CN111840566A - 作为膀胱灌注药物载体用的氟化壳聚糖及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种作为膀胱灌注药物载体用的氟化壳聚糖，具有如下结构：具有如下所示的含有伯氨基的壳聚糖分子骨架：所述壳聚糖的伯氨基与含氟功能基团之间形成的连接基团为：‑NH‑、‑N＝C‑、‑NHCH2CH(OH)‑、‑NHCH2CH(OH)CH2O‑、以及衍生基团；所述含氟功能基团为含氟脂肪链。本发明提供了一种作为膀胱灌注药物载体用的氟化壳聚糖，其合成工艺身份成熟并且操作简易，合成效率高，周期短，无需繁琐的纯化步骤即可获得高产率的膀胱灌注药物载体，其简易的合成方法为其提供了商业化的良好基础。这类部分氟化表面修饰的壳聚糖具有促药物吸收效果显著、低细胞毒性、合成方法简易及高产率等优点。

Description

作为膀胱灌注药物载体用的氟化壳聚糖及制备方法
技术领域
本发明涉及高分子化学以及医药生物材料技术领域，具体涉及基于氟化物修饰改性的壳聚糖高分子作为膀胱灌注药物载体及其制备方法和应用。
背景技术
膀胱癌是最常见的泌尿肿瘤之一，临床上75％以上的膀胱癌为非肌层浸润型膀胱癌 (NMIBC)，其中30％～80％的NMIBC患者行经尿道膀胱肿瘤切除术(TURBT)后5年内复发，10％～20％的NMIBC患者进展为肌层浸润型膀胱癌。因此，TURBT后辅助灌注化疗或免疫治疗抑制或延缓肿瘤复发已成为膀胱癌临床治疗指南首选方案。虽然TURBT后辅助化疗药物可延缓肿瘤复发，但由于膀胱的生理特性及其黏膜的生理屏障作用，使得传统方式膀胱灌注的药液在膀胱内滞留时间有限、作用时间短、生物利用度低，不能使时间、浓度依赖性的灌注药物发挥显著抗肿瘤作用，无法有效降低膀胱癌复发和进展绝对风险并有效改善预后。
壳聚糖是甲壳质脱乙酰基后的阳离子多糖，具有良好的生物安全特性和优良的黏膜黏附性能，其已被广泛应用于经粘膜给药剂型的设计。文献报道壳聚糖可通过其自身正电荷与皮肤及黏膜表面的阴性电荷作用以及疏水基团的疏水效应产生黏膜粘附，有效的延长壳聚糖溶液中生物活性物质(药物、多肽、蛋白等)在病灶部位的滞留时间，在扩散或壳聚糖降解等后期作用的驱动下，使活性物质从壳聚糖溶液中缓慢释放，从而达到局部皮肤、黏膜的长效缓释效果。
根据常理，壳聚糖貌似可以作为膀胱灌注药物载体以促进灌注药物在膀胱黏膜的生物利用度。但是，发明人通过实验发现，虽然壳聚糖可显著提高灌注药物在膀胱黏膜的生物利用度，但高浓度的壳聚糖同时会引起严重的膀胱黏膜、上皮损伤，严重限制了其作为膀胱灌注药物载体的临床应用。
因此，开发一种可改善灌注药物生物利用度的膀胱灌注药物载体，提高膀胱灌注治疗效果，同时低毒性的产品是具有挑战性的研发方向。
发明内容
本发明提供了一种作为膀胱灌注药物载体用的氟化壳聚糖，其合成工艺身份成熟并且操作简易，合成效率高，周期短，无需繁琐的纯化步骤即可获得高产率的膀胱灌注药物载体，其简易的合成方法为其提供了商业化的良好基础。这类部分氟化表面修饰的壳聚糖具有促药物吸收效果显著、低细胞毒性、合成方法简易及高产率等优点。
为解决此等技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种作为膀胱灌注药物载体用的氟化壳聚糖，具有如下结构：具有如下所示的含有伯氨基的壳聚糖分子骨架：
Figure RE-GDA0002117393300000011
所述壳聚糖的伯氨基与含氟功能基团之间形成的连接基团为：-NH-、-N＝C-、-NHCH2CH(OH)-、-NHCH2CH(OH)CH2O-、
