CN114028587B - 双响应纳米前药物胶束及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种双响应纳米前药物胶束及其制备方法和应用,本发明的胶束表达式为NLG919/PGA‑Cys‑PPA@Gd,该胶束具有较高的载药率和控释性能,可用于MRI介导的PDT和免疫协同治疗。本发明以胱胺(Cys)为连接体,通过自组装γ‑聚谷氨酸(PGA)‑Gd3+螯合的脱镁叶绿素A(PPA@Gd)将吲哚胺2,3‑双加氧酶(IDO)抑制剂NLG919装载到疏水核内,构建了纳米药物前胶束,以防止PS提前泄漏并控制药物释放。本发明首次通过将Gd3+与PPA螯合赋予纳米微粒MRI的能力,形成一种集诊断和治疗功能于一体的新型纳米平台。最后,在荷瘤小鼠模型中综合评价成像引导PDT与免疫协同治疗,取得了明显的协同治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米胶束,具体涉及一种双响应纳米前药物胶束及其制备方法和应用。
背景技术
光动力疗法(PDT)是一种侵袭性小、全身毒性低的浅表皮肿瘤的临床治疗方法,被认为是一种很有前景的原发性肿瘤消融策略。通过光敏剂(PS)在局部或全身的应用,使分子氧在特定波长的外部光照射下转化为具有细胞毒性的活性氧(ROS),诱导肿瘤细胞凋亡。此外,PDT还可以诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡,损伤的细胞可以作为原位抗原增强免疫细胞的活性,在体内激发抗肿瘤免疫反应。但PDT的这些免疫信号过于微弱,无法完全激活机体免疫系统对抗肿瘤,且肿瘤微环境(TME)中存在一些免疫抑制因子,所以PDT后肿瘤复发转移的情况时有发生。为了减轻这些担忧,各种免疫佐剂已被开发出来用于提高患者的机体免疫。有研究表明,吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂在肿瘤免疫治疗中存在巨大的潜力,目前正处于积极的临床研究中,因为IDO可以催化色氨酸(Try)降解为Kyn,导致Kyn在肿瘤中积累,其在恶性肿瘤组织中具有更高的催化活性。这些氨基酸代谢产生的抗癌免疫抑制反应与调节性T细胞的分化和效应T细胞的凋亡有关,因此,体内的IDO通路会促进肿瘤的扩散和转移。为了缓解IDO引起的免疫抑制作用,许多IDO抑制剂被设计来阻断Try-Kyn通路,但与传统PS一样,多数免疫佐剂水溶性差、血液清除率高、具有多药耐药性,治疗效果不佳。因此,开发多功能、智能化的药物传递载体具有重要的科学价值和临床价值。
近年来,以纳米材料为基础的策略已经被开发出来用于PDT和免疫治疗中实现药物的共传递。金属纳米粒子、脂质体、纳米囊泡、纳米前药物胶束等作为装载PS和IDO抑制剂的纳米给药系统都致力于提高药物递送的效率。在给药过程中避免药物泄露、提高肿瘤特异性、提高药物释放效率是实现药物有效递送的重要措施。为了防止药物泄漏,通过可裂解化学键将药物连接到辅助分子的前药纳米给药系统已经成为一个新兴的研究领域。例如,Gao等人将聚乙二醇化的PS(PGP)和IDO-1抑制剂(NPC)前药整合到一个平台中,设计了一种TME敏感的前药囊泡(A.Gao,B.Chen,J.Gao,F.Zhou,M.Saeed,B.Hou,Y.Li,H.Yu,SheddableProdrug Vesicles Combating Adaptive Immune Resistance for ImprovedPhotodynamic Immunotherapy of Cancer,Nano Lett 20(1)(2020)353-362.)。在血液运输过程中前药囊泡是稳定的,PDT效应被抑制以避免血流中的光毒性。当累积在肿瘤部位时,MMP-2和GSH诱导的前药可以恢复PDT和IDO-1抑制的能力。为了提高传统药物对肿瘤的特异性,人们设计了许多肿瘤特异性靶向配体进行药物修饰,以增强药物的主动靶向能力。当然,药物传递的最后也是最关键的一步是药物的有效释放。如果递送到肿瘤部位的药物没有被有效地释放出来,那么所有的努力都将白费。为了实现这一点,Yang等人合成了pH响应型纳米囊泡(pRNVs)用于PS(HPPH)和IDO抑制剂(IND)的递送(W.Yang,F.Zhang,H.Deng,L.Lin,S.Wang,F.Kang,G.Yu,J.Lau,R.Tian,M.Zhang,Z.Wang,L.He,Y.Ma,G.Niu,S.Hu,X.Chen,Smart Nanovesicle-Mediated Immunogenic Cell Death through TumorMicroenvironment Modulation for Effective Photodynamic Immunotherapy,ACS Nano14(1)(2020)620-631.)。由于叔胺在酸性环境中的质子化作用,负载双药的pRNVs促进了药物的释放,提高了治疗的特异性和疗效。虽然多种癌症治疗载体已经被研究出来,但这些载体的临床表现并不令人满意,主要是由于其内在缺陷,如载药率低、缺乏肿瘤特异性、具有细胞毒性来源等。因此,为了更有效、准确地治疗肿瘤,必须进一步研究纳米治疗药物。
发明内容
本发明要解决现有技术中的技术问题,提供一种pH/GSH响应的双响应纳米前药物胶束及其制备方法和应用,该胶束具有较高的载药率和控释性能,可用于MRI介导的PDT和免疫协同治疗。
为了解决上述技术问题,本发明的技术方案具体如下:
本发明提供一种双响应纳米前药物胶束,该胶束是以胱胺(Cys)为连接体,通过自组装γ-聚谷氨酸(PGA)-Gd3+螯合的脱镁叶绿素A(PPA@Gd)将吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂NLG919装载到疏水核内,构建得到的双响应纳米前药物胶束,其表达式为NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd。
在上述技术方案中,优选的是,所述双响应纳米前药物胶束呈球形,其平均直径为103.6±2.1nm、平均水动力直径为136.3±4.5nm。
本发明还提供一种双响应纳米前药物胶束的制备方法,包括以下步骤:
步骤1、用PGA和Cys制备得到PGA-Cys;
步骤2、通过酰胺键将PPA与PGA-Cys偶联,合成两亲性接枝共聚物PGA-Cys-PPA;
步骤3、将GdCl3·6H2O加入到PGA-Cys-PPA溶液中,得到产品PGA-Cys-PPA@Gd;
步骤4、将NLG919和PGA-Cys-PPA@Gd结合物混合,然后在超声的情况下将混合溶液滴加到蒸馏水中,透析,得到双药负载的胶束水溶液NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd。
在上述技术方案中,优选的是,所述步骤1的一种具体实施方式为:
