CN111647096B - 一种中性玛咖多糖及其提取方法与应用 - Google Patents

一种中性玛咖多糖及其提取方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种中性玛咖多糖及其提取方法与应用，中性玛咖多糖主链为→4)‑α‑D‑Glcp‑(1→的糖苷键，端基α‑D‑Glcp‑(1→通过O‑6键连接在主链上；分子量为8‑9kDa；该多糖是从传统中药玛咖中提取的天然高分子化合物，其自身具有良好的药理活性、生物可降解性和生物相容性，主链结构上含有大量羟基，能够与多种化学活性官能团结合，利于修饰和改性，纯化得到分子量均一的中性玛咖多糖，采用氨基化合物乙二胺键合到天然多糖骨架表面，得到阳离子化的玛咖多糖，操作简单，成本低，产业化程度高；本发明多糖提取物有巨大的潜力，可以作为免疫调节治疗剂，具有免疫疾病治疗的应用前景。

Description

一种中性玛咖多糖及其提取方法与应用
技术领域
本发明属于医药领域，涉及一种中性玛咖多糖及其提取纯化方法与其在肿瘤免疫治疗中的应用。
背景技术
天然多糖在生物体内具有重要作用，它不仅是生物体结构的主要组成成分之一，而且具有生物分子识别和信息传递的功能，目前关于天然多糖的生物功能报道非常多，如抗衰老和抗病毒等药理作用。玛咖(Lepidiummeyenii.Walp)是原产南美洲安第斯山脉的一种十字花物。叶子椭圆，根茎形似小圆萝卜，可食用，是一种纯天然食品，营养成份丰富，有“南美人参”之誉，我国自2002年以来开始在云南丽江引种玛咖。玛咖含有多糖、生物碱和黄酮类等多种成分，其中最主要的活性物质-玛咖多糖具有抗疲劳、护肝的作用，同时具有良好的生物相容性、生物可降解性和生物活性等优势。
大多数植物多糖都是相对无毒，并且不会引起副作用，所以植物多糖有巨大的潜力。
发明内容
本发明提供一种中性玛咖多糖，来源于天然植物玛咖根茎部位，分子量为8-9kDa，单糖组成主要是葡萄糖，其主链连接方式为→4)-α-D-Glcp-(1→的糖苷键，端基α-D-Glcp-(1→通过O-6键连接在主链上。
本发明还提供所述中性玛咖多糖的提取方法，具体步骤如下：
干燥玛咖根茎粉碎过80目筛后在100℃热水提取2h，过滤，滤液置于45℃～50℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，加Sevag试剂除去游离蛋白质，浓缩至原体积的1/3，加入4倍体积的无水乙醇，析出沉淀，55℃水浴除乙醇至无乙醇味，真空冷冻干燥，得到玛咖粗多糖；阴离子交换纤维素柱层析纯化，依次采用蒸馏水和浓度为0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，选取蒸馏水洗脱液用3500Da透析袋透析24小时，真空冷冻干燥得到冻干粉，进一步纯化得到白色中性玛咖多糖。
所述干燥玛咖根茎与热水的体积比为1:20。
所述Sevag试剂为二氯甲烷与正丁醇体积比为4:1混合的混合物。
所述进一步纯化是采用葡聚糖凝胶G-50柱层析进一步纯化，是将冻干粉溶于去离子水中，配制成2mg/mL的溶液，4000r/min离心5min，取上清液，经Sephadex G-50(2.4cm×110cm)柱层析，以浓度为0.1mol/L的NaCl溶液洗脱，流速0.5mL/min，收集多糖凝胶柱分离谱图对称峰的前9-18管样品，对水在3500Da透析袋透析后真空冷冻干燥，得到纯化的白色中性玛咖多糖。
本发明还提供所述中性玛咖多糖的应用，取50mg中性玛咖多糖与111.3mg乙二胺、150mg N，N-羰基二咪唑混合溶解在50mL无水二甲基亚砜中，将混合物在35℃下搅拌20小时，然后2000Da透析袋用水透析纯化阳离子多糖，冷冻干燥收集得到阳离子多糖，该中性玛咖多糖及阳离子多糖具有抗肿瘤活性并能够将M2型肿瘤相关巨噬细胞重塑为M1型，改善肿瘤微环境，能运用于肿瘤免疫治疗药物的制备及药物递送。