Figure RE-GDA0002117393300000021
Figure RE-GDA0002117393300000022
以及衍生基团；
所述含氟功能基团为含氟脂肪链。
作为膀胱灌注药物载体用的氟化壳聚糖的一种优选方案：所述含氟功能基团为七氟丁酸、全氟庚酸或19F癸酸。
作为膀胱灌注药物载体用的氟化壳聚糖的一种优选方案：所述氟化壳聚糖为氟化程度达到37％-45％的七氟丁酸氟化壳聚糖盐酸盐。
作为膀胱灌注药物载体用的氟化壳聚糖的一种优选方案：所述氟化壳聚糖为氟化修饰程度为18-25％的全氟庚酸氟化壳聚糖盐酸盐分子。
一种药物复合物：包括根据权利要求1至2中任一权利要求所述的作为膀胱灌注药物载体用的氟化壳聚糖以及药物，所述药物包括膀胱灌注用的小分子药物。
药物复合物的一种优选方式：所述药物以表阿霉素(THP)作为膀胱灌注药物。
一种制备七氟丁酸氟化壳聚糖的方法，其包括如下步骤：
(1)制备壳聚糖醋酸水溶液：称取充分干燥的壳聚糖加入的醋酸水溶液中，搅拌使充分溶解，随后缓慢滴加氢氧化钠，搅拌至溶液澄清，pH在6.0-7.0；
(2)七氟丁酸的活化：称取七氟丁酸，将其溶于适量无水DMSO中，依次加入反应量EDC，NHS避光搅拌；
(3)七氟丁酸壳聚糖的制备：将上述活化好的七氟丁酸溶液分别缓慢滴加到快速搅拌的壳聚糖溶液中，避光搅拌反应。
制备七氟丁酸氟化壳聚糖的方法，进一步包括如下步骤：将反应后的溶液缓慢滴加到 KOH乙醇溶液中搅拌，过滤沉淀，用大量无水乙醇冲洗，至滤液呈中性，沉淀经甲醇、乙醚洗涤脱水，真空干燥；干燥后的沉淀物溶于盐酸溶液，冻干得不同氟化修饰程度七氟丁酸氟化壳聚糖盐酸盐分子。
一种制备全氟庚酸氟化壳聚糖的方法，其包括如下步骤：
(1)制备壳聚糖醋酸水溶液：称取充分干燥的壳聚糖加入醋酸水溶液中，搅拌使充分溶解，随后缓慢滴加氢氧化钠，搅拌至溶液澄清，pH在6.0-7.0；
(2)全氟庚酸的活化：称取全氟庚酸，将其溶于适量无水DMSO中，依次加入适量EDC，NHS避光充分搅拌；
(3)全氟庚酸壳聚糖的制备：将上述活化好的全氟酸溶液缓慢滴加到快速搅拌的壳聚糖溶液中，避光搅拌充分反应。
制备全氟庚酸氟化壳聚糖的方法，其进一步包括如下步骤：将充分反应的溶液缓慢滴加到KOH乙醇溶液中充分搅拌，过滤沉淀，用大量无水乙醇冲洗，至滤液呈中性，沉淀经甲醇、乙醚洗涤脱水，真空干燥，干燥后的沉淀物溶于盐酸溶液，冻干得全氟庚酸氟化壳聚糖盐酸盐。
本专利发明人发现壳聚糖本身是一种阳离子高分子材料，同时具备大量可修饰功能基团(-NH2),因此本发明人对壳聚糖进行氟化修饰，然后发现修饰后能够改善壳聚糖的促药物黏膜渗透吸收能力，同时减低壳聚糖的膀胱灌注毒性。
发明人设计合成了一系列氟化修饰的壳聚糖衍生物，通过小鼠膀胱组织冰冻切片荧光分析考察分析其促药物膀胱黏膜吸收性能。实验结果表明，氟化修饰的壳聚糖(简称FCS)具有比壳聚糖更显著的促药物膀胱黏膜渗透吸收的性能，且细胞以及小鼠体内安全评价试验结果表明，FCS具有很好的生物安全性，即使是高浓度的FCS也无明显的细胞毒性及膀胱黏膜上皮损伤作用。因此，本专利选择FCS作为一种新型的膀胱灌注药物载体进行进一步的研究。
通过大量实验数据表明随着壳聚糖骨架上含氟脂肪链长度以及取代度的增加，修饰产物的促药物渗透吸收能力出现先增加后降低的现象，表明对于壳聚糖的修饰不能过度氟化，氟化壳聚糖的促灌注药物黏膜渗透吸收的作用可能是壳聚糖正电荷分子骨架与含氟脂肪链共同作用的结果。
