CN110354276B - 一种前药及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种前药及其制备方法和应用。该前药基本由式1、2所示的化合物与式3所示的聚合物单体结构组成，其中，式1化合物、式2化合物分别与式3单体结构的胱胺相连：
Figure DDA0002156042580000011
本发明的前药增大了所载药物的溶解性，改善其体内分布，并将化疗与光动力治疗联合，实现更高的抗肿瘤效果。

Description

一种前药及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物制剂技术领域，具体涉及一种前药及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
紫杉醇别名红豆杉醇，泰素，紫素，特素，是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物，在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗。但在临床应用中存在着水溶性差、毒副作用大、靶向性差的缺点。
两亲性多糖聚合物纳米载药系统，因良好的稳定性、药理活性、靶向性、生物粘附性、低毒性、低免疫原性、可生物降解性，得到了广泛的研究。两亲性多糖可在水中自组装形成纳米粒，疏水段接枝或包载药物，形成药物储库，防止药物的过早降解和消除。透明质酸是生物体内存在的天然多糖，可靶向多种肿瘤细胞表面高度表达的CD44受体，是构建靶向载体的理想材料。
此外，通过利用肿瘤部位与正常组织微环境性质的差异，构建刺激-响应型纳米载药系统，物理信号(主要包括热、电场、磁场、超声波)和化学信号(主要包括pH、低氧、还原电势、离子强度等)均可作为触发式释药的刺激信号。其中，还原响应性的纳米载体是利用肿瘤部位有较正常部位的高谷胱甘肽浓度，有较高的还原电势，通过引入还原敏感性材料，实现药物在肿瘤部位的触发释放。近年来，许多研究借助纳米技术，将光热治疗(photothermal therapy,PTT)，光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)，声动力治疗(sonodynamic therapy,SDT)等与化学治疗相结合，提高抗肿瘤效果。其中，光动力是利用光敏剂在光的激发下，将周围环境的氧分子转化成活性氧，杀伤肿瘤细胞，实现抗肿瘤作用。同时，一些光敏剂具有荧光能力，可以在体内成像，借此实现肿瘤诊断。为实现多功能诊疗一体化，纳米材料可同时负载光动力、光热、化疗、免疫治疗及核磁CT成像等药物，将化学治疗与光动力治疗、光热、免疫治疗和肿瘤影像学诊断有机整合，以实现同一时空下实现对肿瘤的多重诊疗。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种具有自组装性能、具有多功能的紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物前药及其制备方法和应用。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种前药，其基本由式1、2所示的化合物与式3所示的聚合物单体结构组成，其中，式1化合物、式2化合物分别与式3单体结构中的胱胺相连：
式1
Figure BDA0002156042560000021
式2
Figure BDA0002156042560000022
式3
Figure BDA0002156042560000031
在本发明的技术方案中，式1化合物为琥珀酸酐修饰后的紫杉醇，在本发明中也被称为琥珀酰紫杉醇，其制备方法包括：将溶解于二氯甲烷的琥珀酰酐中加入紫杉醇，于无水吡啶中反应24-48h，经分离干燥得到式1化合物。
其中，紫杉醇(Paclitaxel，PTX)，其CAS号为33069-62-4；分子式：C47H51NO14，结构如下所示：
紫杉醇：
Figure BDA0002156042560000032
在本发明的一些实施方式中，琥珀酸酐与紫杉醇的摩尔比为2-3:1，较为优选的摩尔比为1:0.35。
在本发明的一些实施方式中，琥珀酰与紫杉醇的质量比为1:1-1:10，进一步为1:3-1:5，吡啶用量为反应体系的0.1-0.3％(v/v)。
在本发明的实施方式中，式3结构为透明质酸-胱胺聚合物的单体结构，透明质酸-胱胺聚合物为式3单体结构的重复，可将单体结构以聚合度n的形式表示，聚合度n的情况取决于参与反应的透明质酸的摩尔量(或可根据透明质酸的分子量计算，本领域技术人员可基于常规方法获得聚合度，比如中胱胺的取代度可通过核磁氢谱来确定，在本发明的一些实施例中，胱胺的取代度不小于45％)，其中，透明质酸-胱胺聚合物的制备方法包括：将透明质酸溶解于PBS溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加入胱胺搅拌反应5-48h后得到粗产物，纯化干燥得到透明质酸-胱胺聚合物，其示意结构式4所示：
式4
Figure BDA0002156042560000041
在本发明的实施方式中，透明质酸(HA)的分子式为(C14H21NO11)n的相对分子量为9000～50000Da；其结构式如下所示：
