CN113730332A - 一种靶向肿瘤表面胶原的促进剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的一种靶向肿瘤表面胶原的促进剂及其制备方法与应用，将聚乙二醇、EDC和NHS与二甲基亚砜进行混合得到溶液B，然后将溶液B滴加到溶有氟化壳聚糖的溶液A1或溶有壳聚糖的溶液A2，对应得到PFCS或PCS，向所述PCS滴加全氟庚酸溶液改性得到PFCS，向上述两种方案得到的聚乙二醇改性的氟化壳聚糖中加入过量的戊二醛避光搅拌后得到所述靶向肿瘤表面胶原的促药物透上皮吸收促进剂，通过该方法制备得到的所述靶向肿瘤表面胶原的促进剂表面的醛基可以为肿瘤部位的胶原氨基提供醛‑氨“席夫碱”选择性粘附，而改性的氟化壳聚糖结构可以帮助调节膀胱上皮紧密连接，从而打开上上皮药物屏障，进而增强治疗药物对膀胱肿瘤的渗透，可用于膀胱癌的灌注治疗。

Description

一种靶向肿瘤表面胶原的促进剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医学材料技术领域，尤其涉及一种靶向肿瘤表面胶原的促进剂及其制备方法与应用。
背景技术
膀胱癌是世界范围内最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，其中大多数是非肌层浸润性膀胱癌。经尿道电切后进行膀胱灌注化疗药物或免疫刺激剂(如卡介苗等)是非肌层浸润性膀胱癌的一线治疗方法。大约70％的患者在最初的膀胱内灌注治疗中失败，并在5年内发生肿瘤复发或进展，并伴有相对较差的预后。局部灌注药物治疗可有效清除残留肿瘤组织的同时，还可以大幅减小药物可能引起的系统性毒副作用。虽然很临床药物已应用于膀胱癌临床灌注治疗，但由于其灌注液的膀胱黏膜透过性和肿瘤组织渗透性较差，故需要反复多次、大剂量灌注，但最终其临床效果仍不令人满意，平均缓解率低于30％，即使是膀胱灌注的首选灌注药物卡介苗的缓解率也只有20％～47％，而且可能引发如尿频、血尿、膀胱炎及过敏反应等副作用使病人难以耐受。
由于膀胱上皮屏障的存在，膀胱内药物对膀胱肿瘤病灶的穿透效率决定了膀胱灌注治疗的效果。目前，膀胱灌注液主要为灌注药物的生理盐水或葡萄糖溶液，临床还没有专门用于改善灌注药物疗效的灌注药物载体的使用。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种靶向肿瘤表面胶原的促进剂及其制备方法与应用，旨在解决现有技术中膀胱灌注药物在膀胱上表皮的穿透效率低、肿瘤组织渗透性差以及没有灌注药物载体用于促进药物吸收的问题。
本发明的技术方案如下：
一种靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，包括步骤：
提供氟化壳聚糖，并将所述氟化壳聚糖溶于水中配成溶液A1；
称取聚乙二醇溶于二甲基亚砜中得到混合液，向所述混合液加入N-(3-(二甲氨基)丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺并进行避光活化得到溶液B；
将所述溶液B滴加到所述溶液A1中进行反应后经过透析得到聚乙二醇改性的氟化壳聚糖；
向所述聚乙二醇改性的氟化壳聚糖加入戊二醛并进行避光搅拌，然后经过透析得到所述靶向肿瘤表面胶原的促进剂；
或者，
提供壳聚糖，并将所述壳聚糖溶于醋酸水溶液中得到溶液A2；
称取聚乙二醇溶于二甲基亚砜中得到混合液，向所述混合液加入N-(3-(二甲氨基)丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺并进行避光活化得到溶液B；
将所述溶液B滴加到所述溶液A2中进行反应后经过透析得到聚乙二醇改性的壳聚糖；
