CN118078995A - 一种双重靶向高水溶性小分子硼药及其制备方法和应用 - Google Patents
一种双重靶向高水溶性小分子硼药及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种双重靶向高水溶性小分子硼药及其制备方法和应用。为了克服目前小分子硼药靶向性差，水溶性差，血液半衰期短，肿瘤组织药物富集度低等问题，本发明提供一种双重靶向高水溶性小分子硼药制剂及其制备方法，该硼药水溶性好，正常情况下没有明显的细胞毒性，且能够有效被肿瘤细胞摄取并滞留在肿瘤细胞内，在肿瘤的BNCT治疗中展现出比目前临床批准上市使用的BPA更好的效果。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种双重靶向高水溶性小分子硼药及其制备方法和应用。
背景技术
硼中子俘获治疗(Boron Neutron Capture Therapy， 简称BNCT)是一种二元、细胞尺度的强靶向性的精准治疗方式，其原理是将无放射性的同位素硼-10（10B）在肿瘤组织中聚集，之后对局部肿瘤组织进行热中子照射进行核反应，期间产生的4He2+(α粒子)和7Li3+粒子具有很高的辐射能量和极短的辐射范围(分别为9 µm和5 µm)，其杀伤作用范围仅限于摄取10B的细胞，从而选择性地杀死目标细胞，对未摄取10B的正常组织损伤极少。因此，相比于传统的光子疗法，BNCT对于黑色素瘤、神经脑胶质瘤和复发性头颈部鳞癌等恶性肿瘤具有较好的杀伤作用。
为了保证BNCT的治疗效果，10B携带剂需要满足以下要求，一是肿瘤细胞中10B的含量不低于20 µg/g，即每个肿瘤细胞内至少含有109个10B原子；二是肿瘤组织与正常组织中10B浓度之比（T/N）、肿瘤组织与血液中10B浓度之比（T/B）均大于3，且能够在肿瘤组织内长时间滞留。目前，BNCT临床用硼药仅有(L)-4-二羟基硼苯丙氨酸(BPA)被FDA批准上市。但BPA硼药具有肿瘤选择性差、水溶性差、血液半衰期短、肿瘤组织药物富集度低以及滞留时间短的缺点，由于大量使用果糖等辅料，肾脏毒副作用较明显。这严重限制了BNCT的治疗效果。因此，开发一种具有更好的靶向作用以及肿瘤富集能力的高水溶性小分子硼药对于提高临床肿瘤BNCT疗效至关重要。 鉴于此，为了解决市售BPA硼药水溶性差、生物相容性较差等问题，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种双重靶向高水溶性小分子硼药。
本发明的另一目的在于，提供上述双重靶向高水溶性小分子硼药的制备方法。
本发明的再一目的在于，提供上述双重靶向高水溶性小分子硼药的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种双重靶向高水溶性小分子硼药，其结构通式如下：
。
所述的双重靶向高水溶性小分子硼药，R基团为葡萄糖衍生物中的至少一种。
所述的双重靶向高水溶性小分子硼药，R基团为式I～IV中的至少一种：
。
所述的双重靶向高水溶性小分子硼药，其中的B为10B。
一种双重靶向高水溶性小分子硼药的制备方法，包括如下步骤：
（1）称取BPA溶于溶剂，随后加入NaOH，然后边搅拌边滴加二碳酸二叔丁酯溶液，惰性气氛下室温搅拌反应，反应结束后，分离纯化获得化合物1；
（2）称取7-(BOC-氨基)庚酸和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐，加入溶剂搅拌溶解，然后加入N,N-二异丙基乙胺，搅拌反应，随后加入葡萄糖衍生物，继续搅拌反应，随后加入三氟乙酸，继续搅拌反应，反应结束后，旋蒸去除溶剂，分离纯化得到化合物R；
（3）称取化合物1和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐，加入溶剂搅拌溶解，然后加入N,N-二异丙基乙胺，搅拌反应，随后加入化合物R，继续搅拌反应，随后加入三氟乙酸，继续搅拌反应，反应结束后，旋蒸去除溶剂，分离纯化，得到双重靶向高水溶性小分子硼药。
步骤（1）所述的BPA与二碳酸二叔丁酯的质量比为100：2～5；优选为100：3.5。
步骤（1）所述的BPA与NaOH的质量比为3～10：1；优选为5：1。
步骤（1）所述的BPA为10B丰度高于99％的BPA。
步骤（1）所述的溶剂为有机溶剂；优选为二氧六环。
步骤（1）所述的二碳酸二叔丁酯溶液的溶剂为有机溶剂；优选为二氧六环。
步骤（1）所述的惰性气氛为氩气气氛。
步骤（1）所述的反应的时间为10～20h；优选为12h。
步骤（2）所述的7-(BOC-氨基)庚酸、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺和葡萄糖衍生物的质量比为2～7：5～12：10～20：10～20；优选为5：8：13：13。
步骤（2）所述的三氟乙酸与7-(BOC-氨基)庚酸质量的质量比为1～5：100；优选为1：100。
