CN116077460A - 一种负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制药领域，更具体地，涉及一种负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒、其制备方法及应用。本发明公开了一种负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒，其外层为灵芝多糖，内层为一种或多种化疗药物，DLS为120.6±4.1nm～310.5±6.1nm、PDI为0.230～0.334、Zeta电位为‑14.4±0.41mV～‑10.2±0.24。本发明负载阿霉素的灵芝多糖纳米粒在提高药物稳定性、降低药物低毒性的同时实现缓释效果，具有明确的肿瘤细胞杀伤作用和较强的抑制肿瘤转移作用。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，更具体地，涉及一种负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒、其制备方法及应用。
背景技术
目前，化学治疗已和手术治疗、放射治疗成为恶性肿瘤不可或缺的重要治疗手段。临床化疗过程中，化疗药物强烈毒副作用，已成为肿瘤化学治疗最严重的障碍之一。
为止，人们已经尝试了多种方法努力克服化疗药物强烈毒副作用，包括使用纳米给药系统等，纳米给药系统可以提高抗肿瘤药物的疗效并降低其毒副作用，已有许多不同类型的纳米材料用于构建纳米给药系统，其中多糖作为纳米化的载体的研究工作有很多，大多数是基于壳聚糖、透明质酸、环糊精、纤维素等无免疫活性的多糖，这类多糖纳米给药系统可通过增强渗透和保留作用(EPR)效应在肿瘤组织滞留并富集，将药物尽量限制在肿瘤部位，在提高对肿瘤组织杀伤力的同时减少对正常组织的损伤。但人们对于理想的用于肿瘤治疗的药物递送系统的期望远不止如此。但这类多糖纳米给药系统都面临着：1、多糖载体不能帮助药物达到治疗的目的，通常载体都是惰性的，没有功能，起不到协同治疗肿瘤的目的；2、肿瘤转移的问题，肿瘤发生、生长、治疗过程中会发生转移，使癌症不易根治。
可见，如何从众多的备选材料中合理地进行选择，巧妙地构建出理想的载药系统，尤其是能协同抗肿瘤和肿瘤转移的载药系统并非一件易事，但却对肿瘤的有效治疗具有重要价值和意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒、其制备方法及应用。
本发明公开了一种负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒，其外层为灵芝多糖，内层为一种或多种化疗药物，DLS为120.6±4.1nm～310.5±6.1nm、PDI为0.230～ 0.334、Zeta电位为-14.4±0.41mV～-10.2±0.24。
在另一优选例中，所述化疗药物选自紫杉醇、多西他赛、卡铂、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、卡培他滨、长春新碱、羟基喜树碱、多柔比星、阿霉素或丝裂霉素等；其中优选为阿霉素。
另一方面，本发明还公开上述负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒的制备方法，包含下列步骤：
(1)灵芝多糖纯化：灵芝多糖(GLP)溶解在超纯水中，经4％浓度的三氯乙酸除蛋白、80％乙醇除色素的预处理后，DEAE-32纤维素阴离子交换柱对GLP 进行分离，先用高纯水做流动相洗脱出灵芝多糖中的中性多糖，然后用0.1M 氯化钠溶液作流动相洗脱，收集洗脱液酸性多糖；以0.2M氯化钠为流动相，将酸性多糖经过Sephacry S-300HR凝胶柱分离，收集分子量较小且相对均一的多糖组分；浓缩，透析除盐，冷冻干燥，得到海绵状的粉末，即为精制 GLP；
(2)配制GLP溶液：称量精制GLP，溶于二甲基亚砜(DMSO)中，得到GLP溶液 A；