提供全氟庚酸溶液，将所述全氟庚酸溶液滴加到所述聚乙二醇改性的壳聚糖中反应得到聚乙二醇改性的氟化壳聚糖；
向所述聚乙二醇改性的氟化壳聚糖加入戊二醛并进行避光搅拌，然后经过透析得到所述靶向肿瘤表面胶原的促进剂。
所述的靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，其中，所述氟化壳聚糖的制备方法包括步骤：
将全氟庚酸溶于二甲基亚砜中，并依次加入EDC、NHS进行避光活化得到全氟庚酸溶液；
将壳聚糖加入醋酸水溶液并进行搅拌溶解，然后滴加氢氧化钠至pH为6.0-6.8得到壳聚糖溶液；
将所述全氟庚酸溶液滴加到所述壳聚糖溶液中，避光反应得到所述氟化壳聚糖。
所述的靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，其中，称取聚乙二醇溶于二甲基亚砜中得到混合液，向所述混合液加入N-(3-(二甲氨基)丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺并进行避光活化得到溶液B的步骤中，所述聚乙二醇、N-(3-(二甲氨基)丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为5：6：6。
所述的靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，其中，将所述溶液B滴加到所述溶液A1中进行反应后经过透析得到聚乙二醇改性的氟化壳聚糖的步骤中，所述溶液B与所述溶液A1的摩尔比为10:3；将所述溶液B滴加到所述溶液A2中进行反应后经过透析得到聚乙二醇改性的壳聚糖的步骤中，所述溶液B与所述溶液A2的摩尔比为10:3。
所述的靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，其中，所述避光活化的条件为室温避光，且活化时间为30分钟。
所述的靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，其中，所述避光搅拌的条件为在温度为4℃下进行避光搅拌1小时。
所述的靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，其中，所述透析过程选用截留分子量5000Da的透析袋，并在纯水中进行透析48小时。
所述的靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，其中，所述聚乙二醇为单臂或多臂，分子量1000-5000Da。
一种靶向肿瘤表面胶原的促进剂，其中，所述靶向肿瘤表面胶原的促进剂由本发明任一项的靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法制得。
一种靶向肿瘤表面胶原的促进剂的应用，其中将本发明所述的靶向肿瘤表面胶原的促进剂用于制备灌注治疗肿瘤药物的载体。
有益效果：本发明提供一种靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，将聚乙二醇、N-(3-(二甲氨基)丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺与二甲基亚砜进行混合得到溶液B，然后将溶液B滴加到溶有氟化壳聚糖的溶液A1或溶有壳聚糖的溶液A2，对应得到聚乙二醇改性的氟化壳聚糖或聚乙二醇改性的壳聚糖，其中所述聚乙二醇改性的壳聚糖还需通过滴加全氟庚酸溶液改性得到聚乙二醇改性的氟化壳聚糖(PFCS)，向上述两种方案得到的聚乙二醇改性的氟化壳聚糖中加入过量的戊二醛并在温度为4℃下进行避光搅拌后经过透析得到所述靶向肿瘤表面胶原的促进剂(PGFCS)，通过该方法制备得到的所述靶向肿瘤表面胶原的促进剂表面的醛基可以为肿瘤部位的胶原氨基提供醛选择性粘附，而改性的氟化壳聚糖结构可以帮助调节膀胱上皮紧密连接，从而打开上皮药物吸收屏障，进而增强灌注药物对膀胱肿瘤的渗透，可用于肿瘤的灌注治疗。
