das β-Galactosidase-Reportergen enthielten (Duguid et al., 1998).
  • DOPE (Dioleylphosphatidylethanolamin) ist ein fusogenes Lipid; Elastasespaltung von N-Methoxy-succinyl-Ala-Ala-Pro-Val-DOPE setzte dieses Derivat zu DOPE (gesamte positive Ladung) um, um eine eingekapselte fluoreszierende Sonde, Calcein, dem Zellzytoplasma zuzuführen (Pak et al., 1999). Eine Oligodesoxynucleinsequenz mit 30 Basen, die zu einer Region von β-Endorphin-mRNA komplementär ist, rief eine konzentrationsabhängige Inhibierung von β-Endorphinproduktion in Zellkultur hervor, nachdem sie innerhalb von kleinen, einschichtigen Vesikeln (50 nm), die Dipalmitoyl-DL-α-phosphatidyl-L-serin, ausgestattet mit fusogenen Eigenschaften, enthielten, eingekapselt worden war (Fresta et al., 1998).
  • Zusätzliche fusogene Peptide, die in den Verfahren dieser Erfindung nützlich sind, werden in Tabelle 1, unten, beschrieben.
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001
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  • Figure 00360001
  • Nachdem die Micellen gebildet worden waren, wurden sie mit einer wirksamen Menge eines vesikelbildenden Lipids vermischt, um wirkstoffhältige Liposomen zu bilden. Nützliche Lipide dieser Erfindung umfassen vorgeformte, neutrale Liposomen, Lipide in Pulverform, PEG-DSPE oder hydriertes Soja-Phosphatidylcholin (HSPC). Vesikelbildende Lipide wurden ausgewählt, um einen spezifischen Grad an Fließfähigkeit oder Festigkeit des endgültigen Komplexes zu erreichen, der die Lipidzusammensetzung der äußeren Schicht bereitstellt. Diese kann aus 10–60% Cholesterin bestehen, und die verbleibenden Mengen umfassen bipolare Phospholipide wie Phosphatidylcholin (PC) oder Phosphatidylethanolamin (PE) mit einer Kohlenwasserstoffkettenlänge im Bereich von 14–22, die mit einer oder mehreren C=C-Doppelbindungen gesättigt sind. Ein bevorzugtes Lipid zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist Cholesterin (10–60%), hydriertes Soja-Phosphatidylcholin (HSPC) zu 40–90% und das derivatisierte, vesikelbildende Lipid PEG-DSPE bei 1–7%. Die Liposomen stellten die äußeren Lipid-Doppelschicht-Oberflächen bereit, die mit dem hydrophilen Polymer PEG beschichtet sind. Die PEG-Ketten weisen ein Molekulargewicht zwischen 1.000–5.000 Da auf. Andere hydrophile Polymere umfassen Hyaluronsäure, Polyvinylpyrrolidon, DSPE, Hydroxyethylcellulose und Polyaspartamid. PEG-DSPC und PEG-HSPC sind im Handel bei Syngena erhältlich.
  • Vor dem Vermischen mit dem vesikelbildenden Lipid kann das Ethanol oder andere organische Lösungsmittel durch jedes beliebige, auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren, z.B. durch Dialyse der Micellen durch durchlässige Membranen, entfernt werden.
  • Diagnose- und Therapieverfahren
  • Hierin beschrieben wird die Therapie eines Individuums, z.B. von Säugetieren wie Mäusen, Ratten, Affen und menschlichen Patienten, die menschliche Krebsarten, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf Brust-, Prostata, Kolon-, nicht-kleinzelliges Lungen-, Pankreas-, Hoden-, Eierstock-, Zervixkarzinome und Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinome, in sich tragen. Hierin wird intravenöse Injektion von Cisplatin, eingekapselt in Liposomen, sowie von Kombinationen von eingekapseltem Cisplatin mit eingekapseltem Doxorubicin, Fluorodesoxyuridin, Bleomycin, Adriamycin, Vinblastin, Prednison, Vincristin, Taxol oder Strahlentherapie, eingekapselten Oligonucleotiden, Ribozymen, die krebsbekämpfende Eigenschaften aufweisen, und zahlreichen krebsbekämpfenden Genen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf p53/Pax5/HSV-tk-Genen, beschrieben. Der Ansatz besteht aus zwei Hauptteilen: (i) der Fähigkeit, sich auf Krebszellen zu richten; (ii) der Wirksamkeit des Ansatzes der Erfinder, Krebszellen zu töten.
