CN117186259A - 一种分子结构明确的可消除化疗药毒副作用的多糖化合物 - Google Patents

一种分子结构明确的可消除化疗药毒副作用的多糖化合物 Download PDF

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CN117186259A CN202310984408.6A CN202310984408A CN117186259A CN 117186259 A CN117186259 A CN 117186259A CN 202310984408 A CN202310984408 A CN 202310984408A CN 117186259 A CN117186259 A CN 117186259A
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何春明
莫观
陈金
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梁梅
方哲
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Abstract

本发明适用于植物提取分离技术领域，提供了一种分子结构明确的具有抗肿瘤作用的多糖化合物，该多糖化合物用于治疗晚期癌症(手术条件已经丧失、生存期仅存三至六个月、尚具备化疗条件)患者，分子式为(C30H50O25)n；该多糖化合物通过在高温高压下提取灵芝的有效成分获取得药效成分多糖。具有该药效成分的多糖水溶性能好，易被人体吸收，具备抗肿瘤药效且对人类预防肿瘤的发生具备功效，尤其是与化疗药联合使用时，可消除因化疗药对人体产生的毒副作用并对肿瘤块的控制、减少以及肿瘤细胞的减少和消灭均有相应的实验数据佐证。

Description

一种分子结构明确的可消除化疗药毒副作用的多糖化合物
技术领域
本发明属于植物提取分离技术领域，尤其涉及从灵芝中提取分子结构明确的具有抗肿瘤药效和可消除化疗药毒副作用的多糖化合物。
背景技术
灵芝是一类真菌植物，在中国、日本具有悠久的药用历史。灵芝中的活性成分多且组成复杂，以往人类已从中分离得到了150多种化合物，主要有多糖、三萜类、甾醇类、生物碱类、呋喃衍生物、氨基多肽类以及无机元素等。不同的地理位置(经度和纬度)、不同的种子、不同的生长环境以及不同的温度、湿度和光照度都会对灵芝中本发明所提及的药效成分的含量、占比及存在与否产生重大影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分子结构明确的具有抗肿瘤药效和可消除化疗药毒副作用的多糖化合物。
本发明旨在解决目前国际上尚未攻克的晚期癌症患者治疗难题，所谓晚期癌症患者是指：手术条件已经丧失、生存期仅存三至六个月、尚具备化疗条件的癌症患者；所谓治疗难题是指：让晚期的癌症患者以最快的速度恢复食欲(一般两至三周)，让肿瘤瘤块缩小或者不再增大，与化疗药联合使用可以使化疗药对人体产生的毒副作用基本消除，与化疗药长期联合使用，可以达到基本消灭癌细胞的目的或者将癌细胞数量控制在人体高质量生存的安全范畴。
本发明所指的药效成分还有一种重要功能是可以预防人类正常细胞的变异和防止癌细胞的产生。
本发明所指的药效成分还有一种重要功能就是与化疗药联合使用时对肺癌、肝癌、乳腺癌表现出异常优秀的治疗效果，表现出了一定的广谱性。
本发明是这样实现的，一种提取灵芝多糖GLP-2的方法，该方法包括以下步骤：
S1、将灵芝去尘烘干后进行破碎处理制成灵芝粉末；
S2、将破碎的灵芝粉末置于密闭容器中与水混合加热，在高温高压下将灵芝粉末与水充分融合成药汁溶液；
S3、利用膜浓缩技术将药汁溶液进行分离获得具有药效成分浓溶液和未完全融合药渣；
S4、将含有药效成分浓溶液与纯水配比成预设浓度的水溶液经过多次柱层析分离技术获得具有药效成分的灵芝多糖GLP-2。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤S2中将密闭容器中灵芝粉末与水的混合液体充分搅拌后高温加热至105-200℃，煮沸时间持续2-6h，密闭容器随着加热温度升高其内压力逐渐升高形成密闭容器高温高压环境。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤S2中将密闭容器中灵芝粉末与水的混合液体高温加热至105-170℃，煮沸时间持续3-6h，密闭容器随着加热温度升高其内压力逐渐升高形成密闭容器高温高压环境。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤S4中将含有药效成分的浓缩液与纯水配制成浓度比为1:2-1:5。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤S3中将提取的拥有药效成分水溶液利用膜浓缩技术将其中的灵芝残渣去除获得药效成分浓缩液或膏状物。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤S1中将灵芝通过清水冲洗去除表面的浮尘物经105℃烘干，将烘干后的灵芝进行破碎，其破碎的灵芝粉末大于60目。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤S2中将密闭容器中混合液体高温加热至105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃、145℃、150℃、155℃、160℃、165℃、170℃、175℃、180℃、185℃、190℃、195℃或200℃，煮沸时间2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h或6h，密闭容器随着加热温度升高其内压力逐渐升高形成密闭容器高温高压环境。
本发明的另一目的在于提供一种灵芝多糖GLP-2，所述灵芝多糖GLP-2的结构式
分子式C30H50O25)n，其中，n＝92-147。
本发明的进一步技术方案是：n为92、96、100、105、110、115、120、125、130、135、140、144或147。
本发明的另一目的在于提供一种灵芝多糖GLP-2的应用，所述灵芝多糖GLP-2水溶性能好，易被人体吸收，具备抗肿瘤药效且对人类预防肿瘤的发生具备强大功效，尤其是与化疗药联合使用时，可消灭因化疗药对人体产生的毒副作用并对肿瘤块的控制、减少以及肿瘤细胞的减少和消灭。
本发明的有益效果是：该方法提取工艺简单，多糖提取率高、生产成本低，操作简单；灵芝多糖的溶解性好，易被人体吸收，从而发挥其抗肿瘤的作用。
附图说明
图1是本发明实施例提供的提取灵芝多糖GLP-2的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的lgMp-RT(峰位分子量)校正曲线示意图。
图3是本发明实施例提供的lgMp-RT(重均分子量)校正曲线示意图。
图4是本发明实施例提供的lgMp-RT(数均分子量)校正曲线示意图。
图5是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2的分子量图谱示意图。
图6是本发明实施例提供的混标16糖的离子色谱图一。
图7是本发明实施例提供的混标16糖的离子色谱图二。
图8是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2(PMAA)GCMS色谱图。
图9是本发明实施例提供的多糖甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析质荷比示意图一。
图10是本发明实施例提供的多糖甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析质荷比示意图二。
图11是本发明实施例提供的多糖甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析质荷比示意图三。
