CN112618489B - 一种具有氧化还原响应性的玛咖多糖衍生物胶束及其制备方法与应用 - Google Patents

一种具有氧化还原响应性的玛咖多糖衍生物胶束及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种具有氧化还原响应性的玛咖多糖衍生物胶束及其制备方法与应用，该胶束一端是端羧基聚乳酸‑羟基乙酸共聚物，另一端是改性的活性玛咖多糖，中间通过二硫键链接，赋予胶束氧化还原敏感特性；玛咖多糖自身具有良好的免疫活性，对活性多糖进行氧化还原修饰，使其成为两亲性氧化还原胶束，这种具有靶向性和刺激响应型纳米药物载体可以智能地递送药物，为肿瘤的综合治疗提供了新的研究方向和策略。

Description

一种具有氧化还原响应性的玛咖多糖衍生物胶束及其制备方 法与应用
技术领域
本发明涉及一种具有氧化还原响应性的玛咖多糖衍生物胶束及其制备方法与靶向肿瘤治疗药物上的应用，属高分子载药材料技术领域。
背景技术
在近年的递药系统研究领域中，许多天然大分子(多糖、蛋白质、凝集素等)和合成高分子(PLGA、PEG等)被用作药物缓控释或靶向传递的载体，高分子的纳米材料被广泛用作抗癌药物递送载体，并且这些载体通常具有很好的缓释效果，可以提高药物的生物利用度和体液循环时间，提高药物的利用度，达到良好的治疗效果。
恶性增殖是肿瘤的特性之一，肿瘤内部代谢非常旺盛，肿瘤内环境存在大量还原性谷胱甘肽(glutathione，GSH)，使肿瘤呈现出高还原态，细胞内的谷胱甘肽浓度一般为2-10mM，远高于细胞外的谷胱甘肽浓度(2-10μM)，而肿瘤组织中的谷胱甘肽浓度是正常组织的100-1000倍。二硫键在低谷胱甘肽浓度下(≤20μM)可以稳定存在，在高谷胱甘肽浓度下(0.5-10mM)容易断裂。癌细胞中谷胱甘肽的浓度至少是正常细胞中谷胱甘肽浓度的100倍，可以使二硫键断裂。药物分子与载体通过二硫键交联使其能够高效地输送到作用位点在靶组织中累积到更高浓度，利用这一特性，许多研究相继开展。
发明内容
本发明提供一种具有氧化还原响应性的玛咖多糖衍生物胶束，该胶束是由含二硫键的疏水性端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物以及亲水性的玛咖多糖构成的两亲性嵌段聚合物，胶束一端是端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，另一端是改性的活性玛咖多糖，中间通过二硫键链接，赋予胶束氧化还原敏感特性和靶向肿瘤相关巨噬细胞特性，该胶束具有两亲性和良好的生物相容性，胶束的临界胶束浓度为10-15μg/mL，粒径范围为150-300nm，稳定性良好。
本发明还提供所述具有氧化还原响应性的玛咖多糖衍生物胶束的制备方法，具体步骤如下：
(1)含二硫键的端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物化合物的合成：
将500mg端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于20mL二氯甲烷中，加入14.5mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和23.25mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)活化2h，反应结束后，加入40μLN，N-二异丙基乙胺(DIEA)和28.25mg胱胺盐酸盐(Cys)到上述反应中，边加边搅拌，在室温下搅拌反应24小时，得到的反应溶液在冰冷的50mL乙醚中沉淀，沉淀用冰冷的甲醇洗涤3次，直至乙醚完全洗净，真空冷冻干燥即得含二硫键的端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物化合物(PLGA-ss)；
(2)玛咖多糖羧甲基化：
将玛咖多糖100mg溶于5mL去离子水中，直至完全溶解，加入浓度为3mol/L氢氧化钠溶液15mL，混合搅拌15分钟，使多糖充分碱化，然后加入2-8g一氯乙酸并充分混合，将混合物保持在65℃下加热搅拌反应4小时，反应结束后，冷却至室温，随后用冰醋酸调节混合物pH值至7.0，将混合物装进3500Da透析袋对去离子水透析直至剩余试剂被消除(1-2天)，将上述方法所制备的溶液采用真空冷冻干燥方式处理即得羧甲基化玛咖多糖(CMP)；
