CN115845059A - 一种基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒及其制备方法与应用 - Google Patents

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CN115845059A CN202211414068.5A CN202211414068A CN115845059A CN 115845059 A CN115845059 A CN 115845059A CN 202211414068 A CN202211414068 A CN 202211414068A CN 115845059 A CN115845059 A CN 115845059A
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赵小飞
张月悦
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Abstract

本发明公开了一种基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒，由聚乙二醇‑b‑聚（4‑硼‑L‑苯丙氨酸‑co‑L‑酪氨酸）共聚物装载小分子抑制剂得到。具体的，将聚乙二醇‑b‑聚（4‑硼‑L‑苯丙氨酸‑co‑L‑酪氨酸）共聚物溶液与药物溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析得到基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒，具有较好的药物共包封能力以及稳定性，在酸性/过氧化氢/酶的环境中能快速释放药物，实现对白血病细胞协同杀伤，显著抑制了白血病细胞在骨髓、脾、肝等器官中的浸润。本发明设计的纳米药物具有载药效率高、稳定性好、触发响应的特点，除此之外，该智能纳米药物也具有结构简单、药物组合可调、安全性高、协同疗效强等特点，可以很容易地推广到癌症的治疗中。

Description

一种基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于聚合物递药技术，具体涉及一种基于聚氨基酸的苯硼酸功能化聚合物及小分子抑制剂纳米粒，及其制备方法应用。
背景技术
与化疗药物相比，小分子抑制剂具有高特异性、低脱靶毒性和显著抗癌效果等优点。但是单药抑制剂普遍治疗效果欠佳，因而有必要将其与其它制剂联用来提高疗效。然而，抑制剂组合因其本身生物利用度差以及易被代谢，通常需要连续和重复给药治疗。聚多肽具有生物相容性好等特性在药物递送等领域得到广泛应用。基于聚多肽的纳米药物虽然在一定程度上可改善药物溶解度和药代动力学，但依然存在稳定性差和药物释放不可控（即循环期间药物过早释放和肿瘤部位药物释放缓慢）等局限性。此外，基于聚多肽的纳米载体对于两种或两种以上药物的共包载存在药物比例不可控以及载药效率低等特点。因此，构建出具有稳定性好、响应性释放（pH响应性、ROS响应性或酶响应性等）药物、载药比例可控以及载药效率高的聚多肽纳米药物成为研究的热点。
发明内容
本发明基于聚氨基酸的纳米粒实现有效共载和响应性释放多种小分子抑制剂，构建了苯硼酸功能化共载小分子抑制剂纳米药物用于肿瘤的协同治疗。结果表明，本发明基于聚氨基酸的纳米粒实现对小分子抑制剂等药物的高效装载与递送，尤其是，提高了纳米药物对肿瘤的协同治疗效果。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒，由聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）共聚物装载小分子抑制剂得到。具体的，包括如下步骤：将聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）共聚物溶液与药物溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析得到基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒。优选的，药物溶液含有一种或者一种以上药物。优选的，药物为小分子抑制剂，抑制剂包括BCL2抑制剂、MCL1抑制剂、PLK1抑制剂中的一种或几种。
本发明中，聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）共聚物具有式I结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式I
其中，n为70～210，m为17～55，x为11～42；优选的，n为90～150，m为24～40，x为16～27。
本发明公开了上述基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒在制备抗肿瘤纳米药物中的应用或者在制备具有协同作用的纳米药物中的应用。
由于上述技术方案的应用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明设计制备的聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）共聚物具有良好的生物相容性和酶降解性，且制备简单、重复可控；设计构建的聚多肽纳米粒子具有粒径可控（79～148 nm）、粒径分布较窄、稳定性好以及可以响应性释放（酸性/活性氧/酶）药物的特性；实现对白血病细胞协同杀伤，显著抑制了白血病细胞在骨髓、脾、肝等器官中的浸润。本发明设计的纳米药物具有载药效率高、稳定性好、触发响应的特点，除此之外，该智能纳米药物也具有结构简单、药物组合可调、安全性高、协同疗效强等特点，可以很容易地推广到癌症的治疗中，为提高药物疗效提供了一种简便的策略，可用于对不同癌症进行有效和安全的联合协同治疗。
