BR102017018582A2 - Lipossomas, processo de obtenção, composições antitumorais e usos - Google Patents

Abstract

lipossomas, processo de obtenção, composições antitumorais e usos. a presente invenção consiste em lipossomas caracterizados por conter dioleilfosfatidiletanolamina, hemisuccinato de colesterila, dioleilfosfatidiletanolamina acoplada ao polietilenoglicol, paclitaxel ou docetaxel e doxorrubicina. a invenção se refere ainda ao processo de obtenção dos lipossomas supracitados, às composições contendo os lipossomas e ao uso tanto dos lipossomas quanto das composições para preparação de medicamentos antitumorais.

Description

“LIPOSSOMAS, PROCESSO DE OBTENÇÃO, COMPOSIÇÕES ANTITUMORAIS E USOS” [01] A presente invenção consiste em lipossomas caracterizados por conter dioleilfosfatidiletanolamina, hemisuccinato de colesterila, dioleilfosfatidiletanolamina acoplada ao polietilenoglicol, paclitaxel ou docetaxel e doxorrubicina. A invenção se refere ainda ao processo de obtenção dos lipossomas supracitados, às composições contendo os lipossomas e ao uso tanto dos lipossomas quanto das composições para preparação de medicamentos antitumorais.

[02] O câncer de mama é o tipo de câncer mais incidente e que causa maior mortalidade mundial na população feminina, e a quimioterapia é uma alternativa terapêutica para seu tratamento. Atualmente, os agentes quimioterápicos convencionais mais prescritos são o paclitaxel (PTX) e a doxorrubicina (DXR), principal mente devido à sua excelente eficácia antitumoral contra vários tumores sólidos, incluindo câncer de mama metastático. Os regimes baseados em antraciclinas são os que apresentam melhores resultados clínicos para o tratamento do câncer de mama, e a adição de um taxano melhora ainda mais esses resultados (BINES, J. et al. Anthracyclines and taxanes in the neo/adjuvant treatment of breast câncer: does the sequence matter? Annals of Oncology 00: 1-7, 2014).

[03] A ação mais conhecida do PTX é sua ligação à tubulina, impedindo o desarranjo dos microtúbulos e, consequentemente, levando à parada mitótica e morte celular por apoptose (BARBUTI, A.M e CHEN, Z. S. Paclitaxel Through the Ages of Anticancer Therapy: Exploring Its Role in Chemoresistance and RadiationTherapy. Cancers, 7, 2360-2371, 2015). A DXR é um antibiótico da classe das antraciclinas que ainda não tem seus mecanismos de ação completamente elucidados. Dentre os mecanismos já propostos estão a inibição da topoisomerase II, resultando em quebra da dupla fita de DNA e morte celular; a formação de adutos com DNA e

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2/30 estresse oxidativo pela formação de radicais livres, ambos levando a danos no DNA e morte celular e, finalmente, a superprodução de ceramidas que leva a apoptose via ativação da caspase-3.

[04] Apesar de eficazes, esses agentes têm sua aplicação limitada devido ao aparecimento de efeitos adversos graves e resistência. O PTX causa a neuropatia periférica dependente da dose e do tempo de infusão (SCRIPTURE, C. D. et al. Peripheral Neuropathy Induced by Paclitaxel: Recent Insights and Future Perspectives Curr Neuropharmacol. 4(2): 165172, 2006). Já o uso da DXR é severamente limitado devido à possibilidade de ocorrência de mielossupressão, náuseas, alopecia, estomatite e principalmente cardiotoxicidade (VOLKIVA, M. e RUSSELL, R. Anthracycline Cardiotoxicity: Prevalence, Pathogenesis and Treatment. Curr.Cardiol. Rev, 7(4): 214-220, 2011; OCTAVIA, Y. et al. Doxorubicininduced cardiomyopathy: From molecular mechanisms to therapeutic strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology 52, 1213-1225, 2012; CARVALHO, F. S. Doxorubicin-lnduced Cardiotoxicity: From Bioenergetic Failure and Cell Death to Cardiomyopathy. Med Res Rev 34:106-135. 2013).

[05] A aplicação clínica do PTX é ainda restrita devido à sua baixa solubilidade em água, cerca de apenas 1 pg/mL. Para superar esse problema, o PTX tem sido comercializado sob o nome comercial de Taxol®, o qual é formulado com uma mistura 1:1 (v/v) de Cremophor EL (óleo de rícino polietoxilado) e etanol, na qual a solubilidade alcança cerca de 6 mg/mL. A quantidade de Cremophor EL por administração de Taxol é mais elevada do que a usualmente administrada com outros fármacos injetáveis comercializados. Os pacientes experimentam efeitos secundários graves, tais como reações de hipersensibilidade, atribuídas principal mente ao Cremophor EL. Dessa forma a administração do fármaco requer uma prémedicação composta por corticosteróides e bloqueadores de histamina.

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Para superar tais problemas, formulações nanoestruturadas, tais como lipossomas, nanopartículas lipídicas sólidas e nanopartículas poliméricas ganharam muita atenção na concepção de sistemas de entrega de PTX, pois evitam o uso de veículos tóxicos como o Cremophor EL, ganhando um valor clínico significativo (NOH, J; NAEEM, M; CAO, J; LEE, E. Η; KIM, M; JUNG, Y; YOO, J. Herceptin-functionalized pure paclitaxel nanocrystals for enhanced delivery to HER2-postive breast câncer cells. Intemational Journal of Pharmaceutics, v. 513, p. 543-553, 2016).

[06] A encapsulação lipossomal das antraciclinas, como a DXR, com o objetivo de alterar a distribuição tecidual e a farmacocinética, aumentando assim o seu índice terapêutico também é alvo de recentes esforços de pesquisa (ANAMPA, J; MAKOWER, D; SPARANO, J. A. Progress in adjuvant chemotherapy for breast câncer: an overview. BMC Medicine, 13:195, 2015; O’SHAUGHNESSY, J. A. Pegylated Liposomal Doxorubicin in the Treatment of breast câncer. Clinicai Breast Câncer, p. 318-328, V. 4, 2003; GABIZON, A.A; PATIL, Y; LA-BECK, N. New insights and evolving role of pegylated liposomal doxorubicin in câncer therapy. Drug Resistance Updates, p. 90-106, v. 29, 2016).

[07] No que se refere ao aparecimento de resistência, devido à crescente pré-exposição a antraciclinas e taxanos, cada vez mais mulheres têm desenvolvido câncer de mama metastático refratário a esses fármacos (DEAN-COLOMB, W. e ESTEVA, F. J. Emerging Agents in the Treatment of Anthracycline- and Taxane-Refractory Metastatic Breast Cancer.Semin Oncol 35 (Suppl 2):S31-S38® 2008). Para muitos pacientes, o uso da combinação PTX e DXR passa a não apresentar eficácia superior ao uso isolado de um desses agentes. Desse modo, o benefício da combinação para essas pacientes permanece incerto (ZENG, R. et al. Role of Taxane and Anthracycline Combination Regimens in the Management of Advanced

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Breast Câncer. A Meta-Analysis of Randomized Trials Medicine, Vol. 94, N.17,2015).