(3)胶束聚合物的合成：
称取CMP125mg，加入10mL甲酰胺溶解，然后再缓慢加入20mL二甲基亚砜(DMSO)，加入30mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和50mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)活化2h，反应结束以后，加入40μL三乙胺，并少量多次加入500mgPLGA-ss，在室温下搅拌反应24小时，反应结束后，将混合物装进透析袋(6000-8000Da)对去离子水透析直至剩余试剂被消除(2-3天)，然后冷冻干燥即得氧化还原响应性的玛咖多糖衍生物胶束(MP-ss-PLGA)。
步骤(1)端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA中聚丙交酯和聚乙交酯的摩尔比为50:50，分子量为7000-15000Da。
步骤(2)制备得到的玛咖多糖由专利CN 111647096 A中公开的方法制备得到，该多糖具有明确的化学结构，其主链连接方式为→4)-α-D-Glcp-(1→的糖苷键，而端基α-D-Glcp-(1→通过O-6键连接在主链上，是一种中性多糖，并且具有免疫活性，其中，玛咖多糖的分子量为8-9kDa。
步骤(3)少量多次是5-10次。
本发明还提供所述具有氧化还原响应性的玛咖多糖衍生物胶束的制备及在抗肿瘤药物中的应用，因为具有氧化还原性而具备智能型，因为玛咖多糖具备靶向性，所以本发明玛咖多糖衍生物胶束是智能靶向型向性胶束，该靶向性胶束能够靶向肿瘤相关巨噬细胞，同时，该智能型胶束聚合物是一种氧化还原敏感的胶束，可响应肿瘤微环境的变化，根据肿瘤微环境实现快速释药，从而达到更高效更智能的化疗治疗目的，提高肿瘤治疗疗效。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明结合天然多糖的免疫活性，构建具有靶向肿瘤的聚合物-药物递送载体，是一种潜有力的策略，这种体系可同时携带药物和活性多糖进行靶向递送，并特异性响应肿瘤微环境，实现多综合协同和免疫治疗作用，这种兼具靶向性和响应型纳米胶束载体可以智能地递送药物，为肿瘤的综合治疗提供了新的研究方向和策略。
(2)本发明的智能响应型靶向性胶束具有两亲性和良好的生物相容性。
(3)本发明的智能响应型靶向性胶束作为一种氧化还原敏感型胶束，可响应肿瘤微环境高谷胱甘肽(GSH)的变化，作为一种药物递送体系，为肿瘤的综合治疗提供了新的研究方向和策略。
(4)本发明采用的合成方法，不仅原料简单和实验成本低，而且反应速度快，容易控制。
附图说明
图1为PLGA-ss的1H-NMR谱图；
图2为羧甲基多糖的傅立叶变换-红外光谱图(a)13C-NMR(b)的谱图；
图3为PLGA、PLGA-ss、MP-ss-PLGA的傅立叶变换-红外光谱图；
图4为PLGA、PLGA-ss、MP-ss-PLGA的1H-NMR谱图；
图5为MP-ss-PLGA的临界聚集浓度；
图6为MP-ss-PLGA在不同GSH浓度(0M和10mM)PBS缓冲液条件下的透射电镜图；
图7为MP-ss-PLGA在不同GSH浓度(0M和10mM)和不同时间点(0、6、24h)PBS缓冲液条件下的粒径分布曲线图；
图8为MP-ss-PLGA在不同GSH浓度(0M和10mM)和不同时间点(0、6、24h)PBS缓冲液条件下的ζ电位图；
图9为MP-ss-PLGA胶束对MCF-7的细胞毒性；
图10为MP-ss-PLGA@CQ载药胶束在不同GSH浓度(0M、100μM、1mM、10mM)PBS缓冲液条件下的体外释药情况；
图11为载药胶束注射后的活体光学成像及主要器官与肿瘤组织的离体光学成像；
图12为载药胶束肿瘤组织荧光共定位分析。
具体实施方式
下面通过实施例和附图进一步阐述本发明的实质性特点和显著的进步，但本发明的保护范围绝非仅局限于实施例。实施例中使用的原材料均可市场购买得到。
实施例1
含二硫键的端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物化合物的合成，具体步骤如下：