图12是本发明实施例提供的多糖甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析质荷比示意图四。
图13是本发明实施例提供的多糖甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析质荷比示意图五。
图14是本发明实施例提供的氢谱示意图。
图15是本发明实施例提供的碳谱示意图。
图16是本发明实施例提供的Dept135图谱示意图。
图17是本发明实施例提供的HH-COSY示意图。
图18是本发明实施例提供的HSQC图。
图19是本发明实施例提供的HMBC图谱。
图20是本发明实施例提供的NOESY示意图。
图21是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠模型对照组示意图。
图22是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠顺铂组示意图。
图23是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠顺铂+GLP-2低剂量组示意图。
图24是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠示顺铂+GLP-2高剂量组意图。
图25是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠肿瘤模型对照组示意图。
图26是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠肿瘤顺铂组示意图。
图27是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠肿瘤顺铂+GLP-2低剂量组示意图。
图28是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠肿瘤顺铂+GLP-2高剂量组示意图。
图29是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠模型对照组示意图。
图30是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠顺铂组示意图。
图31是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠顺铂+GLP-2低剂量组示意图。
图32是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠顺铂+GLP-2高剂量组示意图。
图33是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠肿瘤模型对照组示意图。
图34是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠肿瘤顺铂组示意图。
图35是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠肿瘤顺铂+GLP-2低剂量组示意图。
图36是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠肿瘤顺铂+GLP-2高剂量组示意图。
图37是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22原位肝癌小鼠肿瘤的影响(binning：8×8；T＝30s)示意图。
图38是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22原位肝癌小鼠肿瘤的影响示意图。
图39是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22原位肝癌小鼠肝脏的影响(×200)示意图。
图40是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22原位肝癌小鼠脾脏的影响(×200)示意图。
图41是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22原位肝癌小鼠胃的影响(×200)示意图。
图42是本发明实施例提供的灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22原位肝癌小鼠肾脏的影响(×200)示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
如图1所示，本发明提供的提取灵芝多糖GLP-2的方法的流程图，其详述如下：
步骤S1，将采摘的灵芝或经过初步简单处理过的灵芝在清洗设备上通过清水清洗，将其表面上的浮尘清除，去除浮尘后将灵芝转移到烘干设备上进行高温烘干，其烘干温度为105℃，将高温烘干后的灵芝置于破碎机或粉碎机上进行破碎成灵芝粉末，将粉碎的灵芝粉末进行过筛，将灵芝粉末颗粒大于60目筛选出，将灵芝粉末颗粒小于60目的返回至破碎机或粉碎机上进行再次破碎，反复多次该过程直至破碎的灵芝粉末颗粒符合规定的要求为止。
步骤S2，将符合要求的灵芝粉末与纯水混合后置于一密闭容器中，对密闭容器进行加热，密闭容器随着持续加热温度的会一直升高，使得密闭容器内形成高温高压环境，在该环境下更加容易将灵芝粉末与水充分的融合形成混合液体，在对密闭容器进行高温加热至105℃-200℃之间沸腾时间为2-6h，其优选为高温加热至105℃-170℃之间煮沸时间3-6h，其更优选为高温加热至105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃、145℃、150℃、155℃、160℃、165℃、170℃、175℃、180℃、185℃、190℃、195℃或200℃,沸腾时间2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h或6h，使得混合液充分的融合，其密闭容器为反应釜。
步骤S3，将提取的拥有药效成分的水溶液离心去渣，药液用膜浓缩技术进行浓缩获得浓缩液。
步骤S4，将含有药效成分浓缩液配制成一定浓度经过柱层析分离并浓缩冻干获得具有药效成分的灵芝多糖GLP-2。
该方法提取工艺简单，多糖提取率高、生产成本低，操作简单。
本发明的另一目的在于提供一种灵芝多糖GLP-2，所述灵芝多糖GLP-2的结构式
分子式C30H50O25)n，其中，n＝92-147。
n为92、96、100、105、110、115、120、125、130、135、140、144或147。
在获得上述结构的灵芝多糖GLP-后，对其进行测定实验，并得到了如下报告结果。
二、分子量测定
1.实验目的
通过HPGPC测定多糖分子量和纯度。
2.实验材料
2.1仪器
2.2材料
试剂 厂家 批号 货号 级别 有效日期
NaCl ACROS A0356762 139725000 ACROS 2022年
2.3标准品
3.实验步骤
3.1试剂配制
试剂名称 配制方法 保存条件 有效期
0.05M NaCl溶液 精密配制，过0.45μm滤膜，超声脱气10min RT 一个月
3.2样品及标准品溶液配制
精密称取样品和标准品，样品配制成5mg/ml溶液，12000rpm离心10min，上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将样品转置于1.8ml进样小瓶中。
3.3色谱方法
色谱柱：BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm)；流动相：0.05M NaCl溶液；流速：0.6ml/min，柱温：40℃；进样量：20μl；检测器：示差检测器RI-10A。
4.实验结果
如图2-4所示，得到lgMp-RT(峰位分子量)，lgMw-RT(重均分子量)，lgMn-RT(数均分子量)校正曲线。
lgMp-RT校正曲线方程为：y＝-0.1802x+11.661R2＝0.9928；