将0.50g,3.40mmol PGA溶解在50mL 0.1M的磷酸盐缓冲溶液中,然后加入3.28g,0.017mol EDC和3.94g,0.034mol NHS活化PGA的羧基官能团30分钟;随后,向上述溶液中滴加0.1M氢氧化钠直至溶液的pH值达到中性,再向溶液中加入1.54g,6.80mmol Cys,在25℃下连续搅拌反应24h;最后,将反应溶液装入透析袋中,用蒸馏水透析48小时,并使用冷冻干燥机进行冻干得到PGA-Cys。
在上述技术方案中,优选的是,所述步骤2的一种具体实施方式为:
在黑暗以及通入氮气气氛的条件下,将0.12g,0.20mmol PPA溶解于20mL的DMSO中,再向其中加入0.19g,1.01mmol EDC和0.12g,1.01mmol NHS,转移至100mL三颈烧瓶内,通入氮气,在黑暗条件下反应12h用于PPA羧基的活化;然后将第一步合成的产物PGA-Cys加入到上述溶液中连续搅拌反应24小时;随后将反应溶液装入透析袋用DMSO透析2天,再经蒸馏水透析1天,以去除游离的PPA和有机溶剂;最后将反应溶液冷冻干燥,得到墨绿色产物PGA-Cys-PPA。
在上述技术方案中,优选的是,所述步骤3的一种具体实施方式为:
以GdCl3·6H2O:PGA-Cys-PPA的摩尔比2:1将GdCl3·6H2O加入PGA-Cys-PPA溶液中,搅拌24h,然后将未螯合的GdCl3从PGA-Cys-PPA中通过蒸馏水透析2天,然后冻干得到最终产品PGA-Cys-PPA@Gd。
在上述技术方案中,优选的是,所述步骤4的一种具体实施方式为:
将2mg的NLG919和10mg的PGA-Cys-PPA@Gd结合物在100μL DMSO溶液中混合,然后在超声的情况下将混合溶液滴加到4mL蒸馏水中,2分钟后将该溶液用蒸馏水透析2天,得到双药负载的胶束水溶液NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd。
本发明还提供一种双响应纳米前药物胶束在制备用于核磁共振成像引导的光动力免疫协同治疗药物上的应用。
本发明的有益效果是:
本发明针对TME的弱酸性和GSH含量高的特点,开发了一种pH/GSH响应的纳米前药胶束NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd,该胶束具有较高的载药率和控释性能,可用于MRI介导的PDT和免疫协同治疗(图9)。本发明以胱胺(Cys)为连接体,通过自组装γ-聚谷氨酸(PGA)-Gd3+螯合的脱镁叶绿素A(PPA@Gd)将吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂NLG919装载到疏水核内,构建了纳米药物前胶束,以防止PS提前泄漏并控制药物释放。在本发明中,选用PGA作为外层亲水性聚合物延长血液循环,增强生物相容性和主动靶向能力(通过γ-谷氨酰转移酶介导的内吞作用)。内层接枝PPA不仅作为PS和螯合剂,还作为疏水部分通过疏水和π-π堆积相互作用包封NLG919。在生理条件下,纳米胶束表现出良好的稳定性,PPA不处于光活性状态。当在弱酸性还原性肿瘤TME中积累后,可触发胶束裂解,释放光活性的PPA和NLG919。更重要的是,胶束的r1值可以达到29.85mM-1s-1,体内实验结果进一步表明所制备的纳米胶束适合于肿瘤的T1加权MRI。据我们所知,这是首次通过将Gd3+与PPA螯合赋予纳米微粒MRI的能力,形成一种集诊断和治疗功能于一体的新型纳米平台。最后,在荷瘤小鼠模型中综合评价成像引导PDT与免疫协同治疗,取得了明显的协同治疗效果。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明的NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd纳米胶束的结构表征图,其中,PGA-Cys-PPA@Gd的(a)DLS、SEM图像(插图)和(b)CQC值;(c)NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd的DLS结果和SEM图像(插图);(d)PGA-Cys-PPA、NLG919和NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd的紫外-可见光谱图。
图2为本发明的NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd纳米胶束的性能表征图,其中,(a)NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd在PBS中的胶束稳定性;(b)NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd在pH7.4,pH6.8(含或不含GSH)的PBS溶液中的粒径分布的变化和(c)NLG919累积释放情况;(d)NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd在PBS和DMSO(含和不含GSH)溶液中的荧光发射光谱。
图3为本发明的NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd纳米胶束的体外ROS生成及细胞摄取图,其中,(a)PGA-Cys-PPA@Gd在DMSO中有和没有激光(670nm,5mW/cm2)时1O2的产生情况;(b)PPA±激光照射和PGA-Cys-PPA@Gd±激光照射时细胞内产生的ROS的荧光显微镜图像,比例尺:20μm;(c)不同处理组DCF的平均荧光强度;PGA-Cys-PPA@Gd和NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd处理的细胞中PPA的(d)细胞摄取和(e)平均荧光强度,比例尺:40μm。
图4为光毒性和IDO抑制实验图,其中,MTT法测定PPA和PGA-Cys-PPA@Gd处理后(a)4T1和(b)Hela细胞的存活率;(c)观察PPA和PGA-Cys-PPA@Gd治疗组的活细胞和死细胞数量,比例尺:200μm;细胞内(d)Kyn抑制率和(e)Kyn浓度的研究;(f)血浆样品中Kyn与Trp的比值;图(a)和(b)中每4个竖条从左至右依次代表①、②、③、④。
图5为NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd联合PDT和IDO抑制的体内治疗效果图,其中,(a)NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd的T1加权自旋回波MR图像和T1弛豫率;(b)4T1荷瘤小鼠尾静脉注射NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd后不同时间点MRI图像;(c)注射后不同时间点肿瘤平均T1-MR信号的定量;(d)基于NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd抗肿瘤实验示意图;经过不同试剂治疗后肿瘤的(e)体积和(f)重量变化;(g)收集切除的肿瘤图像;经过不同试剂治疗后小鼠的(h)体重和(i)存活率变化情况;不同处理组小鼠血液中(j)TNF-α和(k)IL-6的浓度。