本发明的有益效果为：
(1)本发明分离提取了来自云南丽江的玛咖多糖，对其基本结构进行了鉴定，得到一种新的结构，完善了人们对玛咖物质基础的认识，为玛咖多糖的后续研究奠定了基础。
(2)本发明通过控制反应的条件，可以制备出不同取代度的阳离子化玛咖多糖。
(3)本发明研究了玛咖多糖及其阳离子化衍生物的免疫调节活性，有望成为免疫调节治疗剂，能运用于肿瘤免疫治疗药物的制备及药物递送。
(4)本发明通过将玛咖多糖进行阳离子化修饰，使其免疫活性进一步加强，提高其生物活性，为理解并进一步研究玛咖多糖免疫调节活性机制奠定了基础。
附图说明
图1实施例1的多糖纤维素柱分离谱图；
图2实施例1的多糖凝胶柱分离谱图；
图3实施例2的多糖相对分子质量谱图；
图4实施例2的多糖的单糖组成；
图5实施例2的多糖的红外谱图；
图6实施例2的多糖1H谱图；
图7实施例2的多糖13C谱图；
图8实施例2的多糖Dept135谱图；
图9实施例2的多糖HSQC谱图；
图10实施例2的多糖COSY谱图；
图11实施例2的多糖NOESY谱图；
图12实施例2的多糖HMBC谱图；
图13实施例2的多糖结构单元图；
图14实施例3的阳离子化多糖的合成路线图；
图15实施例3的多糖和阳离子化多糖1H谱图；
图16实施例4的离体肿瘤大小；
图17实施例4的用药期间肿瘤抑制率；
图18实施例4中的流式细胞仪测得细胞平均荧光强度(MFI)。
具体实施方式
下面通过实施例和附图进一步阐述本发明的实质特点，但本发明的保护范围绝非仅局限于实施例。
实施例1
中性玛咖多糖的提取与纯化，具体步骤如下：
(1)取来自云南丽江的黑玛咖原药材块茎烘干(50℃)，粉碎后过80目筛，按照料液比为1:20(v/v)，在100℃热水中提取2h，将提取液过滤，滤液置于45℃～50℃下旋转蒸发浓缩至浓稠(原体积的1/3)，加Sevag试剂(二氯甲烷与正丁醇的体积比为4:1的混合物)除去游离蛋白质后，45℃～50℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，加入4倍体积的无水乙醇，析出沉淀，55℃水浴除乙醇至无乙醇味，真空冷冻干燥，得到淡黄色玛咖粗多糖；
(2)称取300mg步骤(1)制备的玛咖粗多糖溶于20mL去离子水中，通过阴离子交换纤维素柱DEAE-52(4cm×60cm)进行柱层析，以多于一个柱体积的蒸馏水洗脱，随后依次使用一个柱体积的浓度为0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为24mL/h，8mL收集1管，通过苯酚-硫酸法隔管检测，得到两个洗脱组分(图1多糖纤维素柱分离谱图所示)，选取中性多糖浓度高的蒸馏水洗脱液，收集该组分，3500Da透析袋透析24小时，真空冷冻干燥得到冻干粉末；采用葡聚糖凝胶G-50柱层析进一步纯化，将冻干粉末溶于去离子水中，配制成2mg/mL的溶液，离心(4000r/min，5min)，取上清液，经Sephadex G-50(2.4cm×110cm)柱层析，以浓度为0.1mol/L的NaCl溶液洗脱，流速0.5mL/min，8mL收1管，通过苯酚-硫酸法隔管检测，得一多糖洗脱峰，收集该洗脱峰前9-18管样品，对水在3500Da透析袋透析后真空冷冻干燥，得纯化中性玛咖多糖(MPW)(图2多糖凝胶柱分离谱图)。
实施例2
中性玛咖多糖的结构解析：
(1)分子量测定：
使用高效液相色谱仪(岛津LC-10A)联同示差检测器(WATERS-2414)进行检测，以不同相对分子质量的葡聚糖(Mw：1152，5200，11600，23800，148000，273000，410000)作为标准品，色谱柱为BRT105-104-102串联凝胶柱(8mm×300mm)，样品浓度5.0mg/mL，进样量20μL，流动相为浓度为0.05mol/L的NaCl，流速为0.8mL/min，柱温箱40℃，绘制标准曲线；随后将中性玛咖多糖MPW配制成5mg/mL浓度的溶液，按照上述参数进行测试，检测结果如图3所示，MPW呈现均一、对称的峰形，根据葡聚糖标准品的校准曲线，计算MPW的分子量约为8684Da。