lgMw-RT校正曲线方程为：y＝-0.1926x+12.241R2＝0.9965；
lgMn-RT校正曲线方程为：y＝-0.1783x+11.506R2＝0.9911；
根据标准品曲线，得出计算公式进而计算出每个样品的分子量大小。样品的分子量图谱如图5所示，计算结果见下表。
SampleID RT(min) lgMp lgMw lgMn Mp Mw Mn 峰面积比％
37.199 5.0 5.1 4.9 90728 119254 74717 100
其中，46.5min为流动相的峰。
二、单糖组成测定实验
1.实验目的
使用离子色谱仪测定单糖组成。
2.实验原理
基于糖类分子具有电化学活性及在强碱溶液中呈离子化状态。糖类化合物为pKa＞11的弱酸，在高pH值的淋洗液中，它们会部分或全部以阴离子形式存在，根据不同糖类化合物的pKa的差异引起的离子交换作用的差异以及某些糖类与阴离子交换树脂之间的疏水性作用的不同，实现糖类化合物的高效阴离子交换分离，然后对糖分子结构中的羟基在金电极表面发生氧化反应产生的电流实现检测。
3.实验材料
3.1仪器
仪器名称 厂家 型号
离子色谱仪 ThermoFisher ICS5000
电热恒温鼓风干燥箱 力辰科技 101-1BS
氮吹仪 力辰科技 UGC-24M
电子天平 Sartorius BS210S
离心机 ThermoFisher D-37520
移液枪 DRAGONLAB 19050983
3.2试剂
试剂 厂家 批号 货号 级别
三氟乙酸 ACROS A0356762 139725000 AR
50％氢氧化钠溶液 Alfa Aesar Z21E036 33382 GR
醋酸钠 ThermoFishe 191126 059326 GR
3.3标准品
4.实验方法
4.1试剂配制
试剂名称 配制方法 保存条件
15mMNaOH溶液 2.4g50％NaOH溶液,2L水 RT
15mMNaOH&100mMNaOAC溶液 1.2g50％NaOH溶液,8.2gNaOAC，1L水 RT
4.2标准溶液的配制和计算方法
取16种单糖标准品(岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖、古罗糖醛酸、甘露糖醛酸)配成标准母液溶液。
取各单糖标准溶液精密配制浓度标准品作为混标。根据绝对定量方法，测定不同单糖质量，根据单糖摩尔质量计算出摩尔比。
4.3样品准备
精密称量5mg样品置于安瓿瓶中，加入3M TFA 2ml，120℃水解3h。准确吸取酸水解溶液转移至管中氮吹吹干，加入5ml水涡旋混匀，吸取50uL加入950uL去离子水，12000rpm离心5min。取上清进IC分析。
4.4色谱方法
色谱柱：DionexCarbopacTMPA20(3*150mm)；流动相：A:H2O；B:15mMNaOHC:15mMNaOH&100mMNaOAC；流速：0.3ml/min；进样量：5μL；柱温：30℃；检测器：电化学检测器。
4.5标准品序列
No. Name ppm Name RT Area
1 岩藻糖 5 Fuc 5.659 18.741
2 盐酸氨基半乳糖 3 GalN 10.084 23.888
3 鼠李糖 5 Rha 10.475 10.717
4 阿拉伯糖 3.7 Ara 11.092 16.035
5 盐酸氨基葡萄糖 5 GlcN 12.367 31.057
6 半乳糖 5 Gal 13.767 17.597
7 葡萄糖 5 Glc 15.484 20.442
8 N-乙酰-D氨基葡萄糖5 5 GlcNAc 16.792 13.652
9 木糖 5 Xyl 17.834 22.737
10 甘露糖 5 Man 18.117 14.734
11 果糖 15 Fru 20.534 12.857
12 核糖 10 Rib 22.484 26.868
13 半乳糖醛酸 5 GalA 45.125 8.815
14 古罗糖醛酸 10 GulA 45.950 20.824
15 葡萄糖醛酸 5 GlcA 48.509 11.689
16 甘露糖醛酸 10 ManA 50.992 22.847
C(标准品)/A(标准品)＝C(样品)/A(样品)
5.实验结果
混标：溶剂峰：2.0min为氢氧化钠的峰，41min乙酸钠的峰。如图6、7所示。
Name RT 摩尔比
岩藻糖 5.959 0.000
盐酸氨基半乳糖 10.817 0.000
鼠李糖 11.334 0.000
阿拉伯糖 11.792 0.000
盐酸氨基葡萄糖 13.384 0.000
半乳糖 14.609 0.000
葡萄糖 16.759 0.789
N-乙酰-D氨基葡萄糖 18.55 0.000
木糖 19.209 0.000
甘露糖 19.825 0.000
果糖 22.259 0.000
核糖 24.309 0.000
半乳糖醛酸 44.592 0.000
古罗糖醛酸 45.092 0.042
葡萄糖醛酸 47.284 0.168
甘露糖醛酸 50.2 0.000
三、多糖连接方式测定实验
1.实验目的
多糖样品甲基化等衍生后GC-MS测其连接方式。
2.实验材料
2.1仪器
仪器名称 厂家 型号
旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司 R-1001VN
氮吹仪 力辰科技 UGC-24M
磁力搅拌器 DLAB MS7-H550-Pro
真空干燥箱 力辰科技 101-1BS
气相质谱联用仪 Agilent 6890-5973
2.2试剂
3.实验方法
3.1试剂配制
试剂名称 配制方法 保存条件
3M三氟乙酸 1V三氟乙酸+3V水 5℃冰箱保存
氢化钠干燥粉末 60％氢化钠正己烷洗 干燥常温
硼氘化钠氢氧化钠溶液 20mg+20mM NaOH溶液 密封保存
20％乙酸甲醇溶液 1V冰乙酸+4V水 5℃冰箱保存
多糖甲基化试剂盒 A液无水碱溶液 5℃冰箱保存
B液碘甲烷溶液
3.2样品甲基化
样品经甲基化、水解、乙酰化后，经GC-MS测定并与标准质谱图库进行比对。
称量多糖样品(2-3mg)置于玻璃反应瓶中，加入1mL无水DMSO，快速加入甲基化试剂A液，封闭，在超声作用下溶解，再加入甲基化试剂B液。在磁力搅拌水浴30℃反应60min。最后将2mL超纯水加入到上述混合物中终止甲基化反应。
取甲基化后的多糖，加入1ml的2M三氟乙酸(TFA)水解90min，旋转蒸发仪蒸干。残基加入2ml双蒸水，60mg硼氢化钠还原8小时，加入冰醋酸中和，旋蒸，101度烘箱烘干，然后加入1ml乙酸酐乙酰化100℃反应1h，冷却。然后加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复4-5次，以除去多余的醋酐。
将乙酰化后的产物用3mL CH2Cl2溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，如此重复4次。CH2Cl2层以适量的无水硫酸钠干燥，定容10mL，放入液相小瓶。分析采用Shimadzu GCMS-QP 2010气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品。
GC-MS条件：RXI-5SIL MS色谱柱30m*0.25mm*0.25um；程序升温条件为：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min；保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃，载气为氦气，流速为1mL/min。
4.实验结果
样品(PMAA)GCMS色谱图，如图8所示。
多糖甲基化糖醇乙酰酯(PMAA)结果分析，见下表及如图9-13所示。
四、核磁解析图谱及解析
1.实验材料及仪器
重水(D2O，99.9％)、氘代丙酮为内参；冷冻干燥仪、核磁共振仪布鲁克600M(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)；
2.实验步骤
