CN115400223A - 一种二茂铁和tlr7/8激动剂共连接纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种二茂铁和TLR7/8激动剂共连接纳米粒及其制备方法和应用，属于生物医药和分子生物学技术领域。本发明采用RAFT聚合法合成两亲性嵌段共聚物pHEA‑b‑pFcA和pHEA‑b‑pIMDQ，两者在PBS体系中可以自发组装成纳米级别的药物递送平台N@Fc/IM，其可通过芬顿反应诱导细胞氧化死亡的同时充分调动免疫系统，从而可用于抗肿瘤治疗，同时避免因直接递送所导致的较大毒副作用，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种二茂铁和TLR7/8激动剂共连接纳米粒及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及一种二茂铁和TLR7/8激动剂共连接纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
化学动力学疗法(CDT)被定义为一种原位治疗模式，利用肿瘤微环境中的微酸和过量过氧化氢(H2O2)条件，以过渡金属纳米材料为催化剂，通过芬顿反应或类芬顿反应催化H2O2产生剧毒的羟基自由基(·OH)等活性氧，进而诱导肿瘤细胞凋亡。基于铁剂的CDT近年来被广泛研究和报道，而CDT效果的实现还依赖于二价铁离子的递送效率。由于二价铁是不稳定状态，极容易被氧化为三价态，因此二价态铁离子的递送存在巨大挑战。近年来，有研究表明二茂铁(FcA)中的铁是二价态，而且铁环戊二烯基(Fe-Cp)键的大解离能(≈90kcalmol-1)，较为稳定，它的发现为构建新型Fenton反应试剂带来了希望。
除了芬顿反映直接诱导的细胞死亡，CDT过程中产生的活性氧还可以促进肿瘤发生免疫原性细胞死亡。该过程中会伴随钙网蛋白(CRT)的产生，进而激活专职抗原递呈的树突状细胞(DCs)。成熟的DC细胞会通过CD40-CD40L,CD86-CD28,MHC-TCR之间的结合招募T淋巴细胞到达肿瘤部位。大量聚集的T淋巴细胞将共同消灭肿瘤细胞。
为了进一步激发和调动免疫细胞，促发T淋巴细胞募集的最大化，有研究表明，咪唑奎琳类TLR7/8激动剂作为一种免疫佐剂，具有非常强大的DC激活能力。其中咪喹莫特已被批准用于皮肤癌的治疗。但是咪喹莫特极差的溶剂性限制了其在其他类型肿瘤细胞上的应用。广大研究者均对该小分子进行不同的修饰和改造，以期得到更好的化合物。其中IMDQ是一种较为成功的咪唑奎琳类似物，具有更强的活性，而且溶解性较好，值得一提的是IMDQ上的脂肪氨基可以通过化学键连接到其他载体上方便实现药物递送。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种二茂铁和TLR7/8激动剂共连接纳米粒及其制备方法和应用。本发明采用RAFT聚合法合成两亲性嵌段共聚物pHEA-b-pFcA和pHEA-b-pIMDQ，两者在PBS体系中可以自发组装成纳米级别的药物递送平台N@Fc/IM，其可通过芬顿反应诱导细胞氧化死亡的同时充分调动免疫系统，从而可用于抗肿瘤治疗，同时避免因直接递送所导致的较大毒副作用。基于上述研究成果，从而完成本发明。
为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种二茂铁和TLR7/8激动剂共连接纳米粒，所述二茂铁和TLR7/8激动剂共连接纳米粒(N@Fc/IM)其是由嵌段共聚物pHEA-b-pFcA和pHEA-b-pIMDQ通过自组装获得；
其中，所述嵌段共聚物pHEA-b-pFcA和pHEA-b-pIMDQ的结构式如下式I和式II所示：
Figure BDA0003871915820000021
其中，所述纳米粒外壳为pHEA端，从而为纳米粒提供亲水性部分，确保了纳米粒整体的稳定性和亲水性；内核的药物则通过化学作用连接在聚合物上防止药物在体循环中的泄露，避免全身分布引发的毒性。
本发明的第二个方面，提供上述纳米粒的制备方法，所述制备方法包括：