附图说明
图1是实施例一中聚合物PEG-b-P(BPA-co-Tyr)的表征（表1，序号1）。（A）1H NMR（400 MHz，DMSO-d 6/CD3OD-d 4，5/1，v/v）表征；（B）MALDI-TOF表征；
图2是实施例一中聚合物以及实施例二中胶束的理化表征。（A）粒径分布和NPAT的TEM图像；（B）NPAT（1.0 mg/mL）在长期保存下的粒径和PDI变化。（C）NPAT（1.0 mg/mL）在10%FBS和稀释100倍条件下的粒径和PDI变化；（D）在pH 5.5、100 μM H2O2以及蛋白酶K（PK，12U/mL）作用下NPAT粒径的变化；NPAT在（E）酸性（pH 5.5），（F）H2O2（100 μM），（G）PK（12 U/mL）作用下的体外药物释放行为；（H）在蛋白酶K（PK，12 U/mL）作用下NPAV粒径随时间的变化；（I）NPAV在PK（12 U/mL）作用下的体外药物释放行为；
图3是空纳米粒与（A）L929、（B）MOLM-13-Luc以及（C）MV-411细胞共孵育48 h的细胞毒性；
图4是实例三中NPAT的血液相容性和细胞毒性：（A）红细胞与游离ABT199、TW37、ABT199/TW37、NPA、NPT以及NPAT（低浓度：100 μg/mL，高浓度：200 μg/mL）共处理后的代表性图，1% Triton X-100和0.9% NaCl分别作为阳性对照和阴性对照组；（B）不同样品处理后红细胞的溶血率；不同样品与（C-E）MOLM-13-Luc和（F-H）MV-411细胞共孵育48 h的细胞毒性；
图5是实施例四中游离ABT199、TW37、ABT199/TW37（A:T = 1:1）、NPA、NPT以及NPAT（A:T = 1:1）诱导MOLM-13-Luc（ABT199：10 ng/mL，TW37：10 ng/mL）和MV-411（ABT199：60ng/mL，TW37：60 ng/mL）细胞的蛋白表达以及细胞凋亡。（A）由蛋白质印迹分析实验测试纳米药物诱导细胞的蛋白表达；通过annexin V-APC/7-AAD双染技术测得（B）游离药物和（C）纳米药物诱导细胞凋亡的能力；
图6是实施例五中NPAT的体内抗肿瘤实验。NPAT对荷原位MOLM-13-Luc AML小鼠的体内治疗（n = 4）：在第0、3、6、9 d给小鼠静脉注射PBS、NPT、NPA或NPAT，第5、8、11、14 d用生物发光成像检测白血病细胞的浸润。（A）实验设计；（B）生物荧光成像；（C）生物发光随时间变化的定量分析；（D）在第14 d小鼠脾的重量；（E）体重变化；
图7是实施例五中NPAT的体内抗肿瘤实验。（A）MOLM-13-Luc白血病细胞在骨髓（BM），肺（Lu），肝（Li），脾（Sp）和外周血（PB）中的浸润分析；（B）白血病细胞浸润定量分析（n= 3）；
图8是实施例五中NPAT的体内抗肿瘤实验。不同治疗组小鼠股骨和胫骨Micro-CT分析。（A）Micro-CT图；（B）各项指标的定量分析：骨矿物密度（BMD）、骨体积/组织体积（BV/TV）、骨小梁分离/间距（Tb.Sp）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数目（Tb.N）和骨表面积/组织体积（BS/TV）（n = 3）；
图9是实施例五中NPAT的体内抗肿瘤实验。不同治疗组小鼠股骨和胫骨的分析。（A）H&E染色；（B）通过TRAP染色分析破骨细胞。比例尺：100 μm；
图10是实施例五中NPAT的体内抗肿瘤实验。血常规和血生化测试（n = 3）。血是在第14 d从腹腔动脉采取，主要分析白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血小板（PLT）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和尿素；
图11是实施例五中NPAT的体内抗肿瘤实验。给药14 d后对原位荷MOLM-13-LucAML小鼠的脾（Sp）、肾（Ki）、肝（Li）、心（He）和肺（Lu）等脏器的H&E染色分析，比例尺：100 μm；
图12是实施例五中NPAT的体内抗肿瘤实验。NPAT对原位荷MV-411 AML小鼠的体内治疗效果（n = 4）。在第0、3、6、9 d经静脉注射PBS、NPT、NPA或NPAT，第5、8、11、14 d通过生物发光成像检测白血病细胞的浸润。（A）实验设计；（B）MV-411细胞在BM，Lu，Li，Sp和PB中的浸润；（C）细胞浸润定量分析；；（D）PBS组小鼠外周血中MV-411细胞随时间的变化；（E）体重变化；（F）小鼠接受不同药物治疗后第17 d脾的重量。
具体实施方式
本发明构建了聚氨基酸小分子抑制剂纳米药物，具体涉及由聚乙二醇和基于4-硼-L-苯丙氨酸及L-酪氨酸的聚氨基酸材料制备的纳米粒包载小分子抑制剂药物及在肿瘤治疗中的应用。
本发明公开的基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒的制备方法为如下步骤：