(2)中性玛咖多糖组成：
乙酰化衍生物的制备：精确称量实施例1制备得到的中性玛咖多糖2mg，加入1mL浓度为2mol/L的三氟乙酸，充氮气保护，封管，在120℃温度下水解90min，置于45℃～50℃下旋转蒸发仪蒸干，然后残基中加入2mL双蒸水和100mg硼氢化钠还原，加入冰醋酸中和，置于45℃～50℃下旋转蒸发浓缩蒸干，110℃烘箱烘干，然后加入1mL乙酸酐，在100℃下继续乙酰化反应1h；反应结束后，加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复以上步骤5次，以除去多余的乙酸酐；将乙酰化后的产物用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，如此重复5次，氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥，定容至10mL；采用配有RXI-5SIL MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)的Shimadzu GCMS-QP 2010气相色谱-质谱联用仪测定乙酰化产物样品，GC-MS条件如下：起始温度120℃，以3℃/min升温至250℃/min，保持5min，进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min。
与单糖标准品(顺序：鼠李糖，岩藻糖，阿拉伯糖，木糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖)对照，单糖标准品谱图及MPW的谱图见图4，通过对比得出，乙酰化后的单糖组成主要是葡萄糖。
(3)甲基化分析：
将2mg实施例1制备得到的中性玛咖多糖MPW置于反应瓶中，加入6mL DMSO，快速加入200mg NaOH粉末，封闭，在超声作用下溶解，再加入碘甲烷反应1h，最后加入水到上述混合物中终止甲基化反应；取甲基化后的多糖，加入1mL浓度为2mol/L的三氟乙酸，充氮气保护，封管，在120℃温度下水解90min，45℃～50℃下旋转蒸发仪蒸干，然后残基中加入2mL双蒸水和100mg硼氢化钠还原，加入冰醋酸中和，置于45℃～50℃下旋转蒸发浓缩蒸干，110℃烘箱烘干，然后加入1mL乙酸酐，在100℃下继续反应1h进行乙酰化；反应结束后，加入3mL甲苯，减压浓缩蒸干，重复以上步骤4-5次，以除去多余的乙酸酐；将乙酰化后的产物用3mL氯仿溶解后转移至分液漏斗，加入少量蒸馏水充分震荡后，除去上层水溶液，如此重复5次，氯仿层以适量的无水硫酸钠干燥，定容至10mL；采用配有RXI-5 SIL MS色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)的Shimadzu GCMS-QP 2010气相色谱-质谱联用仪来测定甲基化产物，GC-MS条件如下：起始温度120℃，以4℃/min升温至280℃/min；保持5min；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃/min，载气为氦气，流速为1mL/min，通过GC-MS分析，MPW甲基化结果如下表1所示，主要含有三种糖苷键连接，分别是：D-Glcp(1→、→4)-D-Glcp–(1→、→4,6)-D-Glcp(1→，摩尔比为0.050:0.875:0.075，结果表明，MPW存在(1→4)连接的D-吡喃葡萄糖基和(1→4,6)连接的D-吡喃葡萄糖基，其中，→4)-D-Glcp→所占的摩尔比为0.875，可推断其为主要的链接结构。