附图说明
图1为本发明靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法流程图；
图2为FCS、PFCS的19F核磁测试结果图；
图3为PGCS的傅里叶红外光谱图；
图4为FCS、PFCS、PGFCS的粒径电位，透射电子显微镜表征结果图；
图5为实施例1的实验结果图；
图6为实施例2的实验结果图；
图7为实施例3的实验结果图；
图8为实施例4的实验结果图。
具体实施方式
本发明提供一种靶向肿瘤表面胶原的促进剂及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
近年来，大量研究发现对壳聚糖进行化学修饰制备衍生物如乙二醇壳聚糖、丙烯酸酯壳聚糖、羧甲基壳聚糖、硫醇壳聚糖、半乙酰化壳聚糖、马来酰亚胺壳聚糖等都能使其生物活性发生改进，从而提高灌注药物在黏膜组织的吸收。目前，氟化阳离子聚合物作为膀胱灌注药物递送载体，它可以显著改善膀胱内经上皮渗透疗法，用于改进基于膀胱灌注的膀胱癌治疗效果，但该类灌注药物载体无肿瘤靶向性，直接大幅改善药物在整个膀胱壁的渗透和吸收也会对正常组织造成潜在的安全隐患。针对肠道肿瘤靶向治疗研究，有学者报道了氧化葡聚糖对组织胶原氨基的靶向吸附关系，研究表明，氧化葡聚糖中醛基醛可以与组织氨基形成粘附界面，而组织氨基在小肠不同部位的分布密度的变化导致这些含醛物质在回肠表面的“组织特异性”粘附。研究证实，这种“组织氨基密度的变化”也存在于原位膀胱肿瘤，与癌旁正常膀胱上皮组织相比，肿瘤表面含有更多的胶原，这将可以作为含醛载体的黏附点。同时由于氟化壳聚糖对膀胱上皮紧密连接的可逆调控，可显著增加所黏附靶点的药物渗透效率，提高膀胱内药物对膀胱肿瘤病灶的穿透效率，提升膀胱灌注治疗的效果。目前，膀胱灌注液主要为灌注药物的生理盐水或葡萄糖溶液，临床还没有专门用于改善灌注药物疗效的灌注药物载体的使用，因此此类灌注药物载体、吸收促进剂的研发设计具有很好的临床应用市场前景及临床意义。
基于此，如图1，本发明提供一种靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，其中，所述制备方法包括两个方案；
方案1，所述靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法包括步骤：
提供氟化壳聚糖(FCS)，并将所述氟化壳聚糖溶于水中配成溶液A1；
称取聚乙二醇溶于二甲基亚砜中得到混合液，向所述混合液加入N-(3-(二甲氨基)丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)并进行避光活化得到溶液B；
将所述溶液B滴加到所述溶液A1中进行反应后经过透析得到聚乙二醇改性的氟化壳聚糖(PFCS)；
向所述聚乙二醇改性的氟化壳聚糖加入戊二醛并进行避光搅拌，然后经过透析得到所述靶向肿瘤表面胶原的促进剂，即聚乙二醇-戊二醛改性的氟化壳聚糖(PGFCS纳米颗粒)。
在一些实施例中，所述氟化壳聚糖的制备方法包括步骤：
提供壳聚糖(CS)，将所述壳聚糖加入醋酸水溶液并进行搅拌溶解，待所述壳聚糖充分溶解后，然后滴加氢氧化钠并进行搅拌，是溶液澄清且溶液pH为6.0-6.8得到壳聚糖溶液；
将所述全氟庚酸溶于二甲基亚砜中，并依次加入EDC、NHS进行避光活化得到全氟庚酸溶液；
将所述全氟庚酸溶液滴加到快速搅拌的所述壳聚糖溶液中，避光反应得到所述氟化壳聚糖(FCS)。
