CN115605196A - 用于治疗癌症和癌症耐药性的脂质体制剂 - Google Patents

用于治疗癌症和癌症耐药性的脂质体制剂 Download PDF

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Abstract

本文公开了封装一种或多种抗癌剂的脂质体药物组合物和使用该脂质体药物组合物治疗癌症的方法，其中多种抗癌剂可以通过脂质体递送颗粒以协同摩尔比施用于癌症患者。还公开了制备封装多种抗癌剂的脂质体及其药物组合物的方法。

Description

用于治疗癌症和癌症耐药性的脂质体制剂
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2020年5月6日提交的美国临时专利申请号63/020,845的优先权，其公开内容通过引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明涉及基于脂质体的药物制剂、将两种或更多种活性药物成分(API)(特别是抗癌剂)封装在脂质体核心隔室中的方法以及使用该药物制剂治疗癌症(特别是各种耐药性癌症)的方法。
背景技术
癌症化疗的耐药性是一个常见的问题，尤其是在患者通常已经接触过多种先前的治疗后的转移阶段。由于耐药性的产生，患者在治疗期间或治疗结束后不久可能会经历快速的疾病进展。这种耐药性导致治疗选择的数量有限。因此，为了尽量减少耐药性的影响，已尝试同时联合使用两种或更多种具有不相关作用机制和不同耐药模式的抗癌剂。采用联合药物治疗的基本原理是协同的药物相互作用。首先，当应用具有不同分子靶点的多种药物时，癌症适应过程(如癌细胞突变)可能会延迟。第二，当多种药物靶向同一细胞通路时，它们可以协同作用，以获得更高的治疗功效和更高的靶向选择性。目前，临床研究中可用于多种癌症的联合方案在很大程度上局限于施用两种或更多种抗癌剂的物理混合物。临床研究中常用的临床联合方案通常可根据其作用机制进行分类，包括：(1)非特异性小分子化疗剂的联合，(2)靶向特异性受体药物和化疗剂的联合，以及(3)靶向特异性受体药物的联合。
对于化疗剂与靶向特异性受体药物的联合，化疗剂缺乏特异性靶向癌细胞的能力，同时也影响到人体快速分裂的正常细胞。因此，这些化疗剂的主要不良反应是非特异性毒性，包括贫血、恶心、呕吐和脱发。靶向特异性受体药物(或靶向癌症抑制剂)对化疗的优势在于其能够主动靶向特异性受体。传统的化疗不能有效地区分肿瘤细胞和快速分裂的正常细胞，从而导致非特异性的不良反应。相比之下，靶向特异性抗癌疗法干扰了在肿瘤生长或进展中具有不同于正常细胞的重要作用的分子靶点。此外，这些药物中的一些可作为多重耐药性(MDR)相关蛋白的抑制剂，从而提高反应速率。总的来说，与传统化疗相比，靶向疗法提供了一个更广泛的治疗窗口，毒性更小，反应速率更高。靶向疗法经常与化疗和/或放疗联合使用，与传统的细胞毒性疗法相比，其作用机制独特，能产生加和甚至是协同作用。
在过去的几年里，联合化疗在临床上被广泛用于加强癌症治疗。然而，传统的鸡尾酒联合施用方案经常受到不同药物之间不同的药代动力学的影响。在常见的临床前和临床实践中，联合药物疗法是以不同的数量和/或不同的给药计划单一地施用，而没有设计药物制剂来控制药物的递送或半衰期。这些施用方法有各种缺点，限制了联合药物疗法的治疗用途。通常，这类方案的组分首先是单独开发的，没有考虑到它们在联合使用时可能出现的许多问题，如靶标拮抗和不良事件的增强。虽然考虑到各种抗癌药物理论上不重叠的作用机制，联合治疗带来的有益治疗效果是很有希望的，但上述临床癌症治疗中常见的组合远非完美，通常具有适度增强的疗效和加和的毒性。因此，通过将纳米技术与联合抗癌治疗相结合，研究了新的方法。这种有希望的假设是，通过使用载体介导的药物递送系统同时递送两种或更多种药物，组合系统可以产生协同的抗癌作用，减少单个药物的相关毒性，控制释放，并统一每种药物的药代动力学。近年来，广泛研究的载体如脂质体、树枝状大分子、聚合物纳米颗粒和水溶性聚合物-药物缀合物被应用于多种药物递送。(Markman,J.L.等人，Adv.Drug Delivery Rev.2013,65,1866-1879。)
近年来，通过克服P-gp介导的外排、经由高通透性和滞留(EPR)将药物隔绝在肿瘤部位以及一旦内化就能逃脱内体清除，基于脂质的纳米载体显示出良好的效果。例如，CPX-351(
Figure BDA0003929909850000031
)是阿糖胞苷和柔红霉素的双药脂质体封装，经合理设计，比传统的7+3阿糖胞苷/柔红霉素化疗方案对急性髓性白血病(AML)患者的疗效有所提高(Lawrence D Mayer等人，International Journal of Nanomedicine 2019:14,3819-3830)。为了实现多种药物的有效递送，已经尝试将一些药物封装在脂质体递送载体中，其目的是屏蔽掉那些会导致它们从血流中清除的机制。然而，创新的联合抗癌药物脂质体制剂的开发仍然是非常必要的，以改善药物递送的特异性，提高药物的治疗指数，从而减少药物相关的不良反应。
发明内容
本发明涉及使用脂质体递送系统施用有效量的化疗剂和蛋白激酶抑制剂(例如，多柔比星、柔红霉素、伊达比星、长春瑞滨、伊立替康、拓扑替康或吉西他滨与伊马替尼(imatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、尼达尼布(nintedanib)、帕纳替尼(ponatinib)、阿法替尼(afatinib)、鲁索利替尼(ruxolitinib)或其他)药物组合的方法，其中至少一种化疗剂和一种蛋白激酶抑制剂药物被封装。这些组合物可以使两种或更多种药剂以配合的方式递送到疾病部位，从而确保这些药剂将以理想的比例出现在疾病部位。无论这些药剂是共同封装在基于脂质的递送载体中还是封装在单独的基于脂质的递送载体中施用从而在疾病部位保持理想的比例，都将实现这一结果。组合物的药代动力学(PK)由基于脂质的递送载体本身控制，从而实现配合递送(只要递送系统的PK具有可比性)。
在一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括悬浮在液体介质中的脂质体，其中液体介质包括水和pH缓冲剂；其中脂质体包括由外部脂质双层膜包围的内部隔室，其中内部隔室包括在水性介质中的蛋白激酶抑制剂，或优选亲水性化疗剂和蛋白激酶抑制剂的组合；其中脂质双层膜包括形成内部隔室的亲水内表面、亲脂双层和与组合物的液体介质接触的亲水外表面；以及其中亲水性化疗剂和蛋白激酶抑制剂可以以协同模式从脂质体中释放。
在另一个方面，本公开提供了一种根据本文公开的任何实施方案的药物组合物，用于治疗需要治疗的受试者的癌症或癌症耐药性，其中癌症可选地选自由以下组成的组：乳腺癌、黑色素瘤、胃肠癌、肺癌、结直肠癌、尤文氏肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌、子宫癌和胃肠道间质瘤，其中化疗剂和蛋白激酶抑制剂可以通过脂质体递送，对癌细胞具有协同的细胞毒性或细胞抑制作用。
在另一个方面，本公开提供了一种治疗癌症或癌症耐药性的方法，其包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据本文公开的任何实施方案所述的药物组合物。
在另一个方面，本发明公开了一种制备脂质体药物组合物(例如，根据权利要求1至11中的任一项)的方法，其中所述脂质体是通过包括以下步骤的工艺制成的。
在另一个方面，本发明提供了如本文任何实施方案或实施例公开的脂质体和/或通过根据本文公开的任何实施方案或实施例的方法制备的脂质体。
在另一个方面，本发明提供了一种治疗试剂盒，其包括容器和容器中根据本文公开的任何实施方案的多个载药脂质体，其中载药脂质体悬浮在或可以悬浮在无菌稀释液中，准备向需要治疗的受试者施用。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种用于肠胃外施用的脂质体组合物，其包括以治疗有效的比例(特别是非拮抗性的)封装在脂质体中的至少一种化疗剂和一种蛋白激酶抑制剂(有时优选酪氨酸激酶抑制剂)。药剂的治疗有效的非拮抗性比例是通过评估药剂在一定浓度范围内对相关细胞培养和来自单个患者活检的肿瘤匀浆的生物活性或作用来确定的。另外，经常提供包括伊马替尼或舒尼替尼(或另一种蛋白激酶抑制剂)和蒽环类药物(包括多柔比星、柔红霉素、伊达比星或其他已知化疗剂)的组合。可以使用任何能够确定保持所需治疗效果的药剂比例的方法。
该组合物包括至少一种化疗剂和一种蛋白激酶抑制剂，其化疗剂与蛋白激酶抑制剂的摩尔比对培养物中的相关细胞和肿瘤匀浆表现出理想的生物效应。优选地，该比例为药剂无拮抗作用的比例。
在一些实施方案中，本发明涉及一种方法，通过施用本发明的组合物将治疗有效量的化疗剂/蛋白激酶抑制剂组合(例如，多柔比星和伊马替尼或舒尼替尼)递送到所需的靶点。
本发明还涉及一种方法，通过施用与第一递送载体稳定结合的化疗剂和与第二递送载体稳定结合的蛋白激酶抑制剂，递送治疗有效量的化疗剂和蛋白激酶抑制剂的组合。第一和第二递送载体可包含在不同的小瓶中，小瓶中的内容物同时或依次施用于患者。在一个实施方案中，化疗剂和蛋白激酶抑制剂的比例为非拮抗性的。
在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、黑色素瘤、胃肠癌、肺癌、结直肠癌、尤文氏肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌、子宫癌和胃肠道间质瘤。
在一些实施方案中，有时优选地，乳腺癌是三阴性乳腺癌，并且其中肺癌是由野生型EGFR的高水平磷酸化或EGFR氨基酸序列内的突变引起的。
在一些实施方案中，本发明涉及一种制备治疗组合物的方法，该组合物包括含有可提供所需的治疗效果的比例的至少一种化疗剂和一种蛋白激酶抑制剂的脂质体。该方法包括：(a)提供至少一种化疗剂和一种蛋白激酶抑制剂的小组，其中该小组包括至少一个，但优选多个比例的所述药物；(b)测试该小组成员在一定浓度范围内对相关细胞培养物或肿瘤匀浆发挥生物效应的能力；(c)选择该小组的成员，其中所述比例在合适的浓度范围内对细胞培养物或肿瘤匀浆提供所需的治疗效果；以及(d)将该小组中成功的成员所代表的药物比例稳定地结合到基于脂质的药物递送载体中。在优选的实施方案中，上述所需的治疗效果是非拮抗性的。
如下进一步所述的，在优选的实施方案中，在按照上述方法设计合适的组合时，非拮抗性比例被选择为组合指数(CI)≤1.1(等于或小于1.1)的比例。在进一步的实施方案中，合适的脂质体制剂被设计为能稳定地结合有效量的化疗剂和蛋白激酶抑制剂组合，并能在体内持续释放这两种药物。优选的制剂含有mPEG-DSPE或至少一种带负电荷的脂质，例如磷脂酰甘油。
脂质体可以由天然磷脂和合成类似物如电荷两性磷脂酰胆碱制备为主动载药和/或被动载药。可以加入少量的阴离子磷脂，如磷脂酰甘油，以产生净负的表面电荷来稳定胶体。基于共载药物的物理特性，可以使用各种捕获剂(例如，硫酸铵、过渡金属离子和以下的铵或取代的铵盐：多阴离子化硫酸化环糊精、磺丁基醚环糊精、多阴离子化硫酸化糖、多磷酸盐等)。
鉴于以下详细说明、实施例和权利要求，将更好地理解本公开的其他方面或优点。
附图说明
图1显示了联合抗癌药物共载的PEG化脂质体(A)和DSPG脂质体(B)的实例。在PEG化脂质体中，mPEG-2000-DSPE被用来为囊泡提供空间稳定作用。另一方面，在DSPG脂质体中，带负电荷的DSPG被用来通过静电排斥来稳定脂质体。化疗药物和蛋白激酶抑制剂共载在脂质体的水性核心隔室中。
图2列出了(A)盐酸多柔比星(DOX)、(B)甲磺酸伊马替尼(IMT)、(C)苹果酸舒尼替尼(SUN)和(D)盐酸吉西他滨(GEM)的化学结构。
图3显示了PEG化的DOX-L、IMT-L以及1:10、1:5和1:1摩尔比的DOX/IMT-L，以(NH4)2SO4为捕获剂的粒径分布(强度％)。
图4显示了DSPG DOX-L、IMT-L以及1:10和1:5摩尔比的DOX/IMT-L，以TEA-SBE-β-CD为捕获剂的粒径分布(强度％)。
图5显示了脂质与药物摩尔比对以(NH4)2SO4为捕获剂的PEG化的DOX-L和IMT-L的封装效率(EE％)的影响。
图6显示了以(NH4)2SO4为捕获剂的DOX/IMT-L的低温透射电子显微镜(Cryo-TEM)图像。
图7显示了多柔比星和伊马替尼在加速条件下(54℃)来自单独载药PEG化DOX-IMT-L脂质体(即DOX-L(三角形)和IMT-L(菱形))和1:1的DOX:IMT摩尔比的组合PEG化DOX-IMT脂质体(DOX：圆形，IMT：方形)的体外溶出药物释放曲线的比较。(NH4)2SO4被用作上述所有脂质体的捕获剂。
图8显示了捕获剂TEA-SBE-β-CD(左)和TEA-SOS(右)的化学结构。
图9显示了以TEA-SBE-β-CD为捕获剂的DOX-L、SUN-L以及1:10、1:5和1:1摩尔比的DOX/SUN-L的粒径分布(强度％)。
图10显示了在48℃下捕获剂为(NH4)2SO4、TEA-SBE-β-CD和TEA-SOS的PEG化的SUN-L脂质体的体外药物释放曲线。
图11显示了在处理48小时后，多柔比星(DOX)对MDA-MB-231和MDA-MB-231(R)细胞的体外细胞毒性。
图12显示了DOX和IMT组合的摩尔比与MDA-MB-231(R)细胞系的优化。
图13显示了多柔比星(DOX)和伊马替尼(IMT)在SK-MEL-28黑色素瘤细胞中协同性的体外筛选。A：组合指数(CI)被绘制成SK-MEL-28黑色素瘤细胞在接受不同摩尔比的多柔比星(DOX)和伊马替尼(IMT)联合治疗时的细胞生长抑制(即受影响分数，Fa)的函数：1:10(实心方形)，1:5(实心三角形)，1:1(实心圆形)，5:1(空心菱形)和10:1(实心菱形)。CI值为<0.9、0.9-1.1和>1.1分别表示协同性、加和性和拮抗性。B：在ED75(黑色柱，Fa＝0.75)和ED90(空心柱，Fa＝0.90)时，SK-MEL-28黑色素瘤细胞的CI的体外评价被绘制成不同的多柔比星对伊马替尼摩尔药物比例(即1:10、1:5、1:1、5:1和10:1)的函数。
图14显示了多柔比星(DOX)和伊马替尼(IMT)在BT-549三阴性乳腺癌细胞中协同性的体外筛选。A：组合指数(CI)被绘制成BT-549细胞在接受不同摩尔比的多柔比星和伊马替尼联合治疗时的细胞生长抑制(即受影响分数，Fa)的函数：1:10(实心方形)，1:5(实心三角形)，1:1(实心圆形)，5:1(空心菱形)和10:1(实心菱形)。CI值为<0.9、0.9-1.1和>1.1分别表示协同性、加和性和拮抗性。B：在ED75(黑色柱，Fa＝0.75)和ED90(空心柱，Fa＝0.90)时，BT-549乳腺癌细胞的CI的体外评价被绘制成不同的多柔比星对伊马替尼摩尔药物比例(即1:10、1:5、1:1、5:1和10:1)的函数。
图15显示了多柔比星(DOX)和伊马替尼(IMT)在耐药性MCF-7(即MCF-7(R)乳腺癌细胞)中协同性的体外筛选。A：组合指数(CI)被绘制成MCF-7(R)细胞在接受不同摩尔比的多柔比星和伊马替尼联合治疗时的细胞生长抑制(即受影响分数，Fa)的函数：1:10(实心方形)，1:5(实心三角形)，1:1(实心圆形)，5:1(空心菱形)和10:1(实心菱形)。MCF-7乳腺癌细胞的耐药性是通过在低浓度的多柔比星存在下连续培养细胞而产生的。CI值为<0.9、0.9-1.1和>1.1分别表示协同性、加和性和拮抗性。B：在ED75(黑色柱，Fa＝0.75)和ED90(空心柱，Fa＝0.90)时，MCF-7(R)多柔比星耐药性乳腺癌细胞的CI的体外评价被绘制成不同的多柔比星对伊马替尼摩尔药物比例(即1:10、1:5、1:1、5:1和10:1)的函数。