图6为本发明的NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd的生物相容性和安全性图,其中,在不同浓度NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd孵育下的(a)溶血试验和(b)溶血率;(c)血液学参数和(d)H&E染色评估,比例尺:100μm。
图7为本发明的PGA、PGA-Cys和PGA-Cys–PPA结合物的结构表征图,其中,PGA、PGA-Cys和PGA-Cys–PPA结合物的(a)1HNMR,(b)FT-IR和(c)UV-Vis光谱。
图8为本发明的NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd胶束在pH7.4,pH6.8的PBS溶液(有无GSH)中的状态图。
图9为本发明的双响应纳米前药物胶束的制备及用于核磁共振成像引导的光动力免疫协同治疗示意图,其中,(a)NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd纳米前药物胶束的制备图;(b)NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd用于pH/GSH诱导的药物释放和MRI引导的PDT和免疫协同治疗的示意图。
图10为合成路线图,其中,(a)PGA-Cys;(b)PGA-Cys-PPA;(c)PGA-Cys-PPA@Gd结合物。
图11为NLG919标准曲线图。
具体实施方式
本发明的发明思想为:胶束作为纳米载体为恶性肿瘤的早期诊断和治疗提供了新的机会,但在有效地将药物运送到体内病变区域的道路上遇到了许多障碍。为了解决这些问题,针对TME的弱酸性和GSH含量高的特点,本发明开发了一种pH/GSH响应纳米前药物胶束(NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd),该胶束具有较高的载药率和可控的药物释放性能,可用于核磁共振引导的光动力(PDT)和免疫协同治疗。在正常生理条件下,纳米胶束处于稳定的光猝灭状态。然而,当累积到肿瘤部位后,由于PGA-Cys-PPA的酰胺键和Cys的二硫键分别对pH和GSH敏感,胶束显示出肿瘤微环境(TME)触发的光敏剂PPA和吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂NLG919的释放。更重要的是,这些胶束中PPA与聚合物的结合可以避免血液循环中不必要的PPA泄漏。此外,获得的胶束还可以增强肿瘤的T1加权核磁共振成像(MRI)的对比度,其高弛豫率(r1=29.85mM-1s-1)。体外和体内实验结果表明,该胶束具有良好的生物相容性和生物安全性。基于PDT和IDO通路抑制的高效给药策略,该智能双药递送系统可作为MRI引导肿瘤联合治疗的有效途径。
下面将结合本发明实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
以下实施例所用的材料与试剂,细胞系和动物及表征手段如下:
材料与试剂:
γ-聚-谷氨酸(PGA,Mw=50-100kDa)由麦克林生化有限公司(中国上海)提供。胱胺(Cys)二盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、9,10-二甲基蒽(DMA)和NLG919由阿拉丁生化科技有限公司(中国上海)提供。脱镁叶绿素A(PPA)购自FrontierScientific公司(Logan,Utah,USA)。DMEM培养基由以色列生物工业公司提供。GdCl3·6H2O、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、钙黄绿素乙酰氧甲基酯(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)购自Sigma-Aldrich公司(St.Louis,USA)。2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)购自碧云天生物科技有限公司(中国上海)。Hoechst 33342来源于中国北京太阳生物科技有限公司。
细胞系和动物
Hela、4T1细胞系、BALB/c雌性小鼠购于长春亿源生物科技有限公司。所有细胞在含有10%胎牛血清、100U mL-1青霉素和100μg mL-1链霉素的DMEM中培养(37℃、5%CO2)。所有的小鼠接受的治疗都符合国际道德准则。
表征
用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM,JSM-7610F,JEOL Ltd,Japan)在5keV下对PGA-Cys-PPA@Gd和NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd进行形态学检测。使用粒度分析仪(美国Nicomp380),通过动态光散射(DLS)测量PGA-Cys-PPA@Gd和NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd的粒径和粒径分布。通过1H NMR(9.4T Bruker Avance III 400MHz NMR光谱仪,德国)测定了PGA、PGA-Cys和PGA-Cys-PPA结合物的化学结构。此外,还通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR,thermofisher,Waltham,MA,USA)分析了它们的成功接枝。用紫外-可见分光光度计(UV-Vis,Cary50扫描紫外-可见分光光度计,Varian)测定游离PPA和PGA-Cys-PPA复合物在668nm处的吸光度。采用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES,PerkinElmer Optima8000)测定PGA-Cys-PPA@Gd溶液中Gd3+的浓度。使用1.0T动物MRI扫描仪在不同钆浓度下获得T1加权MR图像。NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd的纵向弛豫时间(T1)用9.4T Bruker Avance III400MHz核磁共振波谱仪(德国)估算。通过拟合Gd浓度与弛豫速率1/T1的关系,计算出纵向弛豫率(r1)。
实施例1 NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd纳米胶束的制备
