CN117582518A - 多臂聚乙二醇-bpa硼药、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及多臂聚乙二醇‑BPA硼药、其制备方法及其应用。多臂聚乙二醇‑BPA硼药包括以N‑羟基琥珀酰亚胺酯官能团为端基的多臂聚乙二醇和BPA，所述BPA和所述多臂聚乙二醇通过共价键键合。该硼药不仅能够提高BPA的水溶性，还能够延长BPA在肿瘤组织的滞留时间，提高BPA在肿瘤组织的蓄积量，进而有效提高BNCT治疗的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及多臂聚乙二醇-BPA硼药、其制备方法及其应用。
背景技术
BNCT(硼中子俘获疗法)是一种新型放疗技术，BNCT将具有肿瘤靶向能力的10B药剂输送至肿瘤细胞，进行热中子照射，通过核反应产生的4He2+(α粒子)和7Li3+粒子具有很高的辐射能量和极短的辐射范围(分别为9μm和5μm)，其杀伤作用仅限于摄取10B的细胞，从而能够选择性地杀死目标细胞，对未摄取10B的正常组织损伤极少。
目前，作为临床使用的小分子硼药，如(L)-4-二羟基硼苯丙氨酸(BPA)、硫基十二硼烷二钠盐(BSH)等，均具有肿瘤选择性差、水溶性差、血液半衰期短、肿瘤组织药物富集度低以及滞留时间短的缺点，严重限制了BNCT的效果。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供多臂聚乙二醇-BPA硼药、其制备方法及其应用。本发明实施例提供的多臂聚乙二醇-BPA硼药不仅能够提高BPA的水溶性，还能够延长BPA在肿瘤组织的滞留时间，提高BPA在肿瘤组织的蓄积量，进而有效提高BNCT治疗的治疗效果，具有应用于BNCT临床治疗的应用潜力。且该制备方法过程简单，易于操作。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种多臂聚乙二醇-BPA硼药，其包括以N-羟基琥珀酰亚胺酯官能团为端基的多臂聚乙二醇和BPA，所述BPA和所述多臂聚乙二醇通过共价键键合。
在可选的实施方式中，所述BPA和所述多臂聚乙二醇通过酰胺键键合。
在可选的实施方式中，所述多臂聚乙二醇选自下述结构式所示化合物：
其中，R为多臂聚乙二醇化合物的烷基核结构，m为24-240之间的任一整数，n为1，2，4，6，8中的任一整数。
在可选的实施方式中，所述多臂聚乙二醇-BPA硼药选自下述结构式所示化合物：
其中，R表示多臂聚乙二醇化合物的烷基核结构，m为24-240之间的任一整数，n为1，2，4，6，8中的任一整数。
在可选的实施方式中，R表示C1-C8烷基，优选为C1-C6烷基；
R表示C2-C20烷醚基，优选为C5-C15烷醚基。
在可选的实施方式中，R为CH3时，n为1；
R为CH2-CH2时，n为2；
R为时，n为4；
R为时，n为6；
R为时，n为8。
在可选的实施方式中，所述多臂聚乙二醇的数均分子量范围为2000-100000Da。
第二方面，本发明提供一种前述实施方式所述的多臂聚乙二醇-BPA硼药的制备方法，包括：将多臂聚乙二醇和BPA混合反应后进行透析。
在可选的实施方式中，包括：将所述多臂聚乙二醇与Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液混合形成浓度为5mg-2g/mL的溶液；
将所述BPA与亚砜类溶剂混合，而后与所述溶液混合，，所述亚砜类溶剂与所述缓冲溶液的体积比为1:4.5-5.5；
在惰性气体氛围下，20-30℃条件下反应6-24h，接着，进行透析；
其中，所述多臂聚乙二醇与所述BPA盐的摩尔比为1:1.1-1.3；
优选地，BPA为10B丰度高于95％的化合物。
第三方面，本发明提供一种前述实施方式所述的多臂聚乙二醇-BPA硼药在制备硼中子俘获治疗的药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：本发明实施例通过将BPA((L)-4-二羟基硼苯丙氨酸)与多臂聚乙二醇缀合形成新的硼药，其能够有效改善BPA的水溶性，能够延长BPA在肿瘤组织的滞留时间，提高BPA在肿瘤组织的蓄积量，进而有效提高BNCT治疗的治疗效果，具有应用于BNCT临床治疗的应用潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的单臂聚乙二醇-BPA硼药的核磁氢谱图；