图16显示了多柔比星(DOX)和伊马替尼(IMT)在GIST-T1胃肠道间质瘤细胞中协同性的体外筛选。A：组合指数(CI)被绘制成GIST-T1细胞在接受不同摩尔比的多柔比星和伊马替尼联合治疗时的细胞生长抑制(即受影响分数，Fa)的函数：1:10(实心方形)，1:5(实心三角形)，1:1(实心圆形)，5:1(空心菱形)和10:1(实心菱形)。CI值为<0.9、0.9-1.1和>1.1分别表示协同性、加和性和拮抗性。B：在ED75(黑色柱，Fa＝0.75)和ED90(空心柱，Fa＝0.90)时，GIST-T1癌细胞的CI的体外评价被绘制成不同的多柔比星对伊马替尼摩尔药物比例(即1:10、1:5、1:1、5:1和10:1)的函数。
图17显示了多柔比星(DOX)和舒尼替尼(SUN)在SK-MEL-28黑色素瘤细胞中协同性的体外筛选。A：组合指数(CI)被绘制成SK-MEL-28黑色素瘤细胞在接受不同摩尔比的多柔比星和舒尼替尼联合治疗时的细胞生长抑制(即受影响分数，Fa)的函数：1:5(方形)、1:1(三角形)和5:1(圆形)。CI值为<0.9，0.9-1.1和>1.1分别表示协同性、加和性和拮抗性。B：在ED75(黑色柱，Fa＝0.75)和ED90(空心柱，Fa＝0.90)时，SK-MEL-28黑色素瘤细胞的CI的体外评价被绘制成不同的多柔比星对舒尼替尼摩尔药物比例(即1:5、1:1和5:1)的函数。
图18显示了多柔比星(DOX)和舒尼替尼(SUN)在BT-549三阴性乳腺癌细胞中协同性的体外筛选。A：组合指数(CI)被绘制成BT-549细胞在接受不同摩尔比的多柔比星(DOX)和舒尼替尼(SUN)联合治疗时的细胞生长抑制(即受影响分数，Fa)的函数：1:5(方形)，1:1(三角形)和5:1(圆形)。CI值为<0.9、0.9-1.1和>1.1分别表示协同性、加和性和拮抗性。B：在ED75(黑色柱，Fa＝0.75)和ED90(空心柱，Fa＝0.90)时，BT-549乳腺癌细胞的CI的体外评价被绘制成不同的多柔比星对舒尼替尼摩尔药物比例(即1:5、1:1和5:1)的函数。
图19显示了以TEA-SBE-β-CD为捕获剂的联合多柔比星和伊马替尼(DOX:IMT摩尔比为1:5)的脂质体产品的低温透射电子显微镜(Cryo-TEM)图像。
图20显示了对联合多柔比星和伊马替尼(DOX:IMT摩尔比为1:5)的脂质体产品的药代动力学研究。DOX/IMT-L脂质体以6.0(DOX)/27.3(IMT)mg/kg的剂量经静脉注射向CD-1雄性小鼠施用(每个时间点n＝3)。该药物产品含有TEA-SBE-β-CD作为脂质体内捕获剂。每个时间点的循环血浆伊马替尼与多柔比星的摩尔比是根据绝对血浆浓度计算的。
图21显示了通过脂质体共同递送的多柔比星(DOX)和伊马替尼(IMT)针对基于SK-MEL-28黑色素瘤的实体瘤模型的体内疗效。A，肿瘤体积变化的百分比(％)；B，体重变化的百分比(％)。图A和图B中显示的百分比是通过将某一时间点的肿瘤体积或体重分别归一化为0时获得的数据而计算的。荷瘤雌性BALB/c裸鼠(每组三只)每周静脉治疗，共两周。各治疗组的信息描述如下：盐水(空心方形)；脂质体多柔比星，DOX-L(6mg/kg，空心三角形)；IMT-L(27.3mg/kg，空心圆形)；自由的多柔比星/伊马替尼混合物(cocktail)(分别为6DOX/27.3IMT mg/kg，空心菱形)和脂质体多柔比星/伊马替尼组合药物产品，DOX/IMT-L(分别为6DOX/27.3IMT mg/kg，实心圆形)。对于所有脂质体药物产品，TEA-SBE-β-CD被用作脂质体内捕获剂。
具体实施方式
在本发明中，我们已经确定了容纳至少一种化疗性细胞毒性剂(例如，多柔比星、柔红霉素、伊达比星、表柔比星及其衍生物、吉西他滨、长春瑞滨或类似药物)和至少一种蛋白激酶抑制剂(例如，伊马替尼、舒尼替尼、尼达尼布、阿法替尼、帕纳替尼、鲁索利替尼或类似药物)的组合，从而使每种药物有更好的药物保留和持续药物释放。这进一步证明了这些药物的协同比例，当封装在脂质体中时，可以成功地在血液隔室中保持更长的时间，从而与所组合的单个传统药物剂型相比，提高了治疗相关癌症和癌症耐药性的疗效。
在纳米颗粒递送系统中，脂质体是应用最广泛的药物载体之一，具有几个独特的特点，包括(1)由载体介导的药物循环半衰期延长，(2)非特异性摄取减少，(3)通过被动的高通透性和滞留(EPR)效应和/或通过并入靶向配体的主动靶向，在肿瘤部位的累积增加，(4)主要是细胞内噬摄取，有可能绕过多药耐药性机制，以及(5)能够根据药理倾向定制每种药物的相对比例，(6)以相同平台携带多种药物(亲水性和疏水性药物)的单一递送系统可以导致每种药物的药代动力学同步和受控，从而提高药物疗效，单一制剂的溶解度和生物利用度得到改善(参见，例如，Mamot,C.等人，Drug Resist.Updates 2003,6,271-279)。
本发明提供了包括封装至少一种化疗性癌症药物和一种蛋白激酶抑制剂的脂质体的组合物，其中化疗性癌症药物和蛋白激酶抑制剂以对相关细胞或肿瘤匀浆表现出理想的细胞毒性、细胞抑制或生物效果的化疗性药物:蛋白激酶抑制剂(例如，多柔比星:伊马替尼或多柔比星:舒尼替尼)摩尔比(仅多柔比星，多柔比星:伊马替尼或多柔比星:舒尼替尼为约30:1至约1:30，和仅伊马替尼或舒尼替尼)存在。优选地，本文提供的脂质体组合物将包括封装至少一种化疗药物和至少一种蛋白激酶抑制剂的脂质体，化疗剂与蛋白激酶抑制剂的摩尔比对相关细胞或肿瘤匀浆表现出非拮抗作用。
在一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括悬浮在液体介质中的脂质体，其中液体介质包括水和pH缓冲剂；其中脂质体包括由外部脂质双层膜包围的内部隔室，其中内部隔室包括蛋白激酶抑制剂(有时优选酪氨酸激酶抑制剂)，或亲水性化疗剂和蛋白激酶抑制剂(有时优选酪氨酸激酶抑制剂)的组合，在水性介质中；其中脂质双层膜包括形成内部隔室的亲水内表面、亲脂双层和与组合物的液体介质接触的亲水外表面；以及其中亲水性化疗剂和蛋白激酶抑制剂可以以协同模式从脂质体中释放。
在一些实施方案中，在药物组合物中，脂质体的脂质双层膜包括：(a)至少10mol％的磷脂，其选自由磷脂酰胆碱(例如，HSPC、DSPC、DPPC、DMPC)、磷脂酰甘油(例如，DSPG)、磷脂酰肌醇、甘油糖脂、鞘糖脂(例如，鞘磷脂)及其组合组成的组；(b)0-60mol％的胆固醇或其衍生物；以及(c)可选的带电荷的磷脂，其衍生为聚乙二醇(例如，mPEG-2000-DSPE)。
在一些实施方案中，在药物组合物中，一种或多种脂质独立地选自由HSPC、DSPC、DPPC、DMPC、DSPG、mPEG-DSPE-2000和胆固醇组成的组。
在一些实施方案中，在药物组合物中，液体介质进一步包括以下一种或多种：水溶性有机溶剂、渗透剂、控制释放赋形剂。
在一些实施方案中，在药物组合物中，脂质体的水性内部隔室进一步包括捕获剂。
在一些实施方案中，在药物组合物中，捕获剂选自由以下组成的组：硫酸铵、多阴离子化磺丁基醚环糊精的铵或取代的铵盐(例如，TEA-SBE-α-环糊精、TEA-SBE-β-环糊精、TEA-SBE-γ-环糊精、Tris-SBE-α-环糊精、Tris-SBE-β-环糊精和Tris-SBE-γ-环糊精)；多阴离子化硫酸化碳水化合物的铵或取代的铵盐(例如，TEA-SOS和Tris-SOS)；多磷酸盐的铵或取代的铵盐(例如，三乙基铵肌醇六磷酸盐和三(羟甲基)氨基甲烷肌醇六磷酸盐)；过渡金属盐(例如，铜、锌、锰、镍、钴等与卤化物、硫酸和葡萄糖酸的盐)；季铵化合物(例如，苯扎氯铵、苄索氯铵、十六烷基三甲基溴化铵、硬脂基二甲基苄基氯化铵)、聚氧乙烯(即聚乙二醇)和椰油胺。
在一些实施方案中，在药物组合物中，脂质体的脂质双层膜的外表面包括表面带负电荷的脂质(例如，DSPG)或含有聚乙二醇(例如，mPEG-2000-DSPE)的表面改性剂，其中总脂质与蛋白激酶抑制剂的摩尔比，或者当亲水性化疗剂和蛋白激酶抑制剂两者均存在时，总脂质与亲水性化疗剂和蛋白激酶抑制剂两者组合的总量的摩尔比，是至少相同的(1:1)。
在一些实施方案中，在药物组合物中，化疗剂选自由以下组成的组：多柔比星、环磷酰胺、卡铂、紫杉醇、柔红霉素、表柔比星、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、艾瑞布林、伊沙匹隆、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、长春瑞滨、多烯紫杉醇、塞替派、博来霉素、长春新碱、达卡巴嗪、卡培他滨、强的松、喜树碱、拓扑替康、伊立替康、BCNU、卡莫司汀、顺铂、来那度胺和培美曲塞。
在一些实施方案中，在药物组合物中，蛋白激酶抑制剂选自由以下组成的组：伊马替尼、舒尼替尼、阿法替尼、尼达尼布、帕纳替尼、鲁索利替尼、克唑替尼(crizotinib)、依鲁替尼(ibrutinib)、阿卡替尼(acalabrutinib)、阿贝西利(abemaciclib)、阿柏西普(aflibercept)、阿来替尼(alectinib)、阿瓦普利替尼(avapritinib)、阿昔替尼(axitinib)、博舒替尼(bosutinib)、卡博替尼(cabozantinib)、卡马替尼(capmatinib)、色瑞替尼(ceritinib)、考比替尼(cobimetinib)、克唑替尼(crizotinib)、达拉非尼(dabrafenib)、达克替尼(dacomitinib)、达沙替尼(dasatinib)、康奈非尼(encorafenib)、恩曲替尼(entrectinib)、厄达替尼(erdafitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、依维莫司(everolimus)、菲卓替尼(fedratinib)、福他替尼(fostamatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉瑞替尼(gilteritinib)、依鲁替尼(ibrutinib)、拉帕替尼(lapatinib)、拉罗替尼(larotrectinib)、乐伐替尼(lenvatinib)、劳拉替尼(lorlatinib)、尼达尼布(nintedanib)、来那替尼(neratinib)、尼罗替尼(nilotinib)、奈妥舒迪(netarsudil)、奥希替尼(osimertinib)、帕克替尼(pacritinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、培西达替尼(pexidartinib)、培米替尼(pemigatinib)、帕博西尼(palbociclib)、帕纳替尼(ponatinib)、培西达替尼(pexidartinib)、普拉替尼(pralsetinib)、奎扎替尼(quizartinib)、瑞格菲尼(regorafenib)、瑞博西尼(ribociclib)、瑞派替尼(ripretinib)、塞尔帕替尼(selpercatinib)、司美替尼(selumetinib)、索拉非尼(sorafenib)、替西罗莫司(temsirolimus)、托法替尼(tofacitinib)、曲美替尼(trametinib)、图卡替尼(tucatinib)、乌帕替尼(upadacitinib)、凡德他尼(vandetanib)、维莫非尼(vemurafenib)、泽布替尼(zanubrutinib)和阿柏西普(ziv-aflibercept)。
在一些实施方案中，在药物组合物中，脂质体的内部隔室包括选自由以下组成的组的抗癌剂或组合：
(a)单独封装的伊马替尼；
(b)共同封装的多柔比星和伊马替尼；
(c)单独封装的舒尼替尼；
(d)共同封装的多柔比星和舒尼替尼；
(e)单独封装的吉西他滨；
(f)共同封装的吉西他滨和舒尼替尼；
(g)约30:1至约1:30的摩尔比的多柔比星和伊马替尼；
(h)约30:1至约1:30的摩尔比的多柔比星和舒尼替尼；以及
(i)约30:1至约1:30的摩尔比的吉西他滨和舒尼替尼。
在一些实施方案中，在药物组合物中，脂质体的平均粒径在4.5nm到450nm之间，优选25nm到300nm之间，更优选50nm到200nm之间。
在一些实施方案中，在药物组合物中，化疗剂和蛋白激酶抑制剂可以在施用后以协同模式依次释放。
在一些实施方案中，在药物组合物中，两种共同封装的药剂(即化疗剂和蛋白激酶抑制剂)的摩尔比使得当在受影响细胞分数为约0.20至0.80的浓度范围内在体外测定中将所述比提供给与所述癌症相关的癌细胞时，在所述范围的至少20％上表现出协同作用。
在一些实施方案中，在药物组合物中，封装有化疗剂和蛋白激酶抑制剂的脂质体在体内施用后在血液中保持至少一小时的所述协同摩尔药物比例。
在另一个方面，本公开提供了根据本文公开的任何实施方案的药物组合物，用于治疗需要治疗的受试者的癌症或癌症耐药性，其中癌症可选地选自由以下组成的组：乳腺癌、黑色素瘤、胃肠癌、肺癌、结直肠癌、尤文氏肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌、子宫癌和胃肠道间质瘤，其中化疗剂和蛋白激酶抑制剂可以通过脂质体递送，对癌细胞具有协同的细胞毒性或细胞抑制作用。
在另一个方面，本公开提供了一种治疗癌症或癌症耐药性的方法，其包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据本文公开的任何实施方案的药物组合物。
在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、黑色素瘤、胃肠癌、肺癌、结直肠癌、尤文氏肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌、子宫癌和胃肠道间质瘤。
在一些实施方案中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌，并且其中肺癌是由野生型EGFR的高水平磷酸化或EGFR氨基酸序列内的突变引起的。
在另一个方面，本公开提供了一种制备脂质体药物组合物的方法(例如，根据权利要求1至11中的任一项)，其中该脂质体是通过包括以下步骤的工艺制成的：
(a)在包括水、脂质和捕获剂的溶液中形成多层脂质体囊泡；
(b)在高温(例如，在40-75℃范围内)下通过聚碳酸酯膜(例如，尺寸为50nm或100nm)多次挤压多层脂质体囊泡，以形成单层脂质体；
(c)通过渗滤或尺寸排除色谱法，或其他缓冲液交换方法，基本去除处于脂质体外的捕获剂；以及
(d)在高温(例如，40-75℃)下，加热包括一种或多种活性药物成分(API)的水溶液中的未负载的脂质体，从而形成封装药物的脂质体。
在一些实施方案中，脂质选自由以下组成的组：(a)至少10mol％的磷脂，其选自由磷脂酰胆碱(例如，HSPC、DSPC、DPPC、DMPC)、磷脂酰甘油(例如，DSPG)、磷脂酰肌醇、甘油糖脂、鞘糖脂(例如，鞘磷脂)及其组合组成的组；(b)0-60mol％的胆固醇或其衍生物；以及(c)可选的带电荷的磷脂，其衍生为聚乙二醇(例如，mPEG-2000-DSPE)。
在一些实施方案中，捕获剂选自由以下组成的组：硫酸铵；多阴离子化磺丁基醚环糊精的铵或取代的铵盐(例如，TEA-SBE-α-环糊精、TEA-SBE-β-环糊精、TEA-SBE-γ-环糊精、Tris-SBE-α-环糊精、Tris-SBE-β-环糊精和Tris-SBE-γ-环糊精)；以及多阴离子化硫酸化碳水化合物的铵或取代的铵盐(例如，TEA-SOS和Tris-SOS)；多磷酸盐的铵或取代的铵盐(例如，三乙基铵肌醇六磷酸盐和三(羟甲基)氨基甲烷肌醇六磷酸盐)；过渡金属盐(例如，铜、锌、锰、镍、钴等与卤化物、硫酸和葡萄糖酸的盐)；季铵化合物(例如，苯扎氯铵、苄索氯铵、十六烷基三甲基溴化铵、硬脂基二甲基苄基氯化铵)、聚氧乙烯(即聚乙二醇)和椰油胺。
在一些实施方案中，该方法包括选自主动负载、被动负载及其组合的过程；其中主动负载或被动负载选自由以下组成的组：
(a)基于pH梯度的主动负载方法，所述方法基于跨膜pH梯度来封装API，其中脂质体的内部水性隔室的pH值低于脂质体外部的pH值；
(b)基于过渡金属的主动负载方法，所述方法通过利用过渡金属离子驱动API通过络合作用被摄取到脂质体中来封装API；
(c)被动负载方法，所述方法在脂质体形成过程中封装API；以及
(d)被动负载方法，所述方法涉及脂质体形成后的被动平衡。