S1、pHEA-b-pFcA的合成；
S2、pHEA-b-pIMDQ的合成；
S3、将所述pHEA-b-pFcA和pHEA-b-pIMDQ加入缓冲液中，通过自组装获得。
本发明的第三个方面，提供上述纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的第四个方面，提供一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物其活性成分包含上述纳米粒。
根据本发明，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
本发明的第五个方面，提供一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量上述纳米粒或药物。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案提供一种二茂铁和TLR7/8激动剂共连接纳米粒，上述技术方案选用二价铁稳定的二茂铁分子和活性更强容易修饰的IMDQ进行联合，通过芬顿反应诱导细胞氧化死亡的同时充分调动了免疫系统。两种小分子药物的理化性质存在较大差异，直接递送会导致药物全身分布，进而引发较大的毒副作用。为此，纳米递送策略应运而生，为实现药物在肿瘤部位的靶向聚集提供了便利。本发明利用RAFT聚合法合成了两亲性嵌段共聚物pHEA-b-pFcA和pHEA-b-pIMDQ。两者在PBS体系中可以自发组装成纳米级别的药物递送平台N@Fc/IM。pHEA端为N@Fc/IM提供了亲水性部分，确保了纳米粒整体的稳定性和亲水性。内核的药物通过化学作用连接在聚合物上防止了药物在体循环中的泄露，避免全身分布引发的毒性。N@Fc/IM静脉注射后可以主要依靠被动靶向作用聚集在肿瘤组织中，被细胞吞噬后，纳米粒中的二茂铁遇见过量过氧化氢会发生芬顿反应产生大量的羟基自由基。该过程该便随着肿瘤细胞免疫原性细胞死亡的发生。肿瘤细胞逐渐暴露出来的钙网蛋白和免疫佐剂IMDQ一起激活DC细胞的成熟，并广泛调动T淋巴细胞的募集，为肿瘤的清除和攻击提供了强大的武器。因此本发明具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中单体APMA-FcA和单体PFPA的合成图；a为APMA-FcA的合成；b为PFPA的合成；
图2为本发明实施例中APMA-FcA的1H-NMR结果；
图3为本发明实施例中PFPA的1H-NMR结果；
图4为本发明实施例中嵌段共聚物pHEA-b-pFcA和pHEA-b-pIMDQ的RAFT聚合路线；
图5为本发明实施例中pHEA的1H-NMR结果；
图6为本发明实施例中pHEA-b-pFcA的1H-NMR结果；
图7为本发明实施例中pHEA-b-pPFP的1H-NMR结果；
图8为本发明实施例中聚合物的分子量结果；
图9为本发明实施例中IMDQ的成功连接图；
图10为纳米粒的构建示意图；
图11为本发明实施例中纳米粒的表征；a为N@FcA的粒径分布图；b为N@IMDQ的粒径分布图；c为N@Fc/IM的粒径分布图；d为N@FcA的zeta电位和代表性透射电镜图；e为N@IMDQ的zeta电位和代表性透射电镜图；f为N@Fc/IM的zeta电位和代表性透射电镜图；
图12为本发明实施例中羟基自由基检测；其中，a为亚甲基蓝检测羟基自由基；b为对苯二甲酸为探针检测羟基自由基；
图13为本发明实施例中纳米粒的细胞摄取；
图14为本发明实施例中纳米粒的细胞毒性；
图15为本发明实施例中纳米粒激活DC细胞的示意图；
图16为本发明实施例中纳米粒促进了DC细胞的成熟；其中，a为纳米粒促进了DC细胞表面CD86的表达；b为纳米粒促进了DC细胞表面CD40的表达；c为纳米粒促进了DC细胞表面MHC-II的表达；
图17为本发明实施例中不同组小鼠的肿瘤生长曲线图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种二茂铁和TLR7/8激动剂共连接纳米粒，所述二茂铁和TLR7/8激动剂共连接纳米粒(N@Fc/IM)其是由嵌段共聚物pHEA-b-pFcA和pHEA-b-pIMDQ通过自组装获得；