(3)配制化疗药物溶液：称量化疗药物，溶于二甲基亚砜(DMSO)中，得到化疗药物溶液B；
(4)纳米粒组装：将GLP溶液和化疗药物溶液按照一定的投料比至反应容器中，避光搅拌8h以上，得到载药纳米粒溶液C；
(5)透析：将所得载药纳米粒子溶液C，装入截留分子量为7000Da的透析袋用去离子水透析24h-48h，同时将有机溶剂体系置换成水体系；
(6)超滤浓缩，冷冻干燥，得到载药GLP纳米粒。
在另一优选例中，所述化疗药物选自紫杉醇、多西他赛、卡铂、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、卡培他滨、长春新碱、羟基喜树碱、多柔比星、阿霉素或丝裂霉素等；其中优选为阿霉素。
在另一优选例中，所述GLP溶液和化疗药物溶液的投料比为5:2～1:1，优选为5:2。
另一方面，本发明还公开上述负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的用途。
本发明负载阿霉素的灵芝多糖纳米粒在提高药物稳定性、降低药物低毒性的同时实现缓释效果，具有明确的肿瘤细胞杀伤作用和抑制肿瘤转移作用。
附图说明
图1两种纳米粒的的表征。(A)Dox@DS和Dox@GLP的水合粒径及ζ电位；(B)Dox@DS和Dox@GLP的电镜图；(C)三种化合物的荧光发射波谱。
图2小鼠体重时间变化图。
图3各组肿瘤体积随时间变化曲线。
图4苏木精和伊红对肿瘤组织的染色，图中标尺为100μm。
图5肺转移性结节的定量分析。
图6 Dox@GLP对小鼠肝、心的毒性。(A)谷草转氨酶(AST)；(B)肌酸激酶同工酶(CK-MB)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1.负载阿霉素的灵芝多糖纳米粒
1.1实验材料
灵芝多糖粗提取物(西安源森生物)，DEAE-32阴离子交换树脂(北京鼎国)，Sephacryl S-300HR(GE Healthcare)，DMSO、三乙胺、三氯乙酸、盐酸阿霉素购于Aladin，其余试剂均购于Sigma。
1.2实验方法
1.2.1灵芝多糖的分离与纯化
1.2.1.1蛋白和色素杂质的去除
①精确称量10g灵芝粗多糖粉末，慢慢加至持续搅拌的80℃100mL水中，直至溶解完全。
②将溶解完全的粗多糖水溶液冷却至室温。称取2g三氯乙酸固体加入溶液中，冰浴搅拌120min。然后静置60min，12000rpm离心10min，弃去沉淀，重复离心三次以彻底除去析出的不溶性沉淀，收集上清。
③一边搅拌一边将上清液缓慢倒入到700mL的无水乙醇中(乙醇终浓度约 80％)，搅拌120min后，于4℃环境中静置过夜。
④弃去上清收集沉淀，用无水乙醇反复洗涤值至上清无色，5000rpm离心 10min收集多糖沉淀，最后置于50℃鼓风干燥箱中使残留乙醇挥发完全，得到多糖粉末。
⑤将多糖粉末完全溶解至20mL水中，利用离子交换层析和凝胶过滤层析进一步分离纯化。
1.2.1.2阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化
①取适量经过预处理的DEAE-32介质填充交换柱，用超纯水以1mL/min 的流速平衡阴离子交换柱过夜。
②多糖溶液12000rpm离心10min，除去不溶杂质。打开蠕动泵开关，使交换柱中流动相液面流到距离介质1cm的地方，沿柱壁小心加入多糖溶液(不能超过介质体积的20％)。
③先用流速为1mL/min的水进行洗脱，苯酚硫酸法实时检测洗脱液，直至苯酚硫酸法检测不到多糖，则判断为中性多糖除尽。接着以0.1M氯化钠为流动相进行洗脱，实时检测的洗脱情况，直至阴离子多糖被完全洗脱下来。将洗脱下来的阴离子多糖，用旋转蒸发仪60℃条件下进行浓缩，然后将多糖浓缩液透析(MW＝7000)48h除盐，最后冷冻干燥得海绵状的多糖粉末。
④取适量膨化的Sephacryl S-300HR介质填充凝胶柱，使用0.2M氯化钠平衡凝胶过滤柱过夜。
⑤多糖粉末用0.2M氯化钠溶液溶解，12000rpm离心10min，除去不溶杂质。打开蠕动泵开关，使凝胶柱中流动相液面流到距离介质1cm的地方，沿柱壁小心加入多糖溶液(不能超过介质体积的20％)。