在一些实施方案中，pH梯度是由铵离子的浓度梯度或具有能够被质子化的铵衍生物或取代的铵的有机化合物的浓度梯度形成的。
在一些实施方案中，API是蛋白激酶抑制剂(有时优选酪氨酸激酶抑制剂)或化疗剂和蛋白激酶抑制剂(有时优选酪氨酸激酶抑制剂)的组合。
在一些实施方案中，化疗剂选自由以下组成的组：多柔比星、环磷酰胺、卡铂、紫杉醇、柔红霉素、表柔比星、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、艾瑞布林、伊沙匹隆、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、长春瑞滨、多烯紫杉醇、塞替派、博来霉素、长春新碱、达卡巴嗪、卡培他滨、强的松、喜树碱、拓扑替康、伊立替康、卡莫司汀、顺铂、BCNU、来那度胺和培美曲塞。
在一些实施方案中，蛋白激酶抑制剂选自由以下组成的组：伊马替尼、舒尼替尼、阿法替尼、尼达尼布、帕纳替尼、鲁索利替尼、克唑替尼、依鲁替尼、阿卡替尼、阿贝西利、阿柏西普、阿来替尼、阿瓦普利替尼、阿昔替尼、博舒替尼、卡博替尼、卡马替尼、色瑞替尼、考比替尼、克唑替尼、达拉非尼、达克替尼、达沙替尼、康奈非尼、恩曲替尼、厄达替尼、厄洛替尼、依维莫司、菲卓替尼、福他替尼、吉非替尼、吉瑞替尼、依鲁替尼、拉帕替尼、拉罗替尼、乐伐替尼、劳拉替尼、尼达尼布、来那替尼、尼罗替尼、奈妥舒迪、奥希替尼、帕克替尼、帕唑帕尼、培西达替尼、培米替尼、帕博西尼、帕纳替尼、培西达替尼、普拉替尼、奎扎替尼、瑞格菲尼、瑞博西尼、瑞派替尼、塞尔帕替尼、司美替尼、索拉非尼、替西罗莫司、托法替尼、曲美替尼、图卡替尼、乌帕替尼、凡德他尼、维莫非尼、泽布替尼、阿柏西普及其组合。
在一些实施方案中，脂质体的平均粒径在4.5nm到450nm之间的范围内，优选25nm到300nm之间，更优选50nm到200nm之间。
在另一个方面，本发明提供了如本文任何实施方案或实施例所公开的和/或通过根据本文公开的任何实施方案或实施例的方法制备的多个载药脂质体。
在另一个方面，本发明提供了一种治疗试剂盒，其包括容器和容器中根据本文公开的任何实施方案的多个载药脂质体，其中所述载药脂质体悬浮在或可以悬浮在无菌稀释液中，准备向需要治疗的受试者施用。
在本发明的进一步实施方案中，上述基于脂质的递送载体包括第三或第四药剂，例如，任何治疗性、诊断性或美容性药剂。
在本发明的一些实施方案中，提供了包括一种或多种磷脂的脂质体。在一些实施方案中，磷脂选自由mPEG-2000-DSPE、DPPC、DMPC、DSPC、HSPC、DSPE、DSPG等组成的组。其中，磷脂不低于总脂质的10mol％，带负电荷的脂质为mPEG-2000DSPE或DSPG，作为脂质体稳定脂质。
在本发明的一些实施方案中，提供了包括甾醇的脂质体。在一些实施方案中，所述甾醇是胆固醇，约占总脂质的0-60摩尔％。
在本发明的一些实施方案中，提供了包括捕获剂的脂质体，用于在脂质体核心隔室中的主动负载。在一些实施方案中，捕获剂选自由以下组成的组：硫酸铵、过渡金属和以下的铵或取代的铵盐：多阴离子化硫酸化环糊精、磺丁基醚环糊精、多阴离子化硫酸化糖、多磷酸盐等。
本发明的基于脂质的递送载体不仅可用于肠胃外施用，还可用于局部、鼻腔、皮下、腹腔内、肌肉内、喷雾或口服递送，或通过将递送载体应用于靶标部位或附近的天然或合成可植入装置，用于治疗目的或医学成像等。优选地，本发明的基于脂质的递送载体用于肠胃外施用，最优选是静脉施用。
正如本领域技术人员所理解的那样，所有载药的脂质体和由其制备的药物组合物必须在任何材料和工艺所要求的无菌条件下制成，以便用于对需要治疗的受试者进行施用。因此，虽然公开的内容没有如此限制，但本文公开或要求的、用于治疗受试者的所有脂质体和药物组合物都是无菌的。
本文描述的优选实施方案并不意味着详尽无遗，也不意味着将本发明的范围限制在所公开的精确形式上。选择和描述它们是为了最好地解释本发明的原理及其应用和实际用途，以使本领域的其他技术人员能够理解其教导。
1.组合物
A.治疗剂
a.蛋白激酶抑制剂
i.酪氨酸激酶抑制剂(TKI)
任何抑制酪氨酸激酶途径的化合物都可用于本发明。研究中描述的优选化合物列举如下：
伊马替尼靶向多种BCR-Abl和PDGFR α/β受体。
舒尼替尼靶向PDGFRα/β和VEGR家族受体。
阿法替尼靶向EGFR家族受体。
尼达尼布靶向PDGFRα/β和VEGFR家族受体。
帕纳替尼靶向BCR-Abl和Src家族受体。
鲁索利替尼靶向JAK家族受体。
克唑替尼靶向ALK和c-Met受体。
依鲁替尼靶向BTK受体。
其他TKI包括以下：阿卡替尼、阿来替尼、艾乐替尼(alecensa)、阿瓦普利替尼、阿昔替尼、博舒替尼、卡博替尼、达克替尼、达沙替尼、恩曲替尼、厄洛替尼、吉瑞替尼、埃克替尼(icotinib)、拉帕替尼、米哚妥林(midostaurin)、来那替尼、尼罗替尼、帕克替尼、帕唑帕尼、培西达替尼、奎扎替尼、瑞格菲尼、索拉非尼、凡德他尼、泽布替尼、阿柏西普等。
ii.其他类型的蛋白激酶抑制剂
抑制其他激酶途径的蛋白激酶抑制剂包括以下：阿贝西利、卡马替尼、拉罗替尼、劳拉替尼、奈妥舒迪、培米替尼、瑞博西尼、色瑞替尼、考比替尼、达拉非尼、康奈非尼、厄达替尼、依维莫司、菲卓替尼、福他替尼、吉非替尼、乐伐替尼、奥希替尼、帕博西尼、普拉替尼、瑞派替尼、塞尔帕替尼、司美替尼、替西罗莫司、曲美替尼、图卡替尼、乌帕替尼、凡德他尼、维莫非尼。
许多蛋白激酶与人类癌症的发生和进展有关。近年来，用于治疗不同类型癌症的蛋白激酶抑制剂的开发已被证明在临床治疗中是成功的。在蛋白激酶抑制剂中，蛋白酪氨酸激酶(PTK)是细胞信号转导过程中的主要信号传导酶之一，它催化ATP-γ-磷酸转移到底物蛋白的酪氨酸残基上，使其磷酸化，调节细胞生长、分化、死亡和一系列生理和生化过程。PTK的异常表达通常导致细胞增殖障碍，并与肿瘤的侵袭、转移和肿瘤血管生成密切相关。目前，多种PTK已被用作抗癌药物筛选的靶点。PTK抑制剂与ATP竞争PTK的ATP结合位点，减少酪氨酸激酶磷酸化，从而抑制癌细胞增殖。因此，PTK抑制剂在治疗癌症方面取得了很大进展，但由此产生的获得性耐药性仍不可避免，限制了癌症的治疗。
优选的PTK抑制剂在下面的研究中进行了描述。
伊马替尼(IMT)是一种TKI抑制剂，对BCR-ABL融合基因、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)和c-KIT受体具有高度强效和特异的抑制活性。伊马替尼的甲磺酸盐由诺华公司作为
Figure BDA0003929909850000191
销售，于2001年被FDA批准用于治疗费城染色体阳性的慢性骨髓性白血病(Ph+CML)、与PDGFR基因重排有关的骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、浸润性系统性肥大细胞增多症、高嗜酸性粒细胞综合征、慢性嗜酸性粒细胞白血病、隆突性皮肤纤维肉瘤和恶性胃肠道间质瘤。
另一种优选的TKI抑制剂舒尼替尼(SUN)是一种多靶点的酪氨酸激酶抑制剂，其抑制PDGFR(A和B)、VEGFR1、VEGFR2、FLT3R、c-Kit和RET介导的信号传导。2017年，FDA批准了辉瑞公司将苹果酸舒尼替尼作为
Figure BDA0003929909850000192
作为辅助疗法，用于治疗肾切除术后复发性肾细胞癌(RCC)、甲磺酸伊马替尼疾病进展或对甲磺酸伊马替尼不耐受后的胃肠道间质瘤(GIST)、晚期肾细胞癌的高风险成年患者。进展性、分化良好的胰腺神经内分泌肿瘤(pNET)发生在不可切除的局部晚期或转移性疾病患者中。
b.化疗剂
任何用于癌症治疗的化疗剂都可用于本发明。研究中所述的优选化合物列举如下：多柔比星、环磷酰胺、卡铂、紫杉醇、柔红霉素、表柔比星、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、艾瑞布林、伊沙匹隆、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、长春瑞滨、多烯紫杉醇、塞替派、博来霉素、长春新碱、达卡巴嗪、卡培他滨、强的松、喜树碱、拓扑替康、伊立替康、卡莫司汀、顺铂、来那度胺、培美曲塞。
优选的化疗化合物在下面的研究中进行了描述。
多柔比星常用于治疗各种癌症，包括一些白血病和霍奇金淋巴瘤，以及膀胱癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、多发性骨髓瘤和其他癌症。
多柔比星是一种蒽环类抗生素，与天然产物道诺霉素密切相关。像所有的蒽环类药物一样，它通过嵌入DNA来发挥作用。多柔比星通过嵌入和抑制大分子生物合成来与DNA相互作用。这抑制了酶拓扑异构酶II的进展，拓扑异构酶II使DNA中的超螺旋松弛以进行转录。在拓扑异构酶II复合体断裂DNA链进行复制后，多柔比星稳定了拓扑异构酶II复合体，防止DNA双螺旋被重新封闭，从而停止了复制过程。该分子的平面芳香色基部分嵌入DNA的两个碱基对之间，而六元的六碳氨糖(daunosamine sugar)位于小槽中，并与紧邻嵌入位点的侧翼碱基对相互作用，这已被几个晶体结构所证明。
其他蒽环类DNA嵌入剂包括道诺霉素、arugamycin、表柔比星(多柔比星的差向异构体，仅在糖上的C-4羟基方向不同)、伊达比星(道诺霉素的类似物，它缺乏C-4甲氧基)和戊柔比星(多柔比星的N-三氟乙酰基,1-4-戊酸盐衍生物)。
几十年来，化疗在癌症的辅助治疗中发挥了重要作用并获得了广泛的发展。然而，耐药性的出现和肿瘤的复发往往与癌症化疗有关，这主要是由于癌症单药治疗时普遍出现的通路重叠、交叉效应和中和反应。例如，化疗性蒽环类药物多柔比星(DOX)已被用于治疗各种癌症，例如乳腺癌、卵巢癌和三阴性(ER2,PR 2,Her-22)乳腺癌；然而，在许多情况下仍会出现耐药性(Cobleigh MA(2011).Semin.Oncol.,38,Suppl 2:S11-16)。对于其他癌症，如黑色素瘤，由于内在的耐药性，多柔比星并没有被常规利用。因此，尽管多柔比星是一种高效的化疗剂，但由于耐药性以及其狭窄的治疗窗口(例如心脏毒性)，其使用非常有限(Shi.,Y等人，(2011).Herz 36:296-305)。
对于癌症和癌症药物耐受性的治疗，多柔比星和其他癌症药物的联合方案的研究已经在临床研究中频繁进行。据报道，多柔比星和酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼的组合通过抑制ABC转运体的功能，能够有效地逆转与多柔比星相关的内在和获得性耐药性(Sims,J.T.等人，PLOS One 2013,8,e55509)。Maurel等人(2010)在难治性胃肠道肉瘤患者中进行了一项多柔比星加伊马替尼的I-II期研究。结论是，多柔比星和伊马替尼的低剂量化疗-生物疗法组合在重度预治疗的胃肠道肉瘤患者中(特别是在具有WT KIT表型的患者中)显示出良好的活性，似乎是对大剂量伊马替尼治疗没有反应的患者的合理和安全选择(MaurelJ.等人，Cancer.2010,116(15):3692-3701)。
另一个优选化合物吉西他滨是一种具有抗肿瘤活性的核苷类似物。已知盐酸吉西他滨对治疗胰腺癌和肺癌有效。一般来说，吉西他滨通过干扰核酸的合成来阻止细胞制造DNA和RNA。这一作用阻止了癌细胞的生长，导致细胞死亡。Michaelson等人(2015)报道了吉西他滨和舒尼替尼在肉瘤和/或低风险的转移性肾细胞癌患者中的2期试验。结论是，抗血管生成疗法和细胞毒性化疗对侵袭性RCC患者来说是一种积极和良好耐受的组合。这种组合可能比单独使用其中一种疗法更有效(Michaelson,M.D.等人，Cancer,2015,121(19):3435-43)。
其他类别的化疗化合物包括抗肿瘤药物，例如伊立替康、长春瑞滨、吉西他滨、拓扑替康、长春新碱等，也可用于本发明。
B.肠胃外制剂
本文所述的化合物可以配制用于肠胃外施用。本文使用的“肠胃外施用”是指通过消化道或非侵入性局部或区域途径以外的任何方法施用。例如，肠胃外施用可以包括向患者静脉内、皮内、动脉内、腹腔内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸腔内、气管内、玻璃体内、瘤内、肌肉内、皮下、结膜下、囊内、心包内、脐带内通过注射和输注施用。
肠胃外制剂可以用本领域已知的技术制备成水性组合物。通常，这种组合物可以制备成可注射的制剂，例如溶液或悬浮液；适合用于在注射前加入重构介质后制备溶液或悬浮液的固体形式；乳剂，例如油包水(w/o)乳剂、水包油(o/w)乳剂及其微乳剂、脂质体或乳脂体(emulsome)。
载体可以是含有例如水、缓冲剂和等渗剂的溶剂或分散介质，例如糖类、HEPES缓冲剂或氯化钠等。
作为游离酸或碱的活性化合物或其药学上可接受的盐的溶液和分散体可以在水或另一种溶剂或分散介质中制备，适当地与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合，所述赋形剂包括但不限于表面活性剂、分散剂、乳化剂、pH调节剂、粘度调节剂及其组合。
该制剂可以包含防腐剂以防止微生物生长。合适的防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞。该制剂还可以包含抗氧化剂以防止活性剂降解。
该制剂通常被缓冲至pH为3-8，以便在重构时进行肠胃外施用。合适的缓冲剂包括但不限于HEPES缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和柠檬酸盐缓冲剂。
水溶性聚合物常被用于肠胃外施用的制剂中。合适的水溶性聚合物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、羧甲基纤维素和聚乙二醇。
通过将所需量的活性化合物与上文所列的一种或多种赋形剂按要求加入适当的溶剂或分散介质中，然后进行过滤灭菌来制备无菌注射液。一般来说，通过将各种灭菌的活性成分加入含有基本的分散介质和上文所列的其他所需成分的无菌载体中来制备分散体。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该技术从先前无菌过滤的溶液中得到活性成分和任何另外的所需成分的粉末。可以以使颗粒具有多孔性的方式来制备粉末，这可以增加颗粒的溶解。制作多孔颗粒的方法在本领域中是众所周知的。
2.控释制剂
本文所述的肠胃外制剂可以配制用于控释，包括立即释放、延迟释放、延长释放、脉冲式释放及其组合。
对于肠胃外施用，一种或多种化合物以及可选的一种或多种另外的活性剂可以被并入微颗粒、纳米颗粒或其组合，其提供化合物和/或一种或多种另外的活性剂的控释。在该制剂包含两种或更多种药物的实施方案中，药物可以配制成相同的控释类型(例如延迟、延长、立即或脉冲式)，或者药物可以独立配制成不同的释放类型(例如立即和延迟、立即和延长、延迟和延长、延迟和脉冲式等)。
例如，化合物和/或一种或多种另外的活性剂可以被纳入提供药物控释的纳米颗粒和微颗粒。药物的释放是通过药物从纳米颗粒和微颗粒中的扩散和/或聚合物颗粒的水解和/或酶促降解来控制的。合适的聚合物包括脂质和其他天然或合成的脂质衍生物。
不溶于水的蛋白质如玉米蛋白也可以用作形成含有药物的纳米颗粒和微颗粒的材料。此外，可溶于水的蛋白质、多糖及其组合可以与药物配制成微颗粒，随后交联形成不溶性网络。例如，环糊精可以与单个药物分子复合并随后交联。
通过已知的药物制剂技术，可以实现将药物封装或并入载体材料以生产含有药物的纳米颗粒和微颗粒。在磷脂或磷脂类材料中的制剂的情况下，通常将载体材料加热到其熔化温度以上，加入药物以形成包含悬浮在载体材料中的药物颗粒、溶解在载体材料中的药物或其混合物的混合物。随后可以通过几种方法配制纳米颗粒和微颗粒，包括但不限于凝固、挤压、喷雾冷却或水分散等过程。在优选的过程中，脂质被加热到其熔化温度以上，在水溶液中重新水化，挤压，并负载药物。这些过程在本领域是已知的。
3.确定体外非拮抗性联合药物比例
在本发明的另一个方面，化疗剂和蛋白激酶抑制剂将以协同或加和(即非拮抗)的比例被封装到脂质体中。显示协同性或加和性联合作用的药剂比例的确定可以根据实验类型使用各种算法进行，优选本发明中的Chou-Talay中值效应法(Chou,T.C.,J.Theor.Biol.(1976)39:253-276)。