其中，所述嵌段共聚物pHEA-b-pFcA和pHEA-b-pIMDQ的结构式如下式I和式II所示：
Figure BDA0003871915820000051
其中，所述纳米粒外壳为pHEA端，从而为纳米粒提供亲水性部分，确保了纳米粒整体的稳定性和亲水性；内核的药物则通过化学作用连接在聚合物上防止药物在体循环中的泄露，避免全身分布引发的毒性。
所述纳米粒粒径均匀，平均粒径在200nm左右，透射电镜表明纳米粒的形态较为圆整，电位呈现负电性。
本发明的第二个方面，提供上述纳米粒的制备方法，所述制备方法包括：
S1、pHEA-b-pFcA的合成；
S2、pHEA-b-pIMDQ的合成；
S3、将所述pHEA-b-pFcA和pHEA-b-pIMDQ加入缓冲液中，通过自组装获得。
其中，所述步骤S1和S2并不存在先后顺序之分；
所述步骤S1中，pHEA-b-pFcA的具体合成方法包括：
将聚丙烯酸羟乙酯(pHEA)、FcA-APMA和AIBN在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中混合，通过冻融循环彻底去除氧气，采用RAFT聚合法在65-85℃(包括80℃)过夜聚合；
其中，所述pHEA、FcA-APMA和AIBN的摩尔比为0.01-0.1:0.5-5:0.02-0.1，优选为0.02:1.0:0.026；
所述pHEA可通过市售方式获得，但同样也可采用RAFT聚合法制备获得，具体的，将丙烯酸羟乙酯(HEA)、PABTC和AIBN在DMF中混合，通过冻融循环彻底去除氧气，在65-85℃(包括80℃)过夜聚合。
其中，所述HEA、PABTC和AIBN的摩尔比为5-15:0.1-0.5:0.01-0.05；优选为10:0.2:0.04。
所述FcA-APMA采用EDC/HOBT/DIEA方案通过FcA中的羧基与N-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺(APMA)中的氨基之间的酰胺化反应合成；
具体的，将FcA、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)、1-羟基苯并三唑(HOBT)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)溶解在无水二氯甲烷(DCM)中并搅拌得混合物；然后，将在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中完全溶解的APMA添加到上述混合物中并搅拌过夜即得。
其中，FcA、EDC、HOBT、DIEA和APMA的摩尔比为0.5-1:0.8-1.8:0.8-1.8:1.6-3.6:0.6-1.2，优选为0.65:0.98:0.98:1.96:0.78。
所述步骤S2中，pHEA-b-pIMDQ的合成的具体方法包括：
首先采用RAFT聚合法pHEA-b-pPFP，具体的，将pHEA、PFPA和AIBN在DMF中混合，通过冻融循环彻底去除氧气，在65-85℃(包括80℃)过夜聚合即得，将所述pHEA-b-pPFP、IMDQ和三乙胺混合搅拌，然后使用2-氨基乙醇进一步完全替代PFP，具体的，将产物转移至透析膜中加水透析冻干后即得。
所述pHEA、PFPA和AIBN的摩尔比为0.01-0.05:1.5-3:0.005-0.03；优选为0.03:1.7:0.01。
所述pHEA-b-pPFP与IMDQ的摩尔比为0.05-0.5:0.2-1，优选为0.1:0.5。
所述透析膜截留分子量(MWCO)为1-5kDa，优选为3.5kDa。
其中，所述PFPA可通过市售方式购得，或通过如下方式制备得到：在惰性气氛下将五氟苯酚和三乙胺溶于无水DCM中；然后在冰浴下将完全溶解的丙烯酰氯加入到混合物中，并温热至室温搅拌过夜后即得。
其中，所述惰性气氛可以为氮气，所述五氟苯酚、三乙胺和丙烯酰氯的摩尔比为1-2:1-2:1-2，优选为1.08:1.19:1.19。