透明质酸：
Figure BDA0002156042560000042
在本发明中，透明质酸-胱胺聚合物也被简称为HA-cys聚合物。
在本发明的一些实施方式中，透明质酸-胱胺聚合物的制备过程中，所述PBS溶液的pH为7-8，优选为7.4。
在本发明的一些实施方式中，透明质酸-胱胺聚合物的制备过程中，透明质酸与PBS溶液的用量比为0.1-1g溶于50ml PBS溶液中。
在本发明的一些实施方式中，透明质酸-胱胺聚合物的制备过程中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺为按顺序依次加入；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1-2:1-2，优选为1:1。
在本发明的一些实施方式中，透明质酸-胱胺聚合物的制备过程中，透明质酸、胱胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的投料质量比为1：3-20：0.15-2.05：0.1-3.05；在较为优选的实施方式中，该投量比为1：5-10：0.2-1.5：1-2.5。
在本发明的一些实施方式中，透明质酸-胱胺聚合物的制备过程中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺后于室温下搅拌10-40min；
在本发明的一些实施方式中，透明质酸-胱胺聚合物的制备过程中，加入胱胺后的反应时间为12-24h。
在本发明的一些实施方式中，透明质酸-胱胺聚合物的制备过程中，所述纯化方式为透析，透析袋截留分子量为3000-5000Da，优选为3500Da。
如上所述的，本发明所述的前药为为聚合物，在本发明中也被简称为紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物，可表示为PTX-HA-Ce6，其示意结构如式5所示：
式5：
Figure BDA0002156042560000051
R1、R2各自独立地选自以下结构：
Figure BDA0002156042560000052
Figure BDA0002156042560000061
在本发明的第二方面，本发明还提供了一种制备上述第一方面中所述的前药聚合物的方法，其包括制备得到透明质酸-胱胺聚合物，然后依次将式1和式2连接到透明质酸-胱胺聚合物上，形成前药聚合物。
在本发明的实施方式中，琥珀酸酐经吡啶催化开环，与紫杉醇的羟基连接合成琥珀酰紫杉醇即式1化合物；透明质酸羧基经活化后，与胱胺发生酰胺化反应，合成以式3化合物为单体结构的透明质酸-胱胺聚合物；然后分别将式1化合物和式2化合物的羧基活化后，依次接枝到透明质酸-胱胺聚合物的胱胺上，制备得到前药聚合物。
在本发明的实施方式中，所述透明质酸-胱胺聚合物以及式1化合物的制备方法如上述第一方面中所述方法相同。
在本发明的实施方式中，将式1化合物活化并连接到透明质酸-胱胺聚合物的方法包括：将式1化合物溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌10-40min得到式1化合物溶液；将式1化合物的溶液滴入溶解于甲酰胺的透明质酸-胱胺聚合物中反应12-48h，反应结束后式1化合物连接到透明质酸-胱胺聚合物的胱胺上、纯化干燥得到聚合物简称为紫杉醇-透明质酸聚合物。
在本发明的一些实施方式中，在将式1化合物活化并连接到透明质酸-胱胺聚合物的方法中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1-2：1-2，优选为1:1。
在本发明的一些实施方式中，在将式1化合物活化并连接到透明质酸-胱胺聚合物的方法中，透明质酸-胱胺聚合物与式1化合物的投料质量比为10:1-5；优选为5：1-2。
在本发明的一些实施方式中，在将式1化合物活化并连接到透明质酸-胱胺聚合物的方法中，式1化合物与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的投料质量比为1：0.21-0.63：0.12-0.36，优选为1：0.3-0.5：0.2-0.3。
在本发明的一些实施方式中，在将式1化合物活化并连接到透明质酸-胱胺聚合物的方法中，式2化合物的N,N-二甲基甲酰胺溶液浓度为2-4mg/mL。
在本发明的一些实施方式中，在将式1化合物活化并连接到透明质酸-胱胺聚合物的方法中，反应体系中N,N-二甲基甲酰胺与甲酰胺的体积比为1-2：1-2，优选为1:1。
在本发明的一些实施方式中，在将式1化合物活化并连接到透明质酸-胱胺聚合物的方法中，所述纯化包括将反应液先后依次于N,N-二甲基甲酰胺与水的溶剂体系(比如在本发明一些较为优选的实施方式中DMF/H2O＝4：1，v/v)、以及水中透析，冷冻干燥得紫杉醇-透明质酸聚合物。
在本发明的实施方式中，将式2化合物活化并连接到透明质酸-胱胺聚合物的方法包括：将式2化合物溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌10-40min得式2化合物溶液；紫杉醇-透明质酸聚合物溶解于甲酰胺后，将式2化合物溶液逐滴加入，避光反应24-48h，反应结束后式2化合物连接到紫杉醇-透明质酸聚合物的胱胺上、纯化干燥得到聚合物简称为紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物。