[08] Visando contornar o problema de resistência celular, terapias de combinação de quimioterápicos se tornaram padrão de tratamento para diversos tipos de câncer a partir de 1960, e hoje é sabido que essas são de alta importância para atingir erradicação e cura dos tumores (CHABNER, B. A.; ROBERTS, T. G. Chemotherapy and the war on câncer. Nat. Rev. Câncer, 2005, 5, 65-72; DEVITA, V. T.; CHU, E. A History of Câncer Chemotherapy. Câncer Res, 2008; 68(21), 8643-8653). O desenvolvimento de terapias de combinação baseadas no conceito de sinergismo de fármacos, entretanto, é uma tendência recente que começou a atrair atenção significativa apenas na primeira década deste século. Isso se deve ao fato de que estudos demonstraram que o completo potencial terapêutico dos fármacos combinados pode não estar sendo explorado, visto que diferentes razões dos mesmos fármacos combinados podem levar a sinergismo ou antagonismo quando testados in vitro em uma mesma linhagem celular (SUCHER, N. J. Searching for synergy in silico, in vitro and in vivo. Synergy (2014) 1, 30^13; MAYER, L.D.; JANOFF, A. S. Optimizing combination chemotherapy by controlling drug ratios. Mol. Interv., 2007, 7(4), 216 - 223). Junto a essa informação está a necessidade de controlar as razões dos fármacos que chegam ao sítio tumoral, o que não pode ser conseguido com a administração de um coquetel contendo os fármacos na forma livre. Por essa razão vem crescendo o interesse em nanocarreadores co-encapsulando razões fixas de fármacos. Esses carreadores permitem a entrega simultânea dos fármacos ao sítio tumoral garantindo que os efeitos observados in vitro se transponham para in vivo, otimizando a terapia de combinação (TARDI, P.G.; GALLAGHER, R.C.; JOHNSTONE, S.; HARASYM, N.; WEBB, M.; BALLY, M.B.; MAYER, L.D. Coencapsulation of irinotecan and floxuridine into low cholesterol-containing liposomes that

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5/30 coordinate drug release in vivo. Biochim. Biophys. Acta, 2007, 1768(3), 678-687).

[09] Especificamente para a combinação PTX e DXR, diferentes estudos relatam que razões sinérgicas são observadas quando a DXR se encontra presente em maior proporção molar em relação ao PTX (DUONG, Η. Η. P; YUNG, L.L. Synergistic co-delivery of doxorubicin and paclitaxel using multifunctional micelles for câncer treatment. Intemational Journal of Pharmaceutics, v. 454, p. 486- 495, 2013; WANG, H. et al. A synergistic combination therapy with paclitaxel and doxorubicin loaded micellar nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 116, 41—48, 2014; LIU, Y; FANG, J; KIM, J; WONG, Μ. K; WANG, P. Codelivery of Doxorubicin and Paclitaxel by Cross-Linked Multilamellar Liposome Enables Synergistic Antitumor Activity. Molecular Pharmaceutics, v. 11, p.1651-1661, 2014).

[010] Dessa forma, a co-encapsulação desses dois fármacos em razão que leve a sinergismo pode ser uma estratégia promissora visando melhorar a atividade antitumoral e reduzir a toxicidade da combinação. Dentre os nanossistemas mais conhecidos, estão os lipossomas, os quais são vesículas compostas por bicamadas concêntricas únicas ou múltiplas, encapsulando um compartimento aquoso. Estruturalmente, assemelham-se a membranas lipídicas de células vivas. O tamanho destas vesículas lipídicas, quase esféricas, pode variar de poucos nanômetros a vários micrômetros. No entanto, os lipossomas de uso clínico têm seu tamanho variando entre 50 e 450 nm (BOZZUTO, G., MOLINARI. Liposomes as nanomedical devices.Intemational Journal of Nanomedicine, V. 10, p. 975 999, 2015; MONTEIRO, N., MARTINS, A., REIS, R. L., NEVES, N.M. Liposomes in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of the royal society Interface, V. 11, 2014). Dentre a gama de nanossistemas possíveis para co-encapsulação de fármacos, os lipossomas têm demonstrado uma capacidade superior para manutenção da encapsulação

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6/30 de múltiplos fármacos com diferentes hidrofobicidades, e sua entrega simultânea ao local de ação, quando comparados a outros nanossistemas (LIU, Y; FANG, J; KIM, J; WONG, Μ. K; WANG, P. Codelivery of Doxorubicin and Paclitaxel by Cross-Linked Multilamellar Li poso me Enables Synergistic Antitumor Activity. Molecular Pharmaceutics, v. 11, p.1651-1661, 2014).

[011] Os lipossomas da presente invenção são fusogênicos e de circulação prolongada, sendo compostos de DOPE (dioleilfosfatidiletanolamina), CHEMS (hem isucci nato de colesterila) e DSPE-PEG (dioleilfosfatidiletanolamina acoplada ao polietilenoglicol) co-encapsulando PTX e DXR (LFCP-PTX+DXR). Os lipossomas carreiam razões fixas dos fármacos encapsulados, garantindo a chegada ao sítio tumoral da mesma razão fixa ótima estabelecida em testes In vitro. Esses lipossomas ainda têm a vantagem do direcionamento passivo aos tumores, baseado no efeito de permeabilidade e retenção aumentada existente na região tumoral (BARUA, S; MITRAGOTRI, S. Challenges associated with Penetration of Nanoparticles across Cell and Tissue Barriers: A Review of Current Status and Future Prospects. Nano Today, v. 9, p. 223-243, 2014; BAETKE, S.C; LAMMERS, T; KIESSLING, F. Applications of nanoparticles for diagnosis and therapy of câncer. BrJRadiol, V. 88, 2015).

[012] O DSPE-PEG presente na bicamada visa retardar a depuração dos lipossomas da circulação sanguínea mediante a formação de uma camada de hidratação externa nas vesículas, que atua como uma barreira estérica física contra a opsonização não específica por proteínas plasmáticas (opsoninas). Isso permite aumentar o tempo de circulação dos lipossomas na corrente sanguínea, facilitando o efeito de permeabilidade e retenção aumentada (QHATTAL, H.S.S.; HYE, T.; ALALI, A.; LIU, X. Hyaluronan Polymer Length, Grafting Density, and Surface Poly(ethyleneglycol) Coating

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Influence in Vivo Circulation and Tumor Targeting of Hyaluronan-Grafted Liposomes. Acsnano, V. 8, p. 5423-5440, 2014).

[013] Formulações lipossomais contendo DXR são hoje utilizadas na clínica para o tratamento do câncer de mama e foram recentemente revisadas por Lao e colaboradores (2013). Essas formulações apresentam papel importante pela manutenção da eficácia da DXR somada à redução do risco de cardiotoxicidade, efeito adverso mais grave desse fármaco (LAO, J. et al. Liposomal Doxorubicin in the Treatment of Breast Câncer Patients: A Review. Journal of Drug Delivery. Volume 2013 (2013)). Formulações lipossomais contendo PTX estão em diversos estágios clínicos e uma delas chegou a ser comercializada na China (KOUDELKA, S; TURÁNEK, J. Liposomal paclitaxel formulations. Journal of Controlled Release, p. 322334, v. 163, 2012).

[014] Lipossomas encapsulando ambos os fármacos em uma única vesícula lipossomal, conforme realizado na presente tecnologia apresentam benefícios diversos. A formulação de lipossomas individuais seguida de coadministração das duas formulações faz com que o tratamento seja extremamente oneroso devido ao alto custo inerente dos lípides, assim como de dois processos individuais de manufatura. Além disso, a coadministração de formulações independentes faz com que o paciente seja exposto a uma alta carga lipídica, o que já foi relacionado a efeitos adversos de infusão. A co-encapsulação elimina a possibilidade de interferência que uma população de lipossomas pode exercer sobre o perfil farmacocinético da outra, assim como a biodistribuição individual de duas formulações diferentes (TARDI, P.G.; GALLAGHER, R.C.; JOHNSTONE, S.; HARASYM, N.; WEBB, M.; BALLY, M.B.; MAYER, L.D. Coencapsulation of irinotecan and floxuridine into low cholesterol-containing liposomes that coordinate drug release in vivo. Biochim. Biophys. Acta, 2007, 1768(3), 678-687; HARASYM T.O., TARDI P.G., HARASYM N.L., HARVIE P.,

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JOHNSTONE S.A. & MAYER L.D. Increased preclinical efficacy of irinotecan and floxuridine coencapsulated inside liposomes is associated with tumor delivery of synergistic drug ratios. Oncol. Res., 2007, 16(8), 361374).