  • Folglich wird hierin auch ein Verfahren zur Zufuhr von Cisplatin oder einem anderen therapeutischen Mittel zu einer Zelle beschrieben, das das Kontaktieren der Zelle mit den eingekapselten Wirkstoffen, die mittels der hierin beschriebenen Verfahren erhältlich sind, umfasst. Ebenfalls wird hierin ein Verfahren zur Hemmung des Wachstums eines Tumors in einem Individuum beschrieben, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge der eingekapselten Wirkstoffe, die mittels der hierin beschriebenen Verfahren erhältlich sind, an das Individuum. Je nach der Zusammensetzung der Lipid/Micellen-Formulierung werden hierin auch Verfahren zum Targeting von festen Tumoren und Metastasen in einem Individuum durch intravenöse Verabreichung einer wirksamen Menge der eingekapselten Wirkstoffs sowie Verfahren zum Durchdringen der Zellmembran eines Tumors in einen Individuum durch Verabreichung einer wirksamen Menge des eingekapselten Wirkstoffs beschrieben, worin die Micelle ein freies fusogenes Peptid oder ein fusogenes Peptid-Lipid-Konjugat enthält.
  • Die Verfahren werden in vitro, ex vivo oder in vivo durchgeführt.
  • Die Durchführung des Verfahrens in vitro umfasst das Entnehmen einer Tumorbiopsie oder das Kultivieren einer Zellprobe, die Tumorzellen enthält. Der endgültige Liposomenkomplex oder jegliches Zwischenprodukt, das während der Cisplatin-Einkapselung entsteht (z.B. Micellen, wie sie in 1A dargestellt sind), wird mit der Zellkultur unter Bedingungen, die zur intrazellulären Inkorporation des Wirkstoffs geeignet sind, kontaktiert. Das In-vitro-Verfahren ist als ein Screen geeignet, um die beste Wirkstofftherapie für jeden einzelnen Patienten zu bestimmen. Hemmung von Zellwachstum oder Proliferation geben an, dass die Zelle oder der Tumor durch diese Therapie in geeigneter Weise behandelt wird. Eine wirksame Menge an Wirkstoff für jede Therapie variiert je nach zu behandelndem Tumor und dem zu behandelnden Individuum. Wirksame Mengen können von Fachleuten empirisch bestimmt werden.
  • Wird der Wirkstoff einem Tier verabreicht, so ist das Verfahren nützlich, um die Wirksamkeit des Wirkstoffs oder der Therapie für jeden Tumortyp zu bestätigen. Als ein Beispiel für geeignete Tiermodelle können Gruppen von SCID-Mäusen oder Nacktmäusen (Balb/c NCR nu/nu weiblich, Simonsen, Gilroy, CA) subkutan etwa 105 bis etwa 109 Krebs- oder Targetzellen wie hierin definiert verabreicht werden. Sobald sich der Tumor entwickelt hat, wird das Liposom verabreicht.
  • Wie hierin verwendet soll "Verabreichung, zugeführt oder verabreicht" jegliches Verfahren umfassen, das letztendlich den Wirkstoff/Liposomen-Komplex zur Tumormasse zuführt. Beispiele umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, topische Anwendung, intravenöse Verabreichung, parenterale Verabreichung oder subkutane Injektion rund um den Tumor. Tumormessungen zur Bestimmung des Rückgangs der Tumorgröße erfolgen zweimal wöchentlich zweidimensional unter Verwendung einer Schublehre.