所述二氢卟吩e6(Chlorin e6)即上述的式2化合物，其CAS号为19660-77-6，分子式为C34H36N4O6，其在本发明中也被表示为Ce6。
在本发明的一些实施方式中，在将式2化合物活化并连接到透明质酸-胱胺聚合物的方法中，紫杉醇-透明质酸聚合物与式2化合物的投料质量比为10：1-5，优选为10：2-5，更优选为1:0.24。
在本发明的一些实施方式中，在将式2化合物活化并连接到透明质酸-胱胺聚合物的方法中，式2化合物与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的投料质量比为1：0.3-1.9：0.18-2.54，优选为1：1-1.5：1.2-2。
在本发明的一些实施方式中，在将式2化合物活化并连接到透明质酸-胱胺聚合物的方法中，式2化合物的N,N-二甲基甲酰胺溶液的浓度为2～4mg/mL。
在本发明的一些实施方式中，在将式2化合物活化并连接到透明质酸-胱胺聚合物的方法中，反应体系N,N-二甲基甲酰胺与甲酰胺的体积比为1-2：1-2，优选为1:1。
在本发明的一些实施方式中，在将式2化合物活化并连接到透明质酸-胱胺聚合物的方法中，所述纯化包括将反应液先后依次于N,N-二甲基甲酰胺与水的溶剂体系(比如在本发明一些较为优选的实施方式中DMF/H2O＝4：1，v/v)、以及水中透析，冷冻干燥得紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物，该聚合物为绿色。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种组合物或药物制剂或载药系统，其含有上述第一方面中所述的前药聚合物，或在此基础上可含有至少一种药学上可接受的载体或辅料。
在一个较为优选的实施方式中，所述药物制剂为纳米粒制剂，更优选为自组装纳米粒制剂，其粒径可以为20nm-500nm，紫杉醇的药物含量为3-30wt％，对式2化合物的药物含量为2-20wt％。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种纳米粒制剂的制备方法，其由上述第一方面中所述的前药聚合物自组装制备得到，其制备方法包括：将前药聚合物的冻干粉末加入水或PBS溶液溶解，搅拌使其分散均匀，超声后将得到的胶体溶液过滤即得到前药聚合物的自组装纳米粒制剂。
在本发明的一些实施方式中，所述PBS溶液的pH为6.8-7.5，优选为7。
在本发明的一些实施方式中，所述超声的方法为：探头超声2-5min，超声脉冲2s开，4s关(超声脉冲每开2s后关闭，间隔4s后再打开2s，打开与间隔的总时长是2-5min)。
本发明所述的自组装纳米粒的粒径为20nm-500nm，优选为100-200nm，在水中的平均粒径为130.5nm。
本发明所述的纳米粒制剂中，紫杉醇的载药量为3-30wt％，式2化合物的载药量为2-20wt％。
在本发明的第五方面，本发明还提供了上述第一方面中所述的前药或上述第三方面中所述的组合物或药物制剂在制备用于治疗抗肿瘤的药物中的应用。
如上所述的，本发明的琥珀酸酐经吡啶催化开环，与紫杉醇的羟基连接合成琥珀酰紫杉醇；透明质酸羧基经活化后，与含有二硫键的胱胺发生酰胺化反应，合成透明质酸-胱胺聚合物；后依次将琥珀酰紫杉醇、二氢卟吩e6的羧基活化，接枝到与透明质酸连接的胱胺上，合成紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6前药聚合物。该前药聚合物为两亲性聚合物，可在水中自组装形成纳米粒。本发明依据透明质酸的CD44受体靶向的作用，静脉注射给药后，纳米粒主动靶向递送到肿瘤部位，在肿瘤部位高还原电势的环境中，二硫键断开，释放出抗癌药物紫杉醇和Ce6。在肿瘤部位进行激光照射，二氢卟吩e6将氧分子转化为活性氧，对周围肿瘤细胞进行杀伤，实现化疗和光动力治疗相结合，增强肿瘤杀伤能力。
本发明通过在亲水性透明质酸上先后接枝紫杉醇和二氢卟吩e6，进行功能性疏水性改造，以还原敏感性的二硫键为连接臂，制备形成有靶向作用的紫杉醇前药，并发挥二氢卟吩e6的光动力治疗作用，能够极大地提高肿瘤治疗的有效性和安全性。
本发明的优点在于，制备条件温和，制备工艺简单；本发明所制备的紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物前药，增大了药物的溶解性，改善其体内分布，并将化疗与光动力治疗联合，实现更高的抗肿瘤效果。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为实施例1的相关核磁谱图，A为透明质酸(上)、透明质酸-胱胺(下)核磁图、B为Ce6的核磁图、C为PTX的核磁图。
图2为实施例2中紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物自组装纳米粒电镜照片。
图3为实施例2中紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物自组装纳米粒粒径与粒度分布。