基本的实验数据一般是在体外使用培养中的细胞确定的。优选地，将组合指数(CI)绘制为受影响细胞分数(Fa)的函数，如上所述，其是浓度范围的代用参数。优选的药剂组合是那些在相当大的Fa值范围内显示协同作用或加和作用的药剂。如果在至少约5％的浓度范围内无拮抗作用，其中大于1％的细胞受到影响，即Fa范围大于0.01，则可选择药剂组合。优选地，总体浓度的较大部分表现出有利的CI；例如，5％的0.2-1.0的Fa范围。更优选地，该范围的约10％表现出有利的CI。甚至更优选地，在组合物中使用约20％的Fa范围，优选超过约50％，最优选超过至少约70％的0.2至1.0的Fa范围。在相当大的Fa值范围内显示出协同作用的组合可以在各种药剂比例下重新评估，以确定最佳比例，以增强非拮抗相互作用的强度，并增加观察到协同作用的Fa范围。
尽管希望在细胞受到影响的整个浓度范围内具有协同作用，但据观察，在许多情况下，当使用分光光度法如MTT测定时，结果在0.2-0.8的Fa范围内可靠得多。因此，尽管本发明的组合所表现出的协同作用是在0.01或更大的宽泛范围内存在的，但优选在0.2-0.8的Fa范围内建立协同作用。然而，其他更敏感的测定可用于评估Fa值大于0.8时的协同作用，例如生物发光或克隆形成测定。
最佳组合比例可进一步作为单一的制药单位，以确定与第三种药剂的协同或加和的相互作用。此外，三种药剂组合可作为一个单元来确定与第四种药剂的非拮抗相互作用，依此类推。
如上所述，对细胞培养物的体外研究将用“相关”细胞进行。细胞的选择将取决于该药剂的预期治疗用途。只有一个相关的细胞系或细胞培养类型需要表现出所需的非拮抗作用，以便为组合物进入本发明的范围提供基础。
例如，在本发明的一个优选实施方案中，药剂的组合旨在用于抗癌治疗。在一个经常的实施方案中，药剂的组合旨在用于多种癌症，例如白血病或淋巴瘤治疗、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胃肠癌和肺癌。然后将对要测试的细胞和测试的性质做出适当的选择。特别是，肿瘤细胞系是合适的对象，并且细胞死亡或细胞停滞的测量是合适的终点。正如下文将进一步讨论的那样，在试图为其他适应症寻找合适的非拮抗性组合的情况下，可以采用其他靶细胞和除细胞毒性或细胞停滞以外的标准。
对于涉及抗肿瘤药物的测定，细胞系可以从标准细胞系库(例如NCI或ATCC)、学术机构或包括商业来源在内的其他组织获得。优选的细胞系将包括一个或多个选自NCI/NIH的开发治疗计划所确定的细胞系。该计划使用的肿瘤细胞系筛选目前确定了代表白血病、黑色素瘤和肺癌、结肠癌、脑癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌和肾癌等的约60种不同的肿瘤细胞系。在所需浓度范围内的所需的非拮抗作用只需要在单一细胞类型上显示；然而，优选的是至少两个细胞系显示这种作用，更优选三个细胞系，更优选五个细胞系，更优选十个细胞系。这些细胞系可以是已建立的肿瘤细胞系或从患者样品中获得的原代培养物。细胞系可以来自任何物种，但优选来源是哺乳动物，特别是人类。细胞系可以通过在各种实验室条件下的选择进行基因改变。
在一个优选的实施方案中，给定的效果(Fa)是指在向细胞培养物施加细胞毒性剂后的细胞死亡或细胞停滞。在本发明中，细胞死亡或细胞活率可以通过MTT测定来测量。可以确定两种或更多种药剂的非拮抗比例，以用于癌症以外的疾病适应症，这些信息可用于制备治疗这些疾病的两种或更多种药物的治疗制剂。关于体外测定，可以选择多个可测量的终点来确定药物的协同作用，只要这些终点与特定疾病在治疗上相关。如上所述，对细胞培养物的体外研究将用“相关”细胞进行。细胞的选择将取决于药剂的预期治疗用途。对单个患者活检或整个肿瘤的体外研究可以用“肿瘤匀浆”来进行，所述“肿瘤匀浆”是通过将肿瘤样品均质化为单个细胞产生的。在一个优选的实施方案中，给定的效果(Fa)是指在向“相关”细胞培养物施加细胞毒性剂后的细胞死亡或细胞停滞。细胞死亡或细胞活率可以使用本领域中已知的一些方法来测量。
4.基于脂质的递送载体的制备
用于本发明的优选脂质载体是脂质体。用于本发明的合适的脂质体包括大型单层囊泡(LUV)、多层囊泡(MLV)、小型单层囊泡(SUV)和交错融合的脂质体。用于本发明的脂质体可以被制备为含有磷脂酰胆碱脂质或磷脂样物质，例如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)或氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)。
本发明的脂质体还可以包含甾醇，例如胆固醇。脂质体还可以包含治疗性脂质，其实例包括醚类脂质、磷脂酸、膦酸酯、神经酰胺和神经酰胺类似物、鞘氨醇和鞘氨醇类似物以及含丝氨酸的脂质。
脂质体也可以用表面稳定的亲水性聚合物-脂质缀合物如聚乙二醇-DSPE来制备，以提高循环寿命。带负电荷的脂质如磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰肌醇(PI)也可以被添加到脂质体制剂中，以增加载体的循环寿命。可以采用这些脂质来取代亲水性聚合物-脂质缀合物作为表面稳定剂。本发明的优选实施方案可以利用含有磷脂酰甘油(PG)或磷脂酰肌醇(PI)的脂质体来防止聚集，从而增加载体的血液停留时间。
在一个实施方案中，根据本发明的脂质体组合物优选用于治疗癌症。通过施用本发明的脂质体，实现了将封装的药物递送到肿瘤部位。优选地，脂质体的粒径的平均直径小于300nm。最理想地，脂质体的粒径的平均直径小于200nm。肿瘤血管通常比正常的血管更容易渗漏，这是因为内皮细胞中存在裂隙或间隙。这使得直径为200nm或更小的递送载体能够穿透不连续的内皮细胞层和围绕向肿瘤供血的血管的底层基底膜。外渗后，递送载体选择性积聚到肿瘤部位，从而增强抗癌药物的递送和治疗效果。
可以利用各种方法将活性剂封装在脂质体中。“封装”包括药剂与基于脂质的递送载体的共价或非共价结合。例如，通过药剂与脂质体的一个外层或多个外层相互作用或将药剂夹在脂质体内，可以在脂质体的不同部分之间实现平衡。因此，药剂的封装可以是通过药剂与脂质组分的共价或非共价相互作用，或将药剂夹在脂质体的水性内部，使药剂与脂质体的双分子层结合，或在内部水相和双分子层之间达到平衡。“负载”是指将一种或多种药剂封装到递送载体中的行为。
所需组合的封装可以通过封装在单独的递送载体中或在同一递送载体中实现。在需要封装到单独的脂质体中时，每个脂质体的脂质组成可以有很大的不同，以使药代动力学得到协调。通过改变载体的组成，可以匹配封装药物的释放速率，以便将所需比例的药物递送到肿瘤部位。改变释放速率的方法包括增加形成囊泡的脂质的酰基链长度以改善药物的保留，控制表面接枝的亲水性聚合物如mPEG-DSPE从脂质体膜中的交换，以及将膜固定剂如甾醇或鞘氨醇并入膜中。对于本领域技术人员来说明显的是，如果希望以特定的药物比例施用第一和第二药物，并且如果第二药物在第一药物的脂质体组合物(例如DMPC/Chol)中保留得很差，那么可通过将第二药物封装在具有酰基链长度增加的脂质的脂质体组合物(例如DSPC/Chol)中来实现药代动力学改善。当封装在单独的脂质体中时，应该很容易接受的是，通过在施用前组合适当数量的每种脂质体封装的药物，可以为个体患者产生已经在特定患者基础上确定的提供最佳治疗活性的两种药物的比例。另外，两种或更多种药剂可以被封装在同一个脂质体中。
封装技术取决于治疗剂和递送载体的性质。例如，可以使用被动和主动负载方法将治疗剂负载到脂质体中。将活性剂封装在脂质体中的被动方法涉及在制备脂质体期间将药剂封装起来。这种技术的结果是形成多层囊泡(MLV)，在挤压时其可以转化为大型单层囊泡(LUV)或小型单层囊泡(SUV)。此外，另一种合适的被动封装方法涉及脂质体形成后的被动平衡。该过程涉及在改变的或非环境(基于温度、压力等)条件下孵育预先形成的脂质体，并在脂质体的外部加入治疗剂(例如，化疗剂和/或蛋白激酶抑制剂)。然后，治疗剂穿过脂质体膜平衡到脂质体的内部。然后将脂质体返回到环境条件下，如果存在未封装的治疗剂，则其通过透析或其他合适的方法去除。
药物封装的主动负载方法包括pH梯度负载法和主动过渡金属负载技术。基于跨膜pH梯度的负载方法利用单阳离子或多阳离子的铵或取代的铵盐作为捕获剂，这些捕获剂在封装治疗剂之前被预先负载到脂质体中。这些捕获剂建立了跨膜pH梯度，也可能与治疗剂形成沉淀、聚集或凝胶，作为将药剂主动负载到脂质体中的驱动力。关于pH梯度，一般认为，脂质体内外环境之间的pH值差异至少大于一个单位。为建立和维持跨越脂质体的pH梯度所采用的其他方法包括使用可插入脂质体膜的离子载体和跨膜运输以交换质子。其中，主动过渡金属负载技术利用过渡金属通过络合或配位来驱动药剂在脂质体中的摄取。
合适的捕获剂可以是阴离子、阳离子、两性或非离子活性剂，包括但不限于含有羧酸盐、多磷酸盐、磺酸盐(包括长链烷基磺酸盐和烷基芳基磺酸盐)和硫酸盐的那些。阳离子捕获剂包括季铵化合物，例如苯扎氯铵、苄索氯铵、十六烷基三甲基溴化铵、硬脂基二甲基苄基氯化铵、聚氧乙烯和椰油胺等。
捕获剂的更具体的实例包括硫酸铵、过渡金属和以下的铵或取代的铵盐：多阴离子化硫酸化环糊精、磺丁基醚环糊精、多阴离子化硫酸化糖、多磷酸盐等。
具体来说，捕获剂包括以下多阴离子化硫酸化糖的铵或取代的铵盐：八硫酸蔗糖、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白、硫酸肝素和硫酸化透明质酸、岩藻多糖、半乳聚糖、卡拉胶、硫酸鼠李糖、半乳岩藻多糖、mannoglucuronofucan、硫酸阿拉伯半乳聚糖、硫酸甘露聚糖、硫酸化杂鼠李糖和硫酸木甘聚糖等。
具体来说，捕获剂包括以下形式的磺丁基醚环糊精的铵或取代的铵盐：磺丁基醚-α-环糊精、磺丁基醚-β-环糊精和磺丁基醚-γ-环糊精。
具体来说，捕获剂包括以下多磷酸盐的铵或取代的铵盐：植酸、三磷酸、多磷酸和环三偏磷酸盐。
具体来说，上述多聚物的反离子包括铵和取代的铵，其进一步包括以下物质的质子化形式：三乙胺、三乙醇胺、三(羟甲基)氨基甲烷或氨丁三醇、二乙醇胺、乙二胺、三丁胺、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷、二乙基乙醇胺、二乙醇乙胺(diethanolethylamine)、乙醇胺和吗啉。
基于过渡金属离子的捕获剂包括以下物质的盐形式：铜、锌、锰、镍和钴的离子。金属的反离子包括硫酸根、氯离子、葡萄糖酸根、溴离子和氢氧根。
更具体地说，用于在脂质体中负载药物的捕获剂包括以下：硫酸铵、三乙胺八硫酸蔗糖(TEA-SOS)、三乙胺磺酰丁醚-β-环糊精(TEA-SBE-β-CD)、磺酰丁醚-β-环糊精的三(羟甲基)氨基甲烷盐(Tris-SBE-β-CD)、植酸或六磷酸肌醇的三乙胺盐(TEA-IP6)、葡萄糖酸铜、硫酸铜、氯化铜和硫酸锌。
被动和主动载药的夹带方法也可以结合起来，以制备含有一种以上封装的药剂的脂质体制剂。
5.在体内施用本发明的组合物
如上所述，本发明的递送载体组合物可以被施用于温血动物，包括人类以及家养禽类。对于人类疾病的治疗，有资格的医生将确定应当如何根据既定的方案使用本发明的组合物，包括剂量、计划和施用途径。如果封装在本发明的递送载体组合物中的药剂对受试者的健康组织的毒性降低，此类应用也可以利用剂量递增。
优选地，本发明的药物组合物肠胃外施用，即动脉内、静脉内、腹腔内、皮下或肌肉内施用。更优选地，该药物组合物通过大剂量(bolus)或输注注射在静脉内或腹腔内施用。
在其他方法中，本发明的药物或化妆品制剂可以通过将制剂直接应用于组织而与靶组织接触。这种应用可以通过局部、“开放式”或“封闭式”手术进行。所谓“局部”是指将多药制剂直接应用于暴露在环境中的组织，如皮肤、口咽、外耳道等。“开放式”手术是指那些包括切开患者的皮肤并直接观察到应用药物制剂的底层组织的手术。这通常是通过外科手术完成的，例如通过开胸手术进入肺部，通过开腹手术进入腹部内脏，或通过其他直接手术方法进入靶组织。“封闭式”手术是一种侵入性手术，其中内部靶组织不能直接看到，而是通过在皮肤上的小伤口插入器械而进入。例如，可以通过针头灌洗向腹膜施用制剂。替代地，可以通过内窥镜装置施用制剂。
包含本发明的递送载体的药物组合物按照标准技术制备，可以包含水、缓冲水、0.9％盐水、0.3％甘氨酸、5％葡聚糖、等渗蔗糖溶液等，包括用于增强稳定性的糖蛋白，如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。这些组合物可以通过常规的、众所周知的灭菌技术进行灭菌。得到的水溶液可以包装使用或在无菌条件下过滤并冻干，冻干的制剂在施用前与无菌水溶液混合。该组合物可以根据需要含有药学上可接受的辅助物质，以接近生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、紧张性调节剂等，例如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。此外，递送载体悬浮液可以包括脂质保护剂，它可以保护脂质在储存时免受自由基和脂质过氧化损伤。亲脂性的自由基淬灭剂(如α-生育酚)和水溶性的铁特异性螯合剂(如铁氧胺(ferrioxamine))都是合适的。
药物制剂中的递送载体的浓度可以有很大的变化，例如从低于约0.05重量％，通常为或至少约2重量％-5重量％，到多达10重量％-30重量％，并将主要根据所选择的特定施用方式，通过流体体积、粘度等来选择。例如，可以增加浓度以降低与治疗有关的液体负荷。另外，由刺激性脂质组成的递送载体可以稀释到低浓度，以减轻施用部位的炎症。对于诊断来说，递送载体的量将取决于所使用的特定标记、被诊断的疾病状态和临床医生的判断来施用。
优选地，本发明的药物组合物是静脉施用。递送载体制剂的剂量将取决于药物与脂质的比例，以及用药医生根据患者的年龄、体重和状况的意见。
除药物组合物外，还可以制备用于兽医使用的合适制剂，并以适合受试者的方式施用。优选的兽医受试者包括哺乳动物物种，例如，非人灵长类动物、狗、猫、牛、马、羊和家养的禽类。受试者也可以包括实验动物，例如，特别是大鼠、兔子、小鼠和豚鼠。
6.包装试剂盒
本发明组合物中的治疗剂可以分别配制成单独的组合物，其中适当地，每种治疗剂都与合适的递送载体稳定地合。只要递送载体的药代动力学配合使施用的比例的治疗剂保持在治疗靶点，就可以将这些组合物分别施用于受试者。因此，构建试剂盒是有用的，它包括在单独的容器中的第一组合物，所述第一组合物包括与至少第一治疗剂稳定合的递送载体，以及在第二容器中的第二组合物，所述第二组合物包括与至少一种第二治疗剂稳定结合的递送载体。然后，这些容器可以被包装成包装试剂盒。
该试剂盒还将包括关于向受试者施用组合物的方式的说明，至少包括对要施用的每种组合物的数量比例的描述。替代地，或者另外，试剂盒被构造成使得每个容器中的组合物的量是预先测量的，以便一个容器的内容物与另一个容器的内容物相结合，代表正确的比例。替代地，或者另外，容器上可以标有测量标尺，允许根据可见的标尺分配适当的数量。容器本身可以用于施用；例如，该试剂盒可以在单独的注射器中包含每种组合物的适当数量。包括预先配制的正确比例的治疗剂的制剂也可以用这种方式包装，以便从预先包装在试剂盒中的注射器直接施用该制剂。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在一些情况下，为了明确和/或便于参考，本文对具有普遍理解含义的术语进行了定义，本文包含此类定义并不一定解释为与本领域普遍理解的内容存在实质性差异。本文所描述或引用的许多技术和程序都是本领域技术人员所熟知的，并且通常采用常规方法。在适当的情况下，除非另有说明，否则涉及使用市售试剂盒和试剂的程序通常是按照制造商定义的方案和/或参数进行的。本文提到的所有专利、申请、公开申请和其他出版物都通过引用的方式整体并入本文。如果本部分中阐明的定义与通过引用的方式并入本文的专利、申请、公开申请和其他出版物中阐明的定义相反或不一致，则本部分中阐明的定义优先于通过引用的方式并入本文的定义。