称取多糖样品50mg，将其溶于0.5ml的重水中并冷冻干燥。随后将冻干粉再溶于0.5ml的重水中，并继续冷冻干燥，重复以上过程，以充分交换活泼氢。然后将样品溶于0.5ml的重水中，在室温25℃下置于以600MHz的核磁共振仪测定1H NMR谱、13C NMR谱、DEPT135一维图谱和二维图谱。
3.实验结果
氢谱信号主要集中在3.0～5.5ppm之间。δ3.2-4.0ppm为糖环质子信号，主要端基质子峰δ4.66、4.64、4.46、4.43、4.41，的信号峰集中分布在4.3～5.5ppm区域内。如图14所示。
碳谱分析在13C NMR(201MHz,D2O)：核磁碳谱信号主要集中在60-120ppm之间。通过观察碳谱，可以看到主要异头碳信号峰δ103.92、103.88、103.82、103.81、103.11异头碳区域主要在δ93～105之间。而δ74.51、76.73、70.88、76.4、70.48、74.75、85.63、69.62、77.02、62.03、74.15、71.56、80.14、76.67、61.66、76.68、74.08、81.22、75.39、70.19、72.71、74.54、69.22、76.07、62.12ppm区域。根据单糖组成结果，该多糖由葡萄糖组成。说明该多糖主要为葡聚糖。如图15所示。
Dept135图谱分析，70.48、70.19、62.12、62.03、61.66ppm峰为倒峰，表明为C6的化学位移。如图16所示。
如图17-20所示，通过HSQC图谱，可以观察到异头碳信号为δ103.11，HSQC图谱中对应的异头氢信号是δ4.64，通过HH-COSY，H1-2的信号为4.64/3.51；H2-3的信号为3.51/3.67；H3-4的信号为3.67/3.73；我们可以推断出H1，H2，H3，H4分别为δ4.64、3.51、3.67、3.73。对应的δ103.11、72.71、74.54、69.22。通过Dept135，可以推断出C6为62.12ppm，对应的H6b为3.83ppm，6a的信号为3.63ppm,对应的C5为76.07；因此，该信号应归属于糖苷键β-Glcp-(1→。
通过HSQC图谱，可以观察到异头碳信号为δ103.94，HSQC图谱中对应的异头氢信号是δ4.66，通过HH-COSY，H1-2的信号为4.66/3.47；H2-3的信号为3.47/3.65；我们可以推断出H1，H2，H3，分别为δ4.66、3.47、3.65。对应的δ103.88、74.75、85.63。
通过HH-COSY，H6b-a的信号为3.81/3.62；H6a-5的信号为3.62/3.39；对应的H6b，H6a，H5分别为3.81、3.62、3.39。对应的C5为77.02；C6的化学位移为δ62.03。因此，该信号应归属于糖苷键→3)-β-Glcp-(1→。
通过HSQC图谱，可以观察到异头碳信号为δ103.92，HSQC图谱中对应的异头氢信号是δ4.41，通过HH-COSY，H1-2的信号为4.41/3.22；H2-3的信号为3.22/3.38；H3-4的信号为3.38/3.54；我们可以推断出H1，H2，H3，H4分别为δ4.41、3.22、3.38、3.54，其对应的C1-4为δ103.92，74.51，76.73，70.88；而NOESY图谱观察到δ4.43与3.38、3.54、3.76、4.12有相关峰，Dept135结合HSQC可以判断δ3.76，4.12归属为H6a,b的峰，H5为3.54ppm。对应的C5为76.40；C6的化学位移为δ70.48，对应的H6a为δ3.76，4.11。因此，该信号应归属于糖苷键→6)-β-Glcp-(1→。
根据类似规律并结合HMBC和NOESY，对所有糖苷键信号进行归属，如下表：
氢，碳信号归属
主链分析：
HMBC图谱中，根据核磁一维二维图谱，我们对多糖的糖苷键信号进行归属；糖苷键→6)-β-D-Glcp-(1→的异头氢与→4,6)-β-D-Glcp-(1→的C6有相关信号峰；表明存在→6)-β-D-Glcp-(1→4,6)-β-DGlcp-(1→的链接方式。
支链分析：
NOESY图谱中，糖苷键β-D-Glcp-(1→的异头氢与其→3)-β-D-Glcp-(1→的H3有相关信号峰；表明存在β-D-Glcp-(1→3)-β-D-Glcp-(1→的链接方式。
糖苷键→3)-β-D-Glcp-(1→的异头氢与其→4)-β-D-Glcp-(1→的H4有相关信号峰；表明存在→3)-β-D-Glcp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→的链接方式。
糖苷键→4)-β-D-Glcp-(1→的异头氢与其→4,6)-β-D-Glcp-(1→的H4有相关信号峰；表明存在→4)-β-D-Glcp-(1→4,6)-β-D-Glcp-(1→的链接方式。
综上所述，我们可以推断出该多糖的主链为β-1,6的葡聚糖，而β-D-Glcp-(1→3)-β-D-Glcp-(1→和β-D-Glcp-(1→3)-β-D-Glcp-(1→→4)-β-D-Glcp-(1→分别通过→4,6)-β-D-Glcp-(1→的o-4和→4,6)-β-D-Glcp-(1→的o-4键连接在主链上，分子简化式如下所示。
本发明的另一目的在于提供一种灵芝多糖GLP-2的应用，所述灵芝多糖GLP-2水溶性能好，易被人体吸收，具备抗肿瘤药效且对人类预防肿瘤的发生具备功效，尤其是与化疗药联合使用时，可消除因化疗药对人体产生的毒副作用并对肿瘤块的控制、减少以及肿瘤细胞的减少和消灭具备效果。
所述灵芝多糖GLP-2应用于抑制肿瘤扩散药物中或增强人体免疫力药物中。
灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠抗肿瘤作用实验和数据
实验目的
采用C57小鼠右侧腋下接种LLC肺癌瘤块匀浆液制备荷瘤小鼠，研究灵芝多糖GLP-2对肺癌荷瘤小鼠的抗肿瘤作用，为其临床研究提供实验依据。
实验材料
供试品
灵芝多糖GLP-2，由深圳市奥力美肿瘤医疗技术有限公司提供。
阳性对照品
顺铂，批号：E2128081，上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品。
实验动物
SPF级雄性C57小鼠68只，体重16～18g，由广东医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2022-0002，实验动物质量合格证编号：44007200109382。
主要试剂
PBS缓冲液，由深圳市奥力美肿瘤医疗技术有限公司配制；胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司产品；DMEM培养基，Gibco公司产品；0.25％胰酶，Gibco公司产品。
主要仪器
游标卡尺，上海工具厂有限公司产品；I-2000型天平，东莞市南城长协电子制品厂；眼科剪、眼科镊，上海金钟医疗器械有限公司产品；CCL-170B-8二氧化碳培养箱，新加坡ESCO公司产品；Luna-Ⅱ细胞计数仪，南京衡桥仪器有限公司产品。
实验方法
取正常生长的LLC细胞，接种于8只健康雄性C57小鼠左肩背部皮下，待肿瘤生长至体积为2000-3000mm3时，剖取瘤块并制成匀浆悬液，注射于52只健康雄性C57小鼠腋下皮下，制成实体瘤模型。待所有小鼠肿瘤平均体积在180mm3左右时，根据瘤体体积随机分组，分别灌胃、腹腔注射给予相应药物或药物溶媒，连续给药18天。每3天测量1次肿瘤长短径，计算肿瘤体积，每3天称量1次小鼠体重。实验结束，剖取小鼠肿瘤、脾脏和胸腺称重，并计算肿瘤指数，脾脏指数和胸腺指数。
剂量设计
根据以往实验结果设计灵芝多糖GLP-2，低剂量为：50mg/kg，高剂量为：150mg/kg，按表1所示分别给予相对应药物。
顺铂给药剂量设计依据：根据顺铂临床用量每人每天不超过100mg/m2及小鼠对顺铂的耐受能力，从中选定4mg/kg剂量作为给药剂量。
表1试验分组和剂量设计
检测指标
疗效指标
相对肿瘤抑制率