图4为实施例2中紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物自组装纳米粒在还原环境下粒径与粒度分布。
图5为实施例3中紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物自组装纳米粒药物释放曲线。
图6为实施例3中紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物与游离二氢卟吩e6的活性氧产生能力对比图。
图7为实施例4的相关核磁谱图；A为透明质酸(上)、透明质酸-胱胺(下)核磁图、B为Ce6的核磁图、C为PTX的核磁图、D为透明质酸-胱胺-Ce6的核磁图。
图8为实施例5中PCH和CPH的CMC图。
图9为实施例5中PCH纳米粒的粒径与粒度分布。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明的紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩聚合物前药按照如下述所述的制备方法制备：
(1)琥珀酰紫杉醇的制备：琥珀酸酐混悬于二氯甲烷，加入紫杉醇，搅拌，加入无水吡啶，搅拌反应24～48h；反应后减压蒸馏，加水洗涤，离心收集沉淀，真空干燥，得到琥珀酰紫杉醇；
其中，琥珀酰与紫杉醇的质量比为1:1～1:10，进一步为1:3-1:5，吡啶用量为反应体系的0.1～0.3％(v/v)。
(2)透明质酸-胱胺的制备：将透明质酸溶解于pH7.4的PBS溶液中，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌活化HA的羧基一段时间后，加入胱胺，继续搅拌，得到粗产物，经透析纯化、冷冻干燥得HA-cys聚合物；
其中，所述透明质酸、胱胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的投料质量比为1：3-20：0.15-2.05：0.1-3.05；在较为优选的实施方式中，该投量比为1：5-10：0.2-1.5：1-2.5。透明质酸与PBS的用量比为0.1～1g溶于50mlPBS中。
透明质酸相对分子量为9000～50000Da，透析袋截留为3500Da。
(3)紫杉醇-透明质酸的制备：将琥珀酰紫杉醇溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，依次加入EDC、NHS活化；透明质酸-胱胺溶解于甲酰胺后，将活化后的琥珀酰紫杉醇活性酯溶液逐滴加入，反应24～48h，反应液经在DMF/H2O(4:1，v/v)混合溶剂中透析，后在水中透析纯化，冷冻干燥得紫杉醇-透明质酸PTX-HA；
其中，透明质酸-胱胺与琥珀酰紫杉醇的投料质量比为10：1-5，优选为5：1-2；
琥珀酰紫杉醇与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的投料质量比为1：0.21-0.63：0.12-0.36，优选为1：0.3-0.5：0.2-0.3；
琥珀酰紫杉醇的N,N-二甲基甲酰胺溶液浓度为2～4mg/mL；反应体系N,N-二甲基甲酰胺与甲酰胺的体积比为1-2：1-2，优选为1:1。
(4)紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6(PTX-HA-Ce6)的制备：将二氢卟吩e6溶于DMF，依次加入EDC、NHS活化；紫杉醇-透明质酸溶解于甲酰胺后，将活化后的二氢卟吩e6活性酯溶液逐滴加入，避光反应24～48h，反应液经在DMF/H2O混合溶剂中透析，后在水中透析纯化，冷冻干燥得紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物；
其中，紫杉醇-透明质酸与二氢卟吩e6的投料质量比为10:1～5，优选为10：2-5，更优选为1:0.24；
二氢卟吩e6与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的投料质量比为1：0.3-1.9：0.18-2.54，优选为1：1-1.5：1.2-2。
琥珀酰紫杉醇的N,N-二甲基甲酰胺溶液浓度为2～4mg/mL；反应体系N,N-二甲基甲酰胺与甲酰胺的体积比为1-2：1-2，优选为1:1。
经测量，本发明制备得到的前药聚合物中，紫杉醇的药物含量为3-30wt％，Ce6的药物含量为2-20wt％。
实施例1紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物的合成
(1)称取20mg琥珀酰酐，加8mL二氯甲烷，磁力搅拌溶解后，加入60mg PTX，磁力搅拌溶解后，加入60μL无水吡啶，反应体系澄清后搅拌反应24h，反应完成后，50℃减压蒸馏，加10mL水，搅拌15min，离心后收集沉淀，再次用30mL水洗涤沉淀，真空干燥得琥珀酰紫杉醇(式1化合物)。
(2)称取0.2g透明质酸，溶于50mL PBS(pH＝7.4)中，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)78.2mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)47.0mg，室温搅拌活化HA的羧基30min，加入胱胺1.12g，继续搅拌24h，得到粗产物，经水透析纯化、冷冻干燥得透明质酸-胱胺聚合物；