将500mg端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)(羧基端PLGA中聚丙交酯和聚乙交酯的摩尔比为50:50，分子量为7000-15000Da)溶于20mL二氯甲烷中，加入14.5mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和23.25mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)活化2h，反应结束后，加入40μLN，N-二异丙基乙胺(DIEA)和28.25mg胱胺盐酸盐(Cys)到上述反应中，边加边搅拌，在室温下搅拌反应24小时，得到的反应溶液在冰冷的50mL乙醚中沉淀，沉淀用冰冷的甲醇洗涤3次，直至乙醚完全洗净，真空冷冻干燥即得含二硫键的端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物化合物(PLGA-ss)。
根据图1的1H-NMR结果，在PLGA-ss的图谱中，在δ2.73ppm和δ2.93ppm处出现新的吸收峰，分别属于-CH2-S-和-CH2-N-的特征吸收峰，表明胱胺已连接在PLGA上。
实施例2
玛咖多糖羧甲基化，具体步骤如下：
(1)取来自云南丽江的黑玛咖原药材块茎烘干(50℃)，粉碎后过80目筛，按照料液比为1:20(v/v)，在100℃热水中提取2h，将提取液过滤，滤液置于45℃～50℃下旋转蒸发浓缩至浓稠(原体积的1/3)，加Sevag试剂(二氯甲烷与正丁醇的体积比为4:1的混合物)除去游离蛋白质后，45℃～50℃下旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，加入4倍体积的无水乙醇，析出沉淀，55℃水浴除乙醇至无乙醇味，真空冷冻干燥，得到淡黄色玛咖粗多糖；
(2)称取300mg步骤(1)制备的玛咖粗多糖溶于20mL去离子水中，通过阴离子交换纤维素柱DEAE-52(4cm×60cm)进行柱层析，以多于一个柱体积的蒸馏水洗脱，随后依次使用一个柱体积的浓度为0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为24mL/h，8mL收集1管，通过苯酚-硫酸法隔管检测，得到两个洗脱组分，选取中性多糖浓度高的蒸馏水洗脱液，收集该组分，3500Da透析袋透析24小时，真空冷冻干燥得到冻干粉末；采用葡聚糖凝胶G-50柱层析进一步纯化，将冻干粉末溶于去离子水中，配制成2mg/mL的溶液，离心(4000r/min，5min)，取上清液，经Sephadex G-50(2.4cm×110cm)柱层析，以浓度为0.1mol/L的NaCl溶液洗脱，流速0.5mL/min，8mL收1管，通过苯酚-硫酸法隔管检测，得一多糖洗脱峰，收集该洗脱峰前9-18管样品，对水在3500Da透析袋透析后真空冷冻干燥，得纯化中性玛咖多糖(MP)；
(3)称取步骤(2)的玛咖多糖100mg溶于5mL去离子水中，直至完全溶解，加入浓度为3mol/L氢氧化钠溶液15mL，混合搅拌15分钟，使多糖充分碱化，然后加入一氯乙酸(质量2-8g)并充分混合，将混合物保持在65℃下加热搅拌反应4小时，反应结束后，冷却至室温，随后用冰醋酸调节混合物pH值至7.0，将混合物装进透析袋(3500Da)对去离子水透析直至剩余试剂被消除(1-2天)，将上述方法所制备的溶液采用真空冷冻干燥方式处理即得羧甲基化玛咖多糖(CMP)。
图2(a)是CMP的红外谱图，在1602cm-1，1420cm-1，1325cm-1附近出现新的吸收峰，表明COO-基团的存在，结合在图2(b)13C-NMR谱中，δ(ppm)178(C＝O)的新信号的出现，此部分数据验证了FT-IR中羧甲基化的结果，都是羧甲基化反应成功的证据。
产物取代度(DS)的测定参照Smith滴定法，理论上玛咖多糖的最大取代度为1，测得玛咖多糖羧甲基化取代度0.69±0.8。
实施例3
玛咖多糖衍生物胶束的合成，具体步骤如下：