表1
甲基糖苷 结构链接 摩尔比 m/z
2,3,4,6-Me<sub>4</sub>-Glcp Glcp-(1→ 0.050 43,71,87,101,117,129,145,161,205
2,3,6-Me<sub>3</sub>-Glcp →4)-Glcp-(1→ 0.875 43,87,99,101,113,117,129,131,161,173,233
2,3-Me<sub>2</sub>-Glcp →4,6)-Glcp-(1→ 0.075 43,71,85,87,99,101,117,127,159,161,201
(4)红外分析：
采用KBr法对实施例1制备得到的中性玛咖多糖MPW进行红外分析，将5mg多糖样品与色谱纯的200mgKBr一起用玛瑙研钵研磨混匀，用压片机压成薄片，之后用傅里叶红外光谱仪在4000cm-1～400cm-1范围内进行红外光谱扫描，根据红外谱图5可以看出，3365cm-1处的吸收峰是多糖-OH的伸缩振动吸收峰，而2923cm-1的吸收峰是C-H的伸缩振动吸收峰，1631cm-1处的吸收峰是-OH的弯曲振动吸收峰，1403cm-1处吸收峰＝CH2的变形吸收峰，在850cm-1处存在α-型糖苷键的特征吸收峰，说明MPW为α-多糖，在1014cm-1、1079cm-1和1157cm-1处的吸收峰也表明是吡喃糖形式的糖，929cm-1和850cm-1处的吸收峰表明MPW是D-吡喃葡萄糖衍生物，因此，可以断定MPW属于α-吡喃糖型的葡聚糖。
(5)核磁分析：
将实施例1制备得到的中性玛咖多糖MPW(80mg)溶于400μLD2O(氘代度99.96％)中，然后转移至5mm NMR管中，在Bruker 800-MHz NMR光谱仪上进行一维1H、13C、Dept135光谱和二维HSQC，COSY和HMBC，NOESY光谱的扫描；根据1H谱图6可知，信号主要集中在3.0～5.5ppm之间，这是一个典型的多糖特征，主要端基质子峰δ4.89、5.29、5.13、5.32的信号峰集中分布在4.3～5.5ppm区域内，三个糖残基的三个明显的化学位移信号分别出现在5.32、4.89和5.26ppm处，它们分别被指定为→4)-D-Glcp→1(残基A)，→4,6)-D-Glcp(1→(残基B)和D-Glcp(1→(残基C)的异头质子；根据13C谱图7可以看到核磁碳谱信号主要集中在60-120ppm之间，在δ99.94、100.95、101.32处是主要异头碳信号峰，而δ60～85ppm相对较高的场中的信号分别归因于C-2至C-6，MPW质子和碳的完整分配分别基于2D HSQC、COSY、NOESY和HMBC-NMR光谱进行分配；根据图8Dept135图谱分析，61.86ppm、62.09ppm峰为倒峰，表明为C6的化学位移；通过图9HSQC图谱，可以观察到异头碳信号为δ101.14，HSQC图谱中对应的异头氢信号是δ5.32，通过谱图10COSY图谱，H1-2的信号为5.32/3.56；H2-3的信号为3.56/3.89；H3-4的信号为3.89/3.57；可以推断出H1，H2，H3，H4分别为δ5.32、3.56、3.89、3.57，而图11NOESY图谱观察到，δ5.32与3.57、3.78、3.90有相关峰，因此H5为3.78ppm，对应的C5为72.53；C6的化学位移为δ61.95，对应的H6a为δ3.80，因此，该信号应归属于糖苷键→4)-α-Glcp-(1→，根据类似规律并结合谱图12HMBC和NOESY，对所有糖苷键信号进行归属，如下表2：
表2
Figure BDA0002500112960000061