如图2a为FCS的核磁共振测试结果图，19F NMR结果表明δ-160ppm处显示出FCS的独特峰，表明CS氟化修饰成功。
所述氟化壳聚糖通过可逆地调节膀胱上皮的紧密连接，打开膀胱上皮药物屏障，高效地通过膀胱上皮递送各种治疗药物。
在一些实施例中，所述聚乙二醇为单臂或多臂，例如所述聚乙二醇为PEG-COOH或HOOC-PEG-COOH；在本实施例中，所述聚乙二醇选用PEG-COOH，且相对分子质量为1000-5000Da。
在一些实施例中，称取聚乙二醇溶于二甲基亚砜中得到混合液，向所述混合液加入EDC和NHS并进行避光活化得到溶液B的步骤中，具体的，所述聚乙二醇、N-(3-(二甲氨基)丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为5：6：6，所述混合液加入EDS和NHS后在室温下且避光条件下进行活化30分钟。
在一些实施例中，将所述溶液B滴加到所述溶液A1中进行反应后经过透析得到聚乙二醇改性的氟化壳聚糖的步骤中，所述溶液B与所述溶液A1的摩尔比为10:3；本实施中，将所述溶液B滴加到所述溶液A1中进行反应24小时后装入截留分子量为5000Da的透析袋中，进行纯水透析48小时，得到聚乙二醇改性的氟化壳聚糖(PFCS)。
如图2b为PFCS的19F NMR结果图，19F NMR结果表明在δ3.7ppm处，PEG的质子信号明显增加，表明在FCS中PEG修饰成功。
在一些实施例中，向所述PFCS中加入过量的戊二醛，在温度为4℃且避光条件下搅拌1小时，然后通过截留分子量为5000Da的透析袋在纯水中透析48小时得到纯化的PGFCS；在温度为4℃且避光条件下搅拌1小时时，戊二醛上的醛基会与PFCS上的氨基通过席夫碱反应，形成带有醛基的PGFCS纳米颗粒。
图3为傅里叶红外光谱(FTIR)图，其表明PEG在1348-1486cm-1(-CH2-CH2–O–特征峰)和醛基在2766-2886cm-1(醛-C-H特征峰)的特征吸收峰，表明PGFCS的成功制备。
图4A为茚三酮比色法结果图：图4A对应代表FCS、PFCS、PGFCS的氨基取代度，表明PGFCS取代度较前两者高，进一步佐证PGFCS的合成成功。
图4B为动态光散射(DLS)测试结果图：表明本发明制备的PGFCS纳米颗粒粒径均一，图4C表明通过修饰后的PGFCS电位正电荷降低，但仍然为正电荷，进一步说明PGFCS的合成成功。
图4D、图4E、图4F分别为FCS、PFCS、PGFCS的透射电子显微镜显微图片，说明本发明制备的纳米颗粒尺寸较为均一，直接证明本发明制备的纳米颗粒粒径大小。
具体的，所述PGFCS纳米颗粒表面的醛基可以为肿瘤部位的胶原氨基提供醛选择性粘附，而FCS结构可以帮助调节上皮紧密连接，打开上皮屏障，从而增强治疗药物对膀胱肿瘤的渗透。
方案2，所述靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法包括步骤：
提供壳聚糖，并将所述壳聚糖溶于浓度为1％的醋酸水溶液中，并调节pH至6.0得到溶液A2；
称取聚乙二醇溶于二甲基亚砜中得到混合液，向所述混合液加入N-(3-(二甲氨基)丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺并进行避光活化得到溶液B；
将所述溶液B滴加到所述溶液A2中进行反应后经过透析得到聚乙二醇改性的壳聚糖；
提供全氟庚酸溶液，将所述全氟庚酸溶液滴加到所述聚乙二醇改性的壳聚糖中反应得到聚乙二醇改性的氟化壳聚糖；
向所述聚乙二醇改性的氟化壳聚糖加入戊二醛并进行避光搅拌，然后经过透析得到所述靶向肿瘤表面胶原的促进剂，即聚乙二醇-戊二醛改性的氟化壳聚糖(PGFCS)。