称取实施例2中的CMP 125mg，加入10mL甲酰胺溶解，然后再缓慢加入20mL二甲基亚砜(DMSO)，加入30mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和50mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)活化2h，反应结束以后，加入40μL三乙胺，并少量多次(5-10次)加入实施例1制备得到的PLGA-ss 500mg，在室温下搅拌反应24小时，反应结束后，将混合物装进透析袋(6000-8000Da)对去离子水透析直至剩余试剂被消除(2-3天)，然后冷冻干燥即得氧化还原响应性的玛咖多糖衍生物胶束MP-ss-PLGA。
本实施例制备得到的MP-ss-PLGA的红外光谱(图3)显示在1761cm-1处有一个急剧的拉伸峰，对应于羧基部分的C＝O，在3432.5cm-1处表明-NH-的存在，而在1633cm-1处表明存在C＝O，PLGA-ss与MP成功合成；同时MP-ss-PLGA的1H-NMR谱图(图4)显示在2.98和3.27的化学位移分别归属与胱胺的NH2-CH2-CH2-s-结构中的亚甲基上H的化学位移，且δ3.2-4.0ppm为糖环质子信号，表示PLGA-ss和MP成功合成。
实施例4
对实施例3制备得到的MP-ss-PLGA胶束进行表征：
(1)临界聚集浓度(CMC)值的测定：
MP-ss-PLGA的临界聚集浓度(CMC)值的测定是运用芘荧光探针法来检测聚合物胶束化行为，具体操作步骤如下：
精密称取12.0mg芘转移至10mL棕色容量瓶内，甲醇作为溶剂充分溶解芘；移液管移取0.2mL上述芘的甲醇溶液转移至100mL棕色容量瓶并用甲醇定容，使得芘的甲醇溶液的浓度为1.2×10-5mM/mL，移液管移取0.5mL芘的甲醇溶液(1.2×10-5mM/mL)转移至10mL棕色的容量瓶中，在37℃水浴锅中孵育2h以上，使甲醇完全挥发，芘以薄膜的形式留在容量瓶的底部。
在上述甲醇已挥发的含芘溶液棕色容量瓶内加入浓度为10mg/mL、3.1mg/mL、1mg/mL、0.31mg/mL、0.1mg/mL、0.031mg/mL、0.01mg/mL、0.0031mg/mL的MP-ss-PLGA胶束溶液，编号、定容并摇匀，容量瓶内芘的终浓度为6.0×10-7mol/L，芘的荧光强度由荧光分光光度计测定，发射波长为334nm，荧光光谱的扫描范围为350-450nm，狭缝宽度为1.5nm，记录I374与I385处的荧光强度，以浓度对数为横坐标，I374/I385的比值为纵坐标，绘制图谱，两条拟合直线的交叉处所对应的浓度即为MP-ss-PLGA的CMC值。
临界胶束浓度越低，胶束越稳定，如图5所示，利用芘荧光探针法，测得MP-ss-PLGACMC值在12±0.12μg/mL。
(2)不同GSH浓度(0M和10mM)的PBS缓冲液条件下的MP-ss-PLGA的形貌表征：
分别配制0M和10mM的GSH的PBS缓冲溶液，将胶束溶解在不同GSH浓度的PBS缓冲液中，使胶束浓度不低于1mg/mL，取一滴胶束置于碳涂覆的铜网格上，并用滤纸除去过量的溶液，待干燥后，通过透射电镜(TEM)观察胶束的形态并拍照。
如图6的TEM图所示，随着GSH浓度从0M增大到10mM，胶束的粒径呈现逐渐增大的趋势，并出现结构不稳定且裂解的情况。
(3)不同GSH浓度(0M和10mM)和不同时间点(0、6、24h)PBS缓冲液条件下的粒径测定：
分别配制0M和10mM的GSH的PBS缓冲溶液中，将胶束溶解在不同GSH浓度的PBS缓冲液中，使胶束浓度不低于1mg/mL，超声使其溶解并均匀的分散在缓冲溶液中，通过动态光散射仪测试仪在0h、6h、24h时间点分别测试胶束溶液在不同GSH浓度溶液中的粒径分布。
如粒径发布曲线如图7所示，胶束在生理条件下(0M)稳定，直径大都在170nm左右，分散性良好，且24小时内，粒径变化不大，表明该胶束稳定性良好，在GSH还原条件下，氧化还原敏感胶束结构“崩解”，胶束粒径增大至190nm左右，这与图6的TEM结果一致。
(4)不同GSH浓度(0M和10mM)和不同时间点(0、6、24h)PBS缓冲液条件下的ζ电位测定：
使用上述步骤(3)所述的溶液，通过动态光散射仪测试仪在0h、6h、24h时间点分别测试胶束溶液在不同GSH浓度溶液中的电位。
胶束表面带有一定的负电荷，这种负电性有利于该纳米颗粒在血液中的运输，如ζ电位图(图8)所示，胶束在生理条件下(0M)，ζ电位在-40mv左右，在GSH存在条件下，ζ电位也变大至-15mv左右，但在24小时内，ζ电位变化不大，表明胶束较稳定。
实施例5