（1）在氮气条件下，以单端为氨基的聚乙二醇为引发剂，通过开环聚合4-硼-L-苯丙氨酸-N-羧基内酸酐及L-酪氨酸-N-羧基内酸酐得到聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）共聚物PEG-b-P(BPA-co-Tyr)；
（2）搅拌下，将聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）共聚物与药物的混合溶液滴加到缓冲溶液中，滴加完毕后透析得到基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒。
上述技术方案中，步骤（1）中，单端为氨基的聚乙二醇、4-硼-L-苯丙氨酸-N-羧基内酸酐、L-酪氨酸-N-羧基内酸酐的质量比为1∶0.62~1.23∶0.32~0.95，优选1∶1.23：0.32，开环聚合的温度为室温~80℃，时间为60~80小时；优选的，开环聚合在溶剂中进行，溶剂优选DMF。
上述聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）共聚物的制备方案的具体反应步骤可举例如下：
使用单端为氨基的聚乙二醇（PEG-NH2）作为大分子引发剂引发4-硼-L-苯丙氨酸-N-羧基内酸酐（BPA-NCA）和L-酪氨酸-N-羧酸酐（Tyr-NCA）开环聚合（ROP）制备聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）共聚物。在氮气环境下，将BPA-NCA、Tyr-NCA与PEG-NH2的DMF溶液混合，反应三天。在过量乙醚中沉淀后，粗产物通过重新溶解在二氯甲烷中并在乙醚中沉淀三次而进一步纯化，获得的沉淀真空干燥，得到聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）。
上述制备方案可表示如下：
Figure 386898DEST_PATH_IMAGE002
作为本发明的其中一个具体技术方案，药物为BCL2抑制剂ABT199及MCL1抑制剂TW37时，同时包载ABT199和TW37的纳米药物NPAT是用聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）和药物的混合溶液通过溶剂置换法制备得到。具体过程如下：在搅拌条件下，将计算量的ABT199溶液和TW37溶液（DMSO）与聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）的溶液（DMSO）混合后分散在HEPES缓冲液（pH 7.4）中；然后装入透析袋（MWCO = 3500Da），在HEPES缓冲液中透析4小时除去未载入的药物和有机溶剂，然后在PBS缓冲液（pH7.4）中透析2小时以置换缓冲液，每小时更换一次缓冲介质；最后得到纳米药物。
作为本发明的另一个具体技术方案，药物为BCL2抑制剂ABT199及PLK1抑制剂volasertib时，同时包载ABT199和volasertib的纳米药物NPAV是用聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）和药物的混合溶液通过溶剂置换法制备得到。具体过程如下：在搅拌条件下，将计算量的ABT199溶液和volasertib溶液（DMSO）与聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）的溶液（DMSO）混合后分散在HEPES缓冲液（pH 7.4）中；然后装入透析袋（MWCO = 3500 Da），在HEPES缓冲液中透析4小时除去未载入的药物和有机溶剂，然后在PBS缓冲液（pH 7.4）中透析2小时以置换缓冲液，每小时更换一次缓冲介质；最后得到纳米药物。
本发明进一步公开了上述基于聚氨基酸的苯硼酸功能化纳米粒在制备抗肿瘤纳米药物中的应用，优选的，所述纳米药物在协同治疗急性髓系白血病中的应用。
α-甲氧基-ω-氨基-聚乙二醇（mPEG-NH2，Mn：5.0 kg/mol，≥ 95%，厦门赛诺邦格生物科技有限公司）、L-酪氨酸（Tyr-OH，吉尔生化上海有限公司）、4-硼-L-苯丙氨酸（BPA，北京迈瑞达科技有限公司）、蛋白酶K（PK，> 40 U/mg，上海赛默飞世尔科技有限公司）、TW37（Med Chem Express）、volasertib（Med Chem Express）和ABT199（Venetoclax，Med ChemExpress）购买后直接使用。三光气（BTC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）用乙酸乙酯重结晶后再使用。四氢呋喃（THF）和石油醚（沸点为60-90 ℃）使用溶剂纯化系统（InnovativeTechnology，USA）提纯后直接使用。N, N-二甲基甲酰胺（DMF）经溶剂纯化系统提纯后再通过无水硫酸镁过夜干燥及减压蒸馏后使用。其他无特殊说明的试剂均是从国药集团化学试剂有限公司购买后直接使用。