图2为本发明实施例2提供的二臂聚乙二醇-BPA硼药的核磁氢谱图；
图3为本发明实施例3提供的四臂聚乙二醇-BPA硼药的核磁氢谱图；
图4为本发明实施例4提供的六臂聚乙二醇-BPA硼药的核磁氢谱图；
图5为本发明实施例5提供的八臂聚乙二醇-BPA硼药的核磁氢谱图；
图6为本发明实验例1提供的检测结果图；
图7为本发明实验例2提供的检测结果图；
图8为本发明实验例3提供的检测结果图；
图9为本发明实验例4提供的检测结果图；
图10为本发明实验例5提供的检测结果图；
图11为本发明实验例6提供的检测结果图；
图12为本发明实验例7提供的检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供多臂聚乙二醇-BPA硼药，其原料包括BPA和以N-羟基琥珀酰亚胺酯官能团为端基的多臂聚乙二醇，二者通过共价键键合，例如采用酰胺键键合。
其中，多臂聚乙二醇选自下述结构式所示化合物：
其中，R为多臂聚乙二醇化合物的烷基核结构，m为24-240之间的任一整数，n为1，2，4，6，8中的任一整数。通过调整n可以控制缀合的BPA的数量，通过共同调整m和n可以控制多臂聚乙二醇-BPA硼药的分子量。
具体地，R表示C1-C8烷基，优选为C1-C6烷基；R表示C2-C20烷醚基，优选为C5-C15烷醚基。
更进一步地，R为CH3时，n为1；
R为CH2-CH2时，n为2；
R为时，n为4；
R为时，n为6；
R为时，n为8。
多臂聚乙二醇的数均分子量范围为2000-100000Da。
多臂聚乙二醇-BPA硼药选自下述结构式所示化合物：
其中，R表示多臂聚乙二醇化合物的烷基核结构，m为24-240之间的任一整数，n为1，2，4，6，8中的任一整数。
即根据n为1，2，4，6，8，形成的硼药记为单臂聚乙二醇BPA硼药、二臂聚乙二醇BPA硼药、四臂聚乙二醇BPA硼药、六臂聚乙二醇BPA硼药和八臂聚乙二醇BPA硼药。
第二方面，本发明提供一种前述实施方式所述的多臂聚乙二醇-BPA硼药的制备方法，包括：将多臂聚乙二醇和BPA混合反应后进行透析。
具体过程如下：将多臂聚乙二醇与Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液混合形成浓度为5mg-2g/mL(优选为10mg-2g/mL)的溶液；其中，缓冲溶液的pH为8.0-9.0。
将将所述BPA与亚砜类溶剂(例如二甲基亚砜)混合，多臂聚乙二醇与所述BPA盐的摩尔比为1:1.1-1.3，优选为1:1.2。
而后将多臂聚乙二醇-缓冲溶液加入到上述BPA亚砜类溶剂中，并通入惰性气体(例如，氮气、氩气和氦气中的任意一种)30min-12h，室温(20-30℃)下搅拌反应6-24h之后，将混合溶液转移到得到的反应液置于再生纤维素透析袋(截留分子量为500Da-14000Da，优选为1000Da-14000Da)中进行透析；透析过程一天换液3次-5次，透析时间为3天-5天。将透析完成后得到的物料进行冻干。
第三方面，本发明提供一种前述实施方式所述的多臂聚乙二醇-BPA硼药在制备硼中子俘获治疗的药物中的应用。该药物还包括药学上可接受的辅料。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种单臂聚乙二醇-BPA硼药的制备方法，包括：
取100mg的分子量为2000的单臂聚乙二醇-NHS(R为CH3，n＝1，m＝45)(购自上海芃圣生物科技有限公司)溶解在5mL pH 8.5的Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液中。
取14.7mg的BPA盐酸盐溶解在1mL的DMSO中，随后加入到单臂聚乙二醇-NHS的溶液中，并通氮气40min。
室温(25℃)下搅拌反应12h之后，将混合溶液转移到得到的反应液置于再生纤维素透析袋(截留分子量为500Da)中进行透析3天。将透析完成后得到的物料进行冻干。