MP-ss-PLGA胶束对细胞活力的影响
使用CCK-8细胞毒性试剂盒来测定实施例3制备得到的MP-ss-PLGA胶束对人乳腺癌细胞MCF-7细胞系的细胞毒性，首先在96孔板中配置100μL的细胞悬液，将培养板在培养箱预培养24小时(37℃，5％CO2)，然后向培养板加入10μL不同浓度MP-ss-PLGA胶束(最后的浓度分别为100μg/mL、300μg/mL和500μg/mL)，另设细胞空白对照和培养基空白孔，将培养板在培养箱孵育48h，向每孔加入10μL CCK-8溶液，将培养板在37℃培养箱内孵育2小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，细胞存活率计算如下：细胞存活率＝(实验组吸光值-空白组吸光值)/(对照组吸光值-空白组吸光值)×100％，测试结果如图9所示，即使MP-ss-PLGA胶束浓度达到500μg/mL，细胞存活率仍保持在92％以上，这表明MP-ss-PLGA胶束是无毒的并且是生物相容的，可以用作良好的抗肿瘤药物递送系统。
实施例6
载氯喹胶束的制备及其在不同GSH浓度环境下体外释放，具体步骤如下：
(1)载氯喹胶束(MP-ss-PLGA@CQ)的制备：
通过透析法制备载药胶束，称取30mg胶束MP-ss-PLGA溶于5mLDMSO中，搅拌溶解，之后加入6mg氯喹(CQ)，在室温下搅拌反应12小时，反应结束后，将混合物装进分子量为3500Da的透析袋中对去离子水透析直至游离CQ被消除(2-3天)，最后将装载CQ的胶束溶液冷冻干燥，即得载药胶束(MP-ss-PLGA@CQ)，通过计算得出PLGA-ss-MP@CQ的包封率(EE)为80.7±2.25％，载药量(LC)为11.47±0.92％。
(2)MP-ss-PLGA@CQ载药胶束的不同GSH环境下体外释放：
采用透析法研究MP-ss-PLGA载药胶束在GSH条件下的药物释放特性；分别称取步骤(1)制备得到的MP-ss-PLGA@CQ粉末5mg，溶解于不同GSH浓度(0M、100μM、1mM、10mM)的3mLPBS缓冲液中，并转移到透析袋(MWCO＝3500Da)中，然后透析袋分别没于盛有GSH浓度为0M、100μM、1mM、10mM的25mL的PBS溶液的烧杯中，平行三组，上述溶液于37℃水浴锅100r/min震荡，分别在0.5、1、2、4、8、12、24h收集3mL释放溶液，同时加入相同体积的新鲜溶液；测定释放介质中CQ的量，然后绘制释放曲线。
如图10所示，随着GSH浓度的增加，药物的释放也逐渐增加，在高GSH浓度(10mM)的PBS溶液中，CQ24h累计释放量达到80％，而在PBS缓冲溶液(0M)中，CQ的累计释放最高达20％，这体现了PLGA-ss-MP@CQ载药胶束对CQ良好的控释作用，有利于CQ在还原浓度较高的肿瘤组织及肿瘤细胞内快速将CQ释放，达到增强药效的作用。
实施例7
载药胶束的体内靶向性研究：
(1)4T1乳腺癌细胞的培养：
将小鼠4T1乳腺癌细胞放置于含10％胎牛血清及1％青霉素-链霉素的1640培养基中，置于37℃5％CO2培养箱中培养，每1天更换培养液1次，每2天用0.25％胰酶消化传代一次，细胞汇合率达到90％时，收集细胞，离心去上清，加入生理盐水吹打，使细胞悬浮于生理盐水中，台盼蓝染色(细胞悬液与质量分数0.4％台盼蓝溶液以体积比9:1混合混匀染色)细胞活力测定大于95％，并进行细胞计数，调整细胞浓度为2×105/mL的细胞悬液备用；
(2)4T1乳腺癌细胞blab/c小鼠乳垫原位移植瘤实验：
随机选择9只blab/c小鼠，雌性，体重18-20g左右，饲养于SPF环境中，去除小鼠腹部的毛，充分暴露第4对乳垫，用戊巴比妥钠麻醉小鼠，使小鼠仰卧造手术台上，选择小鼠第4对乳垫，位于下腹部，后腿内侧，可见的小圆点即为乳头，在乳头处注射50uL细胞悬液进乳垫，小鼠接种细胞悬液后，每天用游标卡尺测量肿瘤长径(a)和短径(b)，按公式ab2/2计算肿瘤体积，待瘤体体积为80mm3，开始随机分组：①玛咖多糖-Cy5.5组(MP-Cy5.5)；②游离Cy5.5组(Cy5.5)；③玛咖多糖载体负荷Cy5.5组(MP-ss-PLGA@Cy5.5)；采用荧光材料Cy5.5代替CQ按照实施例6步骤(1)制备载药胶束，取荷瘤blab/c小鼠(80mm3)，按照分组依次尾静脉给药，给药剂量为0.2mL，注射后在1、6、12和24h时间点进行活体成像拍照，实验后的老鼠断颈处死，取出心、肝、脾、肺、肾和肿瘤组织，PBS清洗后，滤纸吸干表面液体，于活体荧光成像仪下进行拍照。