目前发明人通过选用SV-HUC-1人正常膀胱癌商品细胞建立体外膀胱黏膜屏障模型，通过考察FCS对SV-HUC-1单层细胞膜电阻、荧光黄渗透率、细胞紧密连接超微结构以及紧密连接蛋白的影响，简单阐述FCS促药物膀胱黏膜渗透吸收的作用机制。实验结果表明，FCS可显著降低SV-HUC-1单层细胞膜电阻值，增加荧光黄的渗透效率，通过改变紧密连接蛋白以及E-钙黏素蛋白的结构和空间分布调控细胞紧密连接，增加药物分子的细胞旁路摄取效率。
以表阿霉素(THP)作为膀胱灌注药物，利用本发明制备的含氟化合物修饰的壳聚糖作为药物运输载体，促使药物进入膀胱组织。实验表明本发明具有以下优点：本发明在保持显著促灌注药物膀胱黏膜吸收效率的同时，保持很好的生物相容性。通过小鼠体内灌注实验发现，含氟化合物修饰的壳聚糖改善THP在膀胱黏膜吸收的效率要显著高于THP的水溶液以及其壳聚糖溶液；同时含氟化合物修饰的壳聚糖在较低浓度下实现高效的促药物膀胱黏膜吸收。本发明提出的膀胱灌注药物载体兼具高效、低毒、价格低廉、合成简易等优点。
Figure RE-GDA0002117393300000031
含氟羧酸修饰的壳聚糖膀胱灌注药物载体的合成路线图
附图说明
图1为实施例4中荧光共聚焦显微镜对小鼠膀胱组织切片图及对比,其中表阿霉素，THP； CS,壳聚糖；FCS,氟化壳聚糖；右图为左图对应的THP相对荧光强度分析。
图2为实施例5中FCS组小鼠膀胱纵切面的切片图及对比，表阿霉素，THP；CS,壳聚糖；FCS,氟化壳聚糖；右图为左图对应的THP相对荧光强度分析。
图3为实施例6中荧光共聚焦显微镜对小鼠膀胱组织切片图及对比。
图4a为实施例7中13F-3具有很好的体外细胞安全性的对比图。
图4b为实施例7中FCS组小鼠体重与空白对照组无明显差异。
图4c为实施例7中各组灌注后小鼠膀胱与空白对照组小鼠膀胱对比图片。
图5为实施例7中免疫荧光结果对照图片，表明壳聚糖灌注组小鼠膀胱出现了严重得炎症应激与充血水肿，而FCS组与空白对照组无明显差异。(左图为膀胱组织切片的荧光共聚焦图片，右图为CS,FCS处理组与空白组control的相对荧光强度统计分析)
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明做进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权力要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，处以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：制备七氟丁酸不同修饰程度的壳聚糖(脱乙酰度≧95％，粘度100-200mpa.s), 其中全氟庚酸与N氨基葡萄糖单元的投料摩尔比例分别为1：1.1、1:2.2、1:4.4、1:8.8。
合成方法：(1)制备壳聚糖醋酸水溶液：称取200mg充分干燥的壳聚糖加入10ml1％的醋酸水溶液中，搅拌30min使充分溶解，随后缓慢滴加1.6ml 0.5M的氢氧化钠，搅拌至溶液澄清，pH在6.5左右。如此方法制备4份壳聚糖醋酸水溶液。(2)七氟丁酸的活化：分别称取7.6mg、15mg、30mg、61mg七氟丁酸，将其溶于适量无水DMSO中，依次加入反应量EDC，NHS避光搅拌1h。(3)7F丁酸壳聚糖的制备：将上述活化好的七氟丁酸溶液分别缓慢滴加到快速搅拌的壳聚糖溶液中，避光搅拌反应20h。反应结束，依次将反应缓慢滴加到100ml 0.5M KOH乙醇溶液中搅拌8h，过滤沉淀，用大量无水乙醇冲洗，至滤液呈中性，沉淀经甲醇、乙醚洗涤脱水，真空干燥30min。干燥后的沉淀物溶于10ml 0.1 M盐酸溶液，冻干得外观白色粉末的不同氟化修饰程度七氟丁酸氟化壳聚糖盐酸盐分子 (7FCS-1,7FCS-2,7FCS-3,7FCS-4)。