相对肿瘤抑制率(％)＝(1-TRTV/CRTV)×100％。其中，TRTV为实验组相对肿瘤体积，CRTV为模型对照组相对肿瘤体积。相对肿瘤体积RTV＝Vt/V0，Vt为给药第t天时小鼠肿瘤体积，V0为分组时小鼠肿瘤体积。评价标准：相对肿瘤抑制率≥40％，并经统计学分析P<0.05为有效抑制水平。
肿瘤生长抑制率
肿瘤生长抑制率(％)＝(1-T/C)×100％。其中，T表示治疗组平均瘤重，C表示模型对照组平均瘤重。评价标准：肿瘤生长抑制率≥40％及统计学分析P＜0.05为有效抑制水平。
脾脏、胸腺脏器系数：末次给药后取脾脏、胸腺、肿瘤称重并计算脏器系数。
肿瘤指数(％)＝瘤重/体重×100％。
免疫器官指数(mg/g)＝器官质量/体重×1000。
数据处理与统计分析
采用SPSS17.0进行统计分析，统计学意义的水平设定为P≤0.05，计量资料采用均数±标准差表示，用Leven’s test方法检验正态性和方差齐性，如果符合正态性和方差齐性(P>0.05)，用单因素方差分析(ANOVA)和LSD test进行统计分析；如果不符合正态性和方差齐性(P<0.05)，则用Kruskal-Wallis检验，如果Kruskal-Wallis检验有统计学意义(P<0.05)，则用Dunnett’s Test(非参数方法)进行比较分析。评价时考虑统计学差异和生物学意义。
实验结果
动物死亡情况
如表2所示，顺铂组死亡率为25％，其余各组小鼠死亡率为0。
表2各组生存动物数及死亡率统计
灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠体重的影响
如表3所示，与正常组相比，模型对照组在D15～D18小鼠体重显著升高，顺铂组、顺铂+GLP-2低剂量组、高剂量组在D6～D18小鼠体重显著降低。
与模型对照组相比，顺铂组在D9～D18小鼠体重显著降低，顺铂+GLP-2低剂量组、高剂量组在D6～D18小鼠体重显著降低。
与顺铂组相比，顺铂+GLP-2低剂量组在D9～D18小鼠体重显著降低，顺铂+GLP-2高剂量组在D18小鼠体重显著降低。
表3灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠体重的影响
注：与模型对照组比较，+P<0.05；与顺铂组比较，#P<0.05；与正常组比较，*P<0.05。
灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠肿瘤体积的影响
如表4所示，与模型对照组比较，顺铂组、顺铂+GLP-2低剂量组、顺铂+GLP-2高剂量组从D6～D18肿瘤体积显著降低。
与顺铂组相比，顺铂+GLP-2低剂量组、顺铂+GLP-2高剂量组从D15～D18肿瘤体积显著降低。
表4灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠肿瘤体积的影响(x±s)
注：与模型对照组比较，+P<0.05；与顺铂组比较，#P<0.05。
灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠相对肿瘤抑制率的影响
如表5所示，与模型对照组相比，顺铂组在D6～D18相对肿瘤抑制率在40％以上，分别为41.7％、40.1％、56.2％、68.0％、70.9％；顺铂+GLP-2低剂量组在D6～D18相对肿瘤抑制率在50％以上，分别为52.7％、54.0％、71.1％、80.8％、85.5％；顺铂+GLP-2高剂量组在D6～D18相对肿瘤抑制率在45％以上，分别为53.7％、48.7％、66.2％、79.3％、83.3％。
如表6所示，与顺铂组相比，顺铂+GLP-2低剂量组在D15～D18相对肿瘤抑制率为39.9％、50.3％(P<0.05)，顺铂+GLP-2高剂量组在D15～D18相对肿瘤抑制率为35.4％、42.5％(P<0.05)。
表5灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠相对肿瘤抑制率(与模型对照组相比)的影响
注：与模型对照组比较，+P<0.05。
表6灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠相对肿瘤抑制率(与顺铂组相比)的影响
注：与顺铂组比较，#P<0.05。
灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠脏器系数、肿瘤生长抑制率的影响
如表7所示，与模型组相比，顺铂组、顺铂+GLP-2低剂量组、顺铂+GLP-2高剂量组肿瘤指数、脾脏指数和胸腺指数均显著降低。与顺铂组相比，顺铂+GLP-2低剂量组、顺铂+GLP-2高剂量组肿瘤指数、脾脏指数均显著降低。与正常组相比，模型对照组脾脏指数显著升高，顺铂+GLP-2低剂量组脾脏指数显著降低；模型对照组、顺铂组、顺铂+GLP-2低剂量组、顺铂+GLP-2高剂量组胸腺指数显著降低。
与模型对照组相比，顺铂组肿瘤生长抑制率为67.3％，顺铂+GLP-2低剂量组、高剂量组分别为83.6％、81.2％。与顺铂组相比，顺铂+GLP-2低剂量组、高剂量组肿瘤生长抑制率分别为49.7％、42.4％。
表7灵芝多糖GLP-2联合化疗对LLC肺癌荷瘤小鼠脏器指数、肿瘤生长抑制率的影响
注：与模型对照组比较，+P<0.05；与顺铂组比较，#P<0.05；与正常组比较，*P<0.05。
如图21-24所示，为荷瘤小鼠图片，对应组别分别为：图21：模型对照组，图22：顺铂组，图23：顺铂+GLP-2低剂量组，图24：顺铂+GLP-2高剂量组
如图25-28所示，为荷瘤小鼠肿瘤图片，对应组别分别为：图25：模型对照组，图26：顺铂组，图27：顺铂+GLP-2低剂量组，图28：顺铂+GLP-2高剂量组
结论
灵芝多糖GLP-2联合顺铂能显著抑制LLC肺癌荷瘤小鼠肿瘤的增长，且具有显著的增效作用。
灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠抗肿瘤作用实验和数据
实验目的
采用C57小鼠右侧腋下接种H22肝癌瘤块匀浆液制备荷瘤小鼠，研究灵芝多糖GLP-2对肝癌荷瘤小鼠的抗肿瘤作用，为其临床研究提供实验依据。
实验材料
供试品
灵芝多糖GLP-2，由深圳市奥力美肿瘤医疗技术有限公司提供。
阳性对照品
顺铂，批号：E21268081，上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品。
实验动物
SPF级雄性C57小鼠55只，体重16～18g，由广东医学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2022-0002，实验动物质量合格证编号：44007200104725。
主要试剂
PBS缓冲液，由深圳市奥力美肿瘤医疗技术有限公司配制；胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司产品；1640培养基，Gibco公司产品；0.25％胰酶，Gibco公司产品。
主要仪器
游标卡尺，上海工具厂有限公司产品；I-2000型天平，东莞市南城长协电子制品厂；眼科剪、眼科镊，上海金钟医疗器械有限公司产品；CCL-170B-8二氧化碳培养箱，新加坡ESCO公司产品；Luna-Ⅱ细胞计数仪，南京衡桥仪器有限公司产品。
实验方法
将H22小鼠肝癌匀浆悬液，注射于45只健康雄性C57小鼠腋下皮下，制成实体瘤模型。待所有小鼠肿瘤平均体积在150mm3左右时，根据瘤体体积随机分组，分别灌胃、腹腔注射给予相应药物或药物溶媒，连续给药18天。每3天测量1次肿瘤长短径，计算肿瘤体积，每3天称量1次小鼠体重。实验结束，剖取小鼠肿瘤、脾脏和胸腺称重，并计算肿瘤指数，脾脏指数和胸腺指数。
剂量设计
根据以往实验结果设计灵芝多糖GLP-2，低剂量为：50mg/kg，高剂量为：150mg/kg，按表8所示分别给予相对应药物。
顺铂给药剂量设计依据：根据顺铂临床用量每人每天不超过100mg/m2及小鼠对顺铂的耐受能力，从中选定3mg/kg剂量作为给药剂量。