所述步骤S3中，所述缓冲液可以为PBS缓冲液，优选采用超声分散(如超声浴)方式从而使得混合更为均匀。
本发明的一个或多个具体实施方式中，提供上述纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
同时，需要说明的是，肿瘤在本发明中如本领域技术人员所知的那样加以使用，其包括良性肿瘤和/或恶性肿瘤。良性肿瘤被定义为不能在体内形成侵略性、转移性肿瘤的细胞过度增殖。反之，恶性肿瘤被定义为能够形成全身性疾病(例如在远端器官中形成肿瘤转移)的具有多种细胞异常和生化异常的细胞。
本发明的一个或多个具体实施方式中，本发明的药物可用于治疗恶性瘤。可用本发明的药物治疗的恶性瘤的实例包括实体瘤和血液瘤。优选为实体瘤，实体瘤可以是乳腺、膀胱、骨、脑、中枢和外周神经系统、结肠、内分泌腺、食道、子宫内膜、生殖细胞、头和颈、肝、肺、喉和下咽的肿瘤、间皮瘤、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、肾、小肠、软组织、睾丸、胃、皮肤(如黑色素瘤)、输尿管、阴道和外阴的肿瘤。
本发明的一个或多个具体实施方式中，提供一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物其活性成分包含上述纳米粒。
根据本发明，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准，在此不再做具体限定。
本发明的一个或多个具体实施方式中，本发明的药物可以通过任意已知的方式施用至受试者体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员可以理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明纳米粒制剂经静脉注射后可以主要依靠被动靶向作用聚集在肿瘤组织中，被细胞吞噬后，纳米粒中的二茂铁遇见过量过氧化氢会发生芬顿反应产生大量的羟基自由基。该过程该便随着肿瘤细胞免疫原性细胞死亡的发生。肿瘤细胞逐渐暴露出来的钙网蛋白和免疫佐剂IMDQ一起激活DC细胞的成熟，并广泛调动T淋巴细胞的募集。
本发明的一个或多个具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如大鼠、小鼠、豚鼠、狗、兔、猩猩、猴等。
本发明的一个或多个具体实施方式中，提供一种肿瘤治疗的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量上述纳米粒或药物。
所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，优选指哺乳动物，最优选指人。所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。必须认识到，本发明所述活性成分的最佳给药剂量和间隔是由其性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定哺乳动物等外部条件而决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程，即同时化合物在额定的时间内每日的剂量，可以用本领域内公知的方法进行确定。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例
1.试验方法
1.1单体的合成
1.1.1 APMA-FcA的合成
APMA-FcA采用EDC/HOBT/DIEA方案通过FcA中的羧基与N-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺(APMA)中的氨基之间的酰胺化反应合成。简而言之，将FcA(150.02mg,0.65mmol)、EDC(143.78mg,0.98mmol)、HOBT(101.35mg,0.98mmol)和DIEA(252.85mg,1.96mmol)溶解在无水二氯甲烷(DCM)中并搅拌1h。然后，将在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中完全溶解的APMA(107.2mg,0.78mmol)逐滴添加到混合物中并搅拌过夜。之后，旋蒸除去溶剂，溶液用DCM/水系统洗涤。DCM层用无水MgSO4干燥并过滤。使用快速色谱法用己烷:EtOAc(1:1)分离粗产物。