以上反应所得材料以茚三酮反应法检测FCS高分子表面修饰氟化脂肪链的修饰度。茚三酮反应法是一种简单、快速、准确、可靠的方法，可以准确检测水溶液中FCS高分子表面伯氨基团的数量，近而计算出FCS表面氟化基团的数量。茚三酮反应法计算以上制备FCS 的氟化修饰程度依次为：7FCS-1,6.9％；7FCS-2,10.4％；7FCS-3,23.5％；7FCS-4，42.3％。
实施例2：制备全氟庚酸不同修饰程度的壳聚糖(脱乙酰度≧95％，粘度100-200mpa.s), 其中全氟庚酸与N氨基葡萄糖单元的投料摩尔比例分别为1：1.1、1:2.2、1:4.4、1:8.8。
合成方法：(1)制备壳聚糖醋酸水溶液：称取200mg充分干燥的壳聚糖加入10ml1％的醋酸水溶液中，搅拌30min使充分溶解，随后缓慢滴加1.6ml 0.5M的氢氧化钠，搅拌至溶液澄清，pH在6.5左右。如此方法制备4份壳聚糖醋酸水溶液。(2)全氟庚酸(13氟庚酸) 的活化：分别称取13mg、26mg、51.5mg、103mg全氟庚酸，将其溶于适量无水DMSO 中，依次加入适量EDC，NHS避光搅拌1h。(3)13F庚酸壳聚糖的制备：将上述活化好的全氟酸溶液分别缓慢滴加到快速搅拌的壳聚糖溶液中，避光搅拌反应20h。反应结束，依次将反应缓慢滴加到100ml0.5M KOH乙醇溶液中搅拌8h，过滤沉淀，用大量无水乙醇冲洗，至滤液呈中性，沉淀经甲醇、乙醚洗涤脱水，真空干燥30min。干燥后的沉淀物溶于10ml 0.1M盐酸溶液，冻干得外观白色粉末的不同氟化修饰程度全氟庚酸氟化壳聚糖盐酸盐分子(13FCS-1,13FCS-2,13FCS-3,13FCS-4)。
茚三酮反应法计算以上制备FCS的氟化修饰程度依次为：13FCS-1,5.2％；13FCS-2, 11.3％；13FCS-3,21.4％；13FCS-4，42.5％。13FCS-1～13FCS-4 13氟庚羰基基团的连接效率随着全氟庚酸投料的增加为5.2％～42.5％，即平均每个壳聚糖分子中有5.2％～42.5％的葡萄糖结构单元中完成了氟化修饰，产物命名为13FCS-1,13FCS-2,13FCS-3,13FCS-4。
实施例3：制备19F癸酸不同修饰程度的壳聚糖(脱乙酰度≧95％，粘度100-200mpa.s), 其中19F癸酸与N氨基葡萄糖单元的投料摩尔比例分别为1：1.1、1:2.2。
合成方法：(1)制备壳聚糖醋酸水溶液：称取200mg充分干燥的壳聚糖加入10ml1％的醋酸水溶液中，搅拌30min使充分溶解，随后缓慢滴加1.6ml 0.5M的氢氧化钠，搅拌至溶液澄清，pH在6.5左右。如此方法制备2份壳聚糖醋酸水溶液。(2)19F癸酸的活化：分别称取18mg、36.7mg19F癸酸，将其溶于适量无水DMSO中，依次加入适量EDC，NHS 避光搅拌1h。(3)19F癸酸壳聚糖的制备：将上述活化好的19F癸酸溶液分别缓慢滴加到快速搅拌的壳聚糖溶液中，避光搅拌反应20h。反应结束，依次将反应缓慢滴加到100ml 0.5 M KOH乙醇溶液中搅拌8h，过滤沉淀，用大量无水乙醇冲洗，至滤液呈中性，沉淀经甲醇、乙醚洗涤脱水，真空干燥30min。干燥后的沉淀物溶于10ml 0.1M盐酸溶液，冻干得外观白色粉末的不同氟化修饰程度19F癸酸氟化壳聚糖盐酸盐分子(19FCS-1,19FCS-2)。