在一些实施例中，所述聚乙二醇为单臂或多臂，例如所述聚乙二醇为PEG-COOH或HOOC-PEG-COOH；在本实施例中，所述聚乙二醇选用PEG-COOH，且相对分子质量为1000Da。
在一些实施例中，称取聚乙二醇溶于二甲基亚砜中得到混合液，向所述混合液加入EDC和NHS并进行避光活化得到溶液B的步骤中，具体的，所述聚乙二醇、N-(3-(二甲氨基)丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为5：6：6，所述混合液加入EDS和NHS后在室温下且避光条件下进行活化30分钟。
在一些实施例中，将所述溶液B滴加到所述溶液A2中进行反应后经过透析得到聚乙二醇改性的壳聚糖的步骤中，所述溶液B与所述溶液A2的摩尔比为10:3；本实施中，将所述溶液B滴加到所述溶液A2中进行反应24小时后装入截留分子量为5000Da的透析袋中，进行纯水透析48小时，得到聚乙二醇改性的壳聚糖(PCS)。
在一些实施例中，提供全氟庚酸溶液，将所述全氟庚酸溶液滴加到所述聚乙二醇改性的壳聚糖中反应得到聚乙二醇改性的氟化壳聚糖(PFCS)。
其中，所述全氟庚酸溶液的制备方法包括步骤：
将全氟庚酸溶于二甲基亚砜中，并依次加入EDC、NHS进行避光活化得到全氟庚酸溶液；
在一些实施例中，向所述PFCS中加入过量的戊二醛，在温度为4℃且避光条件下搅拌1小时，然后通过截留分子量为5000Da的透析袋在纯水中透析48小时得到纯化的PGFCS；在温度为4℃且避光条件下搅拌1小时时，戊二醛上的醛基会与PFCS上的氨基通过席夫碱反应，形成带有醛基的PGFCS纳米颗粒。
具体的，所述PGFCS纳米颗粒表面的醛基可以为肿瘤部位的胶原氨基提供醛选择性粘附，而FCS结构可以帮助调节紧密连接，打开上皮屏障，从而增强治疗药物对膀胱肿瘤的渗透。
在一些实施例中，所述靶向肿瘤表面胶原的促进剂由上述靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法制得。
在一些实施例中，所述靶向肿瘤表面胶原的促进剂可以用于制备治疗肿瘤的灌注药物载体。
具体的，将PGFCS应用促进原位MB49膀胱肿瘤和患者源性原位异种移植膀胱肿瘤的膀胱灌注治疗药物的滞留和肿瘤靶向吸收的治疗应用，结果表面，PGFCS预处理能显著增强膀胱灌注化疗免疫治疗的疗效。化疗药物吡柔比星(pirabucin,THP)和免疫刺激剂白介素-12(interleukin-12,IL-12)联合应用于膀胱灌注化疗免疫治疗MB49原位膀胱肿瘤小鼠，在PGFCS增强的化疗免疫治疗后，对存活的小鼠进一步观察到显著的长期免疫记忆效应。这种胶原靶向的经上皮渗透增强剂,可以实现肿瘤特异性膀胱灌注治疗，提高了NMIBC灌注治疗安全性和有效性。
下面进一步举例实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例为PGFCS对小鼠膀胱灌注生物安全性对比实验。
本实施例中，将水和PGFCS分别对不同小鼠进行膀胱灌注，然后依次进行称量体重、收集尿液、检测尿液中抗核周因子(APF)和尿糖蛋白(GP51)含量，最后将小鼠处死，对小鼠的各个器官作苏木素-伊红染色(HE)，进行血生化指标检测。
具体的，如图5A所示，收集在进行水和PGFCS灌注小鼠膀胱之前6小时内正常小鼠的尿液，并储存于尿液保护液中，收集完毕后再进行不同组别的灌注实验，形成对照组，其中，共有水为灌注液、PGFCS灌注剂量为25mg/kg和PGFCS灌注剂量为50mg/kg三个实验组；灌注完成后，收集此后的30小时内的尿液，并将收集后的尿液进行检测。
结果如下：