表8试验分组和剂量设计
检测指标
疗效指标
相对肿瘤抑制率
相对肿瘤抑制率(％)＝(1-TRTV/CRTV)×100％。其中，TRTV为实验组相对肿瘤体积，CRTV为模型对照组相对肿瘤体积。相对肿瘤体积RTV＝Vt/V0，Vt为给药第t天时小鼠肿瘤体积，V0为分组时小鼠肿瘤体积。评价标准：相对肿瘤抑制率≥40％，并经统计学分析P<0.05为有效抑制水平。
肿瘤生长抑制率
肿瘤生长抑制率(％)＝(1-T/C)×100％。其中，T表示治疗组平均瘤重，C表示模型对照组平均瘤重。评价标准：肿瘤生长抑制率≥40％及统计学分析P＜0.05为有效抑制水平。
脾脏、胸腺脏器系数：末次给药后取脾脏、胸腺、肿瘤称重并计算脏器系数。
肿瘤指数(％)＝瘤重/体重×100％。
免疫器官指数(mg/g)＝器官质量/体重×1000。
数据处理与统计分析
采用SPSS17.0进行统计分析，统计学意义的水平设定为P≤0.05，计量资料采用均数±标准差表示，用Leven’s test方法检验正态性和方差齐性，如果符合正态性和方差齐性(P>0.05)，用单因素方差分析(ANOVA)和LSD test进行统计分析；如果不符合正态性和方差齐性(P<0.05)，则用Kruskal-Wallis检验，如果Kruskal-Wallis检验有统计学意义(P<0.05)，则用Dunnett’sTest(非参数方法)进行比较分析。评价时考虑统计学差异和生物学意义
实验结果
动物死亡情况
如表9所示，各组小鼠死亡率为0。
表9各组生存动物数及死亡率统计
灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠体重的影响
如表10所示，与正常组相比，模型对照组在D18小鼠体重显著升高；顺铂组在D12～D18小鼠体重显著降低；顺铂+GLP-2低剂量组在D6～D18小鼠体重显著降低；顺铂+GLP-2高剂量组在D12～D18小鼠体重显著降低。
与模型对照组相比，顺铂组在D12～D18小鼠体重显著降低，顺铂+GLP-2低剂量组在D6～D18小鼠体重显著降低，顺铂+GLP-2高剂量组在D9～D18小鼠体重显著降低。
与顺铂组相比，顺铂+GLP-2低剂量组在D6、D9、D12、D18小鼠体重显著降低。
表10灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠体重的影响
注：与模型对照组比较，+P<0.05；与顺铂组比较，#P<0.05；与正常组比较，*P<0.05。
灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠肿瘤体积的影响
如表11所示，与模型对照组比较，顺铂组从D12～D18肿瘤体积显著降低，顺铂+GLP-2低剂量组、顺铂+GLP-2高剂量组从D6～D18肿瘤体积显著降低。
与顺铂组相比，顺铂+GLP-2低剂量组从D15～D18肿瘤体积显著降低，顺铂+GLP-2高剂量组从D12～D18肿瘤体积显著降低。
表11灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠肿瘤体积的影响
注：与模型对照组比较，+P<0.05；与顺铂组比较，#P<0.05。
灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠相对肿瘤抑制率的影响
如表12、表13所示，与模型对照组相比，顺铂组在D12～D18相对肿瘤抑制率在45％以上，分别为47.29％、52.99％、64.27％；顺铂+GLP-2低剂量组在D9～D18相对肿瘤抑制率在45％以上，分别为47.69％、64.57％、72.10％、79.82％；顺铂+GLP-2高剂量组在D6～D18相对肿瘤抑制率在45％以上，分别为45.85％、60.34％、76.86％、77.87％、83.93％。
与顺铂组相比，顺铂+GLP-2低剂量组在D15～D18相对肿瘤抑制率为40.64％、43.52％(P<0.05)，顺铂+GLP-2高剂量组在D12～D18相对肿瘤抑制率为56.10％、52.93％、55.03％(P<0.05)。
表12灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠相对肿瘤抑制率(与模型对照组相比)的影响
注：与模型对照组比较，+P<0.05。
表13灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠相对肿瘤抑制率(与顺铂组相比)的影响
注：与顺铂组比较，#P<0.05。
灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠脏器系数、肿瘤生长抑制率的影响
如表14所示，与模型组相比，顺铂组、顺铂+GLP-2低剂量组、顺铂+GLP-2高剂量组肿瘤指数、脾脏指数和胸腺指数均显著降低。与顺铂组相比，顺铂+GLP-2低剂量组、顺铂+GLP-2高剂量组肿瘤指数显著降低。与正常组相比，模型对照组脾脏指数显著升高；顺铂组、顺铂+GLP-2低剂量组、顺铂+GLP-2高剂量组胸腺指数显著降低。
与模型对照组相比，顺铂组肿瘤生长抑制率为57.3％，顺铂+GLP-2低剂量组、高剂量组分别为76.4％、79.3％。与顺铂组相比，顺铂+GLP-2低剂量组、高剂量组肿瘤生长抑制率分别为44.8％、51.6％。
表14灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22肝癌荷瘤小鼠脏器指数、肿瘤生长抑制率的影响
注：与模型对照组比较，+P<0.05；与顺铂组比较，#P<0.05；与正常组比较，*P<0.05。
如图29-32所示，为荷瘤小鼠图片，对应组别分别为：图29：模型对照组，图30：顺铂组，图31：顺铂+GLP-2低剂量组，图32：顺铂+GLP-2高剂量组
如图33-36所示，为荷瘤小鼠肿瘤图片，对应组别分别为：图33：模型对照组，图34：顺铂组，图35：顺铂+GLP-2低剂量组，图36：顺铂+GLP-2高剂量组
结论
灵芝多糖GLP-2联合顺铂能显著抑制H22肝癌荷瘤小鼠肿瘤的增长，且具有显著的增效作用。
灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22原位肝癌小鼠抗肿瘤作用实验和数据
实验目的
本实验采用C57小鼠右侧腋下接种H22肝癌细胞制备原位肿瘤小鼠，研究灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22原位肝癌小鼠的抗肿瘤作用，为其临床研究提供实验依据。
实验材料
供试品
灵芝多糖GLP-2，批号：ALM20200518A1，由深圳市奥力美肿瘤医疗技术有限公司提供。
对照品
康莱特软胶囊，批号：20211006，浙江康莱特药业有限公司产品；顺铂注射液，批号：601211204，江苏豪森药业集团有限公司产品。
实验动物
SPF级雄性C57小鼠60只，体重12～15g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004，在湖南普瑞玛药物研究中心有限公司屏障环境动物实验室D区饲养，实验动物使用许可证号：SYXK(湘)2020-0015。
主要试剂
0.9％氯化钠注射液，批号：21071401C，湖南康源制药有限公司产品；ALT测定试剂盒，批号：201751，AST测定试剂盒，批号：110620，CRE测定试剂盒，批号：111644，BUN测定试剂盒，批号：201749，均为日本和光纯药工业株式会社产品。
主要仪器
AR223CN型电子天平，奥豪斯仪器(常州)有限公司；LABOSPECT003型自动生化分析仪，日本日立公司；AniView100多模式动物活体成像系统，ANDOR产品；TDZ5-WS型台式多管自动平衡离心机，湖南省凯达实业发展有限公司；ME2002E型电子天平，日本岛津公司产品；流式细胞仪器，BD公司产品；ASP200S型全自动组织脱水机、ASP300S型全自动组织脱水机、TP1020型全自动脱水机、HI1210型摊片机、HI1220型烤片机、RM2235型石蜡切片机、EG1150H+C型组织包埋机、AutoStainer XL自动载玻片染色机+CV5030自动盖片机、BX43型生物显微镜+MD50型数码成像系统、CX31型生物显微镜，德国Leica公司。