19FCS-2的水溶性比较差，无法进行后续的表征及应用评价，故用茚三酮反应法计算以上制备19FCS-1的氟化修饰程度依次为：19FCS-1,5.2％。
实施例4：制备7FCS的膀胱黏膜促渗透作用评价：将实施例1中所制备的7FCS和THP水溶液混合，经小鼠尿道灌注到膀胱，后制备小鼠膀胱冰冻切片，通过检测THP荧光在组织中的分布来评估药物载体的促药物膀胱黏膜吸收效率。
具体方法为：将10-12周的雌性C57BL/6小鼠以戊苯巴比妥溶液麻醉，以0.5％的FCS 水溶液配置0.2％的THP溶液，通过密闭式静脉留置针将其灌注到小鼠膀胱，100μl，夹闭尿道1h，随后放出膀胱内的灌注液，用1ml超纯水冲洗膀胱，取膀胱组织放入组织包埋机中置于-80℃，后进行切片用荧光共聚焦显微镜进行检测。以单纯的等浓度THP水溶液或同样配制的THP壳聚糖水溶液作为对照。
实验结果：如图1所示荧光共聚焦显微镜对小鼠膀胱组织切片进行观察，结果发现7FCS 组小鼠膀胱横切面的药物荧光分布面积及强度均显著高于壳聚糖(CS)以及空白对照组(单纯THP水溶液)，表明FCS可显著提高药物在膀胱黏膜的组织渗透性，且随着氟化程度的增高促渗透作用提高，但当氟化程度达到一定程度时(7FCS,42.3％)制备所得的FCS的促渗透作用最为显著，此时制备的7FCS溶解性较低氟化取代壳聚糖差。以上结果表明FCS可显著提高药物的渗透吸收性能，增强药物在膀胱黏膜的吸收效率，但过高的氟化取代可能不利于材料的应用。
实施例5：13FCS的促膀胱灌注药物膀胱黏膜吸收的作用：将实施例2中所制备的13FCS 和THP水溶液混合，经小鼠尿道灌注到膀胱，后制备小鼠膀胱冰冻切片，通过检测THP荧光在组织中的分布来评估药物载体的促药物膀胱黏膜吸收效率。
具体方法为：将10-12周的雌性C57BL/6小鼠以戊苯巴比妥溶液麻醉，以0.5％的13FCS 水溶液配置0.2％的THP水溶液，通过密闭式静脉留置针将其灌注到小鼠膀胱，100μl，夹闭尿道1h，随后放出膀胱内的灌注液，用1ml超纯水冲洗膀胱，取膀胱组织放入组织包埋机中置于-80℃，后进行切片用荧光共聚焦显微镜进行检测。以同样配制的THP壳聚糖水溶液作为对照。
实验结果如图2所示FCS组小鼠膀胱纵切面的药物荧光分布面积及强度均显著高于壳聚糖(CS)，表明13FCS可显著提高药物在膀胱黏膜的渗透性；同时，13FCS-3的促渗透作用最强，其氟化修饰程度为21.4％。以上结果也表明FCS促灌注药物膀胱黏膜渗透作用可能是壳聚糖阳离子骨架与氟化脂肪链共同作用的结果。
实施例6：为了筛选促灌注药物膀胱黏膜渗透效果最好的氟化壳聚糖，对实施例3中 19FCS-1以及上述各氟化修饰种类中效果最好的FCS进行小鼠体内评价。
具体方法为：将10-12周的雌性C57BL/6小鼠以戊苯巴比妥溶液麻醉，分别以0.5％的 7FCS-4，13FCS-3，19FCS-1水溶液配置0.2％的THP溶液，通过密闭式静脉留置针将其灌注到小鼠膀胱，100μl，夹闭尿道1h，随后放出膀胱内的灌注液，用1ml超纯水冲洗膀胱，取膀胱组织放入组织包埋机中置于-80℃，后进行切片用荧光共聚焦显微镜进行检测。以单纯的等浓度THP水溶液或同样配制的THP壳聚糖水溶液作为对照。
实验结果：如图3所示荧光共聚焦显微镜对小鼠膀胱组织切片进行观察，结果发现19FCS组小鼠膀胱横切面的药物荧光分布面积及强度均较THP与CS组具有显著差异，但13FCS-3的促灌注药物渗透性作用最为突出。