图5B为体重变化曲线，说明PGFCS灌注4次后，最大剂量50mg/kg于对照组相比对小鼠体重影响不大，说明PGFCS有较好的膀胱灌注生物安全性。图5C、图5D为尿液中抗核周因子(APF)和尿糖蛋白51(GP51)含量，未有明显异常，图5D-5H为血生化指标，评价肝肾毒性，与对照组相比，PGFCS组无明显差异，说明本发明制备的纳米颗粒经多次膀胱灌注后，无明显肝肾毒性。图5I为HE染色，染色结果显示经PGFCS膀胱灌注后，与对照组相比膀胱及各脏器细胞形态无明显差异，未见损伤、未见炎症浸润，进一步佐证PGFCS的生物安全性。
实施例2
本实施例为PGFCS灌注后再联合灌注THP、白介素12(IL-12)混合溶液治疗小鼠原位膀胱癌效用实验。
本实施例中，小鼠膀胱原位接种荧光素酶标记的MB49小鼠膀胱癌细胞系，7天后(即当时间点为第0天时)分别以不同组别进行膀胱灌注治疗，以小动物活体成像评价小鼠肿瘤大小及肿瘤细胞体内活性，称量小鼠体重作小鼠健康程度评价指标。
具体的，如图6A所示，时间点为第-7天时，小鼠膀胱原位接种荧光素酶标记的MB49小鼠膀胱癌细胞系，建立小鼠原位膀胱癌模型；7天后，即当时间点为第0天时，对实验组小鼠灌注PGFCS，对照组小鼠灌注水，灌注时间为15分钟，灌注液体排出后；再灌注不同组别药物或其他对照成分1小时。其中，不同组别的药物组成如下表：
Figure BDA0003191609470000111
当时间点为7天、14天、21天、28天时进行同样治疗实验。时间点为35天时，进行最后一次小鼠活体成像观察。
结果如下：
图6B为各实验组各时间段小动物荧光活体成像数据结果图，可以大概看出经膀胱灌注PGFCS联合THP及IL-12灌注治疗后小鼠膀胱部位荧光值明显降低，到35天之后组内老鼠存活率最高，可得出相对于对照组，经膀胱灌注PGFCS后，联合THP及IL-12能抑制小鼠原位膀胱癌肿瘤发展，延缓原位膀胱癌小鼠生存时间。图6C为小动物荧光活体成像统计结果，图6D为实验组生存曲线，图6E为各实验组体重数据，结果佐证相对于对照组，经膀胱灌注PGFCS后，联合THP及IL-12能抑制小鼠原位膀胱癌肿瘤发展，延缓原位膀胱癌小鼠生存时间的结论。
实施例3
本实施例为PGFCS灌注后联合再灌注THP、白介素12(IL-12)对小鼠机体免疫激活的效用实验。
本实施例中，小鼠膀胱原位接种荧光素酶标记的MB49小鼠膀胱癌细胞系，7天后(即当时间点为第0天时)分别以不同组别进行膀胱灌注治疗，然后收集小鼠血清，检测血清细胞因子分析；收集尿液，检测尿液细胞因子分析。当时间点为第14天时，灌注不同药物治疗后，处死小鼠取小鼠膀胱进行淋巴细胞分析，其中，其不同药物治疗的组别与实施例2一致。
具体的，时间点为第-7天时，小鼠膀胱原位接种荧光素酶标记的MB49小鼠膀胱癌细胞系，建立小鼠原位膀胱癌模型；7天后，当时间点为第0天时，对实验组小鼠灌注PGFCS，对照组小鼠灌注水，灌注时间为15分钟，灌注液体排出后；再灌注不同组别药物或其他对照成分1小时。
膀胱灌注治疗24小时后检测血清IL-12和γ干扰素(IFN-γ)水平(图7A)。PGFCS预灌注后，再联合灌注IL-12(第6组)或再灌注IL-12+THP(第8组)的血清IL-12水平与其他组相比均显著升高(图7B)。IL-12诱导的免疫细胞因子血清中的IFN-γ，当PGFCS应用于促进肿瘤靶向的膀胱灌注药物经上皮吸收时也显著增强(图7C)。此外，在给药后的6-96小时内，分别收集不同尿液用于尿液细胞因子分析(图7D)。PGFCS/IL-12+THP组(第8组)小鼠尿中肿瘤坏死因子-a(TNF-α)、IFN-γ和IL-6水平最高(图7E-H)。此外，时间点为14天时，灌注不同组药物治疗后，处死小鼠取小鼠膀胱进行淋巴细胞分析(图7I),。PGFCS/IL-12+THP组(第8组)小鼠膀胱中，巨噬细胞、树突状细胞、杀伤性T细胞细胞比例高于其他组别(图7J-M)。这些数据证明PGFCS预处理能显著提高THP+IL-12共灌注后的免疫激活，显著提高其膀胱灌注可利用性。