PGA-Cys、PGA-Cys-PPA和PGA-Cys-PPA@Gd的合成
在一个典型的碳二亚胺反应中,首先将PGA(0.50g,3.40mmol)溶解在50mL0.1M的磷酸盐缓冲溶液中(PBS,pH=6.8),然后加入EDC(3.28g,0.017mol)和NHS(3.94g,0.034mol)活化PGA的羧基官能团30分钟。随后,向上述溶液中滴加0.1M氢氧化钠直至溶液的pH值达到中性,再向溶液中加入Cys(1.54g,6.80mmol),在25℃下连续搅拌反应24h。最后,将反应溶液装入透析袋(MWCO8-14kDa)中,用蒸馏水透析48小时,并使用冷冻干燥机(FDU-2110,EYELA,Japan)进行冻干得到PGA-Cys。
接着,在黑暗以及通入氮气气氛的条件下,通过酰胺键将PPA与PGA-Cys偶联,合成了两亲性接枝共聚物PGA-Cys-PPA。具体步骤为:首先,将PPA(0.12g,0.20mmol)溶解于20mL的DMSO中,再向其中加入EDC(0.19g,1.01mmol)和NHS(0.12g,1.01mmol),转移至100mL三颈烧瓶内,通入氮气,在黑暗条件下反应12h用于PPA羧基的活化;然后将第一步合成的产物PGA-Cys加入到上述溶液中连续搅拌反应24小时;随后将反应溶液装入透析袋(MWCO8-14kDa)用DMSO透析2天,再经蒸馏水透析1天,以去除游离的PPA和有机溶剂;最后将反应溶液冷冻干燥,得到墨绿色产物PGA-Cys-PPA。
通过与Gd3+简单螯合,合成了PGA-Cys-PPA@Gd结合物。具体步骤为,将GdCl3·6H2O以2:1(GdCl3·6H2O:PGA-Cys-PPA)的摩尔比加入PGA-Cys-PPA溶液中,搅拌24h,然后将未螯合的GdCl3从PGA-Cys-PPA中通过蒸馏水透析2天,然后冻干得到最终产品PGA-Cys-PPA@Gd。
上述合成路线参见图10,本发明以二硫键对GSH敏感的Cys为连接剂通过简单的两步反应合成两亲性PGA-Cys-PPA结合物(图10a和10b)。然后将Gd3+离子螯合到被接枝PPA的卟啉环上,使PGA-Cys-PPA@Gd具有T1加权MRI性能(图10c)。最后,在超声波作用下,在水溶液中自组装得到两亲性PGA-Cys-PPA@Gd载药纳米胶束。通过1H NMR(图7a)、FT-IR(图7b)和UV-Vis(图7c)证实了PGA-Cys-PPA的成功制备。如图所示PGA-Cys的1H NMR谱在δ3.14ppm(a)处的峰值属于-CH2-S-S-,在δ2.99ppm(b)和δ2.87ppm(c)处的峰可以分别归因于与酰胺键(-CH2-NHCO)和氨基(-CH2-NH2)连接的亚甲基上的氢。PGA-Cys-PPA在δ9.31ppm(d)、δ9.22ppm(e)、δ8.66ppm(f)、δ6.86ppm(g)和δ6.20ppm(h)的峰均属于PPA的质子峰,表明Cys已将PGA和PPA成功连接形成共轭物。此外,PGA、PGA-Cys和PGA-Cys-PPA的FT-IR光谱也可以确定PGA-Cys-PPA的成功偶联。在1650cm-1、1560cm-1和1390cm-1处的重叠峰分别对应PGA-Cys和PGA-Cys-PPA酰胺基团的C=O拉伸、N-H弯曲和C-N拉伸振动;在PGA-Cys和PGA-Cys-PPA的FT-IR光谱中额外出现了551cm-1和556cm-1处的峰,均来源于Cys的二硫键。与PPA连接后,在1740cm-1处出现的峰可归因于PPA外环中的酮基。此外,在668nm处的紫外-可见吸收图也证实了PGA-Cys-PPA的成功制备。为了确定Gd3+与PPA卟啉环的螯合是否成功,采用ICP-OES测定其Gd3+含量为1.43mmolg-1,与PPA接枝率基本一致,说明PGA-Cys-PPA@Gd的成功合成。
NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd纳米胶束的制备
通过透析法制备NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd载药纳米胶束。首先,将2mg的NLG919和10mg的PGA-Cys-PPA@Gd结合物在100μL DMSO溶液中混合,然后在超声的情况下将混合溶液缓慢滴加到4mL蒸馏水中,2分钟后将该溶液用蒸馏水透析2天,得到双药负载的胶束水溶液NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd。最后将其直接冻干并称重。采用紫外-可见定量分析方法分别计算了NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd中PPA和NLG919的质量(PPA质量为:2.14mg,NLG919质量为:1.65mg)。最后,根据以下公式计算载药量(DLC)和载药效率(DLE)。
实施例2 CQC的测定及PGA-Cys-PPA@Gd纳米空胶束制备
以芘为探针,用荧光光谱法测定PGA-Cys-PPA@Gd在pH7.4的PBS中临界自淬灭浓度(CQC)。首先,将浓度为5.07×10-4mgmL-1~0.52mgmL-1的PGA-Cys-PPA@Gd溶液加入样品瓶中,在黑暗条件下与芘的丙酮溶液混合。采用荧光分光光度计(PerkinElmer-LS-55),在固定激发波长334nm下,准确测定了芘在374nm(I374)和392nm(I392)处的荧光发射强度。以共轭浓度的对数为横坐标,通过计算强度比I392/I374,所得的交点值即为CQC值。
然后取10mg两亲性PGA-Cys-PPA@Gd结合物物溶于5mL蒸馏水中搅拌半小时,得到PGA-Cys-PPA@Gd纳米空胶束。
两亲性PGA-Cys-PPA@Gd结合物在搅拌作用下能在水溶液中自组装成纳米空胶束。在SEM图像中(图1a的插图),这些未载药的纳米胶束呈球形,平均粒径大约为94.9±3.5nm。相应地,平均水动力直径为118.6±5.2nm(PDI=0.192±0.04)(图1a)。随着自组装胶束的形成,芘分子逐渐被胶束包裹,并由于芘与PPA分子的疏水和π-π堆积相互作用而呈现自淬灭状态。然后以芘为荧光探针测定其临界自淬灭浓度(CQC)为35.8μg mL-1(图1b),表明其具有卓越的自组装和自淬灭能力。然后通过透析法将免疫佐剂NLG919装入胶束中,得到纳米前药物胶束NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd。装载NLG919后,SEM图像显示这些纳米胶束仍然保持良好的球形。然而,它们的平均直径增加到103.6±2.1nm(图1c的插图),通过DLS分析,它们的平均水动力直径增加到136.3±4.5nm(PDI=0.170±0.02)(图1c),这是由于纳米微粒在水介质中处于膨胀状态导致的。如图1d所示,在263nm处的紫外-可见光谱中出现了一个新的吸收峰,这属于NLG919的特征峰,说明免疫佐剂已成功装载到PGA-Cys-PPA@Gd胶束中。计算两种药物的DLC(PPA:35.8%,NLG919:27.6%)和DLE(PPA:84.4%,NLG919:82.6%)。这些数据表明所制备的胶束在肿瘤治疗中具有很高的临床应用潜力。