步骤（2）所述的葡萄糖衍生物包括2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖、3-氨基-3-脱氧-D-葡萄糖、6-氨基-6-脱氧-D-吡喃葡萄糖和4-氨基苯基-D-吡喃葡萄糖苷中的至少一种。
步骤（2）所述的溶剂为有机溶剂；优选为无水乙腈。
步骤（2）所述的第一次搅拌反应的条件为室温下反应30～90min；优选为室温下反应1h。
步骤（2）所述的第二次搅拌反应的条件为室温下反应10～15h；优选为室温下反应12h。
步骤（2）所述的第三次搅拌反应的条件为室温下反应1～3h；优选为室温下反应2h。
步骤（3）所述的化合物1、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺和化合物R的质量比为1～3：4～6：5～10：5～10；优选为2：5：7：7。
步骤（3）所述的溶剂为有机溶剂；优选为无水乙腈。
步骤（3）所述的第一次搅拌反应的条件为室温下反应1～3h；优选为室温下反应2h。
步骤（3）所述的第二次搅拌反应的条件为室温下反应20～30h；优选为室温下反应24h。
步骤（3）所述的第三次搅拌反应的条件为室温下反应4～10h；优选为室温下反应6h。
所述的分离纯化为使用硅胶色谱层析柱进行分离，再使用有机溶剂洗脱纯化。
上述双重靶向高水溶性小分子硼药在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
上述双重靶向高水溶性小分子硼药在制备用于治疗肿瘤的硼中子俘获治疗药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括恶性黑色素瘤、头颈部鳞癌、神经脑胶质瘤、鼻咽癌、乳腺癌中的至少一种；优选转移性、复发、晚期黑色素瘤、头颈部鳞癌和神经脑胶质瘤。
优选地，所述肿瘤包括恶性肿瘤或转移性、不可进行手术切除的，优选黑色素瘤、头颈部鳞癌和神经脑胶质瘤。
所述双重靶向高水溶性小分子硼药可直接用生理盐水或磷酸缓冲溶液或无菌水或葡萄糖溶液溶解配制成硼药制剂用于输注。
所述双重靶向高水溶性小分子硼药无需任何辅料添加，水溶性为市售BPA硼药的1000倍以上。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明的目的在于克服目前小分子硼药靶向性差，水溶性差，血液半衰期短，肿瘤组织药物富集度低等问题，提供一种双重靶向高水溶性小分子硼药制剂及其制备方法，该硼药水溶性好，正常情况下没有明显的细胞毒性，且能够有效被肿瘤细胞摄取并滞留在肿瘤细胞内，在肿瘤的BNCT治疗中展现出比目前临床批准上市使用的BPA更好的效果。
附图说明
图1是本发明实施例1中化合物3的质谱检测结果。
图2是本发明实施例1中化合物3的HPLC检测结果。
图3是本发明实施例5中硼含量实验结果。
图4是本发明实施例6中不同浓度的细胞对硼结合实验结果。
图5是本发明实施例6中不同时间点细胞对硼结合实验结果。
图6是本发明实施例7中将硼药加入细胞24小时后CCK8实验结果。
图7是本发明实施例8中将硼药加入细胞并经BNCT照射后CCK8实验结果。
图8是本发明实施例9中硼药给药处理2h后小鼠各部位的硼含量实验统计图。
图9是本发明实施例9中硼药给药处理2h后小鼠各部位的T/N比实验统计图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下面实施方案中若未注明具体试验条件，则通常按照常规试验条件或按照试剂公司所建议的试验条件。所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
S1.称取100 mg (L)-4-二羟基硼苯丙氨酸（BPA）溶于含有1 mL二氧六环溶液的烧杯中，随后加入20 mg的NaOH，然后边搅拌边滴加含有30wt%二氧六环的二碳酸二叔丁酯5mL，随后通入氩气10分钟，密封，室温搅拌反应12h。反应结束后，使用硅胶色谱层析柱分离得到高纯度的化合物，洗脱纯化获得化合物1：
。
S2.称取50 mg的7-(BOC-氨基)庚酸和80 mg的O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐于烧杯中，随后加入10 mL无水乙腈溶液搅拌溶解，然后加入325mg的N,N-二异丙基乙胺，在室温条件下搅拌反应1小时，随后加入325mg的2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，室温搅拌反应12小时，随后加入0.5 mL三氟乙酸，继续室温搅拌反应2小时，反应结束后，经过旋转蒸发仪旋蒸去除溶剂，再使用硅胶色谱层析柱分离得到高纯度的化合物，洗脱纯化获得化合物2：
。
S3.称取20 mg的化合物1和50 mg的O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐于烧杯中，随后加入5 mL无水乙腈溶液搅拌溶解，然后加入140mg的N,N-二异丙基乙胺，在室温条件下搅拌反应2小时，随后加入140mg的化合物2，室温搅拌反应24小时，随后加入0.2 mL三氟乙酸，继续搅拌反应6小时，反应结束后，经过旋转蒸发仪旋蒸去除溶剂，再使用硅胶色谱层析柱分离得到高纯度的化合物，洗脱纯化获得化合物3：