聚合物核磁共振氢谱（1H NMR）以DMSO-d 6/CD3OD-d 4（5/ 1，v/v）作为溶剂，利用Unity Inova-400 MHz超导核磁共振波谱仪（安捷伦）进行测定，化学位移以溶剂信号为标准。聚合物分子量采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS，DaltonicsUltraflex II，Bruker）测得，所用基质为反式-2-[3-（4-叔丁基苯基）-2-甲基-2-亚丙烯基]丙二腈（DCTB）与三氟乙酸钠盐（CF3COONa+）的混合物（v/v，9/1）。聚合物的分子量分布通过Waters 1515凝胶渗透色谱仪（GPC）测得。纳米粒粒径、粒径分布使用动态光散射仪（Zetasizer Nano-ZS，Malvern Instruments，美国）测试。多功能酶标仪（Varioskan LUX，Thermo Fisher）用于细胞毒性测试。胶束的微观形貌由透射电镜（TEM，Tecnai G220，200kv，美国）表征。流式细胞仪（Becton Dickinson，FACSVerse，美国）用于研究白血病细胞在骨髓和多个器官中的浸润。蛋白印迹（WB）实验的PDVF膜经显影液孵育后用超敏化学发光成像仪（GE Amersham Imager 600）拍摄。苏木精-伊红（H&E）染色图片通过倒置荧光显微镜（Nikon Eclipse Ti）拍摄。TW37、volasertib以及ABT199的载药量和体外释放等实验中的药物浓度由ProStar LC240型高效液相色谱仪（Waters Alliance HPLC）检测，HPLC采用Sepax BR-C18反相色谱柱（规格：4.6×250（mm）；粒径：5 μm；孔径：120 Å）测试，测试条件为：流速0.8 mL/min，进样量为10 μL，紫外检测波长为300 nm，流动相为纯乙腈/二次水（含0.05%磷酸）（80/20，v/v）。
下面结合附图以及实施例对本发明作进一步描述，具体实验操作以及性能测试为常规技术：
实施例一 聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）合成
使用PEG-NH2（Mn = 5.0 kg/mol）在无水DMF中引发BPA-NCA和Tyr-NCA单体开环聚合得到PEG-b-P(BPA-co-Tyr)共聚物。以合成PEG-b-P(BPA-co-Tyr)（Mn = 5.0-4.0-1.0kg/mol）为例，在氮气环境下将PEG-NH2（350 mg，0.07 mmol）的DMF溶液加到BPA-NCA（430mg，1.83 mmol）和Tyr-NCA（111 mg，0.57 mmol）的DMF溶液中，然后在80 ℃下反应72 h，再用反应溶液体积20倍的冰乙醚沉淀、离心（4000 rpm，5 min）、收集沉淀。接着用甲醇复溶，同样的条件再进行两次沉淀、离心收集固体，放在真空干燥箱中72 h除去残余的有机溶剂，最终得到白色产物。产率：83%。1H NMR（400 MHz，DMSO-d 6/CD3OD-d 4，5:1，v/v，δ）：7.68和7.22（-C6H4B(OH)2），6.95和6.61（-C6H4OH），4.47和4.37（-COCHNH-），3.52（-OCH2CH2O-），2.82和2.63（-C6H4CH2-）。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
a由1H NMR计算；b由MALDI-TOF计算；c由GPC测得
通过改变NCA进料比调节聚合物中BPA和Tyr的组成比，结果列于表1中。图1是实施例一中聚合物PEG-b-P(BPA-co-Tyr)的表征（表1，Entry 1）。（A）1 H NMR（400 MHz，DMSO-d 6/CD3OD-d 4，5/1，v/v）表征；（B）MALDI-TOF表征。
实施例二 纳米粒的制备与表征
TW37和ABT199通过溶剂置换法装载到纳米粒子中。将PEG-b-P(BPA-co-Tyr)（20mg/mL，50 μL）、TW37（20 mg/mL，5.6 μL）和ABT199（20 mg/mL，5.6 μL）三者的DMSO溶液混合后滴加到940 μL HEPES缓冲液（pH 7.4，10 mM）中，先在HEPES缓冲液中连续透析4 h，然后在PBS（pH7.4，150 mM）再透析2 h，得到最终纳米药物NPAT。NPAV（共载ABT199和volasertib）通过类似的方法制备。如果仅采用一种药物，则分别得到NPT（载TW37）、NPA（载ABT199）以及NPV（载volasertib）。
封装的TW37、ABT199以及volasertib使用高效液相色谱（HPLC）在吸光度分别为300 nm、289 nm以及320 nm处进行定量。载药量（DLC）和载药效率（DLE）根据以下公式计算：
DLC（wt.%） = 装载药物质量/（空胶束的质量+装载药物质量）×100%
DLE（%） = 装载药物质量/投入药物总质量×100%
将纳米药物（1.0 mg/mL）放置30 d、分散在PBS溶液（含10% FBS）中或稀释100倍，利用DLS检测，观察纳米药物的粒径变化。在（i）PBS（150 mM，pH 7.4），（ii）PBS（150 mM，pH5.5），（iii）含蛋白酶K（PK，12 U/mL）的PBS（150 mM，pH 7.4），（iv）含100 μM H2O2的PBS（150mM，pH 7.4）四种条件下，通过DLS检测粒径变化来研究NPAT的响应性，并同时研究了NPAT在这四种条件下的药物释放行为，具体步骤为：将装有0.5 mL的NPAT溶液置于释放袋（MWCO：30 kDa），置于25 mL不同释放介质的溶液中，在提前设定的时间点吸取5 mL的介质并补充等体积的新鲜介质，待所有样品冻干后用0.3 mL的乙腈/二次水（5/1，v/v）复溶，通过HPLC测定释放的TW37和ABT199。每组设定3个平行组，药物的累积释放量按如下公式计算：
Figure 212028DEST_PATH_IMAGE004