[015] Atividade antitumoral estatisticamente superior já foi observada para duas substâncias bioativas carreadas no mesmo lipossoma, em detrimento das mesmas substâncias bioativas co-administradas em lipossomas independentes, na mesma razão molar. Essa superioridade já foi também verificada para outros nanossistemas co-encapsulando fármacos em detrimento da mistura física dos nanossistemas individuais (ZUCKER, D.; BARENHOLZ, Y. Optimization of vincristine-topotecan combination — Paving the way for improved chemotherapy regimens by nanoliposomes. J. Control. Release, 2010, 146(3) 326-333; RIVIERE, K.; KIELERFERGUSON, H.M.; JERGER, K.; SZOKA, F.C.JR.. Anti-tumor activity of liposome encapsulated fluoroorotic acid as a single agent and in combination with liposome irinotecan. J. Control. Release, 2011, 153(3), 288-296/ LUO, S; GU, Y; ZHANG,Y; GUO, P; MUKERABIGWI,J. F; LIU, M; LEI, S; CAO,Y; HE,H; HUANG, X. Precise Ratiometric Control of Dual Drugs through a Single Macromolecule for Combination Therapy, 2015; LEE, S; O’HALLORAN,T. V; NGUYEN, S. T. AM. CHEM. SOC. 2010, 132, 17130-17138 Polymer-Caged Nanobins for Synergistic CisplatinDoxorubicin Combination Chemotherapy).

[016] Foram encontrados no estado da técnica documentos com tecnologias afins à presente tecnologia.

[017] O documento de patente US 20160256387 intitulado “Dual loaded liposomal pharmaceutical formulations” descreve lipossomas coencapsulando docetaxel e doxorrubicina, sendo que os mesmos são compostos, além dos fármacos, de um fosfolípido insaturado e um colesterol, podendo conter ou não um fosfolípide peguilado. Apesar de na

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9/30 descrição detalhada da patente constar uma lista de possíveis fosfolípides insaturados que podem ser usados, dentre eles o DOPE, este lípide não consta nos exemplos nem nas reivindicações. Ademais, na descrição detalhada a fosfatidilcolina é citada como o fosfolípide preferencial para a tecnologia, sendo ainda preferencialmente a 1,2-dioleil-sn-glicero-3fosfatidilcolina (DOPC). Finalmente, o documento supracitado inclui, na sua descrição detalhada, derivados de colesterol catiônicos, preferencial mente os aminados como o dimetilaminoetanocarbamoil-colesterol (DCcolesterol).

[018] Os lipossomas constituídos por DOPE devem apresentar na sua composição um agente estabilizante carboxilado. Dessa forma, não seria possível obter lipossomas aniônicos fusogênicos utilizando DOPE:DCCHOL, ou mesmo DOPE e qualquer outro colesterol catiônico, conforme o documento US 20160256387 supracitado. Lipossomas contendo DOPE:DC-CHOL seriam catiônicos e por isso não teriam características físico-químicas adequadas para liberação de fármacos nos sítios tumorais e/ou no meio intracelular (BATISTA, C. M. et al. Lipossomas e suas aplicações terapêuticas: Estado da arte. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 43, n. 2, p. 167-179, 2007) [019] O documento de patente CN103622912, intitulado “Doxorubicin hydrochloride-docetaxel or paclitaxel liposome preparation and preparation method thereof, descreve lipossomas coencapsulando docetaxel ou paclitaxel e doxorrubicina e seu processo de obtenção. Os lipossomas descritos são compostos por fosfolípides, colesterol, um antioxidante, um sacarídeo e um agente tamponante. O processo de obtenção dos referidos lipossomas consiste em obtenção de lipossomas carregados com docetaxel via hidratação de filme lipídico seguida de carregamento remoto de doxorrubicina via gradiente de sulfato de amônio. A patente não se refere,

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10/30 no entanto, a lipossomas compostos especificamente por DOPE, CHEMS, DSPE-PEG e os fármacos em questão.

[020] O preparo dos lipossomas contendo DOPE:CHEMS:DSPE-PEG e Paclitaxel/Doxorrubicina, relatado no documento CN103622912, supracitado, é necessário otimizar o processo com a inclusão da etapa de annealing. Sem esta etapa, conforme consta no estado da técnica, a estabilidade dos lipossomas obtidos é extremamente reduzida, ocorrendo a liberação quase imediata do paclitaxel. Também há falta de reprodutividade nos teores de encapsulação.

[021] A presente invenção consiste em lipossomas coencapsulando doxorrubicina e paclitaxel, sendo ainda os lipossomas compostos especificamente por DOPE, CHEMS e DSPE-PEG, além dos fármacos. A combinação dos lípides DOPE e CHEMS garante propriedade fusogênica aniônica às vesículas fazendo com que essas sejam superiores aos lipossomas convencionais, uma vez que são internalizados pelas células de forma mais eficaz. Este fenômeno pode ser explicado pela elevada afinidade dos lipossomas para aderir às membranas celulares, devido à porção polar das moléculas de fosfatidiletanolamina que apresentam reduzido tamanho e se hidratam dificilmente, o que resulta em agregação dessas membranas.

[022] Os lipossomas obtidos são, portanto, fusogênicos e de circulação prolongada. Ao encapsular PTX e DXR em lipossomas aniônicos fusogênicos de circulação prolongada (LFCP), os dois agentes não são mais metabolizados e eliminados independentemente e, sim, como uma unidade, com características farmacocinéticas ditadas pelas vesículas.

[023] Nos lipossomas da presente invenção, as bicamadas lipídicas acomodam o PTX, que é uma molécula hidrofóbica, volumosa e assimétrica. O posicionamento do PTX nessa região representa uma etapa meta-estável que tende a transformar-se numa forma cristalina mais estável

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11/30 (KOUDELKA, S; TURÁNEK, J. Liposomal paclitaxel formulations. Journal of Controlled Release, p. 322-334, v. 163, 2012). O núcleo aquoso comporta a DXR, que é hidrofílica. Para conseguir um bom ajuste das concentrações intra-lipossomais desse fármaco, garantindo a obtenção de lipossomas com as razões fixas desejadas de PTX e DXR, o carregamento remoto por gradiente transmembrana foi utilizado para encapsular a DXR. Uma vez que a DXR é uma base fraca muito solúvel em água, características estruturais que permitem a permeação e a difusão através da bicamada lipídica, foi possível realizar o carregamento remoto de forma eficaz, resultando em acúmulo do fármaco no interior dos lipossomas (CERN, A; GOLBRAIKH, A; SEDYKH, A; TROPSHA, A; BARENHOLZ, Y; GOLDBLUM, A. Quantitative structure - property relationship modeling of remote liposome loading of drugs. Journal of Controlled Release, p. 147157, v. 160, 2012). O carregamento remoto foi possível devido a um gradiente transmembrana criado por sulfato de amônio. Dessa forma a DXR atravessa a membrana lipossomal por difusão passiva e atinge o seu interior aquoso, onde interage com o contra íon (sulfato), o qual leva à precipitação do sal da DXR aprisionando-a no interior dos lipossomas Esse método garante altos teores de encapsulação para a DXR, permitindo o ajuste de sua concentração a partir da concentração de PTX encapsulado (ZUCKER, D; MARCUS, D; BARENHOLZ, Y; GOLDBLUM, A. Liposome drugs' loading efficiency: A working model based on loading conditions and drug's physicochemical properties. Journal of Controlled Release, p. 73-80, v. 139, 2009).