图12HMBC图谱中，根据核磁一维二维图谱，对多糖的糖苷键信号进行归属；糖苷键A→4)-α-D-Glcp-(1→的异头碳C1(δ101.14)与其自身的H4(δ3.55)有相关信号峰；表明存在→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→的链接方式，此外，糖苷键A→4)-α-D-Glcp-(1→的异头碳C1(δ101.14)分别与糖苷键B→4,6)-α-D-Glcp-(1→的H4(δ3.54)有相关峰，表明存在糖苷键→4)-α-D-Glcp-(1→4,6)-α-D-Glcp-(1→，因此，可以推断，该多糖的主链连接方式为A→4)-α-D-Glcp-(1→的糖苷键，而端基α-D-Glcp-(1→通过O-6键连接在主链上，结构单元如图13所示。
实施例3
(1)阳离子化玛咖多糖(C-MPW)的制备
合成路线如图14，将N，N-羰基二咪唑(CDI)与玛咖多糖、乙二胺按照表3中的比例混合溶解在无水二甲基亚砜(DMSO)中，经加热(35℃)、搅拌反应20小时、透析、冷冻干燥，得到阳离子多糖，根据元素分析法，得到C，H，N各元素含量，计算取代度，结果如下表3所示，选取取代度最高(53.37％)的第4组进行接下来的核磁和动物实验，即将MPW(50mg)，与乙二胺(111.3mg)和CDI(150mg)混合溶解在50mL无水DMSO中，并将混合物在35℃下搅拌20小时，然后用水透析(分子量截止值＝2000Da)纯化阳离子多糖(C-MPW)，冷冻干燥进一步收集C-MPW溶液。
表3
组别 CDI:MPW(m/m) CDI:乙二胺(M/M) MPW:DMSO(m/v) N(％) C(％) H(％) DS(％)
1 1:1 1:1 1:1 2.25 37.7 6.35 28.82
2 1:3 1:1 1:1 2.04 38 6.1 25.87
3 1:1 1:2 1:1 3.25 37.5 6.3 43.70
4 1:3 1:2 1:1 3.85 38 6.1 53.37
5 1:3 1:6 1:1 2.5 39.5 6 32.41
(2)C-MPW的核磁分析
将冻干的C-MPW(80mg)溶于400μLD2O(氘代度99.96％)中，然后转移至5mm NMR管中，在Bruker 800-MHz NMR光谱仪上进行1H谱的扫描，1H-NMR谱图如图15所示，阳离子产物(C-MPW)的质子信号为δH3.2-4.0，而δH2.58和δH2.83为乙二胺-CH2-CH2-的质子信号，可以判断阳离子化多糖已成功合成。
实施例4
药理学实验研究
1.实验动物：
50只BALB/c昆明小鼠(SPF级)，雌性，18-22g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号码NO.1107271911005139，置动物于干燥、通风、安静的环境中，按自由饮水、进食普通饲料饲养1周。
2.实验材料和仪器：
(1)MPW(由实施例1制备得到的中性玛咖多糖)、C-MPW(由实施例3制备得到)、小鼠乳腺癌细胞株4T1(中国科学院细胞库)、胎牛血清(FBS)(Sera&Pro公司)、RPMI 1640培养基、无血清RPMI-1640培养基(武汉普诺赛生命科技公司)、青链霉素混合液(100×)(青霉素的含量为100U/mL、链霉素含量为0.1mg/mL)(北京索莱宝科技有限公司)、Dox(MedChemExpressLLC公司)、胶原酶D(上海罗氏制药公司)、DNA酶(上海麦克林生化科技有限公司)、CD206抗体(上海艾博抗贸易有限公司)、CCR7抗体(上海艾博抗贸易有限公司)、pH7.2-7.4磷酸盐缓冲液(PBS)(上海索莱宝科技有限公司)；