实施例4
本实施例为PGFCS灌注后再灌注THP、白介素12(IL-12)后介导的长期免疫记忆实验。
本实施例中，超60天PGFCS灌注后再灌注THP、白介素12(IL-12)组别未发现膀胱原位肿瘤小鼠与对照组再次原位接种荧光标记的小鼠膀胱癌MB49细胞系，接种细胞前，小鼠处死，流式细胞术检测脾脏免疫细胞情况，接种细胞7天后小鼠处死，血清检测细胞因子情况，膀胱石蜡切片作免疫细胞免疫组化。
具体的，在实例2治疗完成后，取未发现膀胱原位肿瘤的PGFCS/THP+IL-12治疗后治愈小鼠和对照小鼠再次原位接种MB49肿瘤细胞，7天后成像记录，60天后处死小鼠作免疫组化及流式细胞术检测(图8A)。所有治愈组小鼠均出现抑制肿瘤再生长(肿瘤未发生)，存活时间超过127天，而未治疗组小鼠肿瘤迅速发生生长，均在90天内死亡(图8,B-D)。如图7E所示，效应T记忆(TEM)细胞(CD3+CD8+CD44+CD62L-)在实验组的比例(54.36％)远远高于对照组的比例(24.18％)。此外,血清肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ的小鼠实验组在接种二次肿瘤7天之后远高于对照组(图8,F和G)。此外,免疫组织化学染色及通过软件统计发现PGFCS/THP+IL-12治疗2个月后小鼠膀胱黏膜下层F4/80+、CD8+、CD4+细胞数量增加(图8，H-K)。结果提示PGFCS灌注后再灌注THP、白介素12(IL-12)后介导的免疫化疗可引起显著的T细胞记忆反应。
需要说明的是，本发明的实施例中，PGFCS灌注后再灌注THP、IL-12，其中，再灌注药物可以是带氨基等基团的一类小分子化合物，如阿霉素、表柔比星、顺铂等；可以是联合其他大分子蛋白质，如白介素家族、酶类等；还可以是联合DNA、RNA等核酸，进行基因递送转染、基因编辑、基因治疗等。还需说明的是，本发明提供的靶向肿瘤表面胶原的促进剂不仅可用于治疗膀胱癌的灌注药物载体，还可用于治疗腹腔转移瘤的药物载体，且不限于此。
综上所述，本发明提供一种靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，将聚乙二醇、N-(3-(二甲氨基)丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺与二甲基亚砜进行混合得到溶液B，然后将溶液B滴加到溶有氟化壳聚糖的溶液A1或溶有壳聚糖的溶液A2，对应得到聚乙二醇改性的氟化壳聚糖或聚乙二醇改性的壳聚糖，其中所述聚乙二醇改性的壳聚糖还需通过滴加全氟庚酸溶液改性得到聚乙二醇改性的氟化壳聚糖，向上述两种方案得到的聚乙二醇改性的氟化壳聚糖中加入过量的戊二醛并在温度为4℃下进行避光搅拌后经过透析得到所述靶向肿瘤表面胶原的促进剂，通过该方法制备得到的所述靶向肿瘤表面胶原的促进剂表面的醛基可以为肿瘤部位的胶原氨基提供醛选择性粘附，而改性的氟化壳聚糖结构可以帮助调节紧密连接，从而打开上表皮屏障，进而增强治疗药物对膀胱肿瘤的渗透，可用于肿瘤的治疗。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：
提供氟化壳聚糖，并将所述氟化壳聚糖溶于水中配成溶液A1；
称取聚乙二醇溶于二甲基亚砜中得到混合液，向所述混合液加入N-(3-(二甲氨基)丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺并进行避光活化得到溶液B；
将所述溶液B滴加到所述溶液A1中进行反应后经过透析得到聚乙二醇改性的氟化壳聚糖；