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [024] A Figura 1 são as fotomicrografias obtidas por microscopia de força atômica em diferentes campos. Sendo que (A) corresponde aos lipossomas fusogênicos coencapsulando paclitaxel e doxorrubicina e as vesículas analisadas apresentaram diâmetro de 169,7 nm. Enquanto que (B)

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12/30 corresponde aos lipossomas fusogênicos brancos (sem fármacos) e as vesículas analisadas apresentaram diâmetro de 175, 8 nm.

[025] A Figura 2 são as fotomicrografias obtidas por MET em diferentes campos. Sendo que (A) corresponde aos lipossomas fusogênicos coencapsulando paclitaxel e doxorrubicina e (B) corresponde aos lipossomas fusogênicos brancos (sem fármacos).

[026] A Figura 3 é a representação gráfica do perfil de liberação de paclitaxel (PTX) em função do tempo em difrentes valores de pH.

[027] A Figura 4 é a representação gráfica do perfil de liberação de doxorrubicina (DXR) em função do tempo em difrentes valores de pH.

[028] A Figura 5 é a representação gráfica da variação do volume tumoral para os grupos tratados em relação ao tempo e a razão de inibição (RI) do tumor por grupo de tratamento. Os diferentes tratamentos avaliados foram, da esquerda para a direita, lipossomas sem fármaco (Lipo branco), doxorrubicina livre (DXR livre), lipossomas encapsulados com doxorrubicina (Lipo DXR), paclitaxel livre (PTX livre), lipossomas encapsulados com paclitaxel (Lipo PTX), mistura física de doxorrubicina e paclitaxel (DXR+PTX livre) e lipossomas coencapsulados com doxorrubicina e paclitaxel (Lipo DXR+PTX).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA [029] A presente invenção consiste em lipossomas caracterizados por conter dioleilfosfatidiletanolamina, hemisuccinato de colesterila, dioleilfosfatidiletanolamina acoplada ao polietilenoglicol, paclitaxel ou docetaxel e doxorrubicina. A invenção se refere ainda ao processo de obtenção dos lipossomas supracitados, às composições contendo os lipossomas e ao uso tanto dos lipossomas quanto das composições para preparação de medicamentos antitumorais.

[030] Os lipossomas da presente invenção são caracterizados por conter dioleilfosfatidiletanolamina, hemisuccinato de colesterila,

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13/30 dioleilfosfatidiletanolamina acoplada ao polietilenoglicol, paclitaxel (PTX) ou docetaxel (DTX) e doxorrubicina (DXR). Ainda, os lipossomas são fusogênicos e contém razões molares fixas de PTX:DXR ou DTX:DXR de 1:1 a 1:11, sendo preferencialmente de 1:10. O diâmetro médio dos lipossomas da presente invenção está entre 50 e 400 nm, sendo preferencialmente de 210 a 280 nm.

[031] A invenção se refere ainda a composições farmacêuticas contendo os lipossomas supracitados e excipientes farmacológica e farmaceuticamente aceitáveis. A invenção também inclui o uso, tanto dos lipossomas quanto das composições para preparação de um medicamento para tratamento de tumores.

[032] O processo de obtenção dos lipossomas da presente invenção contém as seguintes etapas:

a) Colocar em recipiente adequado soluções clorofórmicas de DOPE, CHEMS e DSPE-PEG2000 na proporção molar de 5,7:3,8:0,5 a 6,5:3,0:0,5 e concentração lipídica total igual a 10 a 40 mmol/L;

b) adicionar paclitaxel ou docetaxel para concentração final de 0,25 a 1,0 mg/mL;

c) remover o solvente em evaporador rotativo acoplado a sistema de geração de vácuo;

d) manter o filme lipídico sob atmosfera de clorofórmio por no mínimo 1 hora;

e) adicionar ao filme lipídico quantidade suficiente de solução alcalina para promover a completa ionização do CHEMS;

f) adicionar solução de sulfato de amônio (pH~7,4) previamente aquecida a 40 a 50°C;

g) manter a mistura em banho de ultrassom por 10 a 20 minutos; seguido de diálise por 12 a 24 horas contra tampão HEPES;

h) centrifugar;

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i) determinar a concentração de PTX ou DTX nos lipossomas por análise quantitativa e, com base no valor encontrado, determinar a quantidade de DXR a ser adicionada de modo a obter lipossomas com razões molares fixas;

j) manter a formulação em contato com a DXR por 2 a 4 horas, numa temperatura de 25 a 30 °C;

k) dialisar contra tampão HEPES por 12 a 24 horas.

[033] Na etapa “e” do processo descrito acima, a solução alcalina é preferencialmente de NaOH 0,1 mol/L. Na etapa “h” a centrifugação ocorre preferencialmente de 3000 a 5000 xg durante 10 minutos, em temperatura de 25 °C. Na etapa “i” a razão molar fixa de paclitaxekdoxorrubicina ou docetaxekdoxorrubicina é de 1:1 a 1:11, sendo preferencialmente de 1:10.

[034] A presente invenção pode ser mais bem compreendida pelos seguintes exemplos, não limitantes.

Exemplo 1 - Preparo de lipossomas fusogênicos de circulação prolongada co-encapsulando paclitaxel e doxorrubicina (LFCPPTX+DXR) [035] Alíquotas de soluções clorofórmicas de DOPE, CHEMS e DSPEPEG2000 (proporção molar igual a 5,7:3,8:0,5, respectivamente, e concentração lipídica total igual a 10 mmol.L'¹) e PTX (concentração final no lipossoma de 0,25 mg/mL) foram transferidas para um balão de fundo redondo. O solvente foi removido utilizando um evaporador rotativo da marca BuchiLabortechnik AG, modelo R-215, acoplado a uma bomba de vácuo de mesma marca, modelo V-700 (Flawil, Suíça).O filme lipídico obtido foi então mantido por 1 hora sob atmosfera de clorofórmio, para melhor dispersão do PTX nos lípides, segundo a técnica denominada “annealing. Ao filme lipídico obtido foi adicionada quantidade suficiente de solução de NaOH (0,1 mol.L'¹) para promover a completa ionização do CHEMS. Em seguida, adicionou-se uma solução de sulfato de amônio (pH

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7,4) previamente aquecida a 50°C e a mistura foi mantida em banho de ultrassom por 10 minutos para hidratação do filme lipídico. Os lipossomas foram mantidos em diálise por 24 horas contra tampão HEPES para remoção do sulfato de amônio não encapsulado. O PTX não encapsulado foi então separado dos lipossomas por centrifugação (centrífuga Heraeus Multifuge X1R, Thermo Fischer Scientific, Massachusetts, EUA) a 5000 XG, a 25 °C, durante 10 minutos para a obtenção dos lipossomas purificados.

[036] Esses lipossomas tiveram a concentração de PTX determinada por análise em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), e em seguida, foi determinada a quantidade de DXR a ser adicionada de modo a obter lipossomas com razões molares fixas de PTX:DXR de 1:10.Para a incorporação da DXR na formulação foi utilizado o método de encapsulação remota por gradiente de sulfato de amônio. Após manutenção por 2 horas da formulação em contato com a DXR, numa temperatura de 25°C, os lipossomas foram novamente dialisados contra tampão HEPES por 24 horas, para remoção da DXR não encapsulada.

Exemplo 2 - Determinação do diâmetro, índice de polidispersão e potencial zeta dos LFCP-PTX+DXR [037] O diâmetro das vesículas e o índice de polidispesão (IP) foram determinados por espalhamento dinâmico da luz (DLS) utilizando o equipamento Zetasizer 3000 HSA (Malvern, Inglaterra). As medidas foram efetuadas em temperatura de 25°C, utilizando um ângulo de incidência do laser de 90°. O potencial zeta (PZ) das vesículas foi determinado por DLS associado à mobilidade eletroforética utilizando o mesmo equipamento. Para a realização de ambas as medidas, 50 pL de lipossomas foram diluídos em 1,5 mL de tampão HEPES. As medidas foram feitas em triplicata e os resultados foram apresentados como a média ± desvio

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16/30 padrão. As características físico-químicas dos LFCP-PTX+DXR são apresentadas na Tabela 1.