实施例7：对实施例6中不同种类氟化修饰氟化壳聚糖进行体外、体内安全性评价，具体实验方案如下：
以CCK-8法评价氟化壳聚糖对SV-HUC-1人正常膀胱上皮细胞的细胞毒作用考察氟化壳聚糖的体外生物安全性，具体操作如下：以1x104个/孔T24细胞接种到96孔板，37℃，5％CO2培养过夜，加入不同种类氟化壳聚糖(500ug/ml)的无血清培养基继续培养24h，然后加入适量cck-8，最终以细胞存活率评价氟化壳聚糖的体外安全性。实验结果如图4中 a所示，13F-3具有很好的体外细胞安全性，结合上述研究结果表明13F-3具有最为显著的促灌注药物膀胱黏膜吸收的作用，同时具有较好的体外细胞安全性。为了进一步评价FCS (13F-3)的生物安全性，对其进行进一步的小鼠体内安全性评价实验。
将10-12周健康C57BL/6小鼠分为三组，每组8只。实验组以15mg/ml氟化壳聚糖或壳聚糖1％醋酸水溶液灌注1h，每周灌注一次，共三周，空白对照组灌注等体积双蒸水，以小鼠的体重、生存率以及第一次给药后第28天小鼠膀胱切片的HE、免疫组化分析(CD45 和Ki67)结果评价氟化壳聚糖的体内生物安全性。
实验结果发现，小鼠在灌注壳聚糖后第二天就出现体重骤降，小鼠活动萎靡的状况并且从治疗后的第二天起小鼠出现死亡，并在陆续的3天内实验组8只小鼠全部死亡，而氟化壳聚糖组小鼠无死亡出现，如图4b所示，FCS组小鼠体重与空白对照组无明显差异。同时，如图4c所示，取各组灌注后小鼠膀胱与空白对照组小鼠膀胱对比发现，壳聚糖灌注组小鼠膀胱相对于空白组小鼠膀胱充血严重，HE染色以及图5中CD45，Ki67免疫荧光结果表明壳聚糖灌注组小鼠膀胱出现了严重得炎症应激与充血水肿，而FCS组与空白对照组无明显差异。以上实验结果表明氟化壳聚糖(13FCS-3)可显著提高灌注药物在膀胱黏膜的生物利用度，同时高浓度的氟化壳聚糖不会引起明显的膀胱黏膜、上皮损伤，具有作为膀胱灌注药物载体的可能性。、
参照例
实验设计人员分别以阿霉素(THP)、表阿霉素以及荧光染料罗丹明B作为膀胱灌注药物与壳聚糖(1％醋酸水溶液)混合制备壳聚糖膀胱灌注药物体系，膀胱灌注1h后取膀胱组织制备冰冻切片，以共聚焦荧光显微镜进行药物荧光强度分析，考察药物在膀胱组织的分布情况。实验结果表明等浓度的膀胱灌注药物的壳聚糖(5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml)溶液，在膀胱黏膜中的黏附、渗透能力显著优于灌注单纯药物的水溶液，且随着壳聚糖浓度的增加灌注体系的黏附、渗透能力越强。为了进一步考察壳聚糖作为灌注药物载体的生物安全性，项目设计者将15mg/ml的壳聚糖水溶液进行小鼠膀胱灌注处理，1h后停止灌注，正常饲养条件继续饲养小鼠，并记录其体重。实验结果发现，小鼠在灌注壳聚糖后第二天就出现体重骤降，小鼠活动萎靡的状况。从治疗后的第二天起小鼠出现死亡，并在陆续的3天内实验组 8只小鼠全部死亡，经解剖取其膀胱与空白对照组小鼠膀胱对比发现，壳聚糖灌注组小鼠膀胱相对于空白组小鼠膀胱充血严重，HE染色以及CD45，Ki67免疫荧光结果表明壳聚糖灌注组小鼠膀胱出现了严重得炎症应激与充血水肿。以上实验结果表明虽然壳聚糖可显著提高灌注药物在膀胱黏膜的生物利用度，但高浓度的壳聚糖同时会引起严重的膀胱黏膜、上皮损伤，严重限制了其作为膀胱灌注药物载体的临床应用。