  • Zur In-vivo-Verabreichung werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen vorzugsweise parenteral, d.h. intravenös, intraperitoneal, subkutan, intrathekal, durch Injektion in das Rückenmark, intramuskulär, intraartikulär, durch Injektion in die Pfortader oder intratumoral, verabreicht. Noch bevorzugter werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen intravenös oder intratumoral durch eine Bolusinjektion verabreicht. In anderen Verfahren können die pharmazeutischen Präparate mit dem Targetgewebe durch direktes Auftragen des Präparats auf das Gewebe kontaktiert werden. Das Auftragen kann durch topische, "offene" oder "geschlossene" Verfahren erfolgen. Unter "topisch" wird das direkte Auftragen des pharmazeutischen Präparats auf ein Gewebe, das zugänglich ist, wie Haut, Nasenrachenraum, äußerer Gehörgang, Auge, Genitalschleimhaut, oder durch Inhalation in die Lunge und dergleichen verstanden. "Offene" Verfahren sind jene Verfahren, die das Einschneiden der Haut eines Patienten und das direkte Sichtbarmachen der darunter liegenden Struktur, auf die die pharmazeutischen Präparate aufgetragen werden, umfassen. Dies erfolgt im Allgemeinen durch chirurgische Verfahren, wie Thorakotomie, um Zugang zu den Lungen zu verschaffen, Bauchdeckenschnitt, um Zugang zu den Baucheingeweiden zu verschaffen, oder andere direkte chirurgische Ansätze, um das Zielgewebe zugänglich zu machen. "Geschlossene" Verfahren sind invasive Verfahren, bei denen die inneren Zielgewebe nicht direkt sichtbar gemacht werden, jedoch über das Einführen von Instrumenten durch kleine Wunden in der Haut erreicht werden. Die Präparate können beispielsweise durch Injektion in das Peritoneum verabreicht werden. In ähnlicher Weise können die pharmazeutischen Präparate durch Infusion während einer Lumbalpunktion an die Meningen oder das Rückenmark verabreicht werden, woraufhin geeignetes Positionieren des Patienten, wie dies üblicherweise im Fall von Medullaranästhesie oder Bildgebung des Rückenmarks durch Kontrastmittelinjektion (Metrizamid) geschieht, folgt. Alternativ dazu können die Präparate durch Endoskopieinstrumente verabreicht werden.
  • Verabreichung in vivo kann in einer Dosis, kontinuierlich oder mit Unterbrechungen im Verlauf der Behandlung erfolgen. Verfahren zur Bestimmung des wirksamsten Mittels und die Dosierung der Verabreichung sind Fachleuten durchwegs bekannt und variieren mit der für die Therapie verwendeten Zusammensetzung, dem Zweck der Therapie, der zu behandelnden Targetzelle und dem zu behandelnden Individuum. Einfache oder mehrfache Verabreichungen können unter Verwendung der Dosierungshöhe und des Dosierungsmusters durchgeführt werden, die vom behandelnden Arzt festgelegt werden. Geeignete Dosierungsformulierungen und Verfahren zur Verabreichung der Mittel können von Fachleuten empirisch bestimmt werden.
  • Die hierin beschriebenen Mittel und Zusammensetzungen können bei der Herstellung von Medikamenten und zur Behandlung von Menschen und anderen Tieren durch Verabreichung eines solchen Wirkstoffs in pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß herkömmlichen Verfahren verwendet werden.
  • Idealerweise sollte die Wirkstoff/Lipid-Formulierung so verabreicht werden, dass die höchsten Konzentrationen der aktiven Verbindung an den Stellen der Erkrankung erzielt werden. Dies kann beispielsweise durch intravenöse Injektion der Wirkstoff/Lipid-Formulierung erzielt werden. Wünschenswerte Konzentrationen des Wirkstoffs im Blut können durch eine kontinuierliche Infusion aufrechterhalten werden, um eine therapeutische Menge des Wirkstoffs innerhalb des erkrankten Gewebes bereitzustellen. Die Verwendung von operativen Kombinationen wird erwogen, um therapeutische Kombinationen bereitzustellen, die eine geringere Gesamtdosierung von jedem Komponentenwirkstoff erfordern als möglicherweise erforderlich ist, wenn jede einzelne therapeutische Verbindung oder jeder einzelne Wirkstoff alleine verwendet wird, wodurch abträgliche Nebenwirkungen reduziert werden.
  • Wenn es auch möglich ist, dass die Wirkstoff/Lipid-Formulierung alleine verabreicht wird, wird bevorzugt, sie in Form einer pharmazeutischen Formulierung bereitzustellen, die zumindest einen Wirkstoff, wie oben definiert, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern dafür und gegebenenfalls anderen therapeutischen Mitteln umfasst. Jeder Träger muss in dem Sinne "annehmbar" sein, dass er mit den anderen Bestandteilen der Formulierung verträglich und für den Patienten in keiner Weise schädlich ist.