1.1.2 PFPA的合成
在配备有搅拌棒的圆底烧瓶中，在N 2气氛下将五氟苯酚(200.0mg，1.08mmol)和三乙胺(166μL，1.19mmol)溶解在无水DCM中。然后在冰浴下将完全溶解的丙烯酰氯(101μL，1.19mmol)滴加到混合物中30分钟，并温热至室温搅拌过夜。随后，用Milli-Q水洗涤3次，DCM层用MgSO4干燥，旋转蒸发浓缩，得到无色液体PFPA。
1.2聚合物的合成
1.2.1 pHEA的合成
通过RAFT聚合合成pHEA的典型程序如下：将丙烯酸羟乙酯(HEA，1.15mL，10mmol)、PABTC(47.2mg，0.2mmol)、AIBN(6.57mg，0.04mmol)和DMF装入25mL Schlenk管中。通过三次冻融循环彻底去除氧气。在80℃下过夜聚合，通过在冷乙醚中沉淀和离心分离pHEA。重新溶解在DMF中后，此过程重复三次。将沉淀的聚合物在真空下干燥过夜，得到pHEA。
1.2.2 pHEA-b-pFcA的合成
为了制备pHEA-b-pFcA的共聚物，将pHEA(119.0mg，0.02mmol)、FcA-APMA(400mg，1.0mmol)、AIBN(4.2mg，0.026mmol)和DMF装入25mL Schlenk管中，然后通过三次冻融循环彻底去除氧气。聚合在80℃过夜进行，所得聚合物通过在冷乙醚中沉淀和离心分离。重新溶解在DMF中后，此过程重复三次。将沉淀的聚合物在真空下干燥过夜，得到pHEA-b-pFcA。
1.2.3 pHEA-b-pIMDQ的合成
在获得pHEA-b-pIMDQ之前，pHEA-b-pPFP的合成如下：加入pHEA(182.7mg，0.03mmol)、PFPA(404.3mg，1.70mmol)、AIBN(1.2mg，0.01mmol)和DMF在25mL Schlenk管中，通过三次冻融循环彻底去除氧气。80℃聚合过夜，在冷乙醚中沉淀3次，分离出pHEA-b-pPFP。随后，为了将pHEA-b-pPFP骨架上附加的PFP替换为IMDQ，将pHEA-b-pPFP(161.96mg，0.1mmol)、IMDQ(216.50mg，0.5mmol)和三乙胺(40μL)装入带有搅拌棒的预干燥圆底烧瓶。然后将混合物在40℃搅拌3天。最后再采用2-氨基乙醇进一步完全替代PFP。将它们转移到透析膜(MWCO 3.5kDa)中并用水透析三天，然后冻干以获得pHEA-b-pIMDQ。
1.3纳米粒的制备
所有不同类型的纳米级药物递送平台(N@FcA、N@IMDQ和N@Fc/IM)都是通过简单的自组装策略生成的。对于典型的N@Fc/IM制造，将pHEA-b-pFcA和pHEA-b-pIMDQ两种储备溶液在超声浴中缓慢滴入PBS缓冲液中30分钟。对于N@FcA和N@IMDQ，将单一pDMA-b-pFcA或pDMA-b-pIMDQ的储备溶液缓慢添加到PBS缓冲液中。
1.4纳米粒的表征
使用Zetasizer Nano ZS90仪器测定纳米粒的粒度分布。在用磷钨酸(2％,wt/wt)进行负染色后，使用透射电镜观察其形态。
1.5羟基自由基检测
为了测量·OH的产生，制备了10mg/mL APMA-FcA的浓储液、3.2mg/mL的亚甲基蓝溶液和商品化的过氧化氢溶液。将64μL APMA-FcA浓储液加到1mL Milli-Q水中稀释。然后，将过氧化氢(10mM,1μL)和亚甲基蓝(3.2mg/mL,1μL)添加到混合物中，通过UV-vis光谱在660nm处扫描吸光度。
羟基自由基还可以通过荧光光谱法以对苯二甲酸为探针进行测定。将过氧化氢(500mM)、对苯二甲酸(0.5mM)和APMA-FcA在乙酸缓冲液(pH＝4)中于40℃孵育5小时。然后将反应体系以10000rpm离心10分钟，上清液用于荧光测量。