如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指代，反之亦然，任何复数形式包括单数指代。
除非另有定义，否则术语“约”或“大约”通常包括不超过指定数字的正负10％。例如，“约10％”可以表示9％至11％的范围，而“约20”可以表示18至22。有时优选的是，“约”包括不超过指定值的正负5％。替代地，“约”包括不超过指定值的正负5％。当“约”用在范围之前时，它既适用于该范围的下限，也适用于该范围的上限。
如本文所用，术语“基本上”是指“大部分”或“本质上”，正如本领域普通技术人员所理解的那样，如果可以定量测量，是指至少90％，优选至少95％，更优选至少98％。
除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”或类似术语应被理解为开放式术语(即表示“包括但不限于”)。
如本文所用，术语“协同作用”是指两种或更多种药物之间的相互作用，导致药物的总效果大于每种药物的单独效果之和。
所谓“协同比”是指两种或更多种药物联合使用时可获得协同作用的摩尔比。
如本文所用，术语“协同细胞毒性作用”是指两种或更多种药物之间的相互作用，导致药物的总作用大于每种药物的单独作用之和。这种总作用导致细胞被杀死并最终使肿瘤缩小。
如本文所用，术语“协同细胞抑制作用”是指两种或更多种药物之间的相互作用，导致药物的总作用大于每种药物的单独作用之和。这种总作用导致肿瘤生长的抑制，而没有直接杀死细胞。
术语“加和作用”是指由两种或更多种药物作用产生的联合作用，等于其单独作用之和。
所谓“加和比”是指两种或更多种药物联合使用时可获得加和作用的摩尔比。
术语“非拮抗比”是指协同比和加和比两者。
如本文所用，术语“拮抗作用”是指对接触两种或更多种药物的治疗反应低于如果将单个药物的已知作用加在一起时的预期。
如本文所用，术语“拮抗比”是指两种或更多种药物联合使用时可获得拮抗作用的摩尔比。
术语“组合指数”是指用于确定药物相互作用程度的参数。组合指数(CI)可以根据Chou和Talalay(Adv.Enzyme Reg.(1984),22:27-55)所述的中位效应分析算法计算。CI值<0.9表示协同药物相互作用；0.9≤CI≤1.1的值反映了加和作用，CI>1.1表示拮抗作用。
术语“受影响分数”是指在体外测定中，其生长受特定药物剂量影响的细胞的比例。如Chou和Talalay(Adv.Enzyme Reg.(1984),22:27-55)所述，受影响分数用于计算组合指数。
所谓“相关”细胞是指至少一种适合测试所需生物效应的细胞培养物或细胞系。由于这些药剂被用作抗肿瘤药物，“相关”细胞是那些被美国国家癌症研究所(NCI)/美国国立卫生研究院(NIH)的发展治疗计划(DTP)鉴定为对其抗癌药物发现计划有用的细胞系。目前，DTP筛选利用了60种不同的人类肿瘤细胞系。需要证明对这些细胞系中的至少一个有理想活性。
所谓“肿瘤匀浆”是指从患者活检或肿瘤的均质化中产生的细胞。整个肿瘤或肿瘤活检的提取可以由有资格的医生通过标准医疗技术实现，并且将组织均质化为单细胞可以在实验室中使用本领域中熟知的多种方法进行。
如本文所用，术语“捕获剂”是指在脂质体的水性隔室中存在的化合物，用于将一种或多种药物捕获并保留在脂质体内的同一位置。
术语“脂质体”是指由一个或多个磷脂双分子层组成的球形囊泡，它与细胞膜的结构非常相似。
如本文所用，短语“单层囊泡”是指由一个脂质双层膜组成的球形囊泡，它限定了单一的封闭水性隔室。双层膜由两层脂质组成：一个内层和一个外层。外层中的脂质分子的方向是，其亲水的头部部分朝向外部水性环境，其疏水的尾部向下指向脂质体的内部。脂质的内层直接放置在外层下面，脂质的方向是它们的头部面向脂质体的水性内部，它们的尾部朝向脂质外层的尾部。
如本文所用，“多层囊泡”是指由一个以上的脂质双层膜组成的脂质体，这些膜限定了一个以上的封闭水性隔室。这些膜是同心排列的，因此不同的膜被水性隔室隔开，很像一个洋葱。
所谓“化疗剂”是指一种对治疗癌症有用的药物物质。化疗剂也被称为细胞毒性剂，其作用是导致细胞被杀死并最终使肿瘤缩小。化疗剂可用于治愈目的，或延长生命或减轻症状。化疗剂可以与其他癌症治疗方法(例如放疗或手术)结合施用。
所谓“蛋白激酶抑制剂”是指一大组独特而有效的抗肿瘤药物，它们专门针对在癌细胞中发生改变并导致癌细胞的一些异常生长的蛋白激酶。蛋白激酶抑制剂的作用通常是细胞抑制的，这意味着肿瘤的生长被抑制，而不直接杀死细胞。因此，蛋白激酶抑制剂的毒性较小，在合适的患者群体中，蛋白激酶抑制剂比传统化疗剂更有效。
所谓“释放”是指封装在脂质体中的药物通过构成脂质体的脂质膜，然后流出到脂质体的外部。
如本文所用，术语“封装”是指包围内部相，通常导致内部空腔与外部介质分离。因此，如本文所述，内部相/内部空腔的组分被“封装”。如本文所述，被包围或封装的内部相是水相。装入脂质体内部空腔并且在脂质体被触发释放之前不能进入外部介质的治疗药物的数量将被认为是“封装”在脂质体内。
如本文所用，短语“共同封装”和“共同封装的”是指两种或更多种治疗剂被封装在脂质体内的情况。
如本文所用，术语“被动负载”是指脂质体药物产品制备中使用的载药技术。在一种情况下，可以通过在脂质体形成过程中封装治疗剂来实现被动负载。在另一种情况下，被动负载涉及脂质体形成后的被动药物平衡。在上述两种情况下，治疗剂被负载在脂质体的水性隔室内。
如本文所用，短语“主动负载”是指脂质体药物产品制备中使用的载药技术。本领域中常用的主动负载方法包括跨膜pH梯度负载技术和过渡金属负载技术。前者利用单阴离子或多阴离子的铵或取代的铵盐作为捕获剂，在封装治疗剂之前预先装入脂质体中。基于由pH梯度确定的平衡，治疗剂可以“主动”扩散到脂质体的水性隔室中，通过形成沉淀、聚集或凝胶化与预装的捕获剂相互作用，所述形成沉淀、聚集或凝胶化作为另一种驱动力将治疗剂封装在脂质体内部。基于过渡金属的负载技术利用过渡金属通过络合或配位来驱动药剂被摄取到脂质体中。总的来说，与被动负载技术相比，使用主动负载技术可以获得高得多的治疗剂封装效率(例如，>90％)。
术语“平均粒径”是指脂质体的平均直径。这可以通过基于动态光散射的仪器来测量。
术语“取代的铵”是指铵离子中的氢原子被一个或多个烷基或其他一些有机基团取代以形成取代的铵离子。
术语“三阴性乳腺癌”是指一种类型的乳腺癌，其癌细胞没有雌激素或孕激素受体，也没有制造太多的称为人类表皮生长因子受体2(HER2)的蛋白质。也就是说，这些细胞在上述受体的所有三项测试中均为“阴性”。
术语“耐药性癌症”是指对给定的治疗剂表现出耐药性的癌症类型。当癌细胞对通常能够杀死或削弱它们的药物没有反应时，就会出现耐药性。耐药性可能在治疗前就存在(内在耐药性)，也可能在用药物治疗期间或之后发生(获得性耐药性)。在癌症治疗中，有许多事情可能导致对抗癌药物的耐药性。例如，DNA变化或其他基因变化可能改变药物进入癌细胞的方式或药物在癌细胞内分解的方式。耐药性可能导致癌症治疗无效或癌症复发。
术语“有效量”是指实现预期生物或治疗效果所必需或足够的量。
术语“治疗有效量”是指为延迟正在治疗的特定疾病、病症或病况的发生、抑制其发展或使其完全停止，或为在其他方面对被治疗的受试者产生预期效果所需要递送的治疗有效量的活性剂的量。正如本领域普通技术人员所理解的，治疗有效量随患者的年龄、状况和性别以及患者疾病、病症或病况的性质和程度而变化，剂量可由私人医生(或兽医)调整。
术语“药学上可接受的”描述了一种并非在生物学上或其他方面不合需要的材料，即不会导致不可接受的不良生物效应水平或以有害的方式相互作用。
术语“治疗”或类似术语是指逆转、缓解、抑制或减缓这些术语所适用的疾病、病症或病况的进展，或这些疾病、病症或病况的一个或多个症状。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指人类患者或哺乳动物，例如猫、狗、牛、马、猴子或类似动物。
本发明通过以下实施例进一步描述。提供这些实施例仅仅是为了通过参考具体的实施方案来说明本发明。这些实施例虽然说明了本发明的某些具体方面，但并不描绘公开的本发明的局限性，也不限定公开的本发明的范围。
使用以下缩写：
API：活性药物成分
DOX：多柔比星
IMT：伊马替尼
SUN：舒尼替尼
GEM：吉西他滨
DOX-L：多柔比星封装的脂质体
IMT-L：伊马替尼封装的脂质体
SUN-L：舒尼替尼封装的脂质体
GEM-L：吉西他滨封装的脂质体
DOX/IMT-L：多柔比星和伊马替尼封装的脂质体
DOX/SUN-L：多柔比星和舒尼替尼封装的脂质体
GEM/SUN-L：吉西他滨和舒尼替尼封装的脂质体
mPEG-2000-DSPE，钠盐：N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐
DSPC：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱
DMPC：1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱
DPPC：1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱
DSPG：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油
HSPC：L-α-磷脂酰胆碱，氢化的PG：磷脂酰甘油
Chol：胆固醇
SUV：小型单层囊泡
LUV：大型单层囊泡
MLV：多层囊泡
MTT：3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2-H溴化四唑
TEA：三乙胺
TEA-SOS：三乙胺八硫酸蔗糖
TEA-SBE-β-CD：三乙胺磺酰丁醚-β-环糊精
Tris-SBE-β-CD：三(羟甲基)氨基甲烷磺酰丁醚-β-环糊精
SBE-β-CD：磺酰丁醚-β-环糊精
EDTA：乙二胺四乙酸
HEPES：N-2-羟乙基-哌嗪-N-2-乙磺酸
ED75和ED90：影响细胞培养中75％和90％的细胞所需的有效剂量
CI：组合指数
Fa：受影响分数
MS：HEPES缓冲盐水(20mM HEPES，150mM NaCl，pH 7.4)。
SHE：300mM蔗糖，20mM HEPES，30mM EDTA
实验方法
材料
盐酸多柔比星(DOX)、甲磺酸伊马替尼(IMT)和苹果酸舒尼替尼(SUN)、硫酸铵、八硫酸蔗糖(SOS)钠和SBE-β-环糊精钠盐均购自Sigma-Aldrich公司(St Louis,MO,USA)。氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(mPEG-2000-DSPE，钠盐)和胆固醇均购自Lipoid GmbH。其他试剂来源如下：硫酸铵、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-溴化四唑(MTT)和香豆素-6来自Sigma-Aldrich公司(StLouis,MO,USA)。研究过程中使用的所有其他化学品都是试剂级的，使用时没有经过进一步纯化。
癌细胞系
人乳腺癌细胞系(例如MDA-MB-231)、具有2型EWS-FLI-1融合的尤文氏肉瘤细胞系(例如SK-ES-1)、1型EWS-FLI-1融合细胞系(例如A-673)、对多柔比星显示内在耐药性的黑色素瘤细胞系(例如SK-MEL-28)、对多柔比星显示内在耐药性的三阴性乳腺癌细胞系(例如BT-549)、乳腺癌细胞系(例如MCF-7)、非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系(例如A-549)、具有KIT突变(杂合外显子11)的GIST、V560-Y579缺失的细胞系(例如GIST-T1)和结直肠腺癌细胞系(例如HT-29)都是从美国的细胞库获得的。
DOX耐药的MDA-MB-231和MCF-7细胞系的开发
MDA-MB-231和MCF-7的多柔比星耐药细胞系是在内部开发的。耐药性变体是通过在0.2μmol/L DOX存在下反复培养MDA-MB-231和MCF-7细胞而产生的。这些在多柔比星存在下增殖良好的细胞，经过数次传代后被定义为DOX耐药性的MDA-MB-231和MCF-7细胞，它们被分别命名为MDA-MB-231(R)和MCF-7(R)细胞系。MDA-MB-231(R)和MCF-7(R)细胞系二者均相对于非DOX处理的MDA-MB-231和MCF-7细胞系进行了表征。
脂质体制备
一般单独的和组合的药物脂质体的制备方法如下所述。
主动pH梯度载药方法：例如，通过水合/挤压、透析和远程pH梯度负载来制备共载的多柔比星/伊马替尼(DOX/IMT-L)和多柔比星/舒尼替尼脂质体(DOX/SUN-L)。简而言之，将mPEG-2000-DSPE或DSPG、胆固醇和DSPC或HSPC溶解在有机溶剂中，并在约50-70℃下在选定的捕获剂水溶液(例如硫酸铵、TEA-SOS、TEA-SBE-β-CD水溶液、多磷酸盐离子、其他)中水合。将有机相缓慢注入水相中，并大力搅拌约30分钟，以便进行乳化。在约50-70℃下，用多个50-100nm的膜对乳液进行挤压，以获得所需的脂质体粒径和粒径分布，并在冰浴中冷却，得到未负载的脂质体。脂质体外的捕获剂通过穿过透析膜的扩散来洗掉。将未负载的脂质体悬浮液用蔗糖缓冲液稀释，并加热至约50-70℃。将组合药物如多柔比星/伊马替尼或多柔比星/舒尼替尼加入到温热的未负载的脂质体悬浮液中，并加热45分钟，分别得到共载的组合药物DOX/IMT脂质体(DOX/IMT-L)或DOX/SUN脂质体(DOX/SUN-L)。对于各个药物DOX-L、IMT-L和SUN-L脂质体的制备，在不加入混合药物方案DOX/IMT或DOX/SUN的情况下，分别重复上述程序。
主动过渡金属离子载药方法：例如，通过水合/挤压、透析和过渡金属离子葡萄糖酸铜的远程主动负载来制备共载的多柔比星/伊马替尼(DOX/IMT-L)和多柔比星/舒尼替尼脂质体(DOX/SUN-L)。简而言之，将mPEG-2000-DSPE或DSPG、胆固醇和DSPC或HSPC溶解在有机溶剂中，并在约50-70℃下，在选定的由100mM Cu(葡萄糖酸盐)、220mM三乙醇胺(TEA)组成的捕获剂水溶液(pH 7.4)中水化。将有机相缓慢注入水相中，并大力搅拌约30分钟，以便进行乳化。在约50-70℃下，用多个50-100nm的膜对乳液进行挤压，以获得所需的脂质体粒径和粒径分布，并在冰浴中冷却，得到未负载的脂质体。脂质体外的捕获剂通过穿过透析膜的扩散来洗掉。将未负载的脂质体悬浮液用蔗糖缓冲液稀释，并加热至约50-70℃。将预混合的组合药物物质如多柔比星/伊马替尼或多柔比星/舒尼替尼加入到温热的未负载的脂质体悬浮液中，并加热45分钟，分别得到未负载的组合药物DOX/IMT脂质体(DOX/IMT-L)或DOX/SUN脂质体(DOX/SUN-L)。对于每个单独的药物DOX-L、IMT-L和SUN-L脂质体的制备，在不加入混合药物方案DOX/IMT或DOX/SUN的情况下，分别重复上述程序。
脂质体的表征
粒径和Zetaζ电位：使用Nano-S90 ZetaSizer(Malvern Instruments,UK)，动态光散射(DLS)用于记录组合药物脂质体和单个药物脂质体的流体动力学粒径、多分散指数(PDI)和Zetaζ-电位。所有的实验一式三份进行，散射角为90°，温度为25℃。每个样品在测量前都用蒸馏水充分稀释，每个样品都进行三次测量。
形态学表征：采用低温透射电子显微镜(Cryo-TEM)来检查共载脂质体的大小和形态。将一滴制剂沉积在包被有碳膜的铜网格上，用2％(w/v)磷钨酸对颗粒进行负染色。然后在温和到中等的红外辐射下对样品进行适当的干燥，并在H7600透射电子显微镜(日立，日本东京)下进行观察。
药物负载和封装：脂质体的药物含量(测定)和封装效率(EE％)是通过将已知数量的负载脂质体溶解在Triton-100水溶液中，并通过HPLC-UV分析对每种封装的药物进行定量而确定的。在脂质体悬浮液通过Sephadex G-50旋转柱洗脱后，测量药物的封装效率。然后，使用HPLC-UV分析来确定药物的负载效率。封装效率百分比(EE％)计算为总药物含量减去游离药物含量，然后除以总药物含量得到的百分比。