  • Der Entwurf der dritten Generation von Vehikeln zur Zufuhr von krebsbekämpfenden Wirkstoffen und Genen zu festen Tumoren, wie hierin beschrieben, war das Resultat von fünf zentralen Verbesserungen gegenüber bestehenden Verfahren:
    • 1.) Das Einkapseln antineoplastischer Wirkstoffe in sterisch stabilisierte Liposomen reduzierte ihre Toxizität um ein Vielfaches. Dies wird erwartet, sodass der Albtraum der Chemotherapie, der Krebspatienten unterzogen werden, ein Ende findet. Die meisten antineoplastischen Wirkstoffe, die zur Zeit verwendet werden, haben schwer wiegende Nebenwirkungen wie Haarverlust, Erbrechen, Gewichtsverlust und Verursachung von Infarkten sowie Schädigung der Nieren, des Gehirns, der Leber und aller anderen lebensnotwendigen Geweben. Die hierin beschriebenen, antineoplastischen Wirkstoffe werden innerhalb des Lumens der Lipid-Doppelschicht ver steckt, sind somit für die meisten Gewebe nicht sichtbar und sammeln sich in ihren Tumortargets, aber nicht in jedem Gewebe des Körpers. Bei ihrer Aufnahme durch den festen Tumor üben sie eine spezifische zytotoxische Wirkung auf Krebszellen aus, ohne normale Zellen zu schädigen.
    • 2.) Das Zielen auf feste Tumoren und ihre Metastasen im gesamten Körper. Über 95% der Krebspatienten erliegen Komplikationen in Verbindung mit Metastasen und nicht dem Primärtumor. Das hierin beschriebene Gen- und Wirkstoff-Zufuhrsystem wurde entworfen, um das Immunsystem nach der intravenösen Verabreichung des Gen- oder Wirkstoff-Bullets zu meiden und hierbei nicht nur den Primärtumor, sondern auch jede Metastase im tierischen oder menschlichen Körper, unabhängig von der Größe des Tumors, zu erreichen. Es basiert auf der langen Verweildauer der den Wirkstoff und das Gen tragenden Vehikel im Blutkreislauf und ihrer Extravasation durch das vaskuläre Endothel von Tumoren aufgrund deren Mangelhaftigkeit und Durchlässigkeit in ihrer anfänglichen Bildungsphase (Neoangiogenese in wachsenden Tumoren) sowie aufgrund von Unterschieden im hydrostatischen Druck zwischen dem wachsenden festen Tumor und normalen Körpergeweben. Die Liposomen dieser Erfindung weisen eine unterschiedliche Zusammensetzung zwischen ihren inneren und äußeren Schichten auf, was effiziente Einkapselung und effizientes Tumortargeting ermöglicht.
    • 3.) Die Aufnahme des Liposomen-Bullets durch die Krebszelle. Die Liposomen-Bullets sind in der Lage, Fusion mit der Zellmembran zu fördern. Ähnliche "sterisch stabile" Bullets, die an anderer Stelle entwickelt wurden, sind nicht in der Lage, die Membranbarriere der Krebszelle zu passieren.
    • 4.) Das Erzielen von beinahe 100%iger Effizienz der Liposomeneinkapselung bei krebsbekämpfenden Wirkstoffen, Oligonucleotiden und Genen ist ein zentraler Fortschritt. Dies bedeutet minimaler Verlust und kostenwirksame Verwendung von Wirkstoffen und Genen. Es drückte sich auch in einfacheren Verfahrensschritten bei der Herstellung des krebsbekämpfenden Bullets aus.
    • 5.) Die einmalige, hierin beschriebene Technologie kann DNA-Regulationssequenzen identifizieren, die Expression der Gene im krebsbekämpfenden Geschoss über Monate, und nicht nur über Tage, hinweg unterstützen. Dies führt zu weniger erforderlichen Behandlungen und weniger Leiden für den Krebspatienten. Auch kann dies aufgrund höherer Expressionsniveaus des krebsbekämpfenden Gens eine starke therapeutische Wirkung ausüben; dasselbe Gen ist wirkungslos, wenn es unter die Steuerung einer schwachen Regulationssequenz gestellt wird.