具体结果如图11所示，多糖聚合物更多地聚集在肿瘤部位，且主要脏器和肿瘤组织的离体成像结果与小动物活体光学成像的结果一致，结果表明，相较于多糖及游离荧光，多糖聚合物可以通过EPR效应增强对于肿瘤细胞的靶向性，能在肿瘤部位显示出更多的积累。
(3)肿瘤组织切片的制备：
取固定在4％多聚甲醛的上述(2)的肿瘤组织，将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内(直径约2cm)，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位大约10-20s组织即迅速冰结成块，在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。
取冰冻切片进行固定，首先在样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织，然后取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻，取组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，在速冻架(PE)上放置30min进行固定，最后使用恒温冰冻切片机进行切片，切片厚度为5μm。
(4)肿瘤组织切片的免疫荧光染色：
将切片置于温度为37℃恒温烘箱中30min，浸于PBS缓冲液中20min，用5％羊血清封闭，然后在37℃恒温烘箱孵育60min，孵育结束后，甩去多余的封闭液，加稀释浓度为1:100的F4/80一抗，4℃冰箱过夜，用0.01mol/L PBST(在500mL的0.01mol/L PBS缓冲液中加入500uL的Tween 20)漂洗5min×4次，然后加相应F4/80二抗于组织上进行标记，在37℃下避光孵育1h，然后再用0.01mol/L PBST漂洗5min×3次，吸去多余的水分，每个组织上滴加50uL左右的抗淬灭封片剂(含DAPI)封片，荧光显微镜下观察，拍照。
通过免疫荧光染色检查了胶束的靶向性，如图12所示，F4/80(绿色)和肿瘤组织(红色)高度重合产生黄色的荧光，在MP-ss-PLGA@Cy5.5中可以看到大量的黄色荧光，而在MP和游离Cy5.5中几乎没有黄色荧光，说明MP和游离Cy5.5不能靶向肿瘤，因此可以利用MP的免疫活性，将MP做成胶束，提高对肿瘤的靶向性，起到调节肿瘤微环境的作用。

Claims (5)

1.一种具有氧化还原响应性的玛咖多糖衍生物胶束，其特征在于，胶束一端是端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物，另一端是羧甲基化改性的玛咖多糖，中间通过二硫键链接，胶束具备氧化还原敏感特性，所述胶束的临界胶束浓度为10-15μg/mL，粒径范围为150-300nm。
2.权利要求1所述具有氧化还原响应性的玛咖多糖衍生物胶束的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）含二硫键的端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物化合物的合成：
将500mg端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于20mL二氯甲烷中，加入14.5mgN-羟基琥珀酰亚胺和23.25mg 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化2h，反应结束后，加入40μLN，N-二异丙基乙胺和28.25mg胱胺盐酸盐，边加边搅拌，在室温下搅拌反应24小时，得到的反应溶液在冰冷的50mL乙醚中沉淀，沉淀用冰冷的甲醇洗涤3次，真空冷冻干燥即得含二硫键的端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物化合物；
（2）玛咖多糖羧甲基化：