对所公开的实施例的上述说明，使得本技术领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的。本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理与特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种作为膀胱灌注药物载体用的氟化壳聚糖，具有如下结构：具有如下所示的含有伯氨基的壳聚糖分子骨架：
Figure FDA0002046830770000011
所述壳聚糖的伯氨基与含氟功能基团之间形成的连接基团为：-NH-、-N＝C-、-NHCH2CH(OH)-、-NHCH2CH(OH)CH2O-、
Figure FDA0002046830770000012
Figure FDA0002046830770000013
以及衍生基团；
所述含氟功能基团为含氟脂肪链。
2.根据权利要求1所述的作为膀胱灌注药物载体用的氟化壳聚糖，其特征在于：所述含氟功能基团为七氟丁酸、全氟庚酸或19F癸酸。
3.根据权利要求1所述的作为膀胱灌注药物载体用的氟化壳聚糖，其特征在于：所述氟化壳聚糖为氟化程度达到37％-45％的七氟丁酸氟化壳聚糖盐酸盐。
4.根据权利要求1所述的作为膀胱灌注药物载体用的氟化壳聚糖，其特征在于：所述氟化壳聚糖为氟化修饰程度为18-25％的全氟庚酸氟化壳聚糖盐酸盐分子。
5.一种药物复合物，其特征在于：：包括根据权利要求1至2中任一权利要求所述的作为膀胱灌注药物载体用的氟化壳聚糖以及药物，所述药物包括膀胱灌注用的小分子药物。
6.根据权利要求5所述的药物复合物，其特征在于：所述药物以表阿霉素(THP)作为膀胱灌注药物。
7.一种制备七氟丁酸氟化壳聚糖的方法，其包括如下步骤：
(1)制备壳聚糖醋酸水溶液：称取充分干燥的壳聚糖加入的醋酸水溶液中，搅拌使充分溶解，随后缓慢滴加氢氧化钠，搅拌至溶液澄清，pH在6.0-7.0；
(2)七氟丁酸的活化：称取七氟丁酸，将其溶于适量无水二甲基亚砜(简称DMSO)中，依次加入反应量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(简称NHS)避光搅拌；
(3)七氟丁酸壳聚糖的制备：将上述活化好的七氟丁酸溶液分别缓慢滴加到快速搅拌的壳聚糖溶液中，避光搅拌反应。
8.根据权利要求7所述的制备七氟丁酸氟化壳聚糖的方法，进一步如下步骤：
将反应后的溶液缓慢滴加到氢氧化钾(简称KOH)乙醇溶液中搅拌，过滤沉淀，用大量无水乙醇冲洗，至滤液呈中性，沉淀经甲醇、乙醚洗涤脱水，真空干燥；干燥后的沉淀物溶于盐酸溶液，冻干得不同氟化修饰程度七氟丁酸氟化壳聚糖盐酸盐分子。
9.一种制备全氟庚酸氟化壳聚糖的方法，其包括如下步骤：
(1)制备壳聚糖醋酸水溶液：称取充分干燥的壳聚糖加入醋酸水溶液中，搅拌使充分溶解，随后缓慢滴加氢氧化钠，搅拌至溶液澄清，pH在6.0-7.0；
(2)全氟庚酸的活化：称取全氟庚酸，将其溶于适量无水DMSO中，依次加入适量EDC，NHS避光充分搅拌；
(3)全氟庚酸壳聚糖的制备：将上述活化好的全氟酸溶液缓慢滴加到快速搅拌的壳聚糖溶液中，避光搅拌充分反应。
10.根据权利要求9所述制备全氟庚酸氟化壳聚糖的方法，其进一步包括如下步骤：
将充分反应的溶液缓慢滴加到KOH乙醇溶液中充分搅拌，过滤沉淀，用大量无水乙醇冲洗，至滤液呈中性，沉淀经甲醇、乙醚洗涤脱水，真空干燥，干燥后的沉淀物溶于盐酸溶液，冻干得全氟庚酸氟化壳聚糖盐酸盐。
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