所得产物溶解于重水中，测试核磁氢谱，结果如图1所示。根据图1可知，δ在7.0-7.7之间出现了BPA的特征峰，且其积分和为3.66，接近与一个BPA分子上苯环上H的个数4，证明一个BPA成功缀合到单臂聚乙二醇(分子量2000，n＝1，m＝45，R为CH3)上。
实施例2
本实施例提供一种二臂聚乙二醇-BPA硼药的制备方法，，包括：
取100mg的分子量为2000的二臂聚乙二醇-NHS(n＝2，m＝22，R为CH2-CH2)(购自上海芃圣生物科技有限公司)溶解在5mL pH 8.0的Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液中。
取29.4mg的BPA盐酸盐溶解在4mL的DMSO中，随后加入到四臂聚乙二醇-NHS的溶液中，并通氮气1h。
室温(25℃)下搅拌反应24h之后，将混合溶液转移到得到的反应液置于再生纤维素透析袋(截留分子量为500Da)中进行透析3天。将透析完成后得到的物料进行冻干。
所得产物溶解于重水中，测试核磁氢谱，结果如图2所示。根据图2可知，δ在7.0-7.7之间出现了BPA的特征峰，且其积分和为7.02，接近与两个BPA分子上苯环上H的个数8，证明大部分二臂聚乙二醇(分子量2000，n＝2，m＝22，R为CH2-CH2)上缀合上了两个BPA。
实施例3
本实施例提供一种四臂聚乙二醇-BPA硼药的制备方法，，包括：
取50mg的分子量为2000的四臂聚乙二醇-NHS(分子量2000，n＝4，m＝11，R为)(购自北京奇松生物科技有限公司)溶解在5mL pH 8.0的Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液中。
取29.4mg的BPA盐酸盐溶解在4mL的DMSO中，随后加入到四臂聚乙二醇-NHS的溶液中，并通氮气1h。
室温(25℃)下搅拌反应24h之后，将混合溶液转移到得到的反应液置于再生纤维素透析袋(截留分子量为500Da)中进行透析3天。将透析完成后得到的物料进行冻干。
所得产物溶解于重水中，测试核磁氢谱，结果如图3所示。根据图3可知，δ在7.0-7.7之间出现了BPA的特征峰，且其积分和为16.16，接近与四个BPA分子上苯环上H的个数16，证明四臂聚乙二醇(分子量2000，n＝4，m＝11，R为)上缀合上了四个BPA。
实施例4
本实施例提供一种六臂聚乙二醇-BPA硼药的制备方法，，包括：
取200mg的分子量为10000的六臂聚乙二醇-NHS(分子量10000，n＝6，m＝37，R为)(购自北京奇松生物科技有限公司)溶解在30mL pH 8.0的Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液中。
取35.28mg的BPA盐酸盐溶解在6mL的DMSO中，随后加入到六臂聚乙二醇-NHS的溶液中，并通氮气40min。
室温(25℃)下搅拌反应18h之后，将混合溶液转移到得到的反应液置于再生纤维素透析袋(截留分子量为2000Da)中进行透析3天。将透析完成后得到的物料进行冻干。
所得产物溶解于重水中，测试核磁氢谱，结果如图4所示。根据图4可知，δ在7.0-7.7之间出现了BPA的特征峰，且其积分和为25.43，接近与六个BPA分子上苯环上H的个数24，证明六臂聚乙二醇(分子量10000，n＝6，m＝37，R为)上缀合上了六个BPA。
实施例5
本实施例提供一种八臂聚乙二醇-BPA硼药的制备方法，，包括：
取500mg的分子量为10000的八臂聚乙二醇-NHS(分子量10000，n＝8，m＝28，R为)(购自北京奇松生物科技有限公司)溶解在10mL pH8.5的Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液中。
取12mg的BPA盐酸盐溶解在2mL的DMSO中，随后加入到八臂聚乙二醇-NHS的溶液中，并通氮气30min。
室温下搅拌反应24h之后，将混合溶液转移到得到的反应液置于再生纤维素透析袋(截留分子量为2000Da)中进行透析4天。将透析完成后得到的物料进行冻干。