实施例3 NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd的稳定性和pH/氧化还原触发的响应性
通过监测粒径随时间的变化来评估胶束NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd在PBS(pH=7.4)中的物理稳定性。样品在37℃的振荡浴中孵育,然后用DLS测量胶束粒径随时间的变化情况。此外,通过DLS监测NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd胶束在pH 7.4、pH 6.8和pH 6.8+GSH(10mM)的PBS溶液中孵育2h后的粒径大小变化,进而评估pH/氧化还原引发的胶束裂解情况。
有前途的载体通常需要具有精确的药物释放能力,这就要求载体具有稳定的循环性能和TME响应性。因此,本发明首先用DLS检测了NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd在37℃下PBS溶液中的胶束稳定性。可以发现载药胶束的平均粒径在6天的观察期间内均能保持稳定(图2a),说明这些纳米胶束在正常生理条件下具有长期稳定性。然后在pH 7.4、pH 6.8和pH6.8+GSH(10mM)三种缓冲溶液中,在37℃条件下考察了pH/氧化还原触发的载药胶束裂解情况。当这些胶束在pH 7.4的PBS中孵育时,它们呈现单峰分布,直径约为136nm(图2b);而在pH值为6.8的弱酸性条件下,由于pH值敏感的酰胺键断裂,颗粒尺寸明显增大,呈双模态分布。在pH 6.8、GSH浓度为10mM时,进一步由于二硫键断裂,胶束继续膨胀,粒径增加到2000nm左右。裂解后胶束状态如图8所示。这些结果表明,这些纳米微粒在正常生理条件下具有良好的稳定性,在弱酸性和还原条件下可以逐渐裂解释放药物。
实施例4 NLG919体外释放研究
采用透析法评价NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd的体外免疫佐剂的释放情况。简单地说,取1mLNLG919/PGA-Cys-PPA@Gd溶液转移到透析袋(MWCO=8-14kDa)中,一式三份,然后将该透析袋分别浸泡在15mL不同磷酸盐缓冲溶液(pH7.4,pH6.8和pH6.8+10MmGSH)中,在37℃、300rmin-1搅拌的条件下孵育。透析1、2、4、6、8、12、24h(n=1~7)后,收集500μL透析液,同时补充等量新鲜磷酸盐缓冲液,保持透析外液体积不变。将透析液稀释至1mL,在262nm处用紫外-可见光谱仪测定吸光度。根据NLG919标准曲线(图11)计算不同时间的累积释药量,公式总结如下:
其中:Rc为各样品累积药物释放的百分含量,An表示262nm处的吸光度,Cn和Cn-1(μgmL-1)分别代表第n、n-1个时间点NLG919在透析外液中的浓度,“m”为总载药量。
本发明通过透析法在不同pH值的PBS(含GSH和不含GSH)中进一步研究了NLG919在纳米微粒中的释放性能。采用263nm紫外-可见吸光度法测定药物释放速度,如图2c所示,累积药物释放的百分比在24小时左右达到最大,正如预期的那样,24h后pH7.4组的NLG919只有59.9%的累积释放,而在同一时间点将pH值调整到6.8药物的累积释放率增加到72.3%,当进一步加入10mM GSH时,药物释放率达到89.6%,说明由于酰胺键和二硫键的断裂,弱酸性和还原性条件有利于载体的裂解和药物释放。此外,NLG919的含氮基团在酸性环境下容易发生质子化,导致药物与载体之间的疏水相互作用减弱,进一步促进了药物的释放。因此,NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd可以作为控制NLG919释放和提高其利用率的优秀载体。
实施例5 NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd纳米胶束的自淬灭效应
为了评估NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd自组装引起的自淬灭效应,本发明将NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd(0.2mgmL-1)分别溶于DMSO(含或不含10mMGSH)和PBS(pH=7.4)中。2小时后,用荧光分光光度计记录每个样品溶液在405nm激发波长下的荧光发射光谱。
在给药过程中,PS处于光淬灭状态可以提高诊疗胶束的安全性,减少副作用。为了评价NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd的自淬灭效果,分别检测了胶束在PBS(pH=7.4)和DMSO中的荧光发射光谱。在PBS中几乎没有观察到这些胶束的荧光(图2d),表明当胶束通过疏水和π-π堆积相互作用自组装时,由于PPA和NLG919之间形成基于荧光共振能量转移的供体-受体对,因此PPA分子的光敏性被完全抑制。而当相同PPA浓度的胶束溶解在DMSO中时,可以检测到强烈的荧光发射,说明胶束在DMSO中不能进行组装,从而使接枝到大分子链上的PPA分子部分暴露于溶液中,抑制了分子间光淬灭的发生。此外,在加入10mM GSH后,这些胶束在DMSO中的荧光强度增加了约1.5倍,说明胶束在还原条件下可以通过二硫键断裂导致光活性PPA分子的释放。因此,本发明制备的胶束具有良好的自淬灭性能,可用于减少血液循环过程中的过早光漂白和抑制光毒性。
实施例6体外ROS的产生情况
利用DMA作为1O2捕捉器检测PGA-Cys-PPA@Gd在溶液中的ROS产生情况。首先,将50μL DMA溶液(0.947mM)添加到4mL PGA-Cys-PPA@Gd的DMSO溶液中,保持DMA浓度为1.184×10-2mM。然后使用光强度为5mW/cm2波长为670nm的激发光源(QiYe-031220,长春亮丽电子有限公司,中国)照射该溶液。为了作对比,另一组溶液不经过激光处理。在360nm激发波长下每隔一分钟监测一次DMA的荧光强度。
此外,使用DCFH-DA作为ROS探针测量细胞内ROS的产生情况。首先,以每孔5×105个细胞的密度将Hela细胞接种到6孔板上。过夜孵育后,吸弃旧的培养液,加入2.5mL游离PPA和PGA-Cys-PPA@Gd悬浮液,保持PPA终浓度为5μg mL-1。孵育3h后,移除上清液,用PBS清洗3次。接着向各孔中加入1mL PBS稀释的DCFH-DA探针(10μM)避光孵育1.5h,每孔分别用670nm激光(5mW/cm2)照射5min。最后,向各孔中加入1mL Hoechst 33342(10μM)进行染色,孵育5min后,每组细胞用Leica荧光显微镜(Leica DMI4000B)观察分析。