1.6细胞摄取
将4T1以10×104个细胞/孔的密度接种到48孔板中过夜，然后用尼罗红和加载尼罗红的纳米平台(尼罗红，等于2、4、8μg mL-1)孵育12小时。之后，用细胞解离缓冲液解离细胞，然后以100g离心5分钟。在BD FACS Aria III上进行流式检测，数据使用FlowJo软件包进行处理。
1.7细胞毒性
将4T1细胞以5×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中过夜，然后与一系列浓度的N@Fc/IM(5.0至160μg mL-1)一起孵育过夜。然后加入10μL CCK-8工作液，37℃孵育4h，用酶标仪测定450nm处的OD值，评价细胞毒性。
1.8 BMDC的成熟
从C57BL/6小鼠的骨髓腔中获得骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)，并将其接种在含有GM-CSF(10ng mL-1)和IL-4(10ng mL-1)的RPMI-1640完全生长培养基的6孔板中。培养一段时间后，将BMDCs转移到48孔板中过夜，然后与FcA、IMDQ、Fc/IM、N@FcA、N@IMDQ和N@Fc/IM一起孵育24小时。然后，将它们用anti-CD11c,anti-CD86,anti-MHC-II和anti-CD40抗体标记，通过流式细胞术(BD FACS Celesta)观察BMDCs的成熟。
1.9小鼠抑瘤评价
通过将4T1乳腺癌细胞(1×106细胞mL-1,0.1mL)接种到小鼠的乳房脂肪垫中来建立原位4T1雌性BALB/c小鼠。当肿瘤体积达到约100mm3时，将小鼠随机分为7组(每组6只小鼠)通过尾静脉注射100μL各种制剂，I)PBS、II)FcA、III)IMDQ、IV)Fc/IM,V)N@FcA,VI)N@IMDQ和VII)N@Fc/IM(FcA,等于25mg kg-1；IMDQ,等于500μg kg-1)。每隔一天用游标卡尺测量肿瘤的长度(L)和宽度(W)以及体重。
肿瘤体积由L×W×W/2计算。使用GraphPad Prism 7.0分析肿瘤生长曲线。
2.试验结果
2.1单体APMA-FcA和单体PFPA的合成
按照图1所示技术路线合成了单体APMA-FcA和单体PFPA。图2和图3的核磁证实了其成功合成。
2.2聚合物的合成
为了将单体APMA-FcA和单体PFPA进行聚合，采用了经典的可逆加成-断裂链转移聚合法(Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Polymerization)，简称RAFT聚合法。具体合成步骤如图4所示，首先合成亲水性pHEA，然后再利用pHEA为链转移剂，合成pHEA-b-pFcA和pHEA-b-pPFP。然后IMDQ通过取代反应连接到pHEA-b-pPFP上，为了增强聚合物的亲水性，未完全取代的PFP用2-氨基乙醇进一步取代，得到最终产物pHEA-b-pIMDQ。所有聚合物均通过核磁氢谱进行了表征，并对聚合物分子量进行测定，结果如图5-9所示。
2.3纳米粒的构建和表征
采用自组装技术将聚合物制备成了纳米粒，如图10所示，粒径约为200nm左右，透射电镜表明纳米粒的形态较为圆整，电位呈现负电性。纳米粒具体表征结果如图11所示。
2.4芬顿反应检测
为了验证所合成的APMA-FcA催化芬顿反应产生羟基自由基的能力，分别利用亚甲基蓝和对苯二甲酸进行了检测。结果如图12所示，APMA-FcA和过氧化氢反应后，明显观察到了亚甲基蓝紫外吸收峰的降低，证实了其羟基自由基的产生。同时利用对苯二甲酸作为探针也观察到了羟基自由基的信号。两个实验均证明合成的APMA-FcA具有催化芬顿反应产生羟基自由基的能力。
2.5纳米粒的细胞摄取
结果如图13所示，细胞摄取实验结果表明纳米粒可以被肿瘤细胞(4T1)有效摄取，而且呈现浓度依赖性行为。
2.6纳米粒的细胞毒性