⑥先用流速为1mL/min的0.2M氯化钠溶液进行洗脱，苯酚硫酸法实时检测洗脱液，直至苯酚硫酸法检测不到多糖，则判断多糖洗脱完毕。收集含分子量较小的多糖洗脱液，用旋转蒸发仪60℃条件下进行浓缩，然后将多糖浓缩液透析(MW＝7000)48h除盐。最后冷冻干燥，得到海绵状的粉末，即为精制多糖，可用作后面实验。
1.2.2灵芝多糖-阿霉素纳米粒的制备及表征
1.2.2.1灵芝多糖及阿霉素的紫外吸收及定量
①用苯酚硫酸法对多糖定量：制作标准曲线：准确称取标准葡萄糖20mg于 500mL容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0mL， 1.2mL，1.4mL，1.6mL，及1.8mL，各以水补至2.0mL，然后加入6％苯酚 1.0mL及浓硫酸5.0mL，静止10min，摇匀，温室放置20min以后于490nm 测光密度，以2.0mL水按同样显色操作为空白，以横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。样品含量测定：吸取样品液1.0mL(相当于40μ g左右的多糖)，按上述步骤操作，测光密度，以标准曲线计算多糖含量。
②阿霉素紫外吸收及标准曲线绘制：用DMSO配制浓度约为10μg/ml 的阿霉素溶液，用酶标仪扫描溶液在300-700nm处的紫外吸收峰；用最大吸收峰处对应的波长分别测量浓度为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、 5μg/mL的阿霉素(溶剂为DMSO)，根据紫外吸收制作吸光度-浓度标准曲线。
1.2.2.2Dox@GLP的制备
①将经过纯化的GLP粉末溶于DMSO中配制成10mg/mL溶液，磁力搅拌、超声，使其充分溶解。将Dox粉末溶于DMSO中配制成10mg/mL溶液，搅拌使其充分溶解。
②取0.5ml Dox溶液加入到干燥的反应瓶中，接着加入一定体积的GLP 溶液，再加入一定体积的DMSO，使Dox的浓度保持在1mg/ml，最后加入 TEA(三乙胺)，TEA的量按每1mgDox加2μL的比例加入。反应瓶避光搅拌8h。如表1所示，对GLP与Dox的投料比进行优化。
③反应结束后，溶液用7000截留分子量的透析袋透析2天，借此除掉未反应的Dox，同时将有机溶剂体系置换成水体系，使GLP与Dox形成纳米粒(Dox@GLP)。
④透析后的Dox@GLP转移到超滤管(MWCO＝10,000)中，5000rpm离心10min，离心结束后摇匀，继续5000rpm离心10min。反复离心3次后，将溶液转移到10mL离心管中。
⑤取超滤浓缩后的Dox@GLP，进行鲎试剂检测。具体操作为：用0.1mL细菌内毒素检查用水溶解鲎试剂，分别加入到0.1mL LPS、0.1mL细菌内毒素检查用水和0.1mL纳米粒水溶液中，37℃水浴60min(时间不超过±1min)，观察其现象。
⑥取经过超滤离心浓缩的Dox@GLP 100μL于10mL离心管中，冷冻干燥后，用1mLDMSO溶解，再用酶标仪测其吸光度值(若其吸光度值超过标曲范围，需用DMSO进一步稀释)。
⑦根据Dox的质量计算出纳米粒的包封率和负载率。其中，包封率＝纳米粒中Dox的质量/Dox的投料量，负载率＝纳米粒中Dox的质量/纳米粒的总质量。
⑧硫酸葡聚糖-阿霉素纳米粒(Dox@DS)的制备(阴性对照)：取DS 12.5 mg，Dox5mg加入到反应瓶中，避光搅拌8h后，按照③④⑤⑥⑦步进行透析、浓缩、定量。
表1-1.Dox@GLP制备投料比的优化
1.2.2.3 Dox@GLP在不同体系中稳定性研究
①将浓缩后的Dox@GLP和Dox@DS分别溶解在PBS中和含PBS的 FBS中。计做第0天。
②记录第0天到第7天每天DLS的变化。
1.2.2.4 Dox@GLP的表征
①纳米粒的粒径及稳定性：使用Zeta电位分析仪检测纳米粒的水合粒径、分散度、ζ电位。
②纳米粒的观测：使用TEM直接观察纳米粒的微观形态。(电压参数：120 kV)