体外药物释放研究
例如，通过透析评估DOX/IMT-L、DOX-L和IMT-L在pH 6.8下的DOX和/或IMT的体外释放。将目前研究的脂质体样品(约1-2mL)置于透析袋(分子量截留为50kDa)中，在pH 6.8的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中预水化过夜。将透析袋两端剪开，浸入含有150mL PBS(pH 6.8)的200mL溶出容器中，在200rpm下搅拌，温度在37-48℃之间。在预定的时间间隔内对释放介质的等分试样(约1mL)进行取样，并用等体积的新鲜介质替换。每个样品中的DOX和IMT含量用HPLC-UV方法测定。
体外细胞毒性研究
药物组合的优化。例如，研究改变DOX/IMT-L中DOX和IMT的摩尔比对MDA-MB-231(R)或MCF-7(R)细胞增殖的影响，以确定脂质体中药物的最佳组合比例。为此，在制备DOX-L和IMT-L的同时，还制备了含有DOX和IMT-L的摩尔比为1:1、1:5和1:10的DOX/IMT-L。将MDA-MB-231(R)和MCF-7(R)细胞分别接种在96孔板中(每孔1×104个细胞)的补充有10％ FBS的高糖DMEM中，并在37℃下孵育过夜。从每个孔中取出培养基，以适当的稀释度加入上述制剂，使每个孔中作为总药物浓度的DOX/IMT-L终浓度统一为0.5μg/mL。孵育48小时后，按照下文所述的MTT测定方案确定每个孔中的存活细胞。以所确定的最佳摩尔组合与DOX和IMT共载的DOX/IMT-L被用于进一步研究。
MTT测定
在药物处理前，将接种细胞的板在标准细胞培养箱中在37℃和5％ CO2下孵育24小时。第二天，使用各自的细胞培养基制备限定摩尔药物比例的单独药物或药物组合的药物稀释液。然后用含有药物的新鲜培养基替换96孔板中先前的细胞培养基。再经过24小时的孵育后，按照制造商的方案，通过MTT测定来评估细胞活率。相对存活率百分比是通过药物处理孔的吸光度值减去纯培养基孔的吸光度值，然后与无药物对照孔(仅细胞对照)进行归一化来确定的。随后计算每个孔中受影响细胞的比例(Fa)，或每个药物浓度下的细胞生长抑制(％)。然后计算药物组合的效果，并由CompuSyn软件处理，进行药物协同作用分析。该程序采用中位效应分析算法，其产生组合指数(CI)值作为协同作用程度的定量指标。基于这种分析方法，CI<0.9表示协同作用，0.9≤CI≤1.1表示加和作用，CI>1.1表示拮抗作用。CI图的表示方法一般是，y轴代表CI，x轴代表受影响细胞的比例或受影响分数(Fa)。
体内抗肿瘤研究
SK-MEL-28异种移植模型的开发。将6周龄的雌性小鼠(BALB/c Nude)在小鼠右腹皮下接种10×106个SK-MEL-28肿瘤细胞，让肿瘤发展。然后让接种的肿瘤在开始治疗前生长约五周。将小鼠组织成适当的治疗组，包括盐水对照组和药物治疗组，包括(1)PEG化的DOX-L(2)PEG化的IMT-L(3)DOX/IMT预混合的游离药物混合物溶液(DOX:IMT摩尔比为1:5)和(4)PEG化的DOX/IMT-L(DOX:IMT摩尔比为1:5)。小鼠静脉注射所需体积的样品，根据每个个体小鼠的体重，每周向动物施用目标剂量(6mg/kg DOX，27.3mg/kg IMT)，持续2-5周。测量并监测肿瘤体积和小鼠体重。
药物施用和数据收集
例如，对上述六组异种移植小鼠中的五组在尾静脉中静脉(i.v.)施用盐水溶液(对照)、PEG化的DOX-L、游离的预混合的DOX/IMT混合物、PEG化的DOX-L、PEG化的IMT-L和PEG化的DOX/IMT-L。每周以相当于6mg DOX/kg和27.3mg IMT/kg小鼠体重的剂量施用每种制剂，持续2-5周。在预先确定的时间对小鼠的肿瘤尺寸和体重进行评估。根据以下公式计算各自的肿瘤体积：体积＝1/2×(最长尺寸)×(最短尺寸)。
统计学分析
在MTT测定和体内抗肿瘤研究中，通过单因素ANOVA联合Dunnett检验来确定组合药物脂质体处理的组与其他处理组之间的统计学差异，显著水平为P<0.05。所有观察值均以平均值±SD表示(n＝3)。
实施例
图1A和图1B显示了含有化疗剂和蛋白激酶抑制剂的双药负载脂质体的方案的实施例。图2(A,B,C,D)显示了优选化合物盐酸多柔比星、甲磺酸伊马替尼、苹果酸舒尼替尼和盐酸吉西他滨的化学结构。
实施例1
DOX/IMT脂质体的制备方法
如实验方法部分所述，通过联合乳化、挤压、透析和主动远程负载来制备脂质体DOX-L、IMT-L和DOX/IMT-L。进行初步实验以确定和优化配制和生产工艺条件中影响脂质体粒径、粒径分布、封装效率、脂质体稳定性、药物释放曲线以及脂质体的其他理化性质的主要因素(例如脂质的选择、脂质体组成、药物与脂质的比例、捕获剂、工艺条件等)。
实施例2
以(NH4)2SO4为捕获剂的DOX/IMT-L的理化表征
对DOX-L、IMT-L、DOX/IMT-L纳米颗粒进行了理化表征。使用DSPC/mPEG-2000-DSPE/胆固醇(PEG化的脂质体)或DSPG/DSPC/胆固醇(DSPG脂质体)与pH远程负载捕获剂硫酸铵(NH4)2SO4主动负载多柔比星和/或伊马替尼以形成DOX-L、IMT-L和DOX/IMT-L脂质体，来产生含有多柔比星和伊马替尼的脂质体。最终的PEG化的DOX-L、IMT-L、DOX/IMT-L脂质体显示出以下参数：平均粒径约100nm，PDI<0.100(见图3)，封装效率％>95.0％，表面ζ-电位<-25mV(见表1)。此外，最终的DSPG DOX-L、IMT-L、DOX/IMT-L脂质体显示出以下参数：平均粒径约100nm，PDI<0.100(见图4)，封装效率％>95.0％，表面ζ-电位<-30mV。表2中显示的PEG化脂质体和DSPG脂质体的比较表明，两种脂质体组合物的平均粒径和封装效率相似。粒径<200nm的纳米载体脂质体由于肿瘤血管的渗漏而理想地表现出在肿瘤部位的优先积累，这与纳米颗粒系统的延长循环一起构成了EPR被动肿瘤靶向的核心。目前的脂质体平台的PEG化通过避免网状内皮细胞的清除而获得了所需的延长循环。此外，脂质体纳米载体容纳高有效载荷的能力确保了向肿瘤部位递送充足数量的药物。该纳米载体还表现出适度的DSPG表面电荷，使该系统在循环中具有适当的物理和生理稳定性。
图5显示了总药物与总脂质比例对载药能力和封装效率的影响。在固定的脂质浓度(8mg/mL)下使用硫酸铵捕获剂，当总脂质与总药物的比例在6.4:1至3.2:1(摩尔比)范围内时，载药能力和封装效率％>95％。然而，在总脂质与总药物比例(摩尔比)为1.6:1时，封装效率下降到50-70％左右。
对于使用硫酸铵捕获剂的DOX/IMT-L脂质体(总脂质与总药物摩尔比为6.4:1)，TEM图像显示，脂质体纳米颗粒是球形的，具有密集的核心(DOX和IMT的沉淀物)，尺寸为约100nm(图6)。这些结果证明，药物以无定形或分子分散的状态被良好地共同封装在脂质体的水性核心隔室中。
表1.以(NH4)2SO4作为捕获剂对PEG化的DOX-L、IMT-L和DOX/IMT-L的平均粒径/粒径分布(PDI)和Zeta(ζ)电位(表面电荷)以及封装效率(EE％)的影响
Figure BDA0003929909850000441
表2.PEG化的脂质体和DSPG脂质体对DOX/IMT脂质体的粒径/粒径分布(PDI)、ζ电位和封装效率％(EE％)的影响
Figure BDA0003929909850000442
Figure BDA0003929909850000451
实施例3
以(NH4)2SO4为捕获剂的DOX/IMT-L的体外释放和稳定性研究
PEG化的DOX/IMT-L以及DOX-L和IMT-L的药物释放研究是在pH 6.8(PBS)在加速条件下通过扩散进行的。如图7所示，PEG化的DOX/IMT-L实现了DOX和IMT的持续释放。药物DOX和IMT在5小时的时间点时分别释放了约40％和60％。负载单个药物的PEG化的DOX-L和IMT-L脂质体纳米颗粒也观察到类似的释放趋势。此外，上述PEG化脂质体制剂的药物释放也遵循类似的趋势，其特征在于持续释放模式，明显缺乏开始的爆发性释放，这表明DOX/IMT-L脂质体样品外的游离药物含量低，这证实了封装效率的结果。
通过记录在4℃(长期储存条件)和25℃(加速条件)下储存45天时期的平均粒径和粒径分布(PDI)以及封装效率(EE％)的变化来评估PEG化的DOX/IMT-L脂质体的物理稳定性。在储存开始、1天、4天、7天、15天、30天和45天时获取样品的等分式样，通过DLS表征和HPLC分析分别测定平均粒径、PDI和EE％。表3显示的结果表明，含有(NH4)2SO4捕获剂的DOX/IMT-L脂质体纳米颗粒在4℃和25℃的储存条件下能够稳定45天。
表3.PEG化的DOX/IMT脂质体(NH4)2SO4捕获剂在4℃(长期储存)和25℃(加速)储存条件下的物理稳定性
Figure BDA0003929909850000452
Figure BDA0003929909850000461
实施例4
捕获剂对封装效率和药物释放的影响
如在脂质体制备的主动pH梯度载药方法中所述，捕获剂对有效载荷、封装效率、脂质体形状和药物释放特性至关重要。多年来，硫酸铵一直作为一种常见的众所周知的捕获剂。在本发明中，使用了两种新型脂质体捕获剂TEA-SOS和TEA-SBE-β-CD，其结构如图8所示。
TEA-SOS和TEA-SBE-β-CD的制备：蔗糖八硫酸酯钠和SBE-β-环糊精钠购自美国Sigma-Aldrich。将约10克蔗糖八硫酸酯钠或SBE-β-环糊精钠溶解在约20mL的去离子水中，使硫酸基团的终浓度为约3N。该溶液通过装有约150mL阳离子交换树脂珠粒的分离柱。该柱用约3M HCl预平衡，然后用去离子水洗到中性pH。将约20mL的SOS钠或SBE-β-环糊精钠溶液施加在柱上，用去离子水洗脱。
用TEA-SOS和TEA-SBE-β-CD制备DOX/IMT-L：如实验方法中所述，通过联合乳化、挤压、透析和主动远程负载来制备DOX-L、IMT-L和DOX/IMT-L。表4显示了各种捕获剂对DOX/IMT-L的封装效率和药物释放曲线的比较。当DOX/IMT摩尔比为1:1、1:5、1:10(总药物含量为2mg/mL)时，所有三种捕获剂都有很好的封装效率(>99.0％)，对药物的封装效率和粒径/粒径分布没有太大影响。然而，DOX/IMT-L的药物释放曲线显示出对所有三种捕获剂的显著影响。与(NH4)2SO4和TEA-SOS相比，捕获剂TEA-SBE-β-CD明显减慢了药物释放。这意味着这种缓慢的药物释放是药物在释放介质中的溶解度以及DOX和IMT与TEA-SBE-β-CD之间更强的相互作用的函数。
表4.捕获剂(NH4)2SO4、TEA-SBE-β-CD和TEA-SOS对PEG化的DOX/IMT-L脂质体的封装效率(EE％)的影响
Figure BDA0003929909850000471
实施例5
DOX/SUN-L脂质体的制备方法
使用硫酸铵、TEA-SOS和TEA-SBE-β-CD通过联合乳化、挤压、透析和主动远程负载来制备DOX-L、SUN-L和DOX/SUN-L(参见实验方法)。进行了初步实验，以确定和优化配制和生产工艺条件中影响脂质体粒径、粒径分布、封装效率、脂质体稳定性、药物释放曲线和脂质体其他物理特性的主要因素(例如脂质、脂质体组成、药物与脂质的比例、捕获剂、工艺条件等)。在对SUN-L和DOX/SUN-L脂质体的溶出药物释放研究中，发现舒尼替尼脂质体在有捕获剂硫酸铵的情况下，SUN-L和DOX/SUN-L具有快速的药物释放。为了实现舒尼替尼与DOX在脂质体中的持续释放，在DOX/SUN脂质体的制备中还使用了两种新型脂质体捕获剂TEA-SOS和TEA-SBE-β-CD。
实施例6
DOX/SUN脂质体的理化表征
对DOX-L、SUN-L、DOX/SUN-L进行了理化表征。例如，使用含有捕获剂硫酸铵(NH4)2SO4的PEG化脂质体和DSPG脂质体主动负载多柔比星和/或舒尼替尼以形成DOX-L、SUN-L和DOX/SUN-L脂质体，来产生含有多柔比星和舒尼替尼的脂质体。最终的PEG化的DOX-L、SUN-L、DOX/SUN-L显示出以下参数：平均粒径约100nm，PDI<0.100(见图9)。表5中列出了使用三种捕获剂硫酸铵、TEA-SBE-β-CD和TEA-SOS的封装效率(EE％)的比较。所有三种捕获剂都表现出极好的封装效率(>95％)，粒径在100nm左右。
表5.捕获剂(NH4)2SO4、TEA-SBE-β-CD和TEA-SOS对PEG化的DOX-L、SUN-L、DOX/SUN脂质体的封装效率(EE％)的影响
Figure BDA0003929909850000481
实施例7
DOX/SUN-L的药物体外释放和稳定性研究
在pH 6.8(PBS)在加速条件下在48℃通过透析进行PEG化的DOX-L、SUN-L、DOX/SUN-L与各种捕获剂硫酸铵、预混合的硫酸铵加TEA-SBE-β-CD、TEA-SOS、TEA-SBE-β-CD的药物释放研究。药物释放方法在实验方法中描述。如图10所示，在捕获剂硫酸铵、混合的硫酸铵/SBE-β-CD、TEA-SOS的情况下，所有SUN-L脂质体在3小时的时间点时表现出相当快的释放(>60％的释放)。6小时后，舒尼替尼被完全释放(100％释放)。然而，具有TEA-SBE-β-CD捕获剂的Sun-L在3小时和5小时的时间点时分别只有约18％和30％的药物释放。在使用所有用于SUN-L的捕获剂的共载DOX/SUN-L系统中观察到类似的释放趋势。因此，最终的DOX-L、SUN-L和DOX/SUN-L是用TEA-SBE-β-CD捕获剂制备的，以实现DOX/SUN-L脂质体纳米颗粒的持续释放。
实施例8
MDA-MB-231多柔比星耐药细胞系的制备和表征
MDA-MB-231多柔比星耐药细胞系的制备在实验方法中描述。多柔比星耐药变体MDA-MB-231(R)细胞的表征通过MTT测定和细胞凋亡测定分析进行。与MDA-MB-231相比，MDA-MB-231(R)在48小时DOX处理后的细胞活率在每个剂量水平上都明显更高(图11)。
实施例9
体外多柔比星和伊马替尼比例的协同作用研究
对于组合药物，两种或更多种药物可以表现出协同、加和或拮抗相互作用。为了确定多柔比星和伊马替尼(DOX/IMT)具有协同作用时的比例，在体外细胞系研究中测试了多柔比星和伊马替尼的各种组合的细胞毒性作用。研究了广泛的药物浓度范围以确定多柔比星和伊马替尼之间的协同作用。使用DOX(仅)、1:1、1:5、1:10、IMT(仅)的摩尔比的多柔比星和伊马替尼与各种症细胞系，如A-673、GIST-882GIST基质肿瘤细胞和MDA-MB-231(R)人类乳腺癌细胞，进行测量加和、协同或拮抗作用。DOX/IMT摩尔比与细胞活率％的图表明，DOX/IMT与MDA-MB-231(R)多柔比星耐药细胞系的协同摩尔比为1:5(见图12)。利用标准的基于四唑的比色法MTT细胞毒性测定方案来确定受影响细胞分数的读数。
实施例10
多柔比星和伊马替尼在癌细胞中的协同作用的体外评价
对于组合药物方案，两种或更多种药物可能表现出协同、加和或拮抗相互作用，这取决于组合的药物比例。为了确定多柔比星与伊马替尼(DOX:IMT)具有协同作用的组合比例，用相关的细胞系研究了DOX:IMT的广泛药物摩尔比范围。使用30:1至1:30、优选10:1、5:1、1:1、1:5和1:10的摩尔比的DOX:IMT与各种癌细胞系，如SK-MEL-28(对多柔比星表现出内在耐药性的黑色素瘤细胞)、BT-549(对多柔比星表现出内在耐药性的三阴性乳腺癌细胞)、MCF-7(R)(对多柔比星表现出获得性耐药性的乳腺癌细胞)、A-673(具有1型EWS-FLI-1融合的尤文氏肉瘤细胞系)、A-549(非小细胞肺癌，NSCLC)、GIST-T1(具有KIT突变的GIST：杂合外显子11，V560-Y579缺失)和HT-29(结直肠腺癌)等，确定了多柔比星和伊马替尼之间的协同、加和或拮抗作用。