(3)称取(1)中冻干产物琥珀酰紫杉醇40mg溶于6mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)17.9mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)10.4mg，室温搅拌活化羧基30min；称取(2)中冻干产物透明质酸-胱胺100mg溶解于6mL甲酰胺后，将活化后的琥珀酰紫杉醇活性酯溶液逐滴加入，反应48h，反应液经在DMF/H2O(4:1，v/v)混合溶剂中透析2天，后在水中透析2天纯化，冷冻干燥得紫杉醇-透明质酸聚合物。
(4)称取二氢卟吩e6 12mg溶于6mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)15.5mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)21.5mg，室温搅拌活化羧基30min；称取(3)中冷冻干燥产物紫杉醇-透明质酸50mg溶解于6mL甲酰胺后，将活化后的二氢卟吩e6活性酯溶液逐滴加入，避光反应48h，反应液经在DMF/H2O混合溶剂中透析2天，后在水中透析2天纯化，冷冻干燥得紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物。
通过核磁图谱证明紫杉醇与二氢卟吩e6接枝成功，其中，相较于透明质酸，透明质酸-胱胺聚合物的核磁图谱中在δ2.3-3.5之间出现了胱胺的两个亚甲基峰，表示胱胺在透明质酸上连接成功，以及在紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物中，δ3-4处出现透明质酸的糖环峰、δ7-8出现紫杉醇的苯环峰，以及δ6-10出现Ce6的特征峰，表明紫杉醇、Ce6与透明质酸的成功接枝，具体谱图如图1所示。精密配制1mg/mL紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物，稀释到适当倍数，用紫外分光光度计在227nm和662nm处测定吸光度，分别用以紫杉醇和二氢卟吩e6载药量的测定，结果表明紫杉醇和二氢卟吩e6的接枝率分别为15.2％和11.4％。
实施例2
称取实施例1中所得紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物5mg，溶于3mL水中，探头超声4min，功率为40w，超声脉冲2s开，4s关，将所得胶体溶液过0.45μm微孔滤膜，得到绿色的紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物自组装纳米粒溶液，透射电镜考察纳米粒形态，见图2。
对自组装纳米粒进行还原敏感性考察，用高浓度(20mM)二硫苏糖醇(DTT)孵育纳米粒4h，对比在DTT环境中与水中的粒径与粒径分布，见图3-4，结果如下：
Figure BDA0002156042560000131
实施例3紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物纳米粒的体外释放
称取适量实施例1制备的紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物，分散在PBS(pH＝7.4)中，量取4mL，置3500Da透析袋中，透析袋置于100mL含0.1％吐温80的Ph7.4PBS溶液，37℃、100rpm振荡温育；分别于1、2、3、4、6、8、12、24、48、72、96h取样0.5mL，补加0.5mL释放,样品12000rpm离心10min，上清液过0.22μm滤膜，HPLC分别测定紫杉醇和二氢卟吩e6的浓度；同时模拟还原环境，在释放介质中加入二硫苏糖醇(DTT)，使其浓度为20μM，以模拟肿瘤还原环境，取样点与非还原环境相同，绘；制药物释放曲线，结果见图5。
为了验证PCH聚合物是否具有还原响应型的释药行为，实施例3比较了PCH聚合物在有无二硫苏糖醇(DTT)条件下的释药行为。为了模拟肿瘤还原环境，在释放介质中加入20μM DTT，并将其与PCH聚合物(即紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物)在不含DTT的释放介质中的释放行为进行比较。如图5所示，相比于PCH聚合物在不含DTT的释放介质中释放行为，PCH聚合物在含有20μM DTT的释放介质中，几乎所有PTX、Ce6从聚合物中释放出来，累计释放量高达90％以上。该现象产生的原因可能是，较高浓度的DTT切断了HA和PTX、Ce6之间的连接臂，导致聚合物解体，进而促进PTX、Ce6的释放。
如图5所示，在不含DTT的释放介质中，PTX、Ce6从聚合物中释放出来的释放行为可以分为两相：在前14小时，PTX、Ce6可以较快的从聚合物中释放出来(约20％PTX、Ce6在前14小时被释放出来)；然而在14-100小时，PTX、Ce6则释放的十分缓慢(100小时时，有大约30％的PTX、Ce6被释放出来)。该现象产生的原因可能与聚合物纳米粒的释药机理有关系：在药物释放过程中，释放介质会从聚合物纳米粒的间隙中进入纳米粒的内核并将内核中的药物溶解后扩散带出；同时，随着聚合物载体的溶蚀和降解，被包载的药物也会随之释放出来。在实施例3中，PCH聚合物在前14小时可以较快的释放出来，其原因可能是纳米粒内核存在较高的PTX、Ce6浓度梯度；此外，也有可能是因为一部分PTX、Ce6分布在纳米粒的表面，在释放前期就被释放出来。在14-100小时，PTX、Ce6的释放可能主要通过聚合物载体的溶蚀和降解实现，但由于该过程比较缓慢，有少数PTX、Ce6在该阶段被释放。