实施例7细胞摄取
用荧光显微镜观察细胞对PPA的摄取情况。首先,用PBS缓冲液(不含Ca2+、Mg2+)冲洗生长良好的HeLa细胞并制备成细胞悬液,然后以5×105细胞/孔的密度接种于6孔板中,孵育过夜。随后,丢弃旧培养基,用含有PGA-Cys-PPA@Gd和NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd的2.5mL完全培养基孵育细胞,保持PPA的终浓度为5μg mL-1。孵育4h后,去除培养液,用PBS缓冲液洗涤3次,然后用Hoechst 33342(2μg mL-1)染色。用荧光显微镜观察细胞内PPA的荧光。
为了测定样品溶液中ROS的产生情况,实验选择DMA作为1O2捕获器,因为它可以与1O2反应生成不发荧光的内部氧化物。如图3a所示,PGA-Cys-PPA@Gd溶液在没有经过激光照射时荧光发射强度没有明显降低,说明没有产生1O2。然而,当这些胶束暴露在激光(670nm,5mW/cm2)下时,DMA的荧光强度会迅速下降;激光连续照射15分钟后,溶液的荧光几乎完全淬灭。这些结果表明,所制备的胶束可以有效地产生1O2,可进一步用于肿瘤的光动力治疗。此外,本发明使用DCFH-DA作为一种非常敏感的ROS探针来测定Hela细胞中ROS的产生情况,因为DCFH-DA可被ROS氧化成DCF形式从而发出绿色荧光。荧光图像显示,仅用PPA或PGA-Cys-PPA@Gd处理的Hela细胞几乎没有显示出绿色荧光(图3b和3c),然而,在激光照射后,PPA或PGA-Cys-PPA@Gd处理组有明显的绿色荧光出现,表明合成的纳米胶束保留了PPA原本的功能,并比单独的PPA产生了更多的ROS。
接着,利用荧光显微镜研究了Hela细胞对PGA-Cys-PPA@Gd和NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd的细胞摄取情况。在使用胶束孵育4h后,两组处理组的荧光强度无显著差异(图3d和3e),说明NLG919的负载对胶束中PPA的细胞摄取效率没有明显影响。这种奇妙的细胞摄取能力可能是基于胶束中PGA的存在,有报道称PGA与肿瘤细胞表面γ-谷氨酰转移酶可以共同介导细胞的内吞作用。
实施例8体外光毒性检测
利用MTT法检测游离PPA和PGA-Cys-PPA@Gd对Hela细胞的光毒性。首先,细胞被接种到96孔板的密度为5×104个细胞/孔,孵化24h。然后,将100μL的空白溶液,PPA与不同浓度的PPA/PGA-Cys-PPA@Gd(0.31,0.62,1.25,2.50,5.00,10.00μgmL-1)添加到各孔中,培养4h。然后用新鲜DMEM替换旧培养基,再分别用5mW/cm2(670nm)光源照射细胞5min,然后继续孵育24h。同时,本发明也研究游离PPA和PGA-Cys-PPA@Gd在无光照处理下的暗毒性。最后,向每孔加入100μL MTT溶液(0.5mg mL-1)。孵育0.5h后,弃去上清,每孔加入100μLDMSO使蓝紫色福马赞晶体溶解。最后用酶标仪(Tecan Infinite 200 PRO)在570nm处检测每孔的吸光度。
细胞存活率=A样品/A对照×100%
为进一步观察活细胞和死细胞,将6μL Calcein AM(1000×)和6μL PI(1000×)与6mLPBS缓冲液混合,配制成染色液。首先,以每孔5×105个细胞的密度将Hela细胞接种到6孔板中,过夜孵育。然后加入同等浓度的5μg mL-1的游离PPA和PGA-Cys-PPA@Gd与细胞共孵育4h。随后,以5mW/cm2(670nm)的剂量照射细胞5min。接着,用新鲜DMEM孵育24h,每孔加1mL染液,在37℃条件下进一步孵育0.5h。最后用PBS洗涤3次,用Leica荧光显微镜进行成像观察。
为了评价PGA-Cys-PPA@Gd的体外PDT效率,采用MTT法测定PPA和PGA-Cys-PPA@Gd对4T1和Hela两种细胞株的细胞毒性。所有未经过激光辐照处理组的细胞存活率都很高(≈80%)(图4a和4b),表明胶束的暗毒性可以忽略不计,具有很高的生物安全性;而连续激光照射5min后,PPA和PGA-Cys-PPA@Gd组的细胞存活率与PPA浓度呈负相关,且具有明显的剂量依赖性。激光辐照后PGA-Cys-PPA@Gd(4T1细胞为3.31μgmL-1,Hela细胞为2.58μgmL-1)的半最大效应浓度(EC50)均低于PPA单体(4T1细胞为8.98μgmL-1,Hela细胞为4.42μgmL-1),说明PGA-Cys-PPA@Gd的光活性被抑制,由于纳米结构的裂解而被有效地恢复,纳米胶束中装载的PPA比单独的PPA能更有效地导致ROS触发下的细胞死亡。此外,为了使细胞毒性可视化,采用Calcein-AM/PI染液检测不同方法处理(PBS±激光、PPA±激光和PGA-Cys-PPA@Gd±激光)后Hela细胞的细胞存活情况。细胞存活情况与MTT结果一致,在PBS±激光,PPA-激光和PGA-Cys-PPA@Gd-激光治疗组出现Calcein-AM的绿色荧光(图4c),而PPA和PGA-Cys-PPA@Gd+激光治疗组出现了更大面积的红色荧光。可见,PGA-Cys-PPA@Gd能有效地在激光照射的细胞中产生细胞毒性ROS,并引起明显的细胞死亡,这些结果表明,本发明制备的纳米微球具有作为PDT的PS的潜力。
实施例9 IDO抑制实验
为了验证NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd递送的NLG919在体外对IDO通路具有抑制作用。本发明将Hela细胞在含有10μL色氨酸(1.2mM)的DMEM中以5×104细胞/孔的密度接种于96孔板中,孵育24h。将NLG919和NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd分别以不同浓度(NLG919浓度为0.16,0.32,0.63,1.25,2.50,5.00,10.00μM)加入含有GSH(10mM)的孔板中。同时,加入10μL的IFN-γ(终浓度为50ngmL-1)诱导IDO表达。孵育48h后,将150μL上清液转移至另一个96孔板中,与75μL30%三氯乙酸混合终止反应。然后将混合物置于96孔板中,在50℃下孵育30min,使色氨酸代谢的中间产物水解。然后取100μL上清移入新的96孔板,在空白孔中加入不同浓度的犬尿氨酸,检测制作标准曲线。最后,以相同体积加入Ehrlich试剂(2%对二甲氨基苯甲醛/冰乙酸w/v),反应10分钟后,测定各孔在490nm处的吸光度,计算Kyn的抑制率。
通过检测肿瘤组织中Trp和Kyn的含量来评价IDO通路在体内的抑制作用。简单地,将每组肿瘤取出并切成相同大小的块状,然后加入1mLPBS制备成匀浆。在加入75μL30%三氯乙酸后,将混合溶液在50℃条件下孵育30分钟,然后3000G离心10分钟。最后将上层清液转移到另一个96孔板中,之后的实验步骤和前面的体外步骤一致。最后用酶标仪分别在280nm和490nm处测定色氨酸和犬尿氨酸的吸光度。