(2)CO2恒温培养箱(Panasonic公司)、超净工作台(苏州金净净化设备科技有限公司)、微量移液器(中国Dragonmed)、4℃冰箱(中国海尔公司)、-80℃超低温冰箱(中国海尔公司)、电热恒温水槽(上海基玮试验仪器设备有限公司)、细胞培养板(6孔、24孔、96孔)(美国Corning公司)、离心机(DLAB公司)、Epics altra流式细胞分析仪(美国Beckmancoulter)。
(3)、主要实验试剂的配制：
胎牛血清的灭活：将胎牛血清瓶放入到56℃恒温水浴锅中，勿使瓶子倒置和淹没在水中，计时灭活30min，每隔10min轻轻晃动血清瓶，然后无菌分装，-20℃冻存，临用前37℃溶解；
磷酸盐缓冲液(PBS)：将1袋PBS白色结晶溶于2L去离子水中，用玻璃棒搅拌使其充分溶解，用HCl或NaOH溶液调节pH值在7.2-7.4范围内，然后用0.22μm微孔滤膜滤器过滤除菌，分装后，于4℃冰箱保存备用；
0.1％胶原酶+2mg/mLDNA酶消化液配制：精确称取0.1g胶原酶(活力为1:300)，用100mL无菌PBS充分搅拌溶解，然后用0.22μm微孔滤膜滤器过滤除菌，分装后于4℃冰箱保存；精确称取20mgDNA酶(活力为1:300)，用10mL无菌PBS充分搅拌溶解，然后用0.22μm微孔滤膜滤器过滤除菌，分装后于4℃冰箱保存；0.1％胶原酶与2mg/mLDNA酶按体积比为1：1混合，于4℃冰箱保存备用；
90％RPMI+10％FBS的配制：用无菌移液器精确吸取90mL RPMI-1640培养基、10mL灭活的胎牛血清和1mL青链霉素混合液(100×)于100mL无菌蓝盖试剂瓶中，混匀，即得到90％RPMI+10％FBS培养液，用封口膜封口后，于4℃冰箱保存备用。
3.实验动物的肿瘤接种及数据采集：
(1)细胞培养：4T1细胞培养在含体积分数10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，收集指数生长期的细胞，无血清RPMI-1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1×105个/mL，用于小鼠皮下肿瘤接种；
(2)肿瘤接种及分组给药方案：随机挑选实验小鼠24只，于右侧腋下接种4T1细胞(细胞重悬在无血清RPMI-1640)5×107×125uL(0.2mL/只)，定期观察肿瘤生长情况，肿瘤生长至体积约100mm3时，根据肿瘤大小和小鼠体重随机分为4组给药，每组的动物数及详细的给药途径、剂量和方案见下表4所示；
(3)实验观察和数据收集：肿瘤细胞接种后，常规监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低情况，眼睛、被毛及其它异常情况，开始给药后，每隔一天测量1次小鼠的体重和肿瘤的大小，按照下列计算公式进行计算肿瘤抑制率。
肿瘤体积(mm3)＝1/2×(肿瘤长径×肿瘤短径2)；
肿瘤生长速率(TGR，％)＝(第n天肿瘤体积/第0天肿瘤体积)×100％；
肿瘤抑制率(TSR，％)＝(TGR对照-TGR治疗)/TGR对照×100％；
表4
Figure BDA0002500112960000091
(4)样本收集：按照给药方案要求终止实验，麻醉小鼠进行拍照摘眼球取血后荷瘤及剥瘤照片采集，取材肿瘤并称重，肿瘤组织一分为二，一份保存于多聚甲醛，一份保存在-80℃冰箱内待检测；
(5)TAM的分离：将肿瘤组织用弯头剪剪成2mm大小的碎块，浸入含有含体积分数0.1％胶原酶D和2mg/mLDNA酶的消化液中，37℃温育2小时，再用200目尼龙筛过滤掉没有充分消化的肿瘤组织，滤出液400g离心5分钟，沉淀用PBS清洗两次，重悬细胞以2×106密度铺板，37℃培养1小时，吸弃培养液，用PBS清洗细胞单层，用90％RPMI+10％FBS培养，重悬细胞；
(6)流式细胞仪测定：将TAM的细胞浓度调整为1×108个/mL，取0.2mL液体加入CD206和CCR7的抗体一起温育，避光孵育20min，加入冰PBS清洗两次，1500r离心3min，通过流式细胞仪分析细胞并记录每个样品的平均荧光强度(MFI)；