借助单线态氧探针SOSG用于检测产生的单线态氧。将6μL的SOSG(50μm)与50μL的紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物溶液(二氢卟吩e6的浓度为5μg/mL)，以5μg/mL二氢卟吩e6溶液作为对照，将样品在660nm后照射特定的时间段(1W/cm2)。通过多功能酶标仪测量回收的SOSG荧光，结果见图6。
单态氧测定结果如图6所示，Ce6溶液组的SOSG荧光强度高于聚合物-DTT组，说明Ce6溶液组单态氧的产量大于聚合物-DTT组；但两者荧光强度差别较小，说明聚合物-DTT组单态氧的产量仅略小于Ce6溶液组，二者相差较小。
经DTT处理后，聚合物显示出较强的荧光强度，这是因为Ce6分子间的FRET(荧光共振能量转移，fluorescence resonance energy transfer)效应引起的，在聚合物中Ce6分子聚集在其内部，产生FRET效应，抑制1O2的产生。而加入DTT后，在其作用下，聚合物遭到破坏，Ce6分子间可能由于分子距离的改变FRET效应消失，从而聚合物单态氧的产生得以恢复。
SOSG是一种水溶性单态氧(1O2)荧光探针，SOSG与1O2发生化学反应后，生成一种具有显著荧光特征的内氧化产物，即SOSG endoperoxides(SOSG-EP)。SOSG-EP在504nm波长激发下，会在525nm产生显著绿色荧光，通过检测SOSG-EP在525nm的荧光强度就可以实现对1O2的间接检测。
实施例4
按照实施例1的方法制备紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物，其区别在于，本实施例中先接枝Ce6，再接枝PTX。
通过核磁图谱证明二氢卟吩e6与紫杉醇接枝成功，相较于透明质酸，透明质酸-胱胺聚合物的核磁图谱中在δ2.3-3.5之间出现了胱胺的两个亚甲基峰，表示胱胺在透明质酸上连接成功，以及在紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物中，δ3-4处出现透明质酸的糖环峰、δ6-10出现Ce6的特征峰、δ7-8出现紫杉醇的苯环峰，表明紫杉醇、Ce6与透明质酸的成功接枝，具体谱图如图7所示。
取实施例1和实施例4制备得到的紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物，两种聚合物分别称为PCH(实施例1)和CPH(实施例4)，分别测定聚合物中Ce6和PTX的含量，具体方法如下所示。
一、聚合物中Ce6含量的测定
1.Ce6含量测定方法学的建立
1.1Ce6储备液的配制
精密称取Ce6 10.0mg于10ml容量瓶中，加DMSO定容，充分溶解后得到1mg/ml的Ce6储备液，置于4℃冰箱备用。
1.2检测波长的确定
取Ce6储备液100μL于10ml容量瓶中，用DMSO/H2O(6:1,V:V)定容，得到Ce6样品溶液。以DMSO/H2O(6:1,V:V)为空白对照；用紫外分光光度计在200-800nm波长范围内对Ce6样品溶液进行扫描，记录其紫外吸收图谱。
1.3专属性考察
称取适量的PCH聚合物，加入DMSO/H2O(6:1,V:V)混合溶液溶解聚合物。用紫外分光光度计在200-800nm波长范围内对以上样品进行扫描，记录紫外吸收图谱
1.4Ce6标准曲线的建立
利用1.1项下制得的Ce6储备液，用DMSO/H2O(6:1,V:V)定容至刻度，得到以下浓度的Ce6样品溶液：1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,9.0μg/ml。以DMSO/H2O(6:1,V:V)为空白对照，在检测波长处测定各样品的吸光光度值。以Ce6标准溶液浓度(c)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制Ce6测定的标准曲线，用最小二乘法求回归方程。
1.5精密度实验
分别量取1.1项下制得的Ce6储备液，用DMSO/H2O(6:1,V:V)定容至刻度，得到以下浓度的Ce6样品溶液：2.0,4.0,6.0μg/ml。于一日内间隔相同时间，分5次测定各供试品吸光度；于5日内，在每天固定时间测定各供试品吸光度，测定RSD。
1.6PCH聚合物中Ce6的含量测定
精密称取聚合物材料，加入一定体积的DMSO/H2O(6:1,V:V)，水浴超声使聚合物充分溶解后，用DMSO/H2O(6:1,V:V)将其稀释适当的倍数。用紫外分光光度计测定样品中Ce6的吸光度，根据1.4项下建立的标准曲线方程计算Ce6，从而计算其在聚合物中的含量。
二、聚合物中PTX含量的测定
2.PTX含量测定方法学的建立
2.1PTX储备液的配制