所得产物溶解于重水中，测试核磁氢谱，结果如图5所示。根据图5可知，δ在7.0-7.7之间出现了BPA的特征峰，且其积分和为31.82，接近与八个BPA分子上苯环上H的个数32，证明八臂聚乙二醇(分子量10000，n＝8，m＝28，R为)上缀合上了八个BPA。
实施例6
本实施例提供一种四臂聚乙二醇-BPA硼药的制备方法，，包括：
取250mg的分子量为10000的四臂聚乙二醇-NHS(n＝4，m＝56，R为)(购自北京奇松生物科技有限公司)溶解在10mL pH 8.0的Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液中。
取117.6mg的BPA盐酸盐溶解在4mL的DMSO中，随后加入到四臂聚乙二醇-NHS的溶液中，并通氮气1h。
室温下搅拌反应24h之后，将混合溶液转移到得到的反应液置于再生纤维素透析袋(截留分子量为1000Da)中进行透析3天。将透析完成后得到的物料进行冻干。
实验例1水溶性对比
将相同含硼量的实施例1-5多臂聚乙二醇-BPA硼药与BPA分别加入到1.5mL的玻璃瓶中，加入适量体积的PBS缓冲溶液，配制成硼浓度为60ppm的溶液，观察比较样品的浊度。
结果参见图6，根据图6可知，硼浓度为60ppm的BPA溶液呈浑浊状(样品A)，而相同硼浓度的实施例1-5多臂聚乙二醇-BPA溶液(样品B-F)则呈透明状，证明多臂聚乙二醇修饰的BPA能够有效提高BPA硼药的水溶性。
实验例2细胞摄取能力
利用实施例4-6的多臂聚乙二醇-BPA硼药(对应分子量为10000的六臂、八臂和四臂聚乙二醇与BPA形成的硼药)和BPA分别配制将相同含硼量的溶液。
将小鼠乳腺癌细胞(4T1)(细胞密度1x106)铺于六孔板中培养24h，换新鲜培养基后，分别加入相同含硼量的BPA和多臂聚乙二醇-BPA硼药溶液，孵育3h。孵育结束后，吸去各孔板溶液，用PBS洗3遍。TE消化后吸去，加入培养基终止消化，收集细胞于1.5mL EP管中，1000rpm离心3min，弃去培养基，各加入600μL HNO3，加热消化12h过膜，用ICP-MS测定含硼浓度。
对比各样品的细胞摄取量，测试结果如图7所示。根据图7可知，本发明实施例提供的实施例4-6的多臂聚乙二醇-BPA硼药溶液都显示出了比BPA更强的细胞摄取能力，其中八臂聚乙二醇-BPA的细胞摄取能力最强。
实验例3BPA在肿瘤细胞的滞留能力
利用实施例4-6的多臂聚乙二醇-BPA硼药(对应分子量为10000的六臂、八臂和四臂聚乙二醇与BPA形成的硼药)和BPA分别配制将相同含硼量的溶液。
将小鼠乳腺癌细胞(4T1)(细胞密度1×106)铺于六孔板中培养24h，换新鲜培养基后，分别加入相同含硼量的BPA和多臂聚乙二醇-BPA硼药溶液，孵育3h。之后换液，加入不含BPA的新鲜培养基，分别额外培养1h。孵育结束后，吸去各孔板溶液，用PBS洗3遍。TE消化后吸去，加入培养基终止消化，收集细胞于1.5mL EP管中，1000rpm离心3min，弃去培养基，各加入600μL HNO3，加热消化12h过膜，用ICP-MS测定含硼浓度。
对比各样品的细胞摄取量，测试结果如图8所示。根据图8可知，本发明实施例提供的实施例4-6的多臂聚乙二醇-BPA硼药溶液都显示出了比BPA更强的肿瘤细胞的滞留能力。
实验例4硼药在肿瘤位置的富集能力
其中，选用12只小鼠作为样本分成四组，小鼠为乳腺肿瘤小鼠，相同含硼量的BPA和实施例4-6的多臂聚乙二醇-BPA硼药分别尾静脉给药后，3h后，处死小鼠并取出各小鼠的肿瘤，利用ICP-MS检测各小鼠肿瘤中的硼含量。计算小鼠肿瘤组织中硼的富集量。
结果参见图9，根据图9可知，本发明实施例提供的实施例4-6的多臂聚乙二醇-BPA硼药在肿瘤组织的富集量要高于BPA。
实验例5细胞摄取能力
利用实施例1-2的多臂聚乙二醇-BPA硼药(对应分子量为2000的单臂和二臂聚乙二醇与BPA形成的硼药)和BPA分别配制将相同含硼量的溶液。
将小鼠乳腺癌细胞(4T1)(细胞密度1x106)铺于六孔板中培养24h，换新鲜培养基后，分别加入相同含硼量的BPA和多臂聚乙二醇-BPA硼药溶液，孵育3h。孵育结束后，吸去各孔板溶液，用PBS洗3遍。TE消化后吸去，加入培养基终止消化，收集细胞于1.5mL EP管中，1000rpm离心3min，弃去培养基，各加入600μL HNO3，加热消化12h过膜，用ICP-MS测定含硼浓度。