实验方法
采用Luc标记荧光的浓度为1×107个/mL的肝癌(H22)细胞，首先接种于5只雄性C57小鼠腹腔，待小鼠出现腹水，无菌抽取腹水，HBSS缓冲液洗涤，离心弃上清，台盼蓝染色并于显微镜下计数腹水细胞，HBSS缓冲液调整细胞数至1×1013/mL接种于45只雄性C57小鼠右侧肝区，制备成原位荷瘤小鼠，接种体积10μL/只。1周后采用小动物活体成像仪检测小鼠肝脏成瘤情况，根据肿瘤大小随机分组，分别为：模型对照组、顺铂组(4mg/kg)、康莱特软胶囊组(1404mg/kg)、顺铂+康莱特软胶囊组(4+1404mg/kg)、顺铂+GLP-2低剂量组(4+130mg/kg)、顺铂+GLP-2高剂量组(4+1170mg/kg)，每组6只，另取6只小鼠作为正常对照组。正常对照组、模型对照组灌胃给予纯水，化疗组小鼠进行腹腔注射顺铂，其余各组小鼠分别给予相应药液，给药体积分别为20mL/kg(灌胃)、10mL/kg(腹腔注射)，1次/日，连续给药14天。末次给药后，眼眶采血检测血液WBC、RBC、肝肾功能指标(ALT、AST、BUN、CRE)和CD3+/CD4+、CD3+/CD8+，取脾脏、胸腺、肿瘤称重后计算脏器系数。
剂量设计
根据以往实验结果设计灵芝多糖GLP-2，低剂量为：130mg/kg，高剂量为：1170mg/kg，按表15所示分别给予相对应药物。
康莱特软胶囊临床拟用量为0.45g/粒，6粒/次，4次/天，即为10.8g/天，按体表面积换算成小鼠等效剂量为10.8g/日*0.0026/0.02kg＝1404mg/kg。本试验以临床拟用剂量的等倍进行试验。
顺铂给药剂量设计依据：根据顺铂临床用量每人每天不超过100mg/m2及小鼠对顺铂的耐受能力，从中选定4mg/kg剂量作为给药剂量。
表15试验分组和剂量设计
检测指标
疗效指标
动物生存率及一般情况：每周称重一次，并记录动物死亡情况。
肿瘤体积检测：采用小动物活体成像技术每周检测各组肿瘤体积变化。
血液学检测：末次给药后血常规(WBC、RBC)、生化(肝、肾脏功能)指标检测。
免疫器官：取胸腺、脾脏、肿瘤、肝脏称重，并计算脏器系数。脏器系数(％)＝脏器重量/禁食后体重×100％
CD4+、CD8+含量检测：末次给药后采用流式细胞仪检测血液淋巴细胞分型CD3+/CD4+，CD3+/CD8+含量。
数据处理与统计分析
本试验数据有效数字修约按照四舍五入进行，并按照中心SOP规定进行统计学分析，统计所用软件为SPSS。计量资料以均数±标准差表示，用Leven’s test方法检验正态性和方差齐性。如果没有统计学意义(P>0.05)，用单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析。如果ANOVA有统计学意义(P≤0.05)，用LSD test(参数法)进行比较分析。如果方差不齐(P≤0.05)，则用Kruskal-Wallis检验。如果Kruskal-Wallis检验有统计学意义(P≤0.05)，则用Dunnett’sTest(非参数方法)进行比较分析。统计结果以α＝0.05为检验界限，其中P≤0.05表示有统计学意义，P≤0.01表示所检验的差别有非常显著性意义。
实验结果
动物死亡情况
如表16所示，给药前小鼠活动正常，其行动、步态正常；给药后，可见小鼠的活动减少，肿瘤增长后其饮食饮水受到影响，体重增长小。模型对照组2M01于D12天死亡；顺铂组3M01/3M05、3M02相继于D9、D10天死亡；康莱特软胶囊组4M01于D9天死亡；顺铂+康莱特软胶囊组5M01、5M06相继于D8、D11天死亡；顺铂+GLP-2高剂量组7M03、7M04、7M05相继于D8、D12、D11天死亡。
各组死亡率分别为0％、16.7％、50.0％、16.7％、16.7％、0％、50.0％。其中顺铂组、顺铂+GLP-2高剂量组死亡率最高，均达到50.0％。
表16各组生存动物数及死亡率统计
灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22原位肝癌小鼠体重的影响
如表17所示，与正常对照组比较，模型对照组给药后W2周小鼠体重显著降低(P≤0.01)；与模型对照组比较，顺铂组、顺铂+康莱特软胶囊组、顺铂+GLP-2低剂量组、顺铂+GLP-2高剂量组给药后W1、W2周小鼠体重均显著降低(P≤0.05或P≤0.01)。与顺铂组比较，康莱特软胶囊组给药后W2周小鼠体重显著升高(P≤0.05或P≤0.01)。与康莱特软胶囊组比较，顺铂联合GLP-2低、高剂量组给药W1、W2周小鼠体重均显著降低(P≤0.05或P≤0.01)。与顺铂+康莱特软胶囊组比较，各给药组无统计学意义。
表17灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22原位肝癌小鼠体重的影响
注：与正常对照组比较，++P≤0.01；与模型对照组比较，*P≤0.05，**P≤0.01；与顺铂组比较，#P≤0.05，##P≤0.01；与康莱特软胶囊组比较，&P≤0.05，&&P≤0.01；与顺铂+康莱特软胶囊组比较，★P≤0.05，★★P≤0.01。
灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22原位肝癌小鼠肿瘤的影响
如图37、38、表18所示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠肿瘤显著增加(P≤0.01)；与模型对照组比较，顺铂联合GLP-2低剂量组，康莱特软胶囊组给药W1、W2小鼠肿瘤显著减小(P≤0.05或P≤0.01)；顺铂组、顺铂联合康莱特软胶囊组给药W2小鼠肿瘤显著减小(P≤0.05或P≤0.01)。与顺铂组比较，各组无统计学差异。与康莱特软胶囊组比较，顺铂联合康莱特软胶囊组给药W1小鼠肿瘤显著增加(P≤0.05或P≤0.01)；顺铂联合GLP-2高剂量组给药W1、W2小鼠肿瘤显著增加(P≤0.05)。与顺铂+康莱特软胶囊组比较，顺铂联合GLP-2低剂量组给药W1、W2小鼠肿瘤显著减小(P≤0.05)；其余各组无统计学差异。
如图37所示，对应组别分别为：A：正常组，B：模型对照组，C：顺铂组，D：康莱特软胶囊组，E：顺铂+康莱特软胶囊组，F：顺铂+GLP-2低剂量组，G：顺铂+GLP-2高剂量组。
如图38所示，对应组别分别为：1：正常组，2：模型对照组，3：顺铂组，4：康莱特软胶囊组，5：顺铂+康莱特软胶囊组，6：顺铂+GLP-2低剂量组，7：顺铂+GLP-2高剂量组。
表18灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22原位肝癌小鼠肿瘤的影响
注：与正常对照组比较，++P≤0.01；与模型对照组比较，*P≤0.05，**P≤0.01；与顺铂组比较，#P≤0.05，##P≤0.01；与康莱特软胶囊组比较，&P≤0.05，&&P≤0.01；与顺铂+康莱特软胶囊组比较，★P≤0.05，★★P≤0.01。
灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22原位肝癌小鼠脏器系数、肿瘤生长抑制率的影响
如表19所示，与正常对照组比较，模型对照组脾脏、肝脏组织的脏器系数均显著升高(P≤0.05或P≤0.01)；与模型对照组比较，顺铂联合GLP-2低、高剂量组小鼠胸腺系数、脾脏系数均显著降低(P≤0.05或P≤0.01)，顺铂组、顺铂+康莱特软胶囊组小鼠胸腺系数、脾脏系数均显著降低(P≤0.05)。与顺铂组比较，各给药组无统计学差异。与康莱特软胶囊组比较，顺铂联合GLP-2低、高剂量组小鼠胸腺系数、脾脏系数均显著降低(P≤0.05或P≤0.01)，顺铂联合康莱特软胶囊组小鼠脾脏系数显著降低(P≤0.05或P≤0.01)，其余给药组无统计学差异。