(7)统计分析：所有数据采用SPSS16.0进行统计学处理，并以x±SD表示，两组数据之间采用单因素方差分析进行组间比较，p<0.05和p<0.01被认为表明具有高度统计学意义。
结果分析：
通过与常用的化疗药物Dox联合评估MPW和C-MPW的抗肿瘤作用，对比肿瘤大小(图16)，与空白相比，MPW和C-MPW与Dox联用(实验组1/和2)的治疗均表现出对肿瘤的抑制作用，且均比对照组Dox的抑制效果强，但实验组2的抑瘤效果更好，这表明MPW/C-MPW联用Dox给药后，可显著改善化疗药物引起的免疫抑制作用，TSR值也表明实验组1和2比Dox组具有更好的抗肿瘤功效(图17)，说明Dox与MPW/C-MPW联用比Dox单独使用具有更强的抗肿瘤作用，而且C-MPW比MPW更有效。
CD206被认定是一种高特异性的M2型肿瘤相关巨噬细胞标志物，而CCR7是M1型肿瘤相关巨噬细胞标志物，从肿瘤组织中纯化了TAM，并通过流式细胞仪进行了定量分析(图18)，与空白组和对照组相比，Dox+MPW组和Dox+C-MPW组(实验组1和2)中CD206的平均荧光强度(MFI)显著降低(p<0.01)，Dox+MPW组(实验组1)中CCR7的MFI分别为空白组的6.20倍和对照组的5.0倍，当用C-MPW处理时，MFI更高，是Dox+MPW组(实验组1)的1.78倍，上述结果表明该多糖可以有效地将TAM从M2型肿瘤相关巨噬细胞表型逆转为M1型肿瘤相关巨噬细胞，而且通过多糖阳离子化修饰增强了这种极化作用。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种中性玛咖多糖，其特征在于，单糖组成是葡萄糖，其主链连接方式为→4)-α-D-Glcp-(1→的糖苷键，端基α-D-Glcp-(1→通过O-6键连接在主链上；分子量为8-9kDa；
所述中性玛咖多糖通过如下方法进行制备：
干燥玛咖根茎粉碎过80目筛后在100℃热水提取2h，过滤，滤液于45℃~50℃旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，加Sevag试剂除去游离蛋白质，浓缩至原体积的1/3，加入4倍体积的无水乙醇，析出沉淀，55℃水浴除乙醇，真空冷冻干燥，得到玛咖粗多糖；阴离子交换纤维素柱层析纯化，依次采用蒸馏水和浓度为0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，选取蒸馏水洗脱液用3500Da透析袋透析24小时，真空冷冻干燥得到冻干粉，进一步纯化得到中性玛咖多糖。
2.根据权利要求1所述中性玛咖多糖，其特征在于，干燥玛咖根茎与热水的体积比为1:20。
3.根据权利要求1所述中性玛咖多糖，其特征在于，Sevag试剂为二氯甲烷与正丁醇体积比为4:1混合的混合物。
4.根据权利要求1所述中性玛咖多糖，其特征在于，进一步纯化是采用葡聚糖凝胶Ｇ-50柱层析进一步纯化，将冻干粉溶于去离子水中，配制成2mg/mL的溶液，4000r/min离心5min，取上清液，经Sephadex G-50柱层析，以浓度为0.1mol/L的NaCl溶液洗脱，流速0.5mL/min，收集多糖凝胶柱分离谱图对称峰的前9-18管样品，对水在3500Da透析袋透析后真空冷冻干燥，得到中性玛咖多糖。
5.权利要求1所述中性玛咖多糖在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
6.权利要求1所述中性玛咖多糖的阳离子化衍生物在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
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