  • Die folgenden Beispiele sollen aus Veranschaulichung, und nicht als Einschränkung der Erfindung, wie sie durch die beiliegenden Ansprüche definiert ist, dienen.
  • Beispiele
  • Herstellung von Micellen und in Lipid eingekapseltem Cisplatin
  • Eine Vorgehensweise zur Einkapselung umfasst die folgenden Schritte: (A) Vermischen von Cisplatin (in Pulverform oder anderer Form) mit DPPG (Dipalmitoylphosphatidylglycerin) oder anderen, negativ geladenen Lipidmolekülen in einem Molverhältnis von 1:1 bis 1:2 in zumindest einem 30%igem Ethanol, 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, um etwa 5 mg/ml endgültige Cisplatinkonzentration zu erlangen. Variationen im Molverhältnis zwischen Cisplatin und DPPG sind ebenfalls von therapeutischem Wert, wenn auf andere Gewebe abgezielt wird. (B) Erhitzen auf 50°C. Während der Schritte A und B wird die anfängliche Pulversuspension, die dazu neigt, einen Niederschlag des gelben Cisplatinpulver zu ergeben, zu einer Gel-(kolloidalen) Form umgesetzt; während der Schritte A und B findet eine Umsetzung von Cisplatin zu seiner Aquaform (durch Hydrolyse der Chloridatome und ihre Ersetzung durch Wassermoleküle, die an das Platin gebunden sind) statt, die positiv geladen ist und die aktive Form von Cisplatin darstellt, die mit antineoplastischer Aktivität versehen ist; das Aqua-Cisplatin erfährt gleichzeitig eine Komplexbildung mit dem negativ geladenen Lipid zu Micellen in 30%igem Ethanol. Dieser elektrostatische Cisplatin-DPPG-Komplex weist zur Tumorbekämpfung bereits verbesserte Eigenschaften als freies Cisplatin auf. (C) Die Eigenschaften des Komplexes (und der endgültigen Formulierung nach Schritt D, siehe unten) beim Durchdringen der Tumorzellmembran nach Erreichen seines Targets werden durch den Zusatz von Peptiden und anderen Molekülen, die dem Komplex diese Eigenschaft verleihen, verbessert. (D) Der Cisplatin-DPPG-Micellenkomplex wird zu Liposomen, die die Cisplatin-DPPG-Monolayer einkapseln (1, oben), oder zu einem anderen Typ von Komplexen durch direkten Zusatz von vorgefertigten Liposomen umgesetzt, woraufhin Dialyse gegen Kochsalzlösung und Extrusion durch Membranen erfolgt, um deren Durchmesser auf 100–160 mm zu reduzieren (1, unten). Es ist die Lipidzusammensetzung der zugesetzten Liposomen, die die Zusammensetzung der äußeren Oberfläche der endgültigen Cisplatinformulierung der Erfinder bestimmt.
  • Variationen in Schritt (A) ermöglichen das Einkapseln von Doxorubicin und anderen positiv geladenen antineoplastischen Verbindungen. Die Hinzufügung von positiv geladenen Gruppen zu neutralen oder negativ geladenen Verbindungen ermöglicht in ähnlicher Weise deren Einkapselung in Liposomen.
  • Therapeutische Anwendung
  • Östrogen-Bullets mit einer Freisetzungsdauer von neunzig (90) Tagen wurden subkutan in weibliche SCID-Mäuse implantiert. Den Mäusen wurde subkutan in den Brustfettpolster eine Injektion von 7,5 Millionen MCF-7-(ein menschliches Brustkarzinom von der ATCC) Zellen in 0,1 ml PBS verabreicht. Nach der Entwicklung von Tumoren wurden den Mäusen intravenös in die Schwanzvene 0,1 ml Cisplatinliposomen verabreicht. Die Resultate sind in den 2 bis 4 gezeigt.
  • Obwohl die Erfindung im Detail und unter Verweis auf spezifische Ausführungsformen beschrieben wurde, werden Fachleute erkennen, dass verschiedene Änderungen und Modifikationen daran vorgenommen werden können, ohne den Schutzumfang der Erfindung zu überschreiten, wie er in den beiliegenden Ansprüchen definiert ist.