IDO是多种恶性肿瘤免疫治疗的重要免疫检查点,它能催化Try向Kyn及其衍生物代谢,进一步介导肿瘤免疫耐受和预后不良。因此,本发明采用酶联免疫吸附法检测Kyn的抑制率,以评价诊疗试剂对IDO的抑制效果。如图4d所示,NLG919和NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd处理的Hela细胞中Kyn的抑制率都随着NLG919浓度的增加而增加,可以说明免疫佐剂从纳米载体中有效释放,进而有效地抑制了IDO通路。重要的是,通过拟合计算,药物在胶束处理组中的EC50值达到了5.76μΜ,当给予10μM NLG919进行药物后,Kyn的浓度显著降低至7μgmL-1(图4e),表明NLG919被封装到PGA-Cys-PPA@Gd纳米胶束后仍能保持其抑制活性。在此之后,本发明推测通过静脉注射我们的治疗药物可以在体内实现IDO通路抑制。因此,本发明通过检测肿瘤组织中Trp与Kyn的比值来评价NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd的免疫活性,盐水处理组的比例约为NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd组的2.4倍(图4f),说明释放的NLG919能够有效阻断IDO通路。
实施例10活体MR成像
首先在BALB/c小鼠右前腋窝皮下注射1.0×106个4T1细胞建立原位荷瘤小鼠模型。再根据公式V=L×W2/2计算肿瘤体积(L为肿瘤最长直径,W为肿瘤最短直径)。当肿瘤体积达到~100mm3时,每只小鼠静脉注射200μLNLG919/PGA-Cys-PPA@Gd([PPA]=0.25mgmL-1,[Gd]=0.65mgkg-1)。使用配备了用于小动物成像特殊线圈的1.0T动物MRI扫描仪(AspectImaging,Israel)进行MR成像。
影像引导治疗不仅可以提供准确的肿瘤定位信息,还可以监测治疗后疾病的进展情况,进一步优化治疗效率。为了探索NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd作为T1加权磁共振造影剂的潜力,在9.4TNMR谱仪上测量了不同Gd3+浓度的胶束的纵向弛豫时间(T1)。NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd的纵向弛豫率r1为29.85mM-1s-1(图5a),这主要是由于Gd3+螯合到大分子纳米平台中,可以有效降低分子的翻转率,进一步增强该纳米平台对MRI的正对比能力。根据体外检测的较高的r1值和T1加权自旋回波MRI,本发明监测了荷瘤小鼠体内肿瘤部位的MRI。图5b为静脉给药200μL NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd(PPA剂量为2.5mg kg-1,Gd剂量为0.65mg kg-1)后不同时间间隔4T1荷瘤小鼠的截面T1MR图像,在注射后1h时,肿瘤部位较早地出现了MR信号,然后随着时间的延长。注射后12小时,肿瘤部位出现明亮信号,比初始信号增强58倍(图5c),这些结果表明,该纳米胶束具有良好的磁共振成像能力,可以实时监测肿瘤的生长。
实施例11体内治疗效果
为了评价NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd在体内的治疗效果,当肿瘤达到60~70mm3时,将4T1原位荷瘤小鼠随机分为4组(n=7)。经尾静脉注射生理盐水、PPA、NLG919和NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd(PPA剂量为2.5mgkg-1,NLG919剂量为1.45μmolkg-1)。5h后,用激光(670nm,5mW/cm2)照射肿瘤部位30min,每4天定期治疗1次,在此期间,每天监测各组肿瘤体积和体重变化情况。观察14天后,从眼球中取血,然后处死小鼠,取肿瘤及主要脏器进行进一步分析。
通过皮下4T1肿瘤模型评价NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd的体内抗肿瘤作用。将荷瘤小鼠随机分为四组,分别尾静脉注射生理盐水、PPA、NLG919和NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd(PPA剂量为2.5mgkg-1,NLG919剂量为1.45μmol kg-1)药物。图5d为肿瘤接种、分组、治疗、分析的实验示意图,每隔一天记录各组肿瘤体积变化情况(图5e),如图可见NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd治疗组肿瘤体积大小基本不变,其他肿瘤体积随时间延长明显增加。结合图5f和图5g的结果可以看出单体治疗效果较差,NLG919和PPA治疗组对肿瘤质量的抑制分别为6.0%和37.8%,而胶束治疗组对肿瘤生长的抑制最为明显(63.4%)。这表明联合疗法可以显著提高癌症治疗的效果。与其他组相比,NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd没有抑制小鼠的生长(图5h),并且可以延长小鼠的生存时间(图5i),说明本发明制备的胶束适合治疗肿瘤,毒副作用低。免疫相关细胞因子TNF-α和IL-6主要介导细胞免疫反应,刺激T细胞增殖,促进细胞毒性T淋巴细胞对癌细胞产生杀伤作用,实验用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定不同处理小鼠血中三种化合物的浓度,可以看出NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd组的TNF-α和IL-6水平明显高于其他组(图5j和5k)。结果表明,载药纳米胶束可作为有效的治疗试剂,激活免疫系统,提高光动力治疗的疗效。
实施例12肿瘤相关细胞因子水平
为检测细胞因子含量,将血浆3000G离心10min(4℃),获得各组小鼠血清样本,再采用ELISA试剂盒按说明书操作定量肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)的含量。最后用酶标仪在450nm处测定样品和标准品的OD值。
实施例13生物相容性和安全性
采用溶血实验评价NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd纳米胶束的血液相容性。取正常BALB/c小鼠新鲜血液,4℃3000rpm离心5min,弃掉血清,收取红细胞(RBC)。用PBS三次洗涤后,将红细胞悬浮在不同浓度胶束的PBS溶液(1.0mg mL-1~0.063mg mL-1),PBS(阴性对照)和1%Triton X100(阳性对照),然后在37℃培养2h。3000转离心5分钟后,在540nm处检测上层清液的吸光度。