表19灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22原位肝癌小鼠脏器系数的影响
注：与正常对照组比较，+P≤0.05，++P≤0.01；与模型对照组比较，*P≤0.05，**P≤0.01；与顺铂组比较，#P≤0.05；与康莱特软胶囊组比较，&P≤0.05，&&P≤0.01。
灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22原位肝癌小鼠血液生化指标的影响
如表20所示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠血液AST、CRE显著升高(P≤0.01)；与模型对照组比较，顺铂联合GLP-2低剂量组、康莱特软胶囊组小鼠血液WBC显著降低(P≤0.05)，顺铂联合GLP-2高剂量组小鼠血液BUN显著降低(P≤0.05)。与顺铂组比较，顺铂联合GLP-2高剂量组小鼠血液BUN显著降低(P≤0.05)。与康莱特软胶囊组比较，顺铂联合GLP-2低、高剂量组小鼠血液RBC均显著降低(P≤0.05或P≤0.01)。与顺铂+康莱特软胶囊组比较，顺铂联合GLP-2高剂量组小鼠血液WBC显著升高(P≤0.05或P≤0.01)；其余各组无统计学意义。
表20灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22原位肝癌小鼠血液生化指标的影响
注：与正常对照组比较，+P≤0.05，++P≤0.01；与模型对照组比较，*P≤0.05，**P≤0.01；与顺铂组比较，#P≤0.05，##P≤0.01；与康莱特软胶囊组比较，&P≤0.05，&&P≤0.01；与顺铂+康莱特软胶囊组比较，★P≤0.05，★★P≤0.01。
如表21所示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠血液CD3+/CD4+、CD3+/CD8+有升高趋势，但无统计学意义。与模型对照组比较，顺铂联合GLP-2低剂量组小鼠血液CD3+/CD8+显著升高(P≤0.05)；顺铂联合GLP-2高剂量组小鼠血液CD3+/CD4+、CD3+/CD8+显著升高(P≤0.05)。与顺铂组比较，顺铂联合GLP-2低剂量组小鼠血液CD3+/CD8+显著升高(P≤0.05)；顺铂联合GLP-2高剂量组小鼠血液CD3+/CD4+、CD3+/CD8+均显著升高(P≤0.05)。与康莱特软胶囊组比较，各组无统计学意义。与顺铂+康莱特软胶囊组比较，各组无统计学意义。
表21灵芝多糖GLP-2联合化疗对H22原位肝癌小鼠血液CD3+/CD4+、CD3+/CD8+的影响/>
注：与模型对照组比较，*P≤0.05；与顺铂组比较，#P≤0.05；与康莱特软胶囊组比较，&P≤0.05；与顺铂+康莱特软胶囊组比较，★P≤0.05。
如图39-42结果所示，模型对照组小鼠肝脏出现大量肝癌细胞浸润及坏死，肝窦细胞数目增加，并出现炎细胞浸润；脾脏髓外造血明显增加、红髓弥漫，胃出现肝癌细胞浸润，浆膜出现病灶，胃黏膜广泛萎缩。灵芝多糖GLP-2联合顺铂进行给药后，各组肝脏肝癌细胞浸润和坏死程度降低，脾脏髓外造血增加，胃与肾脏未见明显病变
如图39-42所示，对应组别分别为：A：正常组，B：模型对照组，C：顺铂组，D：康莱特软胶囊组，E：顺铂+康莱特软胶囊组，F：顺铂+GLP-2低剂量组，G：顺铂+GLP-2高剂量组
结论
灵芝多糖GLP-2联合顺铂能显著抑制H22原位肝癌小鼠肿瘤的增长，且具有明显的增效作用。
讨论与总结
肝癌是一种病死率极高的恶性肿瘤，目前采用手术切除加化疗介入治疗，放疗等多只是延缓症状，完全治愈非常困难。肝癌对化疗不敏感，尤其对于晚期肝癌患者，至今没有可靠的证据证明全身化疗可以提高晚期肝癌的总生存期。
本实验结果显示，模型对照组小鼠肿瘤体积显著增加，脾脏指数、肝脏指数显著增加，血液中红细胞数量显著增加，白细胞数量显著降低，肝肾功能显著异常，表明模型对照组小鼠在肿瘤发生过程中淋巴系统功能下降。末次给药后，灵芝多糖GLP-2联合顺铂能显著抑制小鼠肿瘤的增长，胸腺指数、脾脏指数显著降低，小鼠血液中红细胞数量显著降低，白细胞数量显著增加，肝肾功能相关指标有一定程度的恢复。CD4+T细胞和CD8+T细胞介导肿瘤免疫应答，其中CD8+T细胞是肿瘤免疫的主要效应细胞。结果表明，灵芝多糖GLP-2联合顺铂小鼠血液中CD3+/CD4+、CD3+/CD8+含量显著升高，表明灵芝多糖GLP-2联合顺铂可以保护免疫器官，增强机体的自身免疫功能，从而发挥降低毒性和提高抗肿瘤的作用。组织病理学结果也表明，灵芝多糖GLP-2能增强机体免疫。此外，灵芝多糖GLP-2联合顺铂相较于康莱特软胶囊联合顺铂，肿瘤、脾脏系数、胸腺系数均显著减小，本实验结果表明，灵芝多糖GLP-2联合顺铂抗肿瘤效果强于康莱特软胶囊联合顺铂。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种灵芝多糖GLP-2，其特征在于，所述灵芝多糖GLP-2的分子结构式
分子式：C30H50O25)n，其中，n＝92-147。
2.根据权利要求1所述的灵芝多糖GLP-2，其特征在于，n为92、96、100、105、110、115、120、125、130、135、140、144或147。
3.一种提取灵芝多糖GLP-2的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、将灵芝去尘烘干后进行破碎处理制成灵芝粉末；
S2、将破碎的灵芝粉末置于密闭容器中与水混合加热，在高温高压下将灵芝粉末与水充分融合成药汁溶液；
S3、利用膜浓缩技术将药汁溶液进行分离获得具有药效成分浓溶液和未完全融合药渣；
S4、将含有药效成分浓溶液与纯水配比成预设浓度的水溶液经过多次柱层析分离技术获得具有药效成分的灵芝多糖GLP-2。
4.根据权利要求3所述的提取灵芝多糖GLP-2的方法，其特征在于，所述步骤S2中将密闭容器中灵芝粉末与水混合充分搅拌后高温加热至105-200℃，煮沸时间持续2-6h，密闭容器随着加热温度升高其内压力逐渐升高形成密闭容器高温高压环境。
5.根据权利要求4所述的萃取灵芝多糖GLP-2的方法，其特征在于，所述步骤S2中将密闭容器中灵芝粉末与水的混合液体高温加热至105-170℃，煮沸时间持续3-6h，密闭容器随着加热温度升高其内压力逐渐升高形成密闭容器高温高压环境。
6.根据权利要求5所述的提取灵芝多糖GLP-2的方法，其特征在于，所述步骤S4中将含有药效成分的浓缩液与纯水配制成浓度比为1:2-1:5。
7.根据权利要求6所述的提取灵芝多糖GLP-2的方法，其特征在于，所述步骤S3中将提取的拥有药效成分水溶液利用膜浓缩技术将其中的灵芝残渣去除获得药效成分浓缩液或膏状物。
8.根据权利要求7所述的提取灵芝多糖GLP-2的方法，其特征在于，所述步骤S1中将灵芝通过清水冲洗去除表面的浮尘物经105℃烘干，将烘干后的灵芝进行破碎，其破碎的灵芝粉末大于60目。
9.根据权利要求8所述的提取灵芝多糖GLP-2的方法，其特征在于，所述步骤S2中将密闭容器中混合液体高温加热至105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃、145℃、150℃、155℃、160℃、165℃、170℃、175℃、180℃、185℃、190℃、195℃或200℃，煮沸时间2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h或6h，密闭容器随着加热温度升高其内压力逐渐升高形成密闭容器高温高压环境。
10.根据权利要求1或2中所述灵芝多糖GLP-2的应用，其特征在于，所述灵芝多糖GLP-2水溶性能好，易被人体吸收，具备抗肿瘤药效且对人类预防肿瘤的发生具备功效，尤其是与化疗药联合使用时，可消除因化疗药对人体产生的毒副作用并对肿瘤块的控制、减少以及肿瘤细胞的减少和消灭具备效果。
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