③纳米粒的紫外吸收：使用紫外分光光度计扫描纳米粒在300-800nm处的吸收曲线。
④纳米粒的荧光激发、发射：使用稳态瞬态荧光光谱仪扫描纳米粒在各波长激光下的发射光谱，找出最佳激发波长和在最佳激发波长下的最大发射光谱。
1.2.2.5 Dox@GLP的体外释放评价
①将Dox@GLP的浓度调整到500μg/mL，取1mL溶液加入到透析袋中 (MW＝8000-12000)
②将透析袋放入到50mL离心管中，分别以pH＝5.0和pH＝7.4的PBS 为释放介质。将50mL离心管放入到37℃恒温水浴120rpm震荡，在不同时间以指定时间间隔取出20mL的释放介质，同时加入等体积新鲜PBS，保证透析体系体积保持不变。选择取样体积是为了保证透析条件，即保持透析液中的药物浓度低于其水溶性的10％。
③采用紫外分光光度法测定释放介质中阿霉素的含量，并计算Dox的累计释放量。计算公式为：
其中C％表示累计释放率，m1、m2、mn分别表示第一次、第二次、第n次取出的介质中的Dox的质量，m表示初始Dox@GLP中Dox的总质量。
④制作累计释放量-时间关系图
1.3结果与讨论
1.3.1 GLP的分离纯化
GLP粗提多糖溶解在超纯水中，经4％浓度的三氯乙酸除蛋白、80％乙醇除色素的预处理后，再利用DEAE-32纤维素阴离子交换柱对多糖进行分离。粗多糖加入阴离子交换柱后，先用高纯水做流动相洗脱出灵芝多糖中的中性多糖，接着用0.1M氯化钠溶液作流动相洗脱，收集洗脱液酸性多糖。前期研究表明， 0.1M氯化钠可洗脱下阴离子交换柱上的大部分酸性多糖，且体外实验证明这种酸性多糖对树突状细胞的激活能力要远高于中性多糖。最后，以0.2M氯化钠为流动相，将酸性多糖经过Sephacry S-300HR凝胶柱分离，收集分子量较小且相对均一的多糖组分，经透析冻干后即得精制GLP。通过苯酚硫酸法定量精制GLP中的糖含量，以葡萄糖配制标准溶液，做出其OD值与浓度标准曲线。将冻干的精制GLP粉末溶于水中，通过苯酚硫酸法测得的OD值可推出GLP 的纯度为93.89％
1.3.2 Dox@GLP的合成和表征
在我们的反应中，反应投料体系以Dox为基准，确保Dox在DMSO的体系中终浓度为1mg/mL。反应中TEA的作用是中和盐酸阿霉素的盐酸盐，使可溶水的盐酸阿霉素完全脱盐成不容水的Dox，TEA的投料量也是以Dox的投料来计算的，1mg Dox需要投放1μL TEA。表1-1记录了不同投料比下的 Dox@GLP的DLS、PDI、Zeta电位的表征。
DLS是在溶液状态下的聚合粒子粒径，即水合粒径，又称流体动力学直径。一般由于粒子表面亲水官能团，如羟基、羧基等会使颗粒吸附在一起，因而一般情况下会比实际干燥状态下测的粒径(TEM测的粒径)要大得多。PDI是指多分散系数，它用来衡量纳米粒的分散度，分散度越大，纳米粒粒径分布越不均匀，这种纳米粒在实际运用中充满不确定性。Zeta电位表示纳米颗粒本身所带电荷量，一般纳米颗粒在溶液中有聚集的趋势，而带电纳米粒由于电荷的同种相斥，这种聚集趋势会大大降低，且Zeta电位越大，意味着纳米颗粒所带电荷越大，纳米颗粒聚集趋势越小，纳米颗粒在该种溶液中也就越稳定。
表1-2投料比影响Dox@GLP的制备
根据表1-2中数据，我们可以选出适合用作体外实验和体内实验的投料比。对于编号1，当纳米粒制备仅投Dox时，DLS和PDI稍微偏大。更重要的是，纳米粒在超滤管中5000rpm5min离心时，大量颗粒沉淀并附着在滤膜上，可见合成的纳米粒中有较大颗粒。此外，当在此纳米粒水溶液中加入适量PBS粉末(与PBS等渗)，原本深红色纳米粒溶液会在1天之内变浑浊，3天内彻底沉淀(离心管底为红色沉淀，上清为无色透明)。说明，单纯的Dox并不能形成稳定的纳米粒，其能暂时形成纳米粒可能是靠Dox之间的离子键，当溶液中混入大量的离子(如PBS)时，溶液便不在稳定。对于编号2，DLS为199nm， PDI为0.195，是比较合格的纳米粒，但其Zeta电位为-0.196mV，纳米粒相当不稳定，所以不能长期保存。