溶血率=(A样品-A阴性对照)/(A阳性对照-A阴性对照)
然后采集各组小鼠的血液,放入取样管中进行血常规检查。取出各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾,用苏木精伊红(H&E)染色进行组织学分析。
本发明所有实验数据均以均数±标准差(SD)表示。同时使用Origin2018进行统计分析,p<0.05、0.01、0.001、0.0001分别用“*”、“**”、“***”、“****”表示。
生物相容性和安全性评价对新型药物纳米载体的应用具有重要意义,因此,本发明通过溶血试验、血常规分析和H&E染色分析检测这些纳米诊疗试剂在体内外的生物相容性和安全性。如图6a和6b所示,经过不同浓度的NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd孵育后,所有的胶束处理组BALB/c小鼠血液中红细胞溶血率均低于5%,与阳性对照相比,NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd具有良好的生物相容性。在生物安全性方面,血液学参数如白细胞(WBC)计数、红细胞(RBC)计数、血小板(PLT)评估显示,NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd治疗组与其他组之间无显著差异(图6c)。此外,主要器官的组织学染色图像也显示该胶束没有导致任何可见的组织损伤(图6d)。这些结果表明,载药纳米胶束在核磁共振成像引导下的光动力治疗和免疫协同治疗具有很高的安全性。
综上所述,本发明提供了一种同时包覆PPA@Gd和NLG919的双响应前药纳米胶束,用于T1加权MRI引导的光动力治疗和免疫协同治疗。结果表明,前药胶束在正常生理条件下具有较高的载药率和稳定性,然而当累积在肿瘤部位时,由于pH和GSH会引起胶束的酰胺键和二硫键断裂,因此NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd在弱酸性和还原性的TME中释放PPA和NLG919,与仅有pH处理组相比,可实现药物的有效释放。更重要的是,接枝的PPA封装在具有可切换光活性机制的胶束中,可减少光动力治疗的副作用,并可作为Gd3+的螯合剂实现T1加权MRI指导的精确治疗。通过PS与免疫佐剂的结合,本发明不仅可以实现PDT,还可以通过抑制IDO途径逆转免疫抑制的TME。体内实验结果表明,所设计的治疗药物在肿瘤部位有显著的积累,并能有效消融癌细胞,此外,本发明的胶束具有良好的水溶性、生物相容性和生物安全性。因此,本发明所设计的纳米前药物胶束在MRI引导PDT和免疫协同治疗中具有广阔的应用前景。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (8)
1.一种双响应纳米前药物胶束,其特征在于,该胶束是以胱胺(Cys)为连接体,通过自组装γ-聚谷氨酸(PGA)-Gd3+螯合的脱镁叶绿素A(PPA@Gd)将吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂NLG919装载到疏水核内,构建得到的双响应纳米前药物胶束,其表达式为NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd。
2.根据权利要求1所述的双响应纳米前药物胶束,其特征在于,所述双响应纳米前药物胶束呈球形,其平均直径为103.6±2.1nm、平均水动力直径为136.3±4.5nm。
3.一种权利要求1或2所述的双响应纳米前药物胶束的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1、用PGA和Cys制备得到PGA-Cys;
步骤2、通过酰胺键将PPA与PGA-Cys偶联,合成两亲性接枝共聚物PGA-Cy s-PPA;
步骤3、将GdCl3·6H2O加入到PGA-Cys-PPA溶液中,得到产品PGA-Cys-PPA@Gd;
步骤4、将NLG919和PGA-Cys-PPA@Gd结合物混合,然后在超声的情况下将混合溶液滴加到蒸馏水中,透析,得到双药负载的胶束水溶液NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd。
4.根据权利要求3所述的双响应纳米前药物胶束的制备方法,其特征在于,所述步骤1的一种具体实施方式为:
将0.50g,3.40mmol PGA溶解在50mL 0.1M的磷酸盐缓冲溶液中,然后加入3.28g,0.017mol EDC和3.94g,0.034molNHS活化PGA的羧基官能团30分钟;随后,向上述溶液中滴加0.1M氢氧化钠直至溶液的pH值达到中性,再向溶液中加入1.54g,6.80mmol Cys,在25℃下连续搅拌反应24h;最后,将反应溶液装入透析袋中,用蒸馏水透析48小时,并使用冷冻干燥机进行冻干得到PGA-Cys。
5.根据权利要求3所述的双响应纳米前药物胶束的制备方法,其特征在于,所述步骤2的一种具体实施方式为:
在黑暗以及通入氮气气氛的条件下,将0.12g,0.20mmol PPA溶解于20mL的DMSO中,再向其中加入0.19g,1.01mmol EDC和0.12g,1.01mmol NHS,转移至100mL三颈烧瓶内,通入氮气,在黑暗条件下反应12h用于PPA羧基的活化;然后将第一步合成的产物PGA-Cys加入到上述溶液中连续搅拌反应24小时;随后将反应溶液装入透析袋用DMSO透析2天,再经蒸馏水透析1天,以去除游离的PPA和有机溶剂;最后将反应溶液冷冻干燥,得到墨绿色产物PGA-Cys-PPA。
6.根据权利要求3所述的双响应纳米前药物胶束的制备方法,其特征在于,所述步骤3的一种具体实施方式为:
以GdCl3·6H2O:PGA-Cys-PPA的摩尔比2:1将GdCl3·6H2O加入PGA-Cys-PPA溶液中,搅拌24h,然后将未螯合的GdCl3从PGA-Cys-PPA中通过蒸馏水透析2天,然后冻干得到最终产品PGA-Cys-PPA@Gd。
7.根据权利要求3所述的双响应纳米前药物胶束的制备方法,其特征在于,所述步骤4的一种具体实施方式为:
将2mg的NLG919和10mg的PGA-Cys-PPA@Gd结合物在100μL DMSO溶液中混合,然后在超声的情况下将混合溶液滴加到4mL蒸馏水中,2分钟后将该溶液用蒸馏水透析2天,得到双药负载的胶束水溶液NLG919/PGA-Cys-PPA@Gd。
8.一种权利要求1或2所述的双响应纳米前药物胶束在制备用于核磁共振成像引导的光动力免疫协同治疗药物上的应用。
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