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Claims (30)

  1. Verfahren zur Herstellung von Cisplatinmicellen, umfassend: a) das Kombinieren von: (i) Cisplatin; und (ii) einem Phosphatidylglycerinlipidderivat in einem Molverhältnis zwischen Cisplatin und Lipidderivat von 1:1 bis 1:2, um ein Cisplatingemisch herzustellen; und b) das Kombinieren des Cisplatingemischs aus Schritt a) mit einer wirksamen Menge einer zumindest 30%igen Ethanollösung, um Cisplatinmicellen zu bilden, worin Cisplatin in seiner Aquaform vorliegt.
  2. Verfahren zur Herstellung von Cisplatinmicellen, umfassend: a) das Kombinieren von: (i) Cisplatin; und (ii) einer wirksamen Menge einer zumindest 30%igen Ethanollösung, um eine Cisplatin/Ethanol-Lösung zu bilden; und b) das Kombinieren der Cisplatin/Ethanol-Lösung aus Schritt a) mit einem Phosphatidylglycerinlipidderivat in einem Molverhältnis zwischen Cisplatin und Lipidderivat von 1:1 bis 1:2, um Cisplatinmicellen herzustellen, worin das Cisplatin in seiner Aquaform vorliegt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Phosphatidylglycerinlipidderivat ausgewählt ist aus: Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG), Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG), Dicaproylphosphatidylglycerin (DCPG), Distearoylphosphatidylglycerin (DSPG) und Dioleylphosphatidylglycerin (DOPG).
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Molverhältnis 1:1 beträgt.
  5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, ferner umfassend den Schritt des Kombinierens des Gemischs oder der Lösung aus Schritt a) mit einer wirksamen Menge von: einem freien fusogenen Peptid, einem fusogenen Peptid-Lipid-Konjugat oder einem fusogenen Peptid-PEG-hydriertes-Soja-Phosphatidylcholin-(-HSPC-)Konjugat; worin das fusogene Peptid mit einer Folge von 1–6 negativ geladenen Aminosäuren am N- oder C-Terminus derivatisiert ist und deshalb in der Lage ist, elektrostatisch an Cisplatin in seiner Aquaform zu binden.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das freie fusogene Peptid oder fusogene Peptid-Lipid-Konjugat Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE) oder DOPE/kationisches Lipid umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, ferner den Schritt des Entfernens von Ethanol von den Cisplatinmicellen umfassend.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Entfernen von Ethanol durch Dialyse der Micellen durch permeable Membranen stattfindet, um das Ethanol zu entfernen.
  9. Cisplatinmicelle, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
  10. Cisplatinmicelle, erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 5.
  11. Verfahren zum Einkapseln von Cisplatinmicellen, umfassend das Vermischen einer wirksamen Menge eines vesikelbildenden Lipids mit den durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erhaltenen Cisplatinmicellen.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Lipid aus vorgefertigten neutralen Liposomen, bestehend aus 10–60% Cholesterin, 40–90% hydriertem Soja-Phosphatidylcholin (HSPC) und 1–7% Polyethylenglykol-hydriertes-Sojaphosphatidylcholin (PEG- HSPC), oder Lipiden in Lösung, Lipiden in Pulverform und Polyethylenglykol-Distearoylphosphatidylethanolamin (PEG-DSPE) ausgewählt ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Lipid 10–60% Cholesterin umfasst.
  14. Eingekapseltes Cisplatin, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13.
  15. Verfahren zum Erhalten eines Cisplatin/Lipid-Komplexes, der in der Lage ist, Makrophagen und Zellen des Immunsystems zu meiden, wenn er einem Patienten verabreicht wird, wobei das Verfahren das Vermischen einer wirksamen Menge Cisplatinmicellen nach Anspruch 7 oder 8 mit einer wirksamen Menge Polyethylenglykol-Distearoylphosphatidylethanolamin (PEG-DSPE), Polyethylenglykol-Distearoylphosphatidylcholin (PEG-DSPC) oder Hyaluronsäure-Distearoylphosphatidylethanolamin umfasst.
  16. Eingekapseltes Cisplatin, erhältlich durch ein Verfahren nach Anspruch 15.
  17. Zusammensetzung, umfassend das eingekapselte Cisplatin nach Anspruch 14 und eingekapselte Oligonucleotide, Ribozyme oder Polynucleotide.