采用CCK8试剂盒检测了纳米粒的细胞毒性，结果表明浓度越高，细胞存活率越低，结果如图14所示。
2.7纳米粒促进DC细胞的成熟
将药物与骨髓来源树突状细胞孵育，然后检测了细胞表面成熟蛋白的表达，结果如图15和16所示，证明所制备的纳米粒具有较好的DC激活能力。
2.8纳米粒抑制了肿瘤细胞的生长
建立了小鼠乳腺癌模型，并通过静脉注射给药。观察了小鼠的肿瘤生长曲线，结果如图17所示，N@Fc/IM组具有最佳抑瘤效果，证实了所制备纳米粒抑制肿瘤的潜力。
本发明未尽事宜为公知技术。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种二茂铁和TLR7/8激动剂共连接纳米粒，其特征在于，所述二茂铁和TLR7/8激动剂共连接纳米粒其是由嵌段共聚物pHEA-b-pFcA和pHEA-b-pIMDQ通过自组装获得；
其中，所述嵌段共聚物pHEA-b-pFcA和pHEA-b-pIMDQ的结构式如下式I和式II所示：
Figure FDA0003871915810000011
2.如权利要求1所述的二茂铁和TLR7/8激动剂共连接纳米粒，其特征在于，所述纳米粒粒径均匀，形态圆整，电位呈现负电性，进一步的，平均粒径为200nm。
3.权利要求1或2所述纳米粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
S1、pHEA-b-pFcA的合成；
S2、pHEA-b-pIMDQ的合成；
S3、将所述pHEA-b-pFcA和pHEA-b-pIMDQ加入缓冲液中，通过自组装获得；
其中，所述步骤S1和S2并不存在先后顺序之分。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，pHEA-b-pFcA的具体合成方法包括：
将pHEA、FcA-APMA和AIBN在DMF中混合，通过冻融循环彻底去除氧气，采用RAFT聚合法在65-85℃(包括80℃)过夜聚合。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述pHEA、FcA-APMA和AIBN的摩尔比为0.01-0.1:0.5-5:0.02-0.1；
所述FcA-APMA采用EDC/HOBT/DIEA方案通过FcA中的羧基与APMA中的氨基之间的酰胺化反应合成；
进一步的，将FcA、EDC、HOBT和DIEA溶解在无水DCM中并搅拌得混合物；然后，将在DMF中完全溶解的APMA添加到上述混合物中并搅拌过夜即得；
进一步的，FcA、EDC、HOBT、DIEA和APMA的摩尔比为0.5-1:0.8-1.8:0.8-1.8:1.6-3.6:0.6-1.2。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，pHEA-b-pIMDQ的合成的具体方法包括：
首先采用RAFT聚合法pHEA-b-pPFP，具体的，将pHEA、PFPA和AIBN在DMF中混合，通过冻融循环彻底去除氧气，在65-85℃(包括80℃)过夜聚合即得，将所述pHEA-b-pPFP、IMDQ和三乙胺混合搅拌，然后使用2-氨基乙醇进一步完全替代PFP，具体的，将产物转移至透析膜中加水透析冻干后即得。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述pHEA、PFPA和AIBN的摩尔比为0.01-0.05:1.5-3:0.005-0.03；
所述pHEA-b-pPFP与IMDQ的摩尔比为0.05-0.5:0.2-1；
所述透析膜截留分子量为1-5kDa。
8.权利要求1或2所述纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物其活性成分包含权利要求1或2所述纳米粒。
10.如权利要求9所述抗肿瘤药物，其特征在于，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
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