Tabela 1: Características físico-químicas dos LPCP-PTX+DXR

Parâmetros avaliados
Diâmetro Médio (nm)	244,4 ± 28,1
índice de Polidispersão	0,29 ± 0,01
Potencial Zeta (mV)	-4,97 ± 0,64

Cada valor representa a média ± desvio padrão (n = 3) [038] O diâmetro médio por intensidade encontrado para essa formulação foi de 244 ± 28 nm. Este tamanho está dentro da faixa de diâmetros de nanopartículas indicada na literatura como adequadas à aplicação em terapias antineoplásicas que é entre 50 e 400 nm.

[039] O IP inferior a 0,4 indica uma homogeneidade na distribuição de tamanho dos lipossomas (RAMADASS , S. K; ANANTHARAMAN , N. V; SUBRAMANIAN , S; S IVAS UB RAM ΑΝΙΑΝ , S MADHAN, B.

Paclitaxel/Epigallocatechingallate co loaded liposome: A synergistic delivery to control the invasiveness of MDA-MB-231 breast câncer cells. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, p. 65-72, v. 125, 2015). Essa característica somada ao tamanho encontrado das vesículas, o qual foi citado acima, possibilitam o uso endovenoso da formulação.

[040] O PZ apresentou-se próximo à neutralidade, com valor médio de 4,97 ± 0,64 mV, conforme esperado para formulações contendo PEG em sua bicamada lipídica. A presença de fosfolípides derivados do PEG na superfície dos lipossomas faz com que o potencial zeta medido para essas partículas seja próximo da neutralidade. Isso pode ser explicado pelo fato do plano de deslizamento ser movido para mais longe da superfície dos

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17/30 lipossomas e, consequentemente, ocorre a redução do PZ. Além disso, o arraste causado pela presença de cadeias de PEG na superfície dos lipossomas reduz sua mobilidade, reduzindo o potencial zeta (Azonanotechnology article).

Exemplo 3 - Avaliação do tamanho, morfologia, superfície e lamelaridade dos LFCP-PTX+DXR por microscopia de força atômica (FA) e microscopia eletrônica de transmissão (MET) [041] As amostras foram diluídas em água ultrapura, sendo 50 μΙ_ de amostra para 1,5 mL de água ultrapura. Uma gota dessa mistura foi colocada sobre uma lâmina para microscopia e seca com argônio. As imagens foram obtidas no modo de derivação, utilizando sondas comerciais de silício de 228 pm de comprimento, modo intermitente, com frequências de ressonância de 75-98 kHz, constantes de mola de 29-61 N / m e raio de curvatura nominal de 5nm a 10nm. A frequência de varredura utilizada foi de 1 Hz.

[042] As análises de MET foram realizadas no Centro de Microscopia da UFMG no equipamento Microscópio Eletrônico de Transmissão Tecnai G212 - SpiritBiotwin FEI -120 kV. As amostras foram coradas com solução de contraste contendo ácido fosfotúngstico 2% (p/v), albumina sérica bovina 0,5% (p/v) e sacarose 0,5% (p/v).

[043] As imagens de FA e MET, representadas nas Figuras 1 e 2, mostraram que os lipossomas apresentam forma esférica, sem agregação ou fusão, monodispersos e homogêneos. O tamanho dos lipossomas foi correlacionado com os valores medidos pelo método de dispersão dinâmica da luz (DLS), sendo os valores encontrados próximos em todas as técnicas. As imagens dos lipossomas por MET mostram uma forma esférica com contorno nítido de vesículas multilamelares, com várias bicamadas lipídicas, essa estrutura é confirmada na Figura 2.

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Exemplo 4 - Análise do teor de encapsulação de PTX e DXR nos LFCPPTX+DXR [044] A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi utilizada como método de doseamento do PTX. O equipamento utilizado é composto de uma bomba modelo 515, um autoinjetor modelo 717 Plus e um detector DAD modelo 2996 (Waters Instruments, Milford, EUA), conectado a um computador apresentando o software Empower, versão 2.0. Para a separação do PTX utilizou-se como fase estacionária a coluna Hibar 250-4 LiChrospher 100RP-18, 25 cm x 4 mm, 5pm (Merck, Darmstadt, Alemanha). O sistema eluente utilizado foi constituído por acetonitrila:água (55:45) em um fluxo igual a 1,2 mL/min. O volume de injeção foi de 10 pL e o tempo de corrida igual a 8 minutos. O material eluído foi detectado em comprimento de onda igual a 227 nm a temperatura ambiente. O teor de encapsulação (TE) do PTX foi calculado de acordo com a seguinte equação:

TE = ΓΡΤΧ presente nos L lipossomas purificados] x 100 [PTX presente nos lipossomas não purificados] [045] A espectrofotometria UV-VIS (Espectrofotômetro Thermo Evolution 201 UV, Waltham, Massachusetts, EUA) foi utilizada como método de doseamento da DXR. As análises foram realizadas avaliando a absorbância em comprimento de onda de 480 nm. Inicialmente, a membrana lipídica das vesículas foi aberta com álcool isopropílico na proporção 1:2, respectivamente, e em seguida, as preparações foram diluídas em tampão HEPES. O teor de encapsulação (TE) da DXR foi calculado de acordo com a seguinte equação:

TE =fDXR presente nos lipossomas purificados] x 100 [DXR presente nos lipossomas não purificados]

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19/30 [046] O método de encapsulação da DRX mediante o emprego do gradiente remoto de sulfato de amônio se mostrou eficaz, uma vez que o teor encontrado para este fármaco dentro das vesículas foi de aproximadamente 90%. Por outro lado, o PTX obteve uma encapsulação um pouco menor, por volta de 74%. No entanto, a razão molar entre os fármacos se manteve 1:10,9 e ficou bastante próximo da razão inicialmente proposta (1:10). Esses dados podem ser observados na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2: Características químicas dos LPCP-PTX+DXR

Parâmetros avaliados	Paclitaxel	Doxorrubicina
Concentração (mg / mL)	0,18 ±0,01	1,25 ±0,05
Teor de encapsulação (%)	74,1 ± 1,8	89,6 ± 12,3
Razão molar entre PTX /	1	: 10,9
DXR

Cada valor representa a média ± desvio padrão (n = 3).

Exemplo 5 - Avaliação da estabilidade dos LFCP-PTX+DXR [047] As amostras foram mantidas em geladeira, em temperatura entre 5 a 8°C, em frascos de penicilina âmbar com atmosfera de nitrogênio. A estabilidade da formulação foi avaliada nos tempos de 7, 15, 30, 60 e 90 dias. Após cada tempo do estudo as amostras foram verificadas quanto ao teor de retenção para ambos os fármacos presentes nas vesículas, diâmetro médio, IP e PZ. Para o doseamento do PTX as amostras foram submetidas a centrifugação a 25°C, 5000 XG durante 10 minutos antes da análise por CLAE. Essa etapa objetiva purificar a amostra, uma vez que elimina o PTX que foi expulso das vesículas durante o tempo de armazenamento. Já nas amostras em que a DXR foi dosada, inicialmente

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20/30 foi realizada um diálise por 24 horas para eliminar a DXR que foi expulsa das vesículas durante o tempo de armazenamento.