对比各样品的细胞摄取量，测试结果如图10所示。根据图10可知，本发明实施例提供的实施例1-2的多臂聚乙二醇-BPA硼药溶液都显示出了比BPA更强的细胞摄取能力，其中二臂聚乙二醇-BPA的细胞摄取能力最强。
实验例6BPA在肿瘤细胞的滞留能力
利用实施例1-2的多臂聚乙二醇-BPA硼药(对应分子量为2000的单臂和二臂聚乙二醇与BPA形成的硼药)和BPA分别配制将相同含硼量的溶液。
将小鼠乳腺癌细胞(4T1)(细胞密度1×106)铺于六孔板中培养24h，换新鲜培养基后，分别加入相同含硼量的BPA和多臂聚乙二醇-BPA硼药溶液，孵育3h。之后换液，加入不含BPA的新鲜培养基，分别额外培养1h。孵育结束后，吸去各孔板溶液，用PBS洗3遍。TE消化后吸去，加入培养基终止消化，收集细胞于1.5mL EP管中，1000rpm离心3min，弃去培养基，各加入600μL HNO3，加热消化12h过膜，用ICP-MS测定含硼浓度。
对比各样品的细胞摄取量，测试结果如图11所示。根据图11可知，本发明实施例提供的实施例1-2的多臂聚乙二醇-BPA硼药溶液都显示出了比BPA更强的肿瘤细胞的滞留能力。
实验例7硼药在肿瘤位置的富集能力
其中，选用12只小鼠作为样本分成四组，小鼠为乳腺肿瘤小鼠，相同含硼量的BPA和实施例1-2的多臂聚乙二醇-BPA硼药分别尾静脉给药后，3h后，处死小鼠并取出各小鼠的肿瘤，利用ICP-MS检测各小鼠肿瘤中的硼含量。计算小鼠肿瘤组织中硼的富集量。
结果参见图12，根据图12可知，本发明实施例提供的实施例1-2的多臂聚乙二醇-BPA硼药在肿瘤组织的富集量要高于BPA。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种多臂聚乙二醇-BPA硼药，其特征在于，其包括以N-羟基琥珀酰亚胺酯官能团为端基的多臂聚乙二醇和BPA，所述BPA和所述多臂聚乙二醇通过共价键键合。
2.根据权利要求1所述的多臂聚乙二醇-BPA硼药，其特征在于，所述BPA和所述多臂聚乙二醇通过酰胺键键合。
3.根据权利要求1所述的多臂聚乙二醇-BPA硼药，其特征在于，所述多臂聚乙二醇选自下述结构式所示化合物：
其中，R为多臂聚乙二醇化合物的烷基核结构，m为24-240之间的任一整数，n为1，2，4，6，8中的任一整数。
4.根据权利要求1-3任一项所述的多臂聚乙二醇-BPA硼药，其特征在于，所述多臂聚乙二醇-BPA硼药选自下述结构式所示化合物：
其中，R表示多臂聚乙二醇化合物的烷基核结构，m为24-240之间的任一整数，n为1，2，4，6，8中的任一整数。
5.根据权利要求4所述的多臂聚乙二醇-BPA硼药，其特征在于，R表示C1-C8烷基，优选为C1-C6烷基；
R表示C2-C20烷醚基，优选为C5-C15烷醚基。
6.根据权利要求4所述的多臂聚乙二醇-BPA硼药，其特征在于，
R为CH3时，n为1；
R为CH2-CH2时，n为2；
R为时，n为4；
R为时，n为6；
R为时，n为8。
7.根据权利要求1-3任一项所述的多臂聚乙二醇-BPA硼药，其特征在于，所述多臂聚乙二醇的数均分子量范围为2000-100000Da。
8.一种权利要求1所述的多臂聚乙二醇-BPA硼药的制备方法，其特征在于，包括：将多臂聚乙二醇和BPA混合反应后进行透析。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，包括：
将所述多臂聚乙二醇与Na2CO3/NaHCO3缓冲溶液混合形成浓度为5mg-2g/mL的溶液；
将所述BPA盐与亚砜类溶剂混合，而后与所述溶液混合，所述亚砜类溶剂与所述缓冲溶液的体积比为1:4.5-5.5；
在惰性气体氛围下，20-30℃条件下反应6-24h，接着，进行透析；
其中，所述多臂聚乙二醇与所述BPA盐的摩尔比为1:1.1-1.3；
优选地，BPA为10B丰度高于95％的化合物。
10.一种权利要求1所述的多臂聚乙二醇-BPA硼药在制备硼中子俘获治疗的药物中的应用。
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