其中：Er：TW37和ABT199的累计释放量（%）；Ve：释放介质的置换体积（5.0 mL）；V0：释放介质总体积（25 mL）；Ci：第i次取样时释放介质中TW37和ABT199的浓度（μg/mL）；mdrug：用于释放的NPAT中TW37和ABT199的总量（μg）；n：置换介质的次数。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
a 由HPLC测定； b 由DLS（PBS 7.4，25 °C）测定； c 在PBS溶液中通过电泳测定（PBS7.4，25 °C）。
表3 NPAV的表征
Figure 522924DEST_PATH_IMAGE006
a 由HPLC测定； b 由DLS（PBS 7.4，25 °C）测定； c 在PBS溶液中通过电泳测定（PBS7.4，25 °C）
空纳米粒子（NP）通过PEG-b-P(BPA-co-Tyr)自组装得到。选择聚合物PEG-b-P(BPA-co-Tyr)（Mn = 5.0-3.9-1.0 kg/mol）进行载药，获得更大的载药量，NPAT、NPAV纳米粒表征见表2、表3，增加ABT199的载药量能显著提高纳米药物的载药能力，在NPAT中两种药物极好的共载能力，有利于调整纳米药物之间的比例。
参见图2，NPAT的粒径分布和形貌也通过TEM进行了表征，为球状结构；相较于空NP的多分散分布，所有载药NP（NPT，NPA，NPAT）均呈现单分散分布。NPAT即使在100倍稀释、10%FBS以及放置30d的情况下，粒径大小及其分布变化很小，表明NPAT在正常生理条件下具有高稳定性的性质，这进一步证实了药物与多肽链段之间的相互作用有利于提升纳米药物的稳定性。在酸性或者H2O2的环境中纳米粒可以提供触发响应的能力。NPAT在pH 5.5或者100μM H2O2的环境中孵育6 h，纳米粒子显示出明显的溶胀和解离。此外，蛋白酶K（PK）可以降解聚多肽链段，结果显示在PK（12 U/mL）的环境下孵育6 h，NPAT同样表现出响应能力。相一致的是，在pH 5.5，H2O2（100 μM），和PK（12 U/mL）的环境中，48 h后NPAT分别释放了药物总量的66%，80%和82%，而在pH 7.4的环境中，NPAT释放药物的总量低于20%。
实施例三 NPAT的血液相容性和体外细胞毒性实验
纳米粒的细胞毒性：先将PEG-b-P(BPA-co-Tyr)形成空纳米粒（NP），然后将等体积不同浓度的NP（1 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL）与L929、MOLM-13-Luc以及MV-411细胞共孵育48 h，空白对照组是加入等体积的PBS，48 h后向每个样品孔中加入10 μL的CCK8溶液，放于37 ℃培养箱约3 h，最后使用多功能酶标仪测试在450 nm处的吸光值（OD）。细胞存活率按照如下公式计算：
细胞存活率（%） = 实验组的OD/PBS对照组的OD×100%
取健康小鼠的血液于抗凝采血管中，随后在2500 rpm，4 ℃下离心10 min除去上层血清，并加入0.9% NaCl溶液再离心，反复操作数次直到上清液为无色，配置为2%的红细胞悬液。接着分别将相同体积的0.9% NaCl、1% Triton X-100、TW37、ABT199、TW37/ABT199、NPT、NPA和NPAT溶液与等体积的红细胞悬液混合。置于37 ℃水浴中孵育20 min，离心后测试上清液在570 nm处的吸收度。0.9% NaCl溶液组作为阴性对照，1% Triton X-100组作为阳性对照。溶血率（HR）通过以下公式计算：
Figure DEST_PATH_IMAGE007
AS，ANC和APC分别表示样品、阴性对照和阳性对照在570 nm处的紫外吸收度。
药物对MOLM-13-Luc以及MV-411细胞的毒性通过CCK8方法测定。首先往96孔板加入MOLM-13-Luc或者MV-411细胞（2×104 个/孔），然后加入等体积不同浓度和药物比例的TW37、ABT199、Volasertib、TW37/ABT199、Volasertib/ABT199、NPT、NPA、NPV以及NPAT、NPAV，共孵育48 h，测试方法同上。药物协同指数（CI）按照如下方法：
Figure 324658DEST_PATH_IMAGE008
其中，S A和S T分别代表NPA（或ABT199）和NPT（或TW37、Volasertib、NPV）的IC50，C A和C T分别代表ABT199和TW37在NPAT（或TW37/ABT199）中的IC50。常规而言，0.2≤CI<0.4为强协同作用，数值高协同作用弱。
通过CCK8方法分析了空NP对癌细胞（MOLM-13-Luc、MV-411细胞）和正常细胞（L929细胞）的毒性，结果表明，即使在空NP浓度高达200 μg/mL与细胞共孵育48 h后，细胞的存活率也都能达到90%以上（图3A-C），说明聚多肽载体生物相容性好、安全性高。
血液相容性是评价聚合物纳米药物生物相容性的重要指标之一，通过溶血实验考察载药纳米胶束的溶血情况。实验结果表明，不同浓度游离ABT199的溶血率均小于5%；低浓度游离TW37（100 μg/mL）组在离心后红细胞沉降很少，溶血率为55%，并且随着TW37的浓度增大到200 μg/mL，离心后基本上无任何红细胞沉降，溶血率达到75%以上；而所有的纳米药物组均有明显的红细胞沉降，并且可以重新分散于相应介质中，没有红细胞聚集现象，溶血率均低于5%（图4A-B）。这充分说明了共载TW37和ABT199的纳米胶束具有良好的血液相容性，也为静脉给药提供了更大的可能性。
