CN114259468A - 一种共载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种共载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体的制备方法，属于医药技术领域，具体是将大豆卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇2000、多西他赛共同反应制成透明质膜，然后进行温育处理得到多西他赛长循环脂质体；随后再进行超声处理、透析处理，再进行孵育处理得到共同包载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体，最后再进行透析处理得到共同包载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体。本发明提供了一种共载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体的制备方法，本方法整体工艺方法巧妙，创造性的将多西他赛和阿霉素共同包裹于同一脂质体内，能够很好的发挥多西他赛和阿霉素使用效果，可以显著加强其在乳腺癌治疗中的效果。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，特别是一种共载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体的制备方法。
背景技术
乳腺癌为临床上的一种常见恶性肿瘤，发病率位居女性恶性肿瘤的首位，其发病率位居世界癌症种类的第一名，在我国乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，对我国公民的生命健康造成严重威胁，因其具有易生长、易转移的特点，使得乳腺癌得的治疗结果不甚理想。在临床中对晚期乳腺癌的治疗手段常常为化疗，其用药手段中联合用药的方式常常优于单一用药，临床中将多西他赛和阿霉素联合用药用于治疗乳腺癌取得了良好的疗效。
脂质体有许多的优良特点，将药物制备成长循环脂质体可以增加体内循环时间，增加药物稳定性，同时还可以降低药物毒性等。
阿霉素(Doxorubicin,DOX)是目前常用的一线抗肿瘤药物，其水溶性较强，对多种实体肿瘤有效。其作用机理为嵌入DNA而抑制核酸的合成，临床用其治疗乳腺癌有着良好疗效，但是其具有一定的心脏毒性，导致临床使用时要严格控制用量，在一定程度上限制了其使用。
多西他赛(Docetaxel，DTX),为蒽环类抗癌药，抗癌谱较广，临床上为晚期乳腺癌的一线用药，其作用机制与紫杉醇相同，为M期周期特异性药物，通过抑制微管解聚及正常重组，从而使细胞不能进行有丝分裂，从而导致肿瘤细胞坏死凋亡。但是其水溶性很差，限制了其使用，临床的多西他赛注射剂中常加入吐温-80为助溶剂，而吐温-80容易在人体内聚集，有着造成血管堵塞等倾向，对人体有着一定的毒性，因此设计一种剂型使其能够增加水溶性有着重要意义，而脂质体其外层有着大量羟基，因此有着良好的水溶性，将多西他赛包裹于脂质体内来增加水溶性是一种良好的解决方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种共载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体的制备方法，以解决现有技术中的不足。
本发明采用的技术方案如下：
一种共载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将大豆卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、多西他赛共同加入到茄形烧瓶中，再加入氯仿进行溶解；
(2)减压旋转蒸发处理形成均匀的透明质膜，而后置于真空干燥箱内干燥处理1h；再加入硫酸铵，进行温育处理,完成后得多西他赛长循环脂质体；
(3)对多西他赛长循环脂质体进行探头超声处理后得到混悬液；
(4)将超声所得的多西他赛长循环脂质体混悬液装入透析袋中，然后在0.9％氯化钠溶液中透析处理8h，每2h换液一次，以除去外水相中的硫酸铵，使其脂质体形成内外pH梯度差；
(5)向透析过的多西他赛长循环脂质体中加入盐酸阿霉素水溶液，孵育处理后得到共同包载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体；