向所述聚乙二醇改性的氟化壳聚糖加入戊二醛并进行避光搅拌，然后经过透析得到所述靶向肿瘤表面胶原的促进剂；
或者，
提供壳聚糖，并将所述壳聚糖溶于醋酸水溶液中得到溶液A2；
称取聚乙二醇溶于二甲基亚砜中得到混合液，向所述混合液加入N-(3-(二甲氨基)丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺并进行避光活化得到溶液B；
将所述溶液B滴加到所述溶液A2中进行反应后经过透析得到聚乙二醇改性的壳聚糖；
提供全氟庚酸溶液，将所述全氟庚酸溶液滴加到所述聚乙二醇改性的壳聚糖中反应得到聚乙二醇改性的氟化壳聚糖；
向所述聚乙二醇改性的氟化壳聚糖加入戊二醛并进行避光搅拌，然后经过透析得到所述靶向肿瘤表面胶原的促进剂。
2.根据权利要求1所述的靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，其特征在于，所述氟化壳聚糖的制备方法包括步骤：
将全氟庚酸溶于二甲基亚砜中，并依次加入EDC、NHS进行避光活化得到活化的全氟庚酸溶液；
将壳聚糖加入醋酸水溶液并进行搅拌溶解，然后滴加氢氧化钠至pH为6.0-6.8得到壳聚糖溶液；
将所述全氟庚酸溶液滴加到所述壳聚糖溶液中，避光反应得到所述氟化壳聚糖。
3.根据权利要求1所述的靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，其特征在于，称取聚乙二醇溶于二甲基亚砜中得到混合液，向所述混合液加入N-(3-(二甲氨基)丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺并进行避光活化得到溶液B的步骤中，所述聚乙二醇、N-(3-(二甲氨基)丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为5：6：6。
4.根据权利要求1所述的靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，其特征在于，将所述溶液B滴加到所述溶液A1中进行反应后经过透析得到聚乙二醇改性的氟化壳聚糖的步骤中，所述溶液B与所述溶液A1的摩尔比为10:3；将所述溶液B滴加到所述溶液A2中进行反应后经过透析得到聚乙二醇改性的壳聚糖的步骤中，所述溶液B与所述溶液A2的摩尔比为10:3。
5.根据权利要求1所述的靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，其特征在于，所述避光活化的条件为室温避光，且活化时间为30分钟。
6.根据权利要求1所述的靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，其特征在于，所述避光搅拌的条件为在温度为4℃下进行避光搅拌1小时。
7.根据权利要求1所述的靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，其特征在于，所述透析过程选用截留分子量5000Da的透析袋，并在纯水中进行透析48小时。
8.根据权利要求1所述的靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇为单臂或多臂，分子量1000-5000Da。
9.一种靶向肿瘤表面胶原的促进剂，其特征在于，所述靶向肿瘤表面胶原的促进剂由权利要求1-8的任一项的靶向肿瘤表面胶原的促进剂的制备方法制得。
10.一种靶向肿瘤表面胶原的促进剂的应用，其特征在于，将权利要求9所述的靶向肿瘤表面胶原的促进剂用于制备治疗肿瘤的药物载体。
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