细胞毒性结果显示无论在MOLM-13-Luc还是MV-411细胞中，NPT和NPA相对于游离药物皆有更高的细胞毒性（图4C-G）。共载NPAT进一步增加了这种毒性，NPAT（ABT199/TW37，1:1，w/w）对MOLM-13-Luc细胞的IC50为1.15 ng/mL，相对于NPA和NPT分别降低了约3倍和222倍（表4）。进一步增加NPAT中TW37的量，比例达到1:2（w/w）时，虽然ABT199的IC50略有降低，但是TW37的IC50增加更多；降低NPAT中TW37的量，比例降至1:0.5（w/w）时，ABT199的IC50明显降低。虽然NPAT对MV-411细胞相较于MOLM-13-Luc细胞有更高的IC50，但是纳米药物NPAT（ABT199/TW37，1:1，w/w）对于MOLM-13-Luc和MV-411细胞具有相近的协同指数，约0.35（表4& 5），表现为强协同作用。
Figure DEST_PATH_IMAGE009
Figure 919456DEST_PATH_IMAGE010
细胞毒性实验结果显示，NPV在MOLM-13-Luc细胞中展现出一定的细胞毒性，NPAV进一步增加了这种毒性，NPAV（A:V = 1:1，w/w ）对MOLM-13-Luc细胞的IC50为1.7 ng/mL，NPA和NPV对MOLM-13-Luc细胞的IC50是NPAV的2.5～6倍（表6），CI值为0.53，表现出了中等协同作用，进一步增加NPAV中volasertib的量，协同指数增加，表示协同作用减弱。NPAV对MOLM-13-Luc细胞的协同作用以及IC50都较NPAT差。
Figure DEST_PATH_IMAGE011
实施例四 白血病细胞的蛋白表达和细胞凋亡
通过Western blot实验研究NPAT对MOLM-13-Luc、MV-411细胞中BCL2、MCL1和Bim蛋白表达的影响。首先将MOLM-13-Luc细胞（2×105个/孔）铺于12孔板中，然后分别加入200μL NPT、NPA以及NPAT（TW37：10 ng/mL，ABT199：10 ng/mL），在37 ºC下孵育48 h，然后裂解细胞提取蛋白样品，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白的浓度并将蛋白变性，变性过的蛋白加入到SDS-PAGE凝胶（10%）上跑电泳，电泳结束后转移至PVDF膜上，将PVDF膜放入封闭液中室温封闭1.5 h，将不同位置的膜分别与BCL2、MCL1、Bim和β-actin的一抗溶液中在4 ºC下孵育过夜，然后再分别和对应的二抗溶液在室温下孵育1.5 h，使用化学发光检测系统进行显影。对于MV-411细胞中蛋白表达的测定除了用更高浓度的药物（TW37：60 ng/mL，ABT199：60 ng/mL）与细胞孵育外，其余的步骤类似检测MOLM-13-Luc细胞中蛋白的表达。
采用Annexin V-allophycocyanin（APC）和7-amino-actinomycin D（7-AAD）双染技术，利用流式细胞仪进一步研究NPAT诱导MOLM-13-Luc或者MV-411细胞凋亡的能力。MOLM-13-Luc细胞（2×105个/孔）与等体积不同的药物（TW37：10 ng/mL，ABT199：10 ng/mL）于12孔板共孵育48小时后，PBS洗涤重悬后依次加入Annexin V-APC和7-AAD染液，室温下避光孵育5 min，使用流式细胞仪测试。MV-411细胞的凋亡实验除了用更高浓度的药物（TW37：60 ng/mL，ABT199：60 ng/mL）与细胞孵育外，其余的步骤类似与MOLM-13-Luc细胞的凋亡实验。
蛋白质印迹分析（WB）实验揭示了在MOLM-13-Luc和MV-411细胞中BCL2和MCL1蛋白都是过表达的，且TW37可以明显降低MCL1的表达；ABT199可以通过占据BCL2蛋白的疏水槽致使BCL2的抗凋亡功能丧失，在两种AML细胞中，ABT199的纳米制剂对BCL2蛋白表达影响不大（图5A）。Annexin V-APC/7-AAD双染技术评估了在MOLM-13-Luc和MV-411细胞中药物诱导细胞凋亡的能力，结果显示NPA、NPT以及NPAT诱导细胞凋亡的能力远远大于游离药物（图5B-C）。NPAT展示了显著的促凋亡能力，在MOLM-13-Luc细胞中，可以诱导44.3%的晚凋，诱导凋亡的能力分别是NPA和NPT的1.8和5.7倍。
实施例五 体内抗肿瘤效果实验
所有实验动物操作均按照《苏州大学实验动物护理和使用指南》进行，并经苏州大学动物伦理委员会批准。为了研究纳米粒在AML小鼠体内的抗肿瘤效果，将MOLM-13-Luc细胞的PBS悬液（5×105个/只）通过尾静脉注射到B-NDG小鼠体内，完成建模。MOLM-13-LucAML荷瘤小鼠在接种后第3 d被随机分为4组（PBS、NPT、NPA以及NPAT）。接种后的第3 d开始给药，并把第一次给药时间记为第0 d，所有的组在第0，3，6，9 d尾静脉给药（TW37：10 mg/kg，ABT199：10 mg/kg）。在第5，8，11，14 d用IVIS成像系统检测荷瘤小鼠体内MOLM-13-Luc细胞的增殖进度，成像前每只小鼠先注射荧光素加盐（1.5 mg/只）。在第14 d，先眼眶取外周血（PB）置于PBS（包含1% v/v FBS）中，然后腹腔主动脉取血进行血生化与血常规表征。