[048] A manutenção do tamanho das vesículas, índice de polidispersão, teor de encapsulação, razão molar entre os fármacos encapsulados e PZ, após um mês do preparo, em temperatura entre 5 - 8°C provaram a estabilidade da formulação durante esse período. Foi verificada uma tendência dos LFCP-PTX+DXR de permanecerem estáveis por 60 dias, enquanto que para o tempo de 90 dias existiu uma tendência a alterações físico-químicas na formulação e mudanças na sua estrutura, como demonstrado na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3: Estudo de estabilidade dos LFCP - PTX+DXR

Tempo 0 dias 7 dias 15 dias 30 dias 60 dias 90 dias

Doseamento	0,18 +	0,13 +	0,14 +	0,14 +	0,13	0,14
PTX (mg/mL)	0,01	0,01	0,01	0,01	0,13	0,16
Doseamento	1,25 +	0,94+	0,99 +	0,99 +	0,99	0,76
DXR	0,05	0,21	0,09	0,05	0,94	0,89
(mg/mL)
% Teor de	74,1 +	72,3+ 8,3	78,1 +	77,0 +	68,0	75,9
retenção	1,8		10,9	4,6	70,5	85,8
PTX
% Teor de	89,6 +	74,6+	78,7 +	78,7 +	82,3	63,6
retenção	12,3	15,4	5,0	4,5	72,5	69,0
DXR
Diâmetro	244,4 +	203,4+	211,4 +	213,1 +	203,1	214,1
(nm)	28,0	2,3	2,4	0,6	192,8	207
índice de	0,29 +	0,25+	0,24 +	0,27 +	0,28	0,28
polidispersã	0,01	0,01	0,01	0,01	0,29	0,27
o

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Potencial -5,0+ -3,0+0,1 -3,4+ -2,9+ -3,0 -2,5 zeta (mV) 0,6 0,3 0,4 -2,8 -3,9

A unidade amostrai utilizada foi de três experimentos (n=3) e os resultados foram expressos como média ± desvio padrão, exceto para os intervalos de tempo de 60 e 90 dias, para os quais o n=2 e os resultados foram apresentados individualmente por amostra. Análise estatística dos dados até o tempo de 30 dias foi feita por ANOVA e pós-teste de Tuckey com p<0,05.

[049] Os valores do IP, inferiores a 0,3 indicam a permanência da homogeneidade da população das vesículas, reforçando a estabilidade da formulação. Os valores de PZ mantidos próximo a neutralidade, conforme esperado para esse tipo de formulação, durante os 30 dias de estocagem, demonstram que não ocorreram fenômenos físico-químicos que acarretassem na alteração da carga superficial das vesículas. Os valores de PZ mostram tendência das vesículas não sofrerem alteração também após 90 dias do preparo.

[050] O teor de retenção foi elevado para ambos os fármacos, em torno de 80%, em relação ao tempo 0 (zero). Além disso, a relação molar entre PTX e DXR se manteve bem próxima ao desejado (1:10) durante o período citado. Dessa forma, mesmo após um mês de armazenamento, a formulação quando utilizada, garantirá a entrega simultânea dos fármacos em proporção adequada na região tumoral. Uma tendência a redução da encapsulação da DXR foi observada somente após 90 dias do preparo.

Exemplo 6 - Avaliação da liberação de PTX e DXR a partir dos LFCPPTX+DXR [051] O estudo de liberação foi realizado em dois diferentes pH, sendo eles 5 e 7,4. Para as duas condições de pH, o estudo foi realizado de maneira semelhante. Foi colocado 1ml_ de formulação em membrana de diálise com as duas extremidades vedadas. A membrana foi inserida em um frasco de xarope âmbar, contendo 100 mL de tampão HEPES acrescido de Tween 80 (1% p/v), garantindo assim a condição sink para ambos os fármacos. No

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22/30 caso do estudo em pH 5, o pH da solução receptora foi ajustado até este valor utilizando ácido clorídrico 1M. Para cada tempo de investigação (0, 4, 8, 12, 24, 36 horas) existiu um frasco correspondente. Os frascos foram mantidos em incubadora IKA KS 4000 i control a 37°C, sob agitação de 156 rpm. Posteriormente a cada tempo de investigação, uma amostra foi retirada do interior da membrana de diálise e procedeu-se com a caracterização das mesmas para os parâmetros de diâmetro médio, IP e teor de retenção.

[052] O comportamento das vesículas referente a liberação dos fármacos PTX e DXR foi avaliado no pH 7,4 para se ter um indicativo de como seria a liberação dos fármacos in vivo, na circulação sanguínea, uma vez que este pH mimetiza o pH sanguíneo. O estudo de liberação também foi realizado em pH 5, esperando que em meio ácido a liberação do conteúdo lipossomal seria aumentada em relação a do pH fisiológico, no qual este tipo de lipossoma é estável.

[053] Para ambos os pH estudados, os fármacos PTX e DXR inicialmente apresentaram uma liberação com um leve efeito burst nas primeiras 8 horas. Para o pH de 7,4, a liberação de DXR após 4 horas foi de 16,6 % e no final das 36 horas foi de 39 %, enquanto no pH 5 esses valores foram 22,7 % e 42,9 %, respectivamente. Já para o PTX em pH 7,4, nas primeiras horas ocorreu uma liberação de 12,5 % e em 36 horas subiu para 29,4 %. No pH 5 essa liberação foi de 10,3 % e 34,2, %, respectivamente. Estes resultados podem ser observados nos gráficos das Figuras 3 e 4.

[054] A liberação dos fármacos co-encapsulados a partir dos lipossomas, para ambos os pH estudados, foi lenta, aproximadamente 40% de DXR e 30% de PTX após 36 horas de estudo. Dessa forma, não foi observado pH sensibilidade dos lipossomas, uma vez que a liberação do conteúdo em pH não foi significativamente maior quando comparado ao pH 7,4.

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23/30 [055] Apesar da perda da pH sensibilidade, os lipossomas compostos de DOPE:CHEMS ainda são superiores aos lipossomas convencionais, uma vez que são internalizados pelas células de forma mais eficaz, sendo também denominados lipossomas fusogênicos. Este fenômeno pode ser explicado pela sua elevada afinidade para aderir às membranas celulares, devido à parte polar do fosfolípide PE que ocupa pequeno volume e possui baixa capacidade de hidratação, o que resulta em agregação dessas membranas (LIU, X; HUANG, G. Formation strategies, mechanism of intracellular deli ve ry and potential clinicai applications of pH-sensitive liposomes. Asian joumal of pharmaceutical sciences, p. 319 - 328, v. 8, 2013).

[056] Durante todos os tempos avaliados no estudo de liberação a razão molar entre os fármacos PTX e DXR se manteve próximo ao que foi predeterminado para esta formulação (1:10), não apresentando diferença significativa entre as razões, como pode ser verificado na Tabela 4. Dessa forma esse ensaio in vitro mostra que o nanocarreador escolhido foi capaz de manter a razão molar fixa entre os fármacos sendo um indicativo que após uma administração intravenosa da formulação, a entrega simultânea entre PTX e DXR acontecerá na região tumoral na razão fixa ótima para um possível sinergismo, levando a ganhos na eficácia terapêutica.

Tabela 4: Razões molares entre PTX e DXR em função do tempo e do pH nas amostras dos estudos de liberação dos fármacos

	t= 4h	t= 8h	t= 12h	t= 24h	t= 36h
PH 7,4	1 : 10,6	1 : 10,2	1 : 10,2	1 : 10,1	1 : 9,9
pH 5	1 : 9,6	1 : 9,1	1 : 9,4	1 : 9,8	1 : 10,0

[057] Diante dos dados obtidos nos estudos de caracterização química e físico-química da formulação lipossomal, podemos afirmar que os LFCPPetição 870170063796, de 30/08/2017, pág. 32/45

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PTX+DXR representam uma plataforma adequada para a entrega de PTX e DXR, e prosseguir com os estudos biológicos in vitro e in vivo seria favorável.