(6)将制备好的共同包载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体再次放入透析袋中，在0.9％氯化钠水溶液中透析处理8h，每2h换液一次，除去游离的阿霉素，再放入含质量浓度0.5％的吐温-80水溶液中透析8h，每2h换液一次，除去游离的多西他赛，即得共同包载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体。
进一步的，步骤(1)中所述的大豆卵磷脂和胆固醇对应的重量比为1～5：1；所述的大豆卵磷脂和多西他赛对应的重量比为5～25：1；所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和大豆卵磷脂的摩尔比为1～5％。
进一步的，所述大豆卵磷脂和胆固醇对应的重量比为3：1；所述大豆卵磷脂和多西他赛对应的重量比为15：1；所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和大豆卵磷脂的摩尔比为2％。
进一步的，步骤(2)中所述的减压旋转蒸发处理时控制温度为48℃、时长为30min；所述硫酸铵的浓度控制为100～300mmol/L；所述硫酸铵加入后控制大豆卵磷脂的浓度为3～28mg/ml；所述温育处理时控制温度为50℃。
进一步的，所述硫酸铵加入后控制大豆卵磷脂的浓度为21mg/ml；所述硫酸铵的浓度控制为250m mol/L。
进一步的，步骤(3)中所述的探头超声的功率为100W；控制超声处理的方式为开5s关5s，共计超声处理60～360s。
进一步的，所述超声处理的时长为210s。
进一步的，步骤(4)和步骤(6)中所述的透析袋的截留分子量均为8000-14000。
进一步的，步骤(5)中所述的阿霉素的添加量是大豆卵磷脂总质量的1/15；所述孵育处理时控制温度为55℃，孵育的时长为15min。
本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种共载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体的制备方法，本方法整体工艺方法巧妙，创造性的将多西他赛和阿霉素共同包裹于同一脂质体内，能够很好的发挥多西他赛和阿霉素使用效果，可以显著加强其在乳腺癌治疗中的效果，极具市场竞争力和推广应用价值。
附图说明
图1是SPC浓度筛选数据图。
图2是SPC与Chol比例的筛选数据图。
图3是DSPE-PEG2000用量的筛选数据图。
图4是超声时间的筛选数据图。
图5是DTX与SPC比例的筛选数据图。
图6是DOX与SPC比例的筛选数据图。
图7是硫酸铵浓度的筛选数据图。
图8是PEG-DTX/DOX-LP透射电镜图。
图9是PEG-DTX/DOX-LP的粒径测试图。
图10是PEG-DTX/DOX-LP的电位测试图。
图11是4℃下PEG-DTX/DOX-LP粒径的变化图。
图12是4℃下PEG-DTX/DOX-LP包封率的变化图。
图13是37℃下PEG-DTX/DOX-LP粒径的变化图。
图14是37℃下PEG-DTX/DOX-LP包封率的变化图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种共载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将大豆卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、多西他赛共同加入到茄形烧瓶中，再加入氯仿进行溶解；
(2)减压旋转蒸发处理形成均匀的透明质膜，而后置于真空干燥箱内干燥处理1h；再加入硫酸铵，进行温育处理,完成后得多西他赛长循环脂质体；
(3)对多西他赛长循环脂质体进行探头超声处理后得到混悬液；
(4)将超声所得的多西他赛长循环脂质体混悬液装入透析袋中，然后在0.9％氯化钠溶液中透析处理8h，每2h换液一次，以除去外水相中的硫酸铵，使其脂质体形成内外pH梯度差；
(5)向透析过的多西他赛长循环脂质体中加入盐酸阿霉素水溶液，孵育处理后得到共同包载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体；
(6)将制备好的共同包载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体再次放入透析袋中，在0.9％氯化钠水溶液中透析处理8h，每2h换液一次，除去游离的阿霉素，再放入含质量浓度0.5％的吐温-80水溶液中透析8h，每2h换液一次，除去游离的多西他赛，即得共同包载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体。