  18. Zusammensetzung, umfassend eingekapseltes Cisplatin nach Anspruch 14 und ein Arzneimittel, das ausgewählt ist aus: Doxorubicin, Fluordesoxyuridin, Bleomycin, Adriamycin, Vinblastin, Prednison, Vincristin und Taxol.
  19. Verfahren zur Zufuhr von Cisplatin zu einer Zelle, in vitro, umfassend das Kontaktieren der Zelle mit eingekapseltem Cisplatin nach Anspruch 14 oder 16.
  20. Eingekapseltes Cisplatin nach Anspruch 14 oder 16 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers.
  21. Eingekapseltes Cisplatin nach Anspruch 14 oder 16 zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren zur Hemmung des Wachstums eines Tumors in einem menschlichen oder tierischen Körper.
  22. Eingekapseltes Cisplatin nach Anspruch 14 oder 16 zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren zum Zielen auf feste Tumoren und Metastasen durch intravenöse Verabreichung in einen menschlichen oder tierischen Körper.
  23. Eingekapseltes Cisplatin nach Anspruch 14 oder 16 und ein Gen, ausgewählt aus der aus p53-, pax5- und HSV-tk-Genen bestehenden Gruppe, zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren zur Hemmung des Wachstums eines Tumors in einem menschlichen oder tierischen Körper.
  24. Eingekapseltes Cisplatin nach Anspruch 14 oder 16, ein Gen, ausgewählt aus der aus p53-, pax5- und HSV-tk-Genen bestehenden Gruppe, und eine wirksame Menge eingekapseltes Ganciclovir zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren zur Hemmung des Wachstums eines Tumors in einem menschlichen oder tierischen Körper.
  25. Eingekapseltes Cisplatin nach Anspruch 14 oder 16 und ein Gen, ausgewählt aus der aus p53-, pax5- und HSV-tk-Genen bestehenden Gruppe, zur Verwendung in einem Behandlungsverfahren zur Hemmung des Wachstums eines Tumors in einem menschlichen oder tierischen Körper, worin die mit Cisplatin zu kombinierenden Gene eingekapseltes IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α, RB, BRCA1, E1A, Cytosindesaminase in Kombination mit eingekapseltem 5-Fluorcytosin, blc-2, MDR-1, p21, p16, bax, bcl-xs, E2F, IGFI, VEGF und TGF-β oder Kombinationen daraus sind.
  26. Verwendung von eingekapseltem Cisplatin nach Anspruch 14 oder 16 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung zur Hemmung des Wachstums eines Tumors in einem menschlichen oder tierischen Körper.
  27. Verwendung von eingekapseltem Cisplatin nach Anspruch 14 oder 16 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung von festen Tumoren und Metastasen in einem menschlichen oder tierischen Körper durch intravenöse Verabreichung.
  28. Verwendung von eingekapseltem Cisplatin nach Anspruch 14 oder 16 und eines Gens, ausgewählt aus der aus p53-, pax5- und HSV-tk-Genen bestehenden Gruppe, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung zur Hemmung des Wachstums eines Tumors in einem menschlichen oder tierischen Körper.
  29. Verwendung von eingekapseltem Cisplatin nach Anspruch 14 oder 16, eines Gens, ausgewählt aus der aus p53-, pax5- und HSV-tk-Genen bestehenden Gruppe, und einer wirksamen Menge an eingekapseltem Ganciclovir zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung zur Hemmung des Wachstums eines Tumors in einem menschlichen oder tierischen Körper.
  30. Verwendung von eingekapseltem Cisplatin nach Anspruch 14 oder 16 und eines Gens, ausgewählt aus der aus p53-, pax5- und HSV-tk-Genen bestehenden Gruppe, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung zur Hemmung des Wachstums eines Tumors in einem menschlichen oder tierischen Körper, worin die mit Cisplatin zu kombinierenden Gene eingekapseltes IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, GM-CSF, IFN-γ, TNF-α, RB, BRCA1, E1A, Cytosindesaminase in Kombination mit eingekapseltem 5-Fluorcytosin, blc-2, MDR-1, p21, p16, bax, bcl-xs, E2F, IGFI, VEGF und TGF-β oder Kombinationen daraus sind.
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