图13A显示了CI值作为细胞生长抑制(即在不同的DOX与IMT摩尔比下对SK-MEL-28黑色素瘤细胞的受影响分数(Fa))的函数。在DOX与IMT的比例为1:10、1:5和1:1时，观察到协同作用，因为在0.05-0.9的Fa的广泛范围内，CI远小于0.9。这些表明，1:1、1:5和1:10的DOX:IMT比例在引起明显的肿瘤细胞死亡的浓度下具有协同作用。相反，当Fa高于0.6，DOX:IMT摩尔比为10:1和5:1时，观察到拮抗作用(即CI>1.1)。图13B也显示了CI对DOX:IMT比例的依赖性，其中在SK-MEL-28细胞中不同的DOX:IMT摩尔比下，比较了在足以引起75％(ED75)和90％(ED90)肿瘤细胞生长抑制的药物浓度下的CI值。当DOX:IMT比例为1:5时，观察到最强的协同作用。基于上述结果，选择DOX:IMT摩尔比为1:5作为固定的药物比例来配制脂质体药物产品，用于治疗SK-MEL-28黑色素瘤。
以类似的方法，还研究了DOX:IMT比例对BT-549三阴性乳腺癌细胞的细胞生长抑制的影响，结果见图14A和图14B。数据反映出，DOX:IMT在1:5的比例下的组合在广泛的Fa范围内(0.2至0.9之间)具有协同作用。然而，在1:1的比例下，DOX:IMT的组合在所有Fa值下都观察到拮抗作用。对于其他DOX:IMT比例，即1:10、5:1和10:1，没有发现明显的协同作用，组合的效果是加和的。基于这些结果，选择DOX:IMT摩尔比为1:5作为固定的药物比例来配制脂质体产品，用于治疗BT-549乳腺癌。
还评估了多柔比星耐药性MCF-7乳腺癌细胞(即MCR-7(R))对不同药物摩尔比下的DOX/IMT治疗反应的由CI值反映的药物组合效应。耐药性MCF-7细胞是通过在低浓度的DOX存在下反复培养细胞而产生的。几次传代后，在DOX存在下增殖良好的细胞被称为DOX耐药性MCF-7。如图15A和图15B所示，在DOX:IMT比例为1:5和5:1时，观察到加和作用。相反，在ED75和ED90的DOX:IMT比例为1:1时，观察到温和的协同作用。因此，选择1:1的DOX:IMT分子比例作为固定的药物比例来配制脂质体产品，用于治疗多柔比星耐药性MCF-7乳腺癌。
除了上述三个细胞系外，还评估了对其他癌细胞系的由CI值反映的药物组合效应。这些细胞包括A-673肉瘤细胞、GIST-T1胃肠道基质细胞、A-549NSCLC和HT-29结直肠细胞。在不同的DOX/IMT比例下研究的所有细胞系的ED75和ED90的CI值总结在下面的表6中。这些结果表明，在广泛的药物比例范围内，DOX/IMT对A-673、GIST、A-549和HT-29细胞系的组合效应是加和或拮抗的，在这些细胞系中没有观察到对DOX/IMT治疗的明显协同作用。如上所述，在1:5的DOX/IMT摩尔比下，对SK-MEL-28黑色素瘤细胞和BT-549乳腺癌细胞都获得了协同作用。在1:1的DOX/IMT比例下，对MCF-7(R)乳腺癌细胞和SK-MEL-28黑色素瘤细胞也发现有协同作用。此外，5:1的DOX/IMT摩尔比对GIST-T1癌细胞也产生了协同作用(图16A和图16B)。表6中具有协同作用的药物比例为加粗的。
表6.不同DOX:IMT摩尔比在各种癌细胞系中的ED75和ED90的CI值
Figure BDA0003929909850000511
Figure BDA0003929909850000521
实施例11
多柔比星和舒尼替尼在癌细胞中的协同作用的体外评价
为了确定多柔比星与舒尼替尼(DOX:SUN)具有协同作用的比例，用实施例10中描述的类似程序研究了DOX:SUN的各种药物摩尔比。使用30:1至1:30，优选10:1、5:1、1:1、1:5、1:10的DOX:SUN的摩尔比，对下列细胞系进行了药物组合的加和、协同或拮抗作用的测定：SK-MEL-28(对多柔比星表现出内在耐药性的黑色素瘤细胞)和BT-549(对多柔比星表现出内在耐药性的三阴性乳腺癌细胞)。还利用标准的基于四唑的比色法MTT细胞毒性测定方法来确定对药物处理有反应的受影响细胞分数的读数。
如图17A所示，在广泛的药物浓度范围内，发现在三种受试药物摩尔比为5:1、1:1和1:5时，DOX和SUN组合对SK-MEL-28黑色素瘤细胞具有协同作用(即0.10<Fa<0.95)。具体来说，在所有三种药物比例下，在引起75％和90％的肿瘤生长抑制的药物浓度(ED75和ED90，分别对应于Fa＝0.75和0.90)下，观察到强烈的药物协同作用(CI<0.70，图17B)。在BT-549乳腺癌细胞上也分析了药物组合对细胞生长抑制的影响(图18A和图18B)。一般来说，在低、中药物浓度(即Fa<0.7)时，观察到依赖药物比例的CI曲线。相反，在高Fa范围(即Fa>0.70)时，得到所有三种药物比例的协同作用得到了体现。具体来说，在ED75和ED90时，DOX:SUN的比例等于1:1时，出现了明显的协同作用(CI<0.4，图18B)。基于上述结果，选择DOX:SUN比例为1:1的脂质体组合药物产品制剂，用于治疗SK-MEL-28黑色素瘤和BT-549乳腺癌。
实施例12
脂质与药物的比例对药物封装效率的影响
实验方法部分中描述了具有主动负载过程的脂质体制剂的实例。使用PEG化的脂质体，对脂质体DOX/IMT组合研究了药物摩尔比为1:5时，脂质与药物的比例对药物封装效率(EE％)的影响(表7)。脂质体通过Sephadex G-50旋转柱洗脱后，对药物封装效率进行了评估。然后，使用HPLC-UV分析确定了载药效率。采用三种不同的捕获剂进行药物远程负载，即硫酸铵、TEA-SBE-β-CD和TEA-SOS。从所使用的捕获剂类型中可以独立观察到一个普遍的趋势：当总脂质与总药物的摩尔比≥3.2:1时，可以获得明显的高有效载荷EE％(≥95％)。然而，当总脂质与总药物摩尔比降低到≤1.6:1时，观察到EE％明显下降(EE％<80％)。基于上述结果，选择总脂质与总药物的摩尔比为6.4:1进行进一步的脂质体组成研究。
表7.总脂质与总药物的比例对药物封装效率(％)的影响
Figure BDA0003929909850000531
TEA-SBE-CD：三乙胺磺酰丁醚β-环糊精；TEA-SOS：三乙胺八硫酸蔗糖
实施例13
双药负载脂质体的理化表征
用动态光散射法分析了脂质体的平均粒径。使用实验方法中描述的类似程序评估药物封装效率。在pH 6.8下通过透析进行体外溶出研究。
表8总结了使用各种类型的捕获剂对PEG化脂质体DOX/IMT-L中DOX和IMT的平均粒径(直径)和封装效率(EE％)的表征。如表8所示，使用硫酸铵、TEA-SOS和TEA-SBE-β-CD捕获剂时，PEG化的DOX-L、IMT-L、DOX/IMT-L脂质体的平均粒径为90-105nm，PDI<0.100，封装效率％极好(约99％)。然而，使用Tris-SBE-β-CD和葡萄糖酸铜捕获剂时，IMT的封装效率％分别下降到约90％和72％。在上述所有的PEG化脂质体中，组合物被固定在6.4:1的总脂质与总药物摩尔比。
表8.使用各种捕获剂时，多柔比星和/或伊马替尼在PEG化的DOX/IMT-L中的平均粒径(直径)和封装效率(EE％)的比较
Figure BDA0003929909850000541
AS：硫酸铵；TEA-SOS：三乙胺八硫酸蔗糖；TEA-SBE-CD：三乙胺磺酰丁醚β-环糊精；Tris-SBE-CD：SBE-CD的三(羟甲基)氨基甲烷盐；CuGlu/TEOA：葡萄糖酸铜/三乙醇胺
对于PEG化的DOX/SUN-L脂质体，使用各种类型的捕获剂对DOX和SUN的平均粒径(直径)和封装效率(EE％)的表征也被总结在表9中。如表9所示，使用硫酸铵、TEA-SOS和TEA-SBE-β-CD捕获剂时，PEG化的DOX-L、SUN-L、DOX/SUN-L脂质体的平均粒径为约100nm，PDI<0.100，封装效率％极好(约99％)。在上述所有的PEG化脂质体中，组合物被固定在6.4:1的总脂质与总药物摩尔比。
表9.在使用各种捕获剂时，多柔比星和/或舒尼替尼在PEG化的DOX/SUN-L中的平均粒径(直径)和封装效率(EE％)的比较
Figure BDA0003929909850000551
AS：硫酸铵；TEA-SOS：三乙胺八硫酸蔗糖；TEA-SBE-CD：三乙胺磺酰丁醚β-环糊精
在体外药物释放方面，发现PEG化的DOX/IMT-L和DOX/SUN-L中DOX/IMT或DOX/SUN的药物释放速率显示出对捕获剂类型及其浓度的依赖。在捕获剂的适当浓度下，药物释放速率的顺序是：(NH4)2SO4>葡萄糖酸铜>TEA-SOS>Tris-SBE-β-CD>TEA-SBE-β-CD。此外，使用硫酸铵时，PEG化的DOX/IMT-L中的DOX和IMT的药物释放速率比DOX/IMT-DSPG-L慢得多。
基于上述结果，证明与上述其他捕获剂相比，以TEA-SBE-β-CD为捕获剂的药物在脂质体中表现出极好的封装效率和更高的有效载荷保留。因此，TEA-SBE-β-CD被选为捕获剂来进一步封装脂质体中的双药。
通过低温透射电子显微镜(Cryo-TEM)观察脂质体的形态。图19显示了双重负载PEG化脂质体纳米颗粒(DOX:IMT摩尔比为1:5，TEA-SBE-β-CD)的TEM图像，显示出具有单层结构的球形，其核心(DOX和IMT的沉淀物)密集，平均粒径为约100nm。黑暗的内部表明内部隔室有大量的电子密集，这反映了与捕获剂相互作用的API的聚集状态。这些结果证实了这两种药物在聚集/沉淀状态下被很好地共同封装在脂质体的水性核心隔室中。
实施例14
通过被动/主动双药负载制备脂质体的一般方法
对于组合双药负载，可以通过耦合的主动和被动负载方法将两种药物封装到脂质体中。例如，两种药物都通过被动负载方法负载，或者一种是被动负载，而另一种是主动负载。如实验方法中所述，这里还采用了PEG化的脂质组合物，其中有不同脂质比例的DSPC(占总脂质的>10mol％)、胆固醇(占总脂质的0-50mol％)和mPEG-2000-DSPE(PEG化的脂质体)。简而言之，下面描述了一般的耦合的主动和被动负载脂质体制备的实例。
通过耦合的主动和被动双药负载的脂质体的一般制备：1)含有一种药物的多层囊泡的制备：将所有脂质溶解在有机溶剂中。将一种药物(例如盐酸吉西他滨，GEM)和一种选择的捕获剂(例如TEA-SBE-β-CD水溶液)溶解在适当浓度的水中，然后加热到60-70℃。然后在剧烈的搅拌下将脂质溶液分散到上述水溶液中，持续5小时以形成多层囊泡。2)缩小脂质体尺寸：通过多次通过孔径为50-100nm的聚碳酸酯膜进行挤压。目标脂质体尺寸范围是50-200nm，优选是80-110nm之间。3)渗滤：去除外部捕获剂和外部第一负载药物，将被动负载的脂质体转移到pH为6-7.5的主动负载溶液中。4)第二药物的主动负载：通过将药物溶解在水溶液中以达到所需的浓度和与第一治疗剂的协同比例，来制备第二药物储存液(例如苹果酸舒尼替尼)。将第二治疗剂储存液加入步骤3中制备的脂质体分散液中，以达到脂质/药物输入摩尔比>1.0。将该混合物在60-70℃下孵育约1-3小时。将脂质体药物产品冷却至室温，并储存在2-8℃。
对PEG化的GEM/SUN-L脂质体的理化表征方法如实验方法中所述。以上述共载的PEG化GEM/SUN-L脂质体为例，表10显示了使用TEA-β-SBE-SD捕获剂的GEM/SUN-L双药负载脂质体的平均粒径(直径)、封装效率(％)和总GEM/SUN与总脂质的摩尔比。GEM/SUN-L脂质体渗漏研究表明，GEM/SUN-L中的GEM和SUN两者在冷藏条件下稳定至少四周。此外，细胞系(优选NSCLC细胞系)研究表明，吉西他滨和舒尼替尼的协同组合的摩尔比为5:1、1:1和1:5。
表10.吉西他滨(GEM)和舒尼替尼(SUN)共封装的脂质体的表征
Figure BDA0003929909850000571
实施例15
DOX/IMT脂质体对细胞生长的体外抑制
为了比较脂质体对细胞生长的体外抑制，用PEG化的DOX-L、IMT-L、DOX/IMT-L以1:5(协同)和5:1(拮抗)摩尔比的DOX:IMT处理SK-MEL-28黑色素瘤细胞。简要的实验过程陈述如下：将SK-MEL-28黑色素瘤细胞以适当的接种密度接种在96孔板上。在药物处理前，将接种细胞的平板在标准细胞培养箱中在37℃和5％ CO2下孵育24小时。第二天，使用各自的细胞培养基以1:5或5:1摩尔比制备PEG化的单独DOX-L、IMT-L或DOX/IMT-L脂质体药物组合的药物稀释液。然后用含有相关脂质体药物的新鲜培养基替换96孔板中先前的细胞培养基。在总共96小时的孵育后，按照制造商的方案，通过MTT测定来评估细胞活率。相对存活率百分比是通过从药物处理的孔得到的吸光度值中减去纯培养基孔得到的吸光度值，然后与无药物对照孔(仅细胞对照)进行归一化来确定的。细胞生长抑制百分比是通过从100％减去细胞活率百分比来计算的。
如表11所示，PEG化脂质体DOX/IMT-L在其协同比例(即DOX/IMT＝1:5)下的细胞生长抑制能力明显大于如果每种封装药物仅以加和的方式贡献其活性的预期。具体来说，6.25μM脂质体DOX-L的细胞生长抑制值为58.3％，31.25μM脂质体IMT-L的细胞生长抑制值为18.2％，预测脂质体DOX/IMT-L(1:5摩尔比)的细胞生长抑制值为76.5％(见表6)，这大大低于观察到的细胞生长抑制值96.7％。此外，脂质体DOX/IMT-L在其拮抗摩尔比为5:1时的细胞生长抑制值(DOX/IMT＝6.25/1.25μM时为22.8％)明显低于如果每种负载药物以加和的方式贡献其疗效的预期(6.25μM下的DOX的58.3％加上1.25μM下的IMT的10.1％等于68.4μM)。总的来说，上述结果与实施例1中观察到的药物比例对其疗效的影响相呼应，并证明了当作为游离药物溶液使用时，基于DOX/IMT比例的相同协同或拮抗作用可以转化为采用相应药物比例的双药负载脂质体产品。
表11.PEG化的DOX/IMT-L在SK-MEL-28黑色素瘤细胞系中的抗癌活性的体外分析
Figure BDA0003929909850000581
实施例16
DOX/IMT脂质体的体内药代动力学研究
在CD-1小鼠体内对游离多柔比星、游离伊马替尼和DOX/IMT-L(1:5摩尔比)脂质体进行为期一周的体内药代动力学研究。PEG化的DOX/IMT-L与TEA-SBE-β-CD的制备在实验方法中描述。通过尾静脉向CD-1小鼠静脉施用游离多柔比星、游离伊马替尼和PEG化DOX/IMT-L(摩尔比为1:5)，并随时间监测血浆DOX/IMT的比例。脂质体制剂的剂量为6.0mg/kg的盐酸多柔比星和27.3mg/kg的甲磺酸伊马替尼。静脉施用后，在一周内的多个时间点通过心脏穿刺采集血液(每个时间点3只小鼠)，并将其放入EDTA包被的微型容器。将样品离心以分离血浆，并将血浆转移到另一个管中。然后，用LC-MS对DOX和IMT的血浆水平进行定量。根据单次静脉注射后在收集的血浆样品中测得的DOX和IMT血浆水平来计算PK参数。
基于PK研究结果，可以得出结论：游离DOX和游离IMT药物溶液被迅速消除，游离DOX和游离IMT的半衰期(T1/2)值分别为0.5小时(DOX)和0.88小时(IMT)。与游离药物溶液相比，PEG化的DOX/IMT-L脂质体的T1/2延长了>26倍(DOX)和>4.3倍(IMT)。DOX/IMT-L脂质体中两种药物的AUC(曲线下面积)比游离药物溶液中的AUC增加了>52倍(DOX)和>600倍(IMT)。PEG化的DOX/IMT-L脂质体中两种药物的MRT(最大保留时间)也比游离药物溶液中的MRT增加了>24倍(DOX)和8倍(IMT)。这些PK结果表明，与游离药物DOX和IMT相比，共载的DOX/IMT-L脂质体明显延长了药物保留，并表现出DOX和IMT在小鼠体内的血浆药物水平明显提高。这也表明PEG化的DOX/IMT-L中的多柔比星和伊马替尼都能在小鼠血液中持续和自发释放。此外，我们还注意到，在上述药物剂量下，小鼠对DOX/IMT-L脂质体药物产品的耐受性良好，在这项PK研究中没有观察到不良事件。