对于编号6，当GLP与Dox的投料比为5:1时，其DLS为3107nm，说明溶液中颗粒已到微米级别，不再具有纳米粒的特性(如EPR效应)。此外，其Zeta电位为-0.188mV，溶液中的颗粒也不稳定，会加速溶液内颗粒的沉降。对于编号7，反应体系中只加入一定量GLP而不加入 Dox，反应完后，透析，超滤浓缩，溶液观察不到丁达尔效应，纳米粒度及Zeta 电位分析仪分析count rate为7.1kcps，远小于最低检测限的90kcps，也就是说虽然有纳米级别的物质存在，但浓度极低。所以虽然仪器测出了其DLS、PDI 和Zeta电位，但这些数据并没有统计学意义。所以，我们不难得出结论，体系中Dox与GLP质量比在1:1到2:5之间时，GLP与Dox能形成粒径合适、均一且较为稳定的纳米粒。
通过扫描其紫外吸收找到溶解在DMSO中的Dox最大吸收波长为480 nm。通过最大吸收波长处OD值(吸光度值)与浓度关系建立0-5μg/mL的回归曲线方程。将纳米粒冻干后用DMSO复溶，再去测其紫外吸光度，根据回归曲线方程即可计算出纳米粒中Dox的含量。
依据定量结果我们算出Dox@GLP的负载率(wt％)，见表1-3。从表中我们不难看出Dox@GLP的负载率与其投料比关系不大。而在体外、体内实验中，为了实现最大程度的免疫效应我们需要最大的GLP投料，同时考虑到合适负载率和尽可能大包封率，以及尽量小的粒径和尽量大的ζ电位，最终选择 GLP:Dox投料比为5:2的组，其纳米粒水合粒径、TEM图片及荧光发射波谱见图1。
表1-3投料比对Dox@GLP DLC(wt％)的影响
为了预测纳米粒在体内是否稳定，我们使用PBS和含FBS的PBS作为纳米粒的分散系，评价纳米粒在生理盐平衡体系中和在含血清体系中的稳定性。结果显示，在PBS中，纳米粒水合粒径相对于在水中平均增加17nm，在含FBS 的PBS中，纳米粒的水合粒径相对于在水中平均降低31nm。且在一周时间内各分散体系中纳米粒的水合粒径波动幅度小，说明纳米粒在各体系中分散性、稳定性均较好
实施例2.Dox@GLP的体内抗肿瘤研究
1.1实验材料
CD45、IFN-γ购于Miltenyi，Anti-mouseCD4、CD8a、CD44、CD62L、
Foxp3购于Biolegend。6到8周龄的SPF级雌性Balb/C小鼠由常州卡文斯实验动物公司提供。
1.2实验部分
1.2.1 Dox@GLP的体内分布
①将3只体重、行为正常的Balb/C小鼠皮下接种1×106个4T1-luc肿瘤细胞，待第七天肿瘤长到100mm3。
②将Dox-cypate、Dox/cypate@DS和Dox/cypate@GLP通过尾静脉注射到荷瘤小鼠体内，按5mg/kg Dox的剂量给药。
③给药后0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h进行活体成像，并对成像图片进行处理。
1.2.2 Dox@GLP对小鼠4T1-luc皮下瘤生长的影响
①用100mm细胞培养皿培养小鼠乳腺癌细胞系4T1-luc，在37℃含5％ CO2的培养箱中进行孵育。待肿瘤细胞增殖到培养皿面积的80％后，用胰酶消化，PBS稀释胰酶，离心去PBS，收集肿瘤细胞团。PBS重悬细胞团，调整细胞浓度为8×106个/mL，置于冰上备用。
②将40只雌性Balb/C小鼠随机分为5组，每组进行编号，并在小鼠右侧背部皮下注射50μL 4T1-luc肿瘤细胞悬液，推注完后可见明显隆起。
③每天游标卡尺测量肿瘤的长轴和短轴，算出肿瘤体积，待到第7天平均肿瘤体积为80mm3，此时记作第0天。分别在第1天、4天、7天尾静脉注射PBS、GLP、Dox、Dox@DS、Dox@GLP，统一Dox剂量为4mg/kg，游离 GLP给药36mg/kg，PBS则给药100μL。每2天测量一次小鼠体重和肿瘤体积，每3天使用IVIS对肿瘤进行成像。肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝长轴×短轴2/2。