下述名称和对应英文简称如下：
SPC：大豆卵磷脂；Chol：胆固醇；DSPE-PEG2000：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000；DOX：阿霉素；DTX：多西他赛；PEG-DTX-LP：多西他赛长循环脂质体；PEG-DTX/DOX-LP：共同包载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体。
在具体的实验中，为了确定最佳的参数和探索技术的稳定性，进行了下列创造筛查实验：
根据已有做过的大量实验和预实验的基础上，拟定制备PEG-DTX/DOX-LP的处方为大豆卵磷脂(SPC)：胆固醇(Chol)＝3：1(w：w)；大豆卵磷脂(SPC)：多西他赛(DTX)为15:1；大豆卵磷脂(SPC):阿霉素(DOX)为10:1；DSPE-PEG2000浓度为5％(大豆卵磷脂的摩尔比)；水化溶剂为硫酸铵；固定硫酸铵浓度为200m mol/L，超声功率为100w(设置为开5s-关5s)；超声60秒；载DTX的温度为50℃，时间为30min，载DOX的温度为55℃，时间为10min，载药前阿霉素浓度为4mg/ml；
拟定的具体制作方法是按SPC:Chol：DTX＝15：5：1的重量比称取SPC、Chol、DTX，称取大豆卵磷脂的摩尔比例为5％的DSPE-PEG2000，将所有物料置于茄形烧瓶中，而后加入适量氯仿溶解，减压旋转蒸发，形成均匀的透明质膜，而后真空干燥1h，加入适量体积(使SPC浓度为10mg/ml)的浓度为200m mol/L的硫酸铵，在50℃下温育1h，将温育后的脂质体混悬液用探头超声，探头功率设置为100w，开5s关5s，超声60s，超声后即可得到载DTX的长循环脂质体(PEG-DTX-LP)；
而后将制备好的PEG-DTX-LP装入透析袋(截留分子量为8k-14k)中，在0.9％的氯化钠溶液中透析8h，每2h换液一次，以除去外水相中的硫酸铵，使脂质体形成内外pH梯度差，而后在透析过的PEG-DTX-LP加入适量盐酸阿霉素(DOX)水溶液，加入的阿霉素的量为SPC的1/10，而后在55℃下孵育15min即可得到PEG-DTX/DOX-LP(同时载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体)。将制备好的PEG-DTX/DOX-LP再次放入截留分子量为8k-14k的透析袋中，在0.9％氯化钠水溶液中透析8h，每2h换液一次，除去游离的阿霉素，而后在0.5％的吐温-80溶液中透析8h，除去游离的多西他赛，即得最终的SP94/TAT-DOX-LP。
1.1大豆卵磷脂浓度的筛选：
其他条件和上述拟定条件一致，考察不同大豆卵磷脂浓度(3mg/ml、6mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、21mg/ml、28mg/ml)对包封率的影响，其结果如附图1所示；由附图1中结果可知DTX的包封率随磷脂浓度的增大而增大，在21mg/ml趋于平衡，DOX包封率在10mg/ml时包封率最大，但是其后浓度的变化对其包封率的影响不大，综合考虑，将大豆卵磷脂浓度定为21mg/ml；
1.2大豆卵磷脂与胆固醇比例的筛选：
将SPC浓度定为21mg/ml，其他条件与条件1.1相同，考察不同SPC:Chol(1:1 2:13:1 4:1 5:1)对包封率的影响，其结果如附图2所示；由附图2中数据可知，当磷脂：胆固醇(w：w)＝3：1时DTX包封率最高，而DOX的包封率在其比例增大后也相差不大，综合考虑将比例定为3：1；
1.3DSPE-PEG2000用量的筛选：
将SPC:Chol固定为3：1，其他条件与条件1.2保持相同，考察不同DSPE-PEG2000浓度(磷脂的摩尔比例1％2％3％4％5％)对包封率的影响，其结果如附图3所示；由附图3中数据可知，当DSPE-PEG2000用量为2％时，DTX包封率最高，而DSPE-PEG2000含量变化对DOX包封率影响不大，因而综合考虑将其DSPE-PEG2000用量定为2％；
1.4超声时间的筛选：
将DSPE-PEG2000用量固定为SPC摩尔比例的2％，其他条件与条件1.3保持相同，考察不同超声时间(60s、100s、150s、210s、280s、360s)对包封率，粒径的影响，其结果如附图4所示，由附图4中数据可知，超声时间为210s时DOX包封率最大，DTX在其后也无明显区别，脂质体粒径的大小随超声时间的增大而减小，当时间达到210s后，其后变化无明显区别，综合来定，将超声时间定为210s；