精密称取PTX 10.0mg于10ml容量瓶中，加DMSO定容，充分溶解后得到1mg/ml的PTX储备液，置于4℃冰箱备用。
2.2检测波长的确定
取PTX储备液100μL于10ml容量瓶中，用DMSO/H2O(6:1,V:V)定容，得到PTX样品溶液。以DMSO/H2O(6:1,V:V)为空白对照；用紫外分光光度计在200-800nm波长范围内对PTX样品溶液进行扫描，记录其紫外吸收图谱。
2.3专属性考察
分别称取适量的CPH聚合物，加入DMSO/H2O(6:1,V:V)混合溶液溶解聚合物。用紫外分光光度计在200-800nm波长范围内对以上样品进行扫描，记录紫外吸收图谱。
2.4PTX标准曲线的建立
利用1.1项下制得的PTX储备液，用DMSO/H2O(6:1,V:V)定容至刻度，得到以下浓度的PTX样品溶液：1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,9.0μg/ml。以DMSO/H2O(6:1,V:V)为空白对照，在检测波长处测定各样品的吸光光度值。以PTX标准溶液浓度(c)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制PTX测定的标准曲线，用最小二乘法求回归方程。
2.5精密度实验
分别量取1.1项下制得的PTX储备液，用DMSO/H2O(6:1,V:V)定容至刻度，得到以下浓度的PTX样品溶液：2.0,4.0,6.0μg/ml。于一日内间隔相同时间，分5次测定各供试品吸光度；于5日内，在每天固定时间测定各供试品吸光度，测定RSD。
2.6PCH聚合物中PTX的含量测定
精密称取聚合物材料，加入一定体积的DMSO/H2O(6:1,V:V)，水浴超声使聚合物充分溶解后，用DMSO/H2O(6:1,V:V)将其稀释适当的倍数。用紫外分光光度计测定各样品中PTX的吸光度，根据1.4项下建立的标准曲线方程计算PTX，从而计算其在聚合物中的含量。
其中，接枝率计算公式如下所示：
Ce6接枝率＝(C测定Ce6/C定量Ce6)*100％
PTX接枝率＝(C测定PTX/C定量PTX)*100％
公式中C表示浓度，单位为mg/ml。
经计算，结果如表2所示。
表2
Ce6接枝率 TPX接枝率
实施例1聚合物PCH 11.4％ 15.2％
实施例4聚合物CPH 9.7％ 10.1％
实施例5
临界胶束浓度CMC的测量：小的CMC预示着前药聚合物在体液中有着较好的抗稀释能力，可以在体液中保持着完整的胶束结构，避免提前释药引起的不良反应。
采用尼罗红荧光探针法测量实施例1中制备得到的PCH前药聚合物和实施例4中制备得到的CPH前药聚合物的CMC，PCH聚合物的CMC小于CPH聚合物的CMC，结果如图8所示，其中，PCH的CMC为0.3mg/ml，CPH的CMC为0.39mg/ml。
此外，本实施例根据实施例2的方法，将实施例4制备得到的CPH前药聚合物制备成自组装纳米粒溶液。
在相同条件下同时测量由PCH(实施例1的前药聚合物)以及CPH(实施例4的前药聚合物)制备得到的纳米粒的粒径。
粒径在一定程度上可以反映接枝情况，接枝率提高，疏水性基团的数量增加越多，使得聚合物分子间/内疏水性提高，导致粒径变小。
经测量PCH制备得到的纳米粒(即实施例2的纳米粒)在水中的粒径分布如图3所示，其平均粒径为130.5nm；CPH制备得到的纳米粒在水中的粒径分布如图9所示，其平均粒径为188.5nm。由此辅助推断PCH的接枝率高于CPH。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (28)

1.一种前药，其特征在于，由式1、2所示的化合物与式3所示的聚合物单体结构组成，
前药结构为：
Figure FDA0002737582730000011
R1、R2各自独立地选自以下结构：
Figure FDA0002737582730000012
其中，式1化合物、式2化合物分别与式3单体结构的胱胺相连：
式1
Figure FDA0002737582730000021
式2
Figure FDA0002737582730000022
式3
Figure FDA0002737582730000023
所述式1化合物为琥珀酸酐修饰后的紫杉醇，透明质酸的相对分子量为9000～50000Da。
2.根据权利要求1所述的前药，其特征在于，式1化合物通过如下方法制备：
将溶解于二氯甲烷的琥珀酸酐中加入紫杉醇，于无水吡啶中反应24-48h，经分离干燥得到式1化合物。
3.根据权利要求2所述的前药，其特征在于，所述吡啶用量为反应体系的0.1-0.3％，体积百分比。
4.根据权利要求1所述的前药，其特征在于，透明质酸-胱胺聚合物通过如下方法制备：
将透明质酸溶解于PBS溶液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺，加入胱胺搅拌反应后得到粗产物，纯化干燥得到透明质酸-胱胺聚合物；
透明质酸、胱胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的投料质量比为1：3-20：0.15-2.05：0.1-3.05；
所述PBS溶液的pH为7-8。
5.根据权利要求4所述的前药，其特征在于，透明质酸与PBS的用量比为0.1-1g透明质酸溶于50mlPBS溶液中。