④第19天，颈椎脱臼处死全部小鼠。取出皮下肿瘤组织：将其一分为二，一半置于10ml 4％多聚甲醛中固定，用于制作HE染色石蜡切片；另一半置于 5mL胶原酶IV消化液中，制备成单细胞悬液，用作后面实验。肿瘤组织单细胞悬液制作步骤如下：
a)肿瘤组织消化液配制：50mg 0.05wt％胶原酶IV和2mg 0.002wt％ DNase加入到100ml无血清1640培养基中，震荡混匀。
b)将肿瘤组织剪成细小组织碎块，置于5ml组织消化液中，37℃下水浴震荡孵育1h，用尼龙网研磨后过70μm细胞筛，除去黏连细胞团，得到肿瘤单细胞悬液。
c)在细胞悬液中加入1mL红细胞裂解液，混匀反应5min去除红细胞，再用PBS稀释红细胞裂解液，离心，PBS重悬即得肿瘤组织的单细胞悬液。
⑤对于脾脏组织：将脾脏一分为二，一半置于10mL 4％多聚甲醛中固定，用于制作HE染色石蜡切片；另一半用尼龙网研磨后过70μm细胞筛，离心后加入3mL红细胞裂解，去红后离心PBS重悬即得脾单细胞悬液。
⑥取出腹股沟淋巴结，置于5mL胶原酶IV消化液中，37℃下水浴震荡孵育1h，用尼龙网研磨后过70μm细胞筛，除去黏连细胞团，得到肿瘤单细胞悬液。
⑦其余器官(心、肝、肺、肾)用10mL 4％多聚甲醛固定，制作HE染色切片，进行组织病理学研究。
1.2.3数据分析
采用SPSS软件对实验数据进行one-way ANOVA分析，平行组数据用平均数+标准差表示，当p<0.05时表示有显著性差异，*代表0.01<p<0.05,**代表 0.001<p<0.01,***代表p<0.001。
1.3结果与讨论
1.3.1 Dox@GLP的体内分布
cypate是ICG的一种羧基衍生物，比起ICG其结构稳定性更好，而且结构中有两个羧基，便于对结构进行修饰。Dox的荧光发射在595nm处，属于可见光范围，激发荧光穿透力低，容易被吸收；而cypate激发和发射波长分别为783nm和815nm，其发射光属于近红外区，穿透力强，适合作为光热转换和活体成像。我们对cypate的羧基用EDC/NHS进行活化，然后将活化后的 cypate与Dox进行反应，最后用多糖与两者纳米化成功制备纳米粒。通过IVIS成像可以看出，两种多糖纳米粒先后在肿瘤处均有成像，而游离Dox-cypate在肿瘤处却始终没有成像，说明纳米粒通过EPR效应，在肿瘤处确实有富集作用，游离药物在肿瘤处没有成像，可能是因为浓度太低，没有达到成像的最低浓度。
1.3.2Dox@GLP对小鼠4T1-luc皮下瘤生长的影响
小鼠体重一般可以反映药物对小鼠的整体毒性，通过图2看出，Dox@GLP大幅度降低了阿霉素对小鼠的整体毒性。肿瘤的体积随时间变化曲线、4T1-luc肿瘤的IVIS荧光成像反映了几种不同处理方式对肿瘤的影响，我们不难看出， Dox@GLP处理组对肿瘤的生长有着最强的抑制效果。
肿瘤体积反映着药物的整体抗肿瘤效果(图3)。从图中不难得出以下结论：同等Dox当量下，Dox@GLP有着最强的抗肿瘤效果。GLP效果微弱，而Dox 及Dox@DS也有着不错的抗肿瘤效果，而且这种抗肿瘤效果与Dox@GLP相比虽然稍弱但很遗憾并没有显著性差异。用游标卡尺测量肿瘤体积有着很大的误差，本实验还利用IVIS成像对肿瘤大小进行成像。由于4T1-luc转染了荧光素每的基因，可以将注入的荧光素底物转化为近红外的荧光产物，所以可以利用它进行肿瘤成像。从荧光成像图中我们不难看出，Dox@GLP有着最强的抗肿瘤效果。
H&E染色切片显示(图4)，在PBS处理组(对照组)的肿瘤组织中发现大量具有大核和密集染色质的4T1-luc细胞，而所有Dox及其纳米粒处理组则这类肿瘤细胞的数量有所减少。令人欣喜的是，在Dox、Dox@GLP和 Dox@DS处理的组中，细胞质收缩和核碎裂很明显。此外，4T1-luc有着很强的肿瘤转移能力，随着肿瘤进展，当仅给予PBS治疗时，我们发现肺部有大量肺转移结节。图5显示了肺转移性结节的定量分析。Dox有效地抑制了原发性肿瘤的生长，但小鼠肺转移结节的总体水平几乎没有下降。令人惊讶的是，可以观察到Dox@GLP有较强的抑制肿瘤转移，高于Dox组。肺的组织病理学检查还表明，与其他组相比，Dox@GLP组肺组织形态变化较少。Dox@GLP的抗肿瘤转移作用可能是由于全身免疫反应，尤其是T细胞在肺中的活化，导致转移的4T1-luc肿瘤被抑制。