1.5多西他赛(DTX)与大豆卵磷脂(SPC)比例的筛选：
将超声时间固定为210s，其他与条件1.4保持一致，考察不同SPC：DTX(5：1、10：1、15：1、20：1、25：1)对包封率的影响，其结果如附图5所示，由附图5中数据可知，其变化对DOX几乎无影响，当比例为15：1时DTX包封率最高，综合确定多西他赛的同量SPC的1/15；
1.6阿霉素(DOX)与大豆卵磷脂(SPC)比例的筛选：
将多西他赛(DTX)与SPC的比例确定为15：1，其他条件与条件1.5保持一致，考察不同磷脂：阿霉素(5：1、10：1、15：1、20：1、25：1)对包封率的影响。其结果如附图6所示，此因素对DTX包封率影响不大，而当其比例为15：1时，DOX包封率较高，综合确定阿霉素(DOX)与大豆卵磷脂(SPC)比例为15：1；
1.7硫酸铵浓度的筛选
将阿霉素与磷脂的比例确定为15：1，其他条件与条件1.6保持一致，考察不同硫酸铵浓度(100m mol/L、150m mol/L、200m mol/L、250m mol/L、300m mol/L)对包封率的影响，其结果如附图7所示，由附图7可知，硫酸铵浓度对DTX的包封率影响不大，而当硫酸铵浓度为250m mol/L时，DOX包封率最好，综合考虑将硫酸铵浓度定为250m mol/L。
通过上述单因素考察，最终确定的PEG-DTX/DOX-LP制备材料比例，SPC：Chol＝3：1；SPC:DOX(阿霉素)＝15:1；SPC:DTX(多西他赛)＝15:1；DSPE-PEG2000用量为磷脂摩尔比例的2％；超声探头设置为100w，开5s，停5s，探头超声时间为210s。整个制备过程如下：
按SPC:Chol：DTX＝15：5：1的重量比称取SPC、Chol、DTX，称取大豆卵磷脂的摩尔比例为2％的DSPE-PEG2000，将所有物料置于茄形烧瓶中，而后加入适量氯仿溶解，减压旋转蒸发，形成均匀的透明质膜，而后真空干燥1h，加入适量体积(使SPC浓度为21mg/ml)的浓度为250m mol/L的硫酸铵，在50℃下温育1h，将温育后的脂质体混悬液用探头超声，探头功率设置为100w，开5s关5s，超声210s，超声后即可得到载DTX的长循环脂质体(PEG-DTX-LP)。
而后将制备好的PEG-DTX-LP装入透析袋(截留分子量为8k-14k)中，在0.9％的氯化钠溶液中透析8h，每2h换液一次，以除去外水相中的硫酸铵，使脂质体形成内外PH梯度差，而后在透析过的PEG-DTX-LP加入适量盐酸阿霉素(DOX)水溶液，加入的阿霉素的量为SPC的1/15，而后在55℃下孵育15min即可得到PEG-DTX/DOX-LP(同时载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体)。将制备好的PEG-DTX/DOX-LP再次放入截留分子量为8k-14k的透析袋中，在0.9％氯化钠水溶液中透析8h，每2h换液一次，除去游离的阿霉素，而后在0.5％的吐温-80溶液中透析8h，除去游离的多西他赛，即得最终的SP94/TAT-DOX-LP。
为了进一步探究本发明的效果，对PEG-DTX/DOX-LP物理性质进行的考察，具体如下：
2.1PEG-DTX/DOX-LP形态考察
取适量PEG-DTX/DOX-LP稀释后，用2％磷钨酸染色，自然干燥后用透射电镜观察形态，并拍摄照片。结果如附图8所示，由图可以看出，所制备PEG-DTX/DOX-LP形态较规则，粒径大约在100左右，大多呈类球形。
2.2PEG-DTX/DOX-LP的粒径、分布、电位的考察
将制备好的PEG-DTX/DOX-LP取适量用水稀释后，过0.22um的微孔滤膜，而后于Nano ZS90激光纳米粒度测定其平均粒径、PDI及Zeta电位，其结果如附图9、10所示，由图可以看出，平均粒径为116±4.28nm；PDI为0.159±0.04；电位为-9.54±1.63mV；表明脂质体粒子分布均匀，略带负电，符合制剂要求。
2.3PEG-DTX/DOX-LP稳定性考察
将制备好的PEG-DTX/DOX-LP置于4℃和37℃下，于第0、1、2、4、7、14和30天测定粒径和包封率，比较储存前后，脂质体粒径和包封率的变化，考察各种脂质体的稳定性，其结果如附图11～14所示。