将玛咖多糖100mg溶于5mL去离子水中，加入浓度为3mol/L的氢氧化钠溶液15mL，混合搅拌15分钟，然后加入2-8g一氯乙酸并充分混合，将混合物保持在65℃搅拌反应4小时，冷却至室温，随后用冰醋酸调节混合物pH值至7.0，将混合物装进3500Da透析袋对去离子水透析1-2天，真空冷冻干燥得羧甲基化玛咖多糖；
（3）胶束聚合物的合成：
称取步骤（2）得到的羧甲基化玛咖多糖125mg，加入10mL甲酰胺溶解，然后再缓慢加入20mL二甲基亚砜，加入30mgN-羟基琥珀酰亚胺和50mg 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化2h，反应结束以后，加入40μL三乙胺，并少量多次加入500mg步骤（1）得到的含二硫键的端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物化合物，在室温下搅拌反应24小时，反应结束后，将混合物装进6000-8000Da透析袋对去离子水透析2-3天，冷冻干燥即得氧化还原响应性的玛咖多糖衍生物胶束。
3.根据权利要求2所述具有氧化还原响应性的玛咖多糖衍生物胶束的制备方法，其特征在于，步骤（1）端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物中聚丙交酯和聚乙交酯的摩尔比为50:50，分子量为7000-15000Da。
4.根据权利要求2所述具有氧化还原响应性的玛咖多糖衍生物胶束的制备方法，其特征在于，步骤（3）少量多次是5-10次。
5.权利要求1所述具有氧化还原响应性的玛咖多糖衍生物胶束在制备抗肿瘤药物中的应用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101891833A (zh) * 2009-05-21 2010-11-24 上海工程技术大学 一种羧甲基玛咖多糖的制备方法
CN105213307A (zh) * 2015-09-30 2016-01-06 天津大学 用于粘液渗透的还原响应性靶向高分子胶束及其制备方法
CN106137962A (zh) * 2016-07-27 2016-11-23 毕云科 一种负载卡莫司汀的胶质瘤靶向聚合物胶束及其制备方法
CN111647096A (zh) * 2020-05-20 2020-09-11 昆明理工大学 一种中性玛咖多糖及其提取方法与应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104522815B (zh) * 2015-01-14 2016-07-06 三株福尔制药有限公司 一种益生菌发酵玛咖组合物及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101891833A (zh) * 2009-05-21 2010-11-24 上海工程技术大学 一种羧甲基玛咖多糖的制备方法
CN105213307A (zh) * 2015-09-30 2016-01-06 天津大学 用于粘液渗透的还原响应性靶向高分子胶束及其制备方法
CN106137962A (zh) * 2016-07-27 2016-11-23 毕云科 一种负载卡莫司汀的胶质瘤靶向聚合物胶束及其制备方法
CN111647096A (zh) * 2020-05-20 2020-09-11 昆明理工大学 一种中性玛咖多糖及其提取方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Tingting Guo，et al.Lepidium meyenii Walpers polysaccharide and its cationic derivative re-educate tumor-associated macrophages for synergistic tumor immunotherapy.《Carbohydr Polym》.2020, *
刘欠,等.玛卡多糖体外抗氧化及对H2O2诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的保护作用.《中国药师》.2018,第21卷(第5期),第761-765页. *

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