Exemplo 7 - Avaliação da citotoxicidade de LFCP-PTX+DXR contendo diferentes razões molares de PTX e DXR frente a linhagens de tumor de mama humano [058] Para avaliação da citotoxicidade das diferentes formulações frente a linhagens tumorais de mama humano, as células foram plaqueadas em diferentes densidades (10000 células para a linhagem MCF-7 e 6000 células para a linhagem MDA-MB-231) por poço, em placas de 96 poços, e mantidas em estufa por cerca de 24 horas antes da exposição aos tratamentos. Para determinação da concentração inibitória de 70% (IC70), as células foram expostas a concentrações diferentes de PTX, DXR, lipossomas fusogênicos contendo paclitaxel (LFCP-PTX), lipossomas fusogênicos contendo DXR (LFCP-DXR), PTX+DXR livre ou LFCPPTX+DXR (razões molares de 10:1, 1:1 ou 1:10) por 48 horas. Ao final do tempo de incubação, os tratamentos foram removidos e foram adicionados 100 pL de MTT em concentração final de 0,5 mg/mL e as células foram incubadas por 2 horas a 37°C. O meio contendo MTT foi então removido e foram adicionados 100 pL de DMSO para solubilização dos cristais de formazan. As células viáveis foram quantificadas usando detecção a 570 nm em um espectrofotômetro de placas modelo Benchmark Plus (Bio-Rad , Califórnia, EUA). Todas as análises foram feitas em quadruplicata de poços e triplicata de placas. A determinação da IC₇₀ foi feita com auxílio do software CalcuSyn® e os resultados são demonstrados na Tabela 5.

Tabela 5 : Determinação dos valores de IC₇₀ para diferentes tratamentos frente as linhagens celulares MCF-7 e MDA-MB-231

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	IC70	MCF-7	MDA-MB-231
PTX (μΜ)	DXR (μΜ)	PTX (μΜ)	DXR (μΜ)
	PTX livre	>5,0	-	>8,0	-
	DXR livre	-	2,09 + 0,12	-	5,74+ 0,61
10:1	PTX/DXR livre	>4,54	>0,45	>9,6	>0,96
1:1	PTX/DXR livre	1,18 + 0,12	1,18 + 0,12	2,27 + 0,24	2,27 + 0,24
1:10	PTX/DXR livre	0,15 + 0,00	1,50 + 0,03	0,28 + 0,05	2,82 ± 0,48
	LFCP-PTX	1,37 + 0,14	-	>8,0	-
	LFCP-DXR	-	2,46 ± 0,33	-	7,13+ 0,27
10:1	LFCP-PTX+DXR	>4,54	>0,45	14,15+ 1,36	1,41+0,13
1:1	LFCP-PTX+DXR	1,86 + 0,17	1,86 + 0,17	4,43+ 0,66	4,43 + 0,66
1:10	LFCP-PTX+DXR	0,15+ 0,03	1,54 + 0,31	0,58+ 0,03	5,84+ 0,35

[059] Como pode ser observado na Tabela 5, para ambas as linhagens os tratamentos com PTX+DXR livres em razões molares combinatórias de 1:1 e 1:10 permitiram redução significativa de ambos os fármacos para atingir a IC₇₀ (p<0.05). No que se refere aos fármacos encapsulados individualmente e co-encapsulados, para a linhagem MCF-7, apenas a razão molar de 1:10 permitiu a redução de ambos os fármacos, enquanto para a linhagem MDAMB-231, essa redução foi observada para as razões 1:1 e 1:10 (p<0.05). As IC₇₀ para os tratamentos contendo apenas PTX não foram atingidas, com exceção dos LFCP-PTX para a linhagem MCF-7. Assim como as IC₇₀ para os tratamentos contendo maior proporção molar de PTX em relação a DXR (10:1), com exceção dos LFCP-PTX+DXR (10:1) para a linhagem MDA-MB231. Apesar disso, é possível observar que uma quantidade maior de fármacos é necessária para atingir a IC70 quando a razão PTX:DXR é igual a 10:1 comparativamente a 1:1 ou 1:10. Esses resultados estão de acordo com outros estudos (WANG, 2011; Ll, 2014; DUONG, 2013; WANG, 2014 e LIU, 2014) onde efeito sinérgico entre PTX e DXR foi observado quando a DXR está presente em maior proporção na combinação.

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Exemplo 8 - Avaliação da atividade antitumoral dos LFCP-PTX+DXR co-encapsulando PTX:DXR em razão molar de 1:10 em modelo de tumor de mama murino [060] Para avaliação da atividade antitumoral da formulação foi escolhido como modelo animal camundongos Balb/c acometidos por tumor murino da linhagem celular de mama 4T1. Esse modelo foi selecionado pela facilidade de manutenção dos animais associado ao baixo custo experimental quando comparado ao uso de animais imunossuprimidos com xenoenxerto. Foi então inicialmente verificado o potencial citotóxico dos LFCP-PTX+DXR na linhagem celular 4T1. As células foram plaqueadas em densidades de 5x10³ células por poço, em placas de 96 poços, e mantidas em estufa por cerca de 24 horas antes da exposição aos tratamentos, por 72 horas. A dose total de fármacos para os diferentes tratamentos foi sempre de 2000 nM, sendo esses: PTX (2000nM), DXR (2000nM), LFCP-PTX (2000nM), LFCP-DXR (2000nM), PTX+DXR (1:10 = 182:1818nM) e LFCP-PTX+DXR (1:10 = 182:1818 nM). Ao final das 72 horas de incubação, os tratamentos foram removidos e foram adicionados 100 pL de MTT em concentração final de 0,25 mg/mL e as células foram incubadas por 2 horas a 37°C. O meio contendo MTT foi então removido e foram adicionados 100 pL de DMSO para solubilização dos cristais de formazan. As células viáveis foram quantificadas usando detecção a 570 nm em um espectrofotômetro de placas modelo Benchmark Plus (Bio-Rad , Califórnia, EUA). Todas as análises foram feitas em quadruplicata de poços e triplicata de placas. A porcentagem de inibição da proliferação celular para cada um dos tratamentos é demonstrada na Tabela 6. Observou-se que o potencial citotóxico foi mantido após encapsulação de PTX ou DXR em LFCP tanto para os fármacos avaliados individualmente como para a mistura dos mesmos. Esse resultado permitiu a execução da avaliação da atividade antitumoral no modelo animal selecionado.

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Tabela 6: Inibição da proliferação de células 4T1 de acordo com os tratamentos realizados em estudo de citotoxicidade

Tratamentos	Concentração dos fármacos PTX / DXR (nM)	Inibição da proliferação celular (%)
PTX livre	2000	53,6 ± 0,02
DXR livre	2000	97,0 ± 0,01
PTX + DXR livre (razão	182	98,1 ±0,02
molar 1:10)	1818
LFCP-PTX	2000	52,4 ± 0,02
LFCP-DXR	2000	96,6 ± 0,01
LFCP-PTX+DXR (razão	182	99,1 ± 0,01
molar 1:10)	1818

[061] Camundongos Balb/c fêmeas entre 8-10 semanas de vida (aproximadamente 20 g) foram adquiridos do Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências Biológicas - CEBIO, da Universidade Federal de Minas Gerais. Os animais foram alojados em gaiolas de plástico, mantidos em ambiente com controle de ciclo de luz e ventilação e tiveram livre acesso a ração e água. Os estudos in vivo foram realizados sob aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFMG - Protocolo 6/2016. Para desenvolvimento do tumor, 2,5x10⁶ células em 100μΙ_ de meio de cultura incompleto foram inoculados no flanco esquerdo de cada animal. No sétimo dia após o inóculo, os animais com tumores entre 70 e 140 mm³ foram divididos em sete grupos para receber os diferentes tratamentos, com mesma quantidade total em moles de fármacos: DXR (4mg/Kg); PTX (6,3 mg/Kg); DXR + PTX (3,64 mg/Kg + 0,57 mg/Kg - razão molar 10:1);

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LFCP-DXR (4 mg/Kg); LFCP-PTX (6,3 mg/Kg); LFCP-DXR+PTX (3,64 mg/Kg + 0,57 mg/Kg - razão molar 10:1); LFCP-Branco (controle). Os tratamentos foram administrados por via endovenosa caudal, com intervalo de três dias entre as doses, em um total de quatro administrações. Os animais foram acompanhados quanto ao peso e medidas quantitativas do volume tumoral durante todo o período do experimento, em intervalos de dois dias, e eutanasiados por deslocamento cervical ao final do experimento (vinte dias após a inoculação).