由附图11～14可以得出，各种脂质体在低温4℃时30天内相对稳定，包封率，粒径变化都不大，但是在37℃条件下，脂质体各项指标，在一周内都将发生重大变化，可以判断脂质体对热不稳定，应当注意避光低温保存。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，但本发明不以所示限定实施范围，凡是依照本发明的构想所作的改变，或修改为等同变化的等效实施例，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种共载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将大豆卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、多西他赛共同加入到茄形烧瓶中，再加入氯仿进行溶解；
(2)减压旋转蒸发处理形成均匀的透明质膜，而后置于真空干燥箱内干燥处理1h；再加入硫酸铵，进行温育处理,完成后得多西他赛长循环脂质体；
(3)对多西他赛长循环脂质体进行探头超声处理后得到混悬液；
(4)将超声所得的多西他赛长循环脂质体混悬液装入透析袋中，然后在0.9％氯化钠溶液中透析处理8h，每2h换液一次，以除去外水相中的硫酸铵，使其脂质体形成内外pH梯度差；
(5)向透析过的多西他赛长循环脂质体中加入盐酸阿霉素水溶液，孵育处理后得到共同包载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体；
(6)将制备好的共同包载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体再次放入透析袋中，在0.9％氯化钠水溶液中透析处理8h，每2h换液一次，除去游离的阿霉素，再放入含质量浓度0.5％的吐温-80水溶液中透析8h，每2h换液一次，除去游离的多西他赛，即得共同包载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体。
2.根据权利要求1所述的一种共载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的大豆卵磷脂和胆固醇对应的重量比为1～5：1；所述的大豆卵磷脂和多西他赛对应的重量比为5～25：1；所述的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和大豆卵磷脂的摩尔比为1～5％。
3.根据权利要求2所述的一种共载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体的制备方法，其特征在于，所述大豆卵磷脂和胆固醇对应的重量比为3：1；所述大豆卵磷脂和多西他赛对应的重量比为15：1；所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000和大豆卵磷脂的摩尔比为2％。
4.根据权利要求1所述的一种共载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的减压旋转蒸发处理时控制温度为48℃、时长为30min；所述硫酸铵的浓度控制为100～300m mol/L；所述硫酸铵加入后控制大豆卵磷脂的浓度为3～28mg/ml；所述温育处理时控制温度为50℃。
5.根据权利要求4所述的一种共载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体的制备方法，其特征在于，所述硫酸铵加入后控制大豆卵磷脂的浓度为21mg/ml；所述硫酸铵的浓度控制为250m mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种共载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的探头超声的功率为100W；控制超声处理的方式为开5s关5s，共计超声处理60～360s。
7.根据权利要求6所述的一种共载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体的制备方法，其特征在于，所述超声处理的时长为210s。
8.根据权利要求1所述的一种共载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(4)和步骤(6)中所述的透析袋的截留分子量均为8000-14000。
9.根据权利要求1所述的一种共载多西他赛和阿霉素的长循环脂质体的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的阿霉素的添加量是大豆卵磷脂总质量的1/15；所述孵育处理时控制温度为55℃，孵育的时长为15min。
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