小鼠血液中谷草转氨酶、肌酸激酶同工酶的含量越高说明药物分别对肝功能和心功能损害越强。以PBS组为对照，可以看出给药10天后，各组药物对小鼠肝功能几乎没有影响(图6A)，但Dox对心功能的毒性要高于Dox@DS和 Dox@GLP(图6B)，Dox@GLP大幅度降低了阿霉素对小鼠的脏器毒性。
我们制备了Dox@GLP纳米粒。Dox@GLP的制备简单，所用化学试剂少，反应条件常温常压使得反应能耗小，是一种比较绿色的多糖纳米粒制备方法。纳米粒通过被动靶向(EPR效应)在肿瘤处富集，并在肿瘤处发挥化疗和免疫的双重作用。我们的研究结果显示，Dox@GLP具有明确的肿瘤细胞杀伤作用和较强的抑制肿瘤转移作用。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。
Claims (10)
1.一种负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒，其外层为灵芝多糖，内层为一种或多种化疗药物，DLS为120.6±4.1nm～310.5±6.1nm、PDI为0.230～0.334、Zeta电位为-14.4±0.41mV～-10.2±0.24。
2.如权利要求1所述的灵芝多糖纳米粒，其特征在于所述化疗药物为紫杉醇、多西他赛、卡铂、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、卡培他滨、长春新碱、羟基喜树碱、多柔比星、阿霉素或丝裂霉素。
3.如权利要求1所述的qPCR检测试剂盒，其特征在于所述化疗药物为阿霉素。
4.如权利要求1-3所述灵芝多糖纳米粒的制备方法，包含下列步骤：
(1)灵芝多糖纯化：GLP溶解在超纯水中，经4％浓度的三氯乙酸除蛋白、80％乙醇除色素的预处理后，DEAE-32纤维素阴离子交换柱对GLP进行分离，先用高纯水做流动相洗脱出灵芝多糖中的中性多糖，然后用0.1M氯化钠溶液作流动相洗脱，收集洗脱液酸性多糖；以0.2M氯化钠为流动相，将酸性多糖经过Sephacry S-300HR凝胶柱分离，收集分子量较小且相对均一的多糖组分；浓缩，透析除盐，冷冻干燥，得到海绵状的粉末，即为精制GLP；
(2)配制GLP溶液：称量精制GLP，溶于二甲基亚砜中，得到GLP溶液A；
(3)配制化疗药物溶液：称量化疗药物，溶于二甲基亚砜中，得到化疗药物溶液B；
(4)纳米粒组装：将GLP溶液A和化疗药物溶液B按照一定的投料比至反应容器中，避光搅拌8h以上，得到载药纳米粒溶液C；
(5)透析：将所得载药纳米粒子溶液C，装入截留分子量为7000Da的透析袋用去离子水透析24h-48h，同时将有机溶剂体系置换成水体系；
(6)超滤浓缩，冷冻干燥，得到载药GLP纳米粒。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述化疗药物为紫杉醇、多西他赛、卡铂、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、卡培他滨、长春新碱、羟基喜树碱、多柔比星、阿霉素或丝裂霉素。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述化疗药物为阿霉素。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述GLP和化疗药物的投料比为5:2～1:1。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述GLP和化疗药物的投料比为5:2。
9.如权利要求1所述负载化疗药物的灵芝多糖纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于所述化疗药物为阿霉素。
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