除此之外，解剖取出小鼠的肺、肝、脾和一条腿骨，接着进行研磨获取细胞，加入红细胞裂解液进行裂解15 min，用APC-anti-human-CD45抗体对白血病细胞进行标记20 min，最后用流式细胞仪进行测试。白血病细胞在主要器官和骨髓（BM）的浸润可以通过H&E染色再用倒置荧光显微镜观察。股骨和胫骨的破坏程度可以通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色破骨细胞进行分析。Micro-CT评价小鼠股骨和胫骨的骨矿物密度（BMD）、骨量以及形态和结构。为了进一步研究NPAT在AML小鼠的体内抗肿瘤效果，建立了MV-411 AML小鼠模型，在实验期间（第3、6、9、12、15、17 d）通过测量外周血中白血病细胞的浸润来跟踪肿瘤进展。第17 d处死MV-411 AML小鼠，观察AML小鼠BM及主要器官中白血病细胞的浸润。实验结束时称量小鼠脾脏的重量，每3 d测量荷瘤小鼠体重。
为研究NPAT的体内抗AML活性，首先采用B-NDG小鼠通过尾静脉注射MOLM-13-Luc细胞构建了原位MOLM-13-Luc AML小鼠模型（图6A）。从MOLM-13-Luc肿瘤细胞在小鼠体内的成像结果看出，PBS组小鼠病情进展迅速，在第8 d时小鼠身体局部开始出现荧光，在第11 d时小鼠身上的荧光愈加明显，第14 d时荧光已经布满小鼠全身，同时伴随着小鼠后腿瘫痪，耳廓发白。相对于PBS组，尤其在最初的11 d内，NPT和NPA组延缓了白血病细胞在小鼠体内的浸润；NPAT直到实验结束时几乎都能完全抑制MOLM-13-Luc细胞在小鼠体内的浸润（图6B-C）。NPAT治疗后，小鼠脾的重量与健康小鼠的相似，与PBS、NPA和NPT组小鼠脾脏肿大形成鲜明对比（图6D）。这些结果初步表明，NPAT强效抑制MOLM-13-Luc肿瘤细胞在小鼠体内的浸润。各组小鼠在治疗期间和结束后体重未出现明显下降，表明NPAT具有较好的安全性（图6E）。
在首次给药后的第14 d，收集外周血、肝脏、脾脏、肺及后腿骨，研磨后加入APC-anti-human-CD45抗体标记白血病细胞，并通过流式细胞仪检测小鼠各器官中白血病细胞浸润的情况。结果显示，PBS组小鼠的骨髓（BM）、肺（Lu）、肝（Li）、脾（Sp）、及外周血（PB）中均有大量的白血病细胞浸润，白血病细胞占比分别为35.2%、39.9%、80.5%、86.0%和15.4%（图7A-B），表明MOLM-13-Luc细胞累及并浸多个器官。NPA、NPT和NPAT组显著抑制了白血病细胞在各个器官的浸润，NPAT组展现出了最好的抑制能力，在骨髓和其它器官中白血病细胞的浸润率分别小于0.4%和2%。尽管在第14 d，NPA和NPT组也减少了白血病细胞在小鼠体内的浸润，但是在骨髓、肝以及脾中的浸润率也已经超过了15%，结果表明NPAT双药联合组大幅增加了在原位MOLM-13-Luc AML小鼠模型中的治疗效果，有效抑制了白血病细胞在小鼠体内的增殖，提高了小鼠的生存质量。
Micro-CT图像结果显示PBS组小鼠后腿骨出现严重的破骨现象，骨小梁大量缺失，经NPAT治疗后，小鼠的溶骨性病变得到明显改善（图8A）。随后通过进一步的定量分析，PBS组小鼠股骨和胫骨骨矿物密度（BMD）最低，NPA、NPT和NPAT显著提高BMD，其中NPAT组BMD约为PBS组的2.8倍（图8B）。与PBS组比较，NPAT组小鼠骨量明显增加，骨表面积/组织体积（BS/TV）和骨体积/组织体积（BV/TV）分别增加2倍左右。PBS组小鼠骨小梁间距（Tb.Sp）增加，骨小梁厚度（Tb.Th）减少，骨小梁数量（Tb.N）减少，表明AML引起的溶骨性病变导致明显的骨损伤。NPAT诱导的骨小梁空间形态和结构正常，Tb.Sp，Tb.Th和Tb.N和健康小鼠相似。
小鼠股骨和胫骨的HE分析表明，PBS组小鼠骨髓腔内分布大量白血病细胞，仅有少量造血细胞，而NPA、NPT和NPAT组显著减少MOLM-13-Luc白血病细胞在骨髓腔的浸润（图9A）。小鼠在NPAT治疗后骨髓腔内基本上看不到白血病细胞。健康小鼠骨中的破骨细胞和成骨细胞处于动态平衡之中，破骨细胞的增加往往会引起溶骨病变，最终导致骨质疏松和骨溶解。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）是破骨细胞的主要标志，通过对TRAP染色显示出PBS组小鼠腿骨中存在大量的破骨细胞，而NPA、NPT和NPAT治疗后破骨细胞显著减少，其水平与健康小鼠相当。
由血生化和血常规分析看出（图10），PBS组、NPT组和NPA组小鼠的红细胞和血小板减少，白细胞增加，而NPAT组小鼠与健康小鼠的各项指标基本上没有差别，这与骨H&E结果相吻合。得注意的是，所有纳米药物（NPA、NPT和NPAT）治疗后小鼠体内的丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、尿素水平和健康小鼠相似，这表明纳米药物具有显著的安全性。
H&E染色结果显示：在小鼠的肝、脾以及肾中，PBS组可见大量MOLM-13-Luc白血病细胞的浸润，NPT组和NPA组也有少部分白血病细胞的浸润，而NPAT组未见白血病细胞的浸润，且NPAT各个器官的细胞形态正常、均一，肝细胞排列紧密有序，脾脏红髓丰富，免疫细胞密集分布（图11）。