此外，从该PK研究中，还可以确定不同时间点血浆中DOX和IMT的摩尔比。图20显示了CD-1小鼠静脉施用后24小时内血浆中DOX/IMT的摩尔比的图。结果是，在对CD-1小鼠施用后约20小时内，当药物同时由脂质体递送时，封装在PEG化脂质体中的DOX和IMT的摩尔比很好地维持在实施例10中所示的DOX/IMT的协同摩尔比，即1:5至1:1。数据点代表在指定时间点在血浆中测定的DOX:IMT的摩尔比(+/-标准偏差)。如实施例1所讨论的，DOX:IMT的摩尔比高于约1:1对于组合药物在SK-EML-28中表现出协同作用是必要的。因此，适当设计的脂质体递送载体在CD-1小鼠体内显示了所需摩尔比的DOX和IMT的递送。此外，LC-MS分析表明，循环脂质体药物制剂含有完整的药物，没有观察到任一种化合物降解的证据。
实施例17
携带SK-MEL-28异种移植肿瘤的小鼠的体内肿瘤消退
为了最大限度地提高药物组合的治疗活性并获得体外观察到的协同作用益处，药物组合需要以最佳的药物比例递送到肿瘤部位。为此，在实施例10中开发了含有DOX和IMT的脂质体制剂，其固定比例已知在SK-MEL-28细胞中具有协同作用，如实施例8中所示，允许体内药物协调释放。然后在SK-MEL-28黑色素瘤模型中对该制剂的抗肿瘤活性进行了体内评估。本研究使用了PEG化脂质体与DOX和IMT以1:5的协同摩尔比共同封装，并采用TEA-SBE-β-CD作为捕获剂。
为了对小鼠(BALB/c Nude)进行肿瘤研究，在小鼠右腹皮下接种10x106个SK-MEL-28肿瘤细胞，以进行肿瘤发展。然后让接种的肿瘤在开始治疗前生长约五周。将小鼠组织成适当的治疗组，包括盐水对照组和药物治疗组，包括(1)DOX-L(2)DOX/IMT混合游离药物混合物溶液和(3)DOX/IMT-L(DOX:IMT摩尔比为1:5)。根据每个个体小鼠的体重，每周向小鼠静脉注射所需体积的样品，以向动物施用目标剂量(6mg/kg DOX，27.3mg/kg IMT)，持续两周。测量并监测肿瘤体积和小鼠体重。
如图21A所示，总的来说，与在荷瘤盐水对照组以及其他药物处理组(包括DOX-L单药治疗、IMT-L单药治疗和组合游离DOX/IMT混合物溶液)中观察到的情况相比，双药负载脂质体(DOX/IMT-L)明显抑制了肿瘤生长。这种对肿瘤生长的抑制是由于纳米脂质体制剂的高通透性和滞留(EPR)效应，它可以提高药物在肿瘤部位的递送特异性。因此，关于游离药物混合物和脂质体药物组合的疗效比较，反映出目前脂质体制剂所实现的优越的生物分布可以导致更有效的肿瘤抑制。与其他药物治疗组相比，DOX-L单药治疗的肿瘤增长率与在盐水对照组中观察到的相似，这证实了SK-MEL-28细胞系内在的多柔比星耐药性。另外，与DOX-L或IMT-L单药治疗相比，DOX/IMT-L组合对肿瘤生长的抑制作用更强。该结果表明，从体外研究中发现的DOX和IMT之间的协同作用(实施例10)可以很好地转化为体内环境中的脂质体制剂。此外，在体内药效研究中，所有调查组的体重都没有明显下降(图21B)。总的来说，上述结果表明，通过将它们封装在脂质体内，固定的协同性DOX:IMT摩尔比可以极大地提高抗肿瘤活性。
上述实施方案和实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。可以有上面描述的那些的许多变化。由于对于本领域技术人员来说，基于本公开对上述实施方案和实施例进行的各种修改和改变是显而易见的，因此这种修改和改变在本发明的精神和范围内。本文引用的所有专利或非专利文献都是通过引用的方式整体并入本文，不承认它们是现有技术。

Claims (28)

1.一种药物组合物，包括悬浮在液体介质中的脂质体，其中所述液体介质包括水和pH缓冲剂；其中所述脂质体包括由外部脂质双层膜包围的内部隔室，其中所述内部隔室包括在水性介质中的蛋白激酶抑制剂，或亲水性化疗剂和蛋白激酶抑制剂的组合；其中所述脂质双层膜包括形成所述内部隔室的亲水内表面、亲脂双层和与所述组合物的液体介质接触的亲水外表面；以及其中所述亲水性化疗剂和蛋白激酶抑制剂可以以协同模式从所述脂质体中释放。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂质双层膜包括：(a)至少10mol％的磷脂，所述磷脂选自由磷脂酰胆碱(例如HSPC、DSPC、DPPC、DMPC)、磷脂酰甘油(例如DSPG)、磷脂酰肌醇、甘油糖脂、鞘糖脂(例如鞘磷脂)及其组合组成的组；(b)0-60mol％的胆固醇或其衍生物；以及(c)可选的带电荷的磷脂，所述带电荷的磷脂衍生为聚乙二醇(例如mPEG-2000-DSPE)。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中一种或多种脂质独立地选自由HSPC、DSPC、DPPC、DMPC、DSPG、mPEG-DSPE-2000和胆固醇组成的组。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述液体介质进一步包括以下的一种或多种：水溶性有机溶剂、渗透剂、控制释放赋形剂。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中脂质体颗粒的水性内部隔室进一步包括捕获剂。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述捕获剂选自由以下组成的组：硫酸铵、多阴离子化磺丁基醚环糊精的铵或取代的铵盐(例如TEA-SBE-α-环糊精、TEA-SBE-β-环糊精、TEA-SBE-γ-环糊精、Tris-SBE-α-环糊精、Tris-SBE-β-环糊精和Tris-SBE-γ-环糊精)；多阴离子化硫酸化碳水化合物的铵或取代的铵盐(例如TEA-SOS和Tris-SOS)；多磷酸盐的铵或取代的铵盐(例如三乙基铵肌醇六磷酸盐和三(羟甲基)氨基甲烷肌醇六磷酸盐)；过渡金属盐(例如铜、锌、锰、镍、钴等与卤化物、硫酸和葡萄糖酸的盐)；季铵化合物(例如苯扎氯铵、苄索氯铵、十六烷基三甲基溴化铵、硬脂基二甲基苄基氯化铵)、聚氧乙烯(即聚乙二醇)和椰油胺。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质双层膜的外表面包括表面带负电荷的脂质(例如DSPG)或含有聚乙二醇(例如mPEG-2000-DSPE)的表面改性剂，其中总脂质与蛋白激酶抑制剂的摩尔比，或者当亲水性化疗剂和蛋白激酶抑制剂两者均存在时，总脂质与亲水性化疗剂和蛋白激酶抑制剂两者组合的总量的摩尔比至少是相当的(1:1)。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述化疗剂选自由以下组成的组：多柔比星、环磷酰胺、卡铂、紫杉醇、柔红霉素、表柔比星、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、艾瑞布林、伊沙匹隆、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、长春瑞滨、多烯紫杉醇、塞替派、博来霉素、长春新碱、达卡巴嗪、卡培他滨、强的松、喜树碱、拓扑替康、伊立替康、BCNU、卡莫司汀、顺铂、来那度胺和培美曲塞。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其中所述蛋白激酶抑制剂选自由以下组成的组：伊马替尼、舒尼替尼、阿法替尼、尼达尼布、帕纳替尼、鲁索利替尼、克唑替尼、依鲁替尼、阿卡替尼、阿贝西利、阿柏西普、阿来替尼、阿瓦普利替尼、阿昔替尼、博舒替尼、卡博替尼、卡马替尼、色瑞替尼、考比替尼、克唑替尼、达拉非尼、达克替尼、达沙替尼、康奈非尼、恩曲替尼、厄达替尼、厄洛替尼、依维莫司、菲卓替尼、福他替尼、吉非替尼、吉瑞替尼、依鲁替尼、拉帕替尼、拉罗替尼、乐伐替尼、劳拉替尼、尼达尼布、来那替尼、尼罗替尼、奈妥舒迪、奥希替尼、帕克替尼、帕唑帕尼、培西达替尼、培米替尼、帕博西尼、帕纳替尼、培西达替尼、普拉替尼、奎扎替尼、瑞格菲尼、瑞博西尼、瑞派替尼、塞尔帕替尼、司美替尼、索拉非尼、替西罗莫司、托法替尼、曲美替尼、图卡替尼、乌帕替尼、凡德他尼、维莫非尼、泽布替尼和阿柏西普。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质体的内部隔室包括选自由以下组成的组的抗癌剂或组合：
(a)单独封装的伊马替尼；
(b)共同封装的多柔比星和伊马替尼；
(c)单独封装的舒尼替尼；
(d)共同封装的多柔比星和舒尼替尼；
(e)单独封装的吉西他滨；
(f)共同封装的吉西他滨和舒尼替尼；
(g)约30:1至约1:30的摩尔比的多柔比星和伊马替尼；
(h)约30:1至约1:30的摩尔比的多柔比星和舒尼替尼；和
(i)约30:1至约1:30的摩尔比的吉西他滨和舒尼替尼。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质体的平均粒径在4.5nm到450nm之间，优选25nm到300nm之间，更优选50nm到200nm之间。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，其中化疗剂和蛋白激酶抑制剂可以在施用后以协同模式依次释放。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的药物组合物，其中两种共同封装的药剂(即化疗剂和蛋白激酶抑制剂)的摩尔比使得，当在受影响细胞分数为约0.20至0.80的浓度范围内在体外测定中将所述比提供给与所述癌症相关的癌细胞时，在所述范围的至少20％上表现出协同作用。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的药物组合物，其中封装有化疗剂和蛋白激酶抑制剂的脂质体在体内施用后在血液中保持至少一小时的协同摩尔药物比。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的药物组合物，用于治疗需要治疗的受试者的癌症或癌症耐药性，其中所述癌症可选地选自由以下组成的组：乳腺癌、黑色素瘤、胃肠癌、肺癌、结直肠癌、尤文氏肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌、子宫癌和胃肠道间质瘤，其中所述化疗剂和蛋白激酶抑制剂可以通过所述脂质体递送，对癌细胞具有协同的细胞毒性或细胞抑制作用。
16.一种治疗癌症或癌症耐药性的方法，所述方法包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至14中任一项所述的药物组合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、黑色素瘤、胃肠癌、肺癌、结直肠癌、尤文氏肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌、子宫癌和胃肠道间质瘤。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌，并且其中所述肺癌是由野生型EGFR的高水平磷酸化或EGFR氨基酸序列内的突变引起的。
19.一种制备脂质体药物组合物(例如，根据权利要求1至11中的任一项)的方法，其中所述脂质体是通过包括以下步骤的工艺制成的：
(a)在包括水、脂质和捕获剂的溶液中形成多层脂质体囊泡；
(b)在高温(例如在40-75℃范围内)下通过聚碳酸酯膜(例如，尺寸为50nm或100nm)多次挤压所述多层脂质体囊泡，以形成单层脂质体；
(c)通过渗滤或尺寸排除色谱法，或其他缓冲液交换方法，基本去除处于脂质体外的捕获剂；以及
(d)在高温(例如40-75℃)下，加热包括一种或多种活性药物成分(API)的水溶液中的未负载的脂质体，从而形成封装药物的脂质体。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述脂质选自由以下组成的组：(a)至少10mol％的磷脂，所述磷脂选自由磷脂酰胆碱(例如HSPC、DSPC、DPPC、DMPC)、磷脂酰甘油(例如DSPG)、磷脂酰肌醇、甘油糖脂、鞘糖脂(例如鞘磷脂)及其组合组成的组；(b)0-60mol％的胆固醇或其衍生物；以及(c)可选的带电荷的磷脂，所述带电荷的磷脂衍生为聚乙二醇(例如mPEG-2000-DSPE)。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述捕获剂选自由以下组成的组：硫酸铵；多阴离子化磺丁基醚环糊精的铵或取代的铵盐(例如TEA-SBE-α-环糊精、TEA-SBE-β-环糊精、TEA-SBE-γ-环糊精、Tris-SBE-α-环糊精、Tris-SBE-β-环糊精和Tris-SBE-γ-环糊精)；以及多阴离子化硫酸化碳水化合物的铵或取代的铵盐(例如TEA-SOS和Tris-SOS)；多磷酸盐的铵或取代的铵盐(例如三乙基铵肌醇六磷酸盐和三(羟甲基)氨基甲烷肌醇六磷酸盐)；过渡金属盐(例如铜、锌、锰、镍、钴等与卤化物、硫酸和葡萄糖酸的盐)；季铵化合物(例如苯扎氯铵、苄索氯铵、十六烷基三甲基溴化铵、硬脂基二甲基苄基氯化铵)、聚氧乙烯(即聚乙二醇)和椰油胺。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，包括选自主动负载、被动负载及其组合的过程；其中所述主动负载或被动负载选自由以下组成的组：
(a)基于pH梯度的主动负载方法，所述方法基于跨膜pH梯度来封装API，其中所述脂质体的内部水性隔室的pH值低于脂质体外部的pH值；
(b)基于过渡金属的主动负载方法，所述方法通过利用过渡金属离子驱动API通过络合作用被摄取到所述脂质体中来封装API；
(c)被动负载方法，所述方法在脂质体形成过程中封装API；以及
(d)被动负载方法，所述方法涉及脂质体形成后的被动平衡。
23.根据权利要求22所述的方法，其中pH梯度是由铵离子的浓度梯度或具有能够被质子化的铵衍生物或取代的铵的有机化合物的浓度梯度形成的。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述API选自蛋白激酶抑制剂以及化疗剂和蛋白激酶抑制剂的组合。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述化疗剂选自由以下组成的组：多柔比星、环磷酰胺、卡铂、紫杉醇、柔红霉素、表柔比星、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、艾瑞布林、伊沙匹隆、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、长春瑞滨、多烯紫杉醇、塞替派、博来霉素、长春新碱、达卡巴嗪、卡培他滨、强的松、喜树碱、拓扑替康、伊立替康、卡莫司汀、顺铂、BCNU、来那度胺和培美曲塞组成的组；并且其中所述蛋白激酶抑制剂选自由伊马替尼、舒尼替尼、阿法替尼、尼达尼布、帕纳替尼、鲁索利替尼、克唑替尼、依鲁替尼、阿卡替尼、阿贝西利、阿柏西普、阿来替尼、阿瓦普利替尼、阿昔替尼、博舒替尼、卡博替尼、卡马替尼、色瑞替尼、考比替尼、克唑替尼、达拉非尼、达克替尼、达沙替尼、康奈非尼、恩曲替尼、厄达替尼、厄洛替尼、依维莫司、菲卓替尼、福他替尼、吉非替尼、吉瑞替尼、依鲁替尼、拉帕替尼、拉罗替尼、乐伐替尼、劳拉替尼、尼达尼布、来那替尼、尼罗替尼、奈妥舒迪、奥希替尼、帕克替尼、帕唑帕尼、培西达替尼、培米替尼、帕博西尼、帕纳替尼、培西达替尼、普拉替尼、奎扎替尼、瑞格菲尼、瑞博西尼、瑞派替尼、塞尔帕替尼、司美替尼、索拉非尼、替西罗莫司、托法替尼、曲美替尼、图卡替尼、乌帕替尼、凡德他尼、维莫非尼、泽布替尼、阿柏西普及其组合。
26.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中所述脂质体的平均粒径在4.5nm到450nm之间，优选25nm到300nm之间，更优选50nm到200nm之间的范围内。
27.根据权利要求1至14中任一项所述的或通过根据权利要求19至26中任一项所述的方法制备的多个载药脂质体。
28.一种治疗试剂盒，所述试剂盒包括容器和容器中根据权利要求27所述的多个载药脂质体，其中所述载药脂质体悬浮在或可以悬浮在无菌稀释液中，准备向需要治疗的受试者施用。
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