6.根据权利要求4所述的前药，其特征在于，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺按顺序依次加入。
7.根据权利要求4所述的前药，其特征在于，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺后于室温下搅拌10-40min。
8.根据权利要求4所述的前药，其特征在于，反应时间为5-48h。
9.根据权利要求4所述的前药，其特征在于，纯化方式为透析，透析袋截留分子量为3000-5000Da。
10.根据权利要求9所述的前药，其特征在于，透析袋截留分子量为3500Da。
11.权利要求1至10中任一项所述前药的制备方法，其特征在于，包括制备得到透明质酸-胱胺聚合物，然后依次将式1和式2化合物连接到透明质酸-胱胺聚合物上，形成前药聚合物。
12.根据权利要求11所述前药的制备方法，其特征在于，所述方法包括：琥珀酸酐经吡啶催化开环，与紫杉醇的羟基连接合成琥珀酰紫杉醇即式1化合物；透明质酸羧基经活化后，与胱胺发生酰胺化反应，合成以式3化合物为单体结构的透明质酸-胱胺聚合物；然后分别将式1化合物和式2化合物的羧基活化后，依次接枝到透明质酸-胱胺聚合物的胱胺上，制备得到前药聚合物。
13.根据权利要求12所述前药的制备方法，其特征在于，将式1化合物的羧基活化并连接到透明质酸-胱胺聚合物的方法包括：将式1化合物溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌10-40min得到式1化合物溶液；将式1化合物的溶液滴入溶解于甲酰胺的透明质酸-胱胺聚合物中反应12-48h，反应结束后式1化合物连接到透明质酸-胱胺聚合物的胱胺上、纯化干燥得到聚合物简称为紫杉醇-透明质酸聚合物；
透明质酸-胱胺聚合物与式1化合物的投料质量比为10:1-5；
式1化合物与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的投料质量比为1：0.21-0.0.63：0.12-0.36。
14.根据权利要求13所述前药的制备方法，其特征在于，式1化合物的N,N-二甲基甲酰胺溶液浓度为2-4mg/mL；
反应体系中N,N-二甲基甲酰胺与甲酰胺的体积比为1-2：1-2。
15.根据权利要求13所述前药的制备方法，其特征在于，所述纯化包括将反应液先后依次于N,N-二甲基甲酰胺与水的溶剂体系、以及水中透析，冷冻干燥得紫杉醇-透明质酸聚合物。
16.根据权利要求12所述前药的制备方法，其特征在于，将式2化合物的羧基活化并连接到透明质酸-胱胺聚合物的方法包括：将式2化合物溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌10-40min得式2化合物溶液；紫杉醇-透明质酸聚合物溶解于甲酰胺后，将式2化合物溶液逐滴加入，避光反应24-48h，反应结束后式2化合物连接到紫杉醇-透明质酸聚合物的胱胺上、纯化干燥得到聚合物简称为紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物，紫杉醇-透明质酸聚合物与式2化合物的投料质量比为10:1～5；
式2化合物与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的投料质量比为1:0.3～0.9:0.18～0.54。
17.根据权利要求16所述前药的制备方法，其特征在于，式2化合物的N,N-二甲基甲酰胺溶液的浓度为2～4mg/mL。
18.根据权利要求16所述前药的制备方法，其特征在于，反应体系N,N-二甲基甲酰胺与甲酰胺的体积比为1-2：1-2。
19.根据权利要求16所述前药的制备方法，其特征在于，所述纯化包括将反应液先后依次于N,N-二甲基甲酰胺与水的溶剂体系、以及水中透析，冷冻干燥得紫杉醇-透明质酸-二氢卟吩e6聚合物。
20.一种组合物，其含有权利要求1至10中任一项所述的前药，或在此基础上含有至少一种药学上可接受的载体。
21.根据权利要求20所述组合物，其特征在于，所述药物制剂为纳米粒制剂。
22.根据权利要求21所述组合物，其特征在于，所述纳米粒制剂的粒径为20nm-500nm。
23.一种纳米粒制剂的制备方法，其由权利要求1至10中任一项所述的前药自组装制备得到，其制备方法包括：将前药聚合物的冻干粉末加入水或PBS溶液溶解，搅拌使其分散均匀，超声后将得到的胶体溶液过滤即得到前药的自组装纳米粒制剂。
24.根据权利要求23所述纳米粒制剂的制备方法，其特征在于，所述PBS溶液的pH为6.8-7.5。
25.根据权利要求23所述纳米粒制剂的制备方法，其特征在于，所述超声的方法为：超声2-5min，超声脉冲2s开，4s关。
26.根据权利要求23所述纳米粒制剂的制备方法，其特征在于，所述自组装纳米粒制剂中纳米粒的粒径为20nm-500nm。
27.根据权利要求23所述纳米粒制剂的制备方法，其特征在于，所述自组装纳米粒制剂中，紫杉醇的含药量为3-30wt％，式2化合物的含药量为2-20wt％。
28.权利要求1至10中任一项所述的前药或权利要求20至22中任一项所述的组合物在制备用于治疗抗肿瘤的药物中的应用。
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