NPAT的治疗效果进一步在原位MV-411荷瘤B-NDG小鼠体内进行了评估（图12A）。PBS组MV-411白血病细胞在小鼠体内快速浸润，第17 d在BM、Lu、Li、Sp和PB中的白血病细胞占比分别为14.2%、40.0%、24.7%、15.0%和4.9%（图12B-C）。NPA、NPT和NPAT均能抑制白血病细胞在主要器官的浸润，NPAT抑制白血病细胞在骨髓中浸润的能力最佳（< 2%），验证了NPAT联合双药的强协同作用。将ABT199和TW37的药物剂量从10 mg/kg都增加到15 mg/kg可进一步改善治疗结果，并显示出更好的抑制能力，在骨髓中的白血病细胞浸润比例减少约3.4倍（0.36% vs 1.21%）。与NPAT相比，NPAT-H组小鼠在脾脏和肺中浸润的MV-411细胞分别减少约1.9倍和3.4倍。也可以看到PBS组小鼠外周血中白血病细胞的数量随时间的增加迅速增加（图12D），说明MV-411白血病模型建立成功并且进展迅速。PBS组、NPA组和NPT组小鼠脾的重量明显大于健康小鼠，NPAT治疗后脾重与健康小鼠相似（图12E）。重要的是，NPA、NPT和NPAT在治疗期间诱导的体重变化很小，而PBS组小鼠体重下降约7%，主要归因于白血病细胞后期快速的浸润，导致小鼠病情加重（图12F）。这些结果综合表明了NPAT双药联合大幅增加了在原位AML小鼠模型中的治疗效果，有效抑制了白血病细胞在小鼠体内的增殖及器官中的浸润。
本发明公开了一种聚氨基酸功能化纳米载体，具体为聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）共聚物，制备包载小分子抑制剂药物的聚氨基酸的苯硼酸功能化共载小分子抑制剂纳米药物用于肿瘤的协同治疗。本发明设计制备的聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）共聚物具有良好的生物相容性和酶降解性，且制备简单、重复可控；设计构建的聚多肽纳米粒子具有粒径可控（79~148 nm）、粒径分布较窄、稳定性好以及可以响应性释放（酸性/活性氧/酶）药物的特性，实现对抗肿瘤小分子药物的高效包载。在体外细胞毒性实验中，对MOLM-13-Luc和MV-411 AML细胞具有显著的细胞毒性，在ABT199/TW37重量比为1:1时，IC50分别为1.15和7.45 ng/mL。此外，NPAT在MOLM-13-Luc和MV-411AML模型中能显著抑制白血病细胞在骨髓、肺、肝、脾和外周血中的浸润，并显著提高小鼠存活率。因此，苯硼酸功能化的智能纳米药物具有结构简单、药物组合可调、安全性高、协同疗效强等特点，可以很容易地推广到不同癌症的治疗中。

Claims (10)

1.一种基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒，其特征在于，所述基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒由聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）共聚物装载小分子抑制剂得到。
2.根据权利要求1所述基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒，其特征在于，小分子抑制剂包括BCL2抑制剂、MCL1抑制剂、PLK1抑制剂中的一种或几种。
3.权利要求1所述基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒的制备方法，其特征在于，将聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）共聚物溶液与小分子抑制剂溶液滴加到缓冲溶液中，然后透析得到基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒。
4.根据权利要求3所述基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒的制备方法，其特征在于，以聚乙二醇为引发剂，通过开环聚合4-硼-L-苯丙氨酸-N-羧基内酸酐及L-酪氨酸-N-羧基内酸酐得到聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）共聚物。
5.根据权利要求3所述基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒的制备方法，其特征在于，小分子抑制剂为一种或者一种以上小分子抑制剂。
6.聚乙二醇-b-聚（4-硼-L-苯丙氨酸-co-L-酪氨酸）共聚物在制备权利要求1所述基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒中的应用。
7.权利要求1所述基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒在制备纳米药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述纳米药物为抗肿瘤药物。
9.权利要求1所述基于聚氨基酸的小分子抑制剂纳米粒在制备具有协同作用的纳米药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述小分子抑制剂为BCL2抑制剂和MCL1抑制剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117582518A (zh) * 2023-11-22 2024-02-23 东莞市人民医院 多臂聚乙二醇-bpa硼药、其制备方法及其应用

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