[062] Após medição do nódulo tumoral dos animais utilizando como ferramenta um paquímetro, o volume tumoral foi calculado de acordo com a fórmula apresentada abaixo, onde d1 é o maior diâmetro do tumor, d2 é o menor diâmetro do turmor e d1 e d2 são perpendiculares entre si (Mitutoyo,Tóquio, Japão) (ROLLANDef al., 2009).

VT = 0,5x(d1 xd2²) [063] A razão de inibição do crescimento do tumor (RI) foi calculada a partir do volume tumoral relativo (VTR) (LEITE etal., 2012). As duas fórmulas são dadas abaixo, sendo D20 o último dia de mensuração do tumor e D0 o primeiro dia de mensuração do tumor.

VTR = Volume tumoral D20

Volume tumoral D0

RI (%) = 1 - Média do VTR do grupo tratado X 100

Média do VTR do grupo controle [064] O VT e a RI determinados no estudo são apresentados na Figura 5. Os dados de VTR de cada animal foram utilizados para análise estatística

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29/30 comparativa dos grupos. Os dados de VTR foram avaliados quanto a normalidade e homocedasticidade pelo teste KS e D’Agostino e Pearson e posteriormente submetidos a análise de variância (ANOVA) seguido do pós-teste de Tuckey.

[065] Foi possível verificar que, com esse esquema de tratamento, não houve inibição significativa do crescimento tumoral (p>0.05) com DXR ou LFCP-DXR, comparativamente ao controle. Embora o PTX tenha se mostrado menos citotóxico que a DXR in vitro frente à linhagem 4T1, os tratamentos com PTX e com LFCP-PTX levaram a inibição significativa do crescimento tumoral comparativamente ao controle (p<0.05), não diferindo estatisticamente entre sí (p>0.05). Os tratamentos com PTX+DXR e LFCPPTX+DXR também levaram a inibição significativa do crescimento tumoral comparativamente ao controle (p<0.05), não diferindo estatisticamente entre sí (p>0.05).

[066] Os tratamentos associando PTX e DXR não diferiram daqueles contendo apenas PTX (PTX ou LFCP-PTX; p>0.05). É interessante notar que nos tratamentos onde os fármacos são associados, a dose de PTX é cerca de 11 vezes inferior àquela dos tratamentos contendo apenas PTX. Nesses tratamentos, a dose de DXR é ligeiramente inferior àquela para os tratamentos contendo apenas DXR (3,64 mg/kg versus 4 mg/Kg), os quais não foram capazes de inibir o crescimento tumoral. O fato da dose de PTX ser tão reduzida somado ao fato da dose de DXR ser praticamente a mesma daquela em que não houve inibição do crescimento tumoral sugere uma potenciação da ação da DXR pelo PTX.

[067] É sabido que na clínica o PTX não pode ser administrado juntamente a DXR por exercer sinergismo de toxicidade. Essa maior toxicidade decorre aparentemente de uma interferência farmacocinética entre esses dois fármacos. Essa interferência resulta em maiores concentrações de DXR e doxorrubicinol no plasma (GIANNI, L. et al. Paclitaxel by 3-hourinfusion in

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30/30 combination with bolus doxorubicin in women with untreated metastatic breast câncer: high antitumor efficacy and cardiac effects in a dose-finding and sequence-finding study,Joumal of Clinicai Oncology, vol. 13, no. 11, pp. 2688-2699, 1995/ GIANNI, L. et al. Human pharmacokinetic characterization and in vitro study of the interaction between doxorubicin and paclitaxel in patients with breast câncer, Joumal of ClinicalOncology, vol. 15,no. 5, pp. 1906-1915,1997), podendo fazer com que o risco cardíaco se torne inaceitável. Os LFCP-PTX+DXR podem se mostrar capazes de contornar esse problema, uma vez que os fármacos são carreados juntos até o sítio tumoral. Essa possibilidade será futuramente investigada.

Claims (10)

1 Lipossomas aniônicos, fusogênicos e de circulação prolongada caracterizados por conter dioleilfosfatidiletanolamina, hemisuccinato de colesterila, dioleilfosfatidiletanolamina acoplada ao polietilenoglicol, paclitaxel ou docetaxel e doxorrubicina.

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c) remover o solvente em evaporador rotativo acoplado a sistema de geração de vácuo;

d) manter o filme lipídico sob atmosfera de clorofórmio por no mínimo 1 hora;

e) adicionar ao filme lipídico quantidade suficiente de solução alcalina para promover a completa ionização do CHEMS;

f) adicionar solução de sulfato de amônio (pH~7,4) previamente aquecida a 40 a 50°C;

g) manter a mistura em banho de ultrassom por 10 a 20 minutos; seguido de diálise por 12 a 24 horas contra tampão HEPES;

h) centrifugar;

i) determinar a concentração de PTX ou DTX nos lipossomas por análise quantitativa e, com base no valor encontrado, determinar a quantidade de DXR a ser adicionada de modo a obter lipossomas com razões molares fixas;

j) manter a formulação em contato com a DXR por 2 a 4 horas, numa temperatura de 25 a 30 °C;

k) dialisar contra tampão HEPES por 12 a 24 horas.

2 Os lipossomas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizados por conterem razões molares fixas de paclitaxeLdoxorrubicina ou docetaxekdoxorrubicina de 1:1 a 1:11, preferencialmente 1:10.

3 Os lipossomas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo diâmetro médio estar entre 50 e 400 nm, sendo preferencialmente de 210 a 280 nm.

4 Uso dos lipossomas definidos nas reivindicações 1 a 3 caracterizado por ser para preparar um medicamento para tratamento de tumores.

5 caracterizado por ser para preparar um medicamento para tratamento de tumores.

5 Composições farmacêuticas antitumorais caracterizadas por conter os lipossomas definidos nas reivindicações 1 a 3 e excipientes farmacológica e farmaceuticamente aceitáveis.

6 Uso das composições farmacêuticas definidas na reivindicação

7 Processo de obtenção dos lipossomas, definidos nas reivindicações 1 a 3, caracterizado por conter as seguintes etapas:

a) Colocar em um recipiente adequado soluções clorofórmicas de DOPE, CHEMS e DSPE-PEG2000 na proporção molar de 5,7:3,8:0,5 a 6,5:3,0:0,5 e concentração lipídica total igual a 10 a 40 mmol/L;

b) adicionar paclitaxel ou docetaxel para concentração final de 0,25 a 1,0 mg/mL;

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8 O processo, de acordo com a reivindicação 7, etapa “e”, caracterizado pela solução alcalina ser preferencialmente de NaOH 0,1 mol/L.

9 O processo, de acordo com a reivindicação 7, etapa “h”, caracterizado pela centrifugação ser preferencialmente de 3000 a 5000 xg durante 10 minutos, em temperatura de 25 °C.

10 O processo, de acordo com a reivindicação 7, etapa “i”, caracterizado pela razão molar fixa de paclitaxeLdoxorrubicina ou docetaxekdoxorrubicina ser de 1:1 a 1:11, sendo preferencialmente de 1:10.