。
将实施例1得到的硼药化合物3溶解在水中，使用核磁质谱和HPLC进行检测，结果参见图1～2。将1mg化合物3分散在1 mL水中时，化合物3瞬间溶解，溶液清澈透明；对应的将1mg BPA分散在1 mL水中时，发现BPA呈块状白色颗粒分散在水溶液中，无法完全溶解，表明水溶性极差。
实施例2
S1.称取20 mg的7-(BOC-氨基)庚酸和50 mg的O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐于烧杯中，随后加入5 mL无水乙腈溶液搅拌溶解，然后加入154mg的N,N-二异丙基乙胺，在室温条件下搅拌反应2小时，随后加入154mg的3-氨基-3-脱氧-D-葡萄糖，室温搅拌反应12小时，随后加入0.1 mL三氟乙酸，继续搅拌反应2小时，反应结束后，经过旋转蒸发仪旋蒸去除溶剂，在进行分离纯化，得到化合物4：
。
S2.称取10 mg的化合物1和20 mg的O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐于烧杯中，随后加入2 mL无水乙腈溶液搅拌溶解，然后加入60mg的N,N-二异丙基乙胺，在室温条件下搅拌反应6小时，随后加入60mg的化合物4，室温搅拌反应24小时，随后加入0.1 mL三氟乙酸，继续搅拌反应5小时，反应结束后，经过旋转蒸发仪旋蒸去除溶剂，在进行分离纯化，得到化合物5：
。
实施例3
S1.称取200 mg的7-(BOC-氨基)庚酸和500 mg的O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐于烧杯中，随后加入20 mL无水乙腈溶液搅拌溶解，然后加入1750mg的N,N-二异丙基乙胺，在室温条件下搅拌反应5小时，随后加入1750mg的6-氨基-6-脱氧-D-吡喃葡萄糖，室温搅拌反应24小时，随后加入0.8 mL三氟乙酸，继续搅拌反应6小时，反应结束后，经过旋转蒸发仪旋蒸去除溶剂，在进行分离纯化，得到化合物6：
。
S2.称取100 mg的化合物1和200 mg的O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐于烧杯中，随后加入25 mL无水乙腈溶液搅拌溶解，然后加入750mg的N,N-二异丙基乙胺，在室温条件下搅拌反应12小时，随后加入750mg的化合物6，室温搅拌反应48小时，随后加入0.6 mL三氟乙酸，继续搅拌反应12小时，反应结束后，经过旋转蒸发仪旋蒸去除溶剂，在进行分离纯化，得到化合物7：
。
实施例4
S1.称取80 mg的7-(BOC-氨基)庚酸和150 mg的O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐于烧杯中，随后加入12 mL无水乙腈溶液搅拌溶解，然后加入483mg的N,N-二异丙基乙胺，在室温条件下搅拌反应12小时，随后加入483mg的4-氨基苯基-D-吡喃葡萄糖苷，室温搅拌反应24小时，随后加入0.3 mL三氟乙酸，继续搅拌反应12小时，反应结束后，经过旋转蒸发仪旋蒸去除溶剂，在进行分离纯化，得到化合物8：
。
S2.称取60 mg的化合物1和140 mg的O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐于烧杯中，随后加入15mL无水乙腈溶液搅拌溶解，然后加入460mg的N,N-二异丙基乙胺，在室温条件下搅拌反应24小时，随后加入460mg的化合物8，室温搅拌反应36小时，随后加入0.5 mL三氟乙酸，继续搅拌反应24小时，反应结束后，经过旋转蒸发仪旋蒸去除溶剂，在进行分离纯化，得到化合物9：
。
实验例5 具有双重靶向硼药制剂的硼含量实验结果
本实验取实施例1制备得到的化合物3配置5mg/ml药物制剂，将其稀释为10、50、100 μg/ml的溶液（溶剂为水），加入500 μl硝酸硝解，70°C加热24小时，0.22 μm滤头过滤后，使用ICP-MS测定不同浓度溶液的硼含量，结果如图3所示。
实验例6 具有双重靶向硼药制剂的细胞结合实验结果
本实验以B16F10（小鼠黑色素瘤细胞）为研究对象，研究硼药制剂的细胞结合能力。
（1）将1×106个B16F10细胞接种于培养皿中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，37℃，5%CO2，培养24小时后，加入化合物3，控制其终浓度分别为10、50、100 μg/ml，37℃孵育3 h，结束后，吸去培养液，用PBS清洗，加入500 μl硝酸硝解70°C加热24小时，0.22 μm滤头过滤后，ICP-MS测定不同浓度溶液的硼含量，结果见图4，10 μg/ml硼药在细胞的硼含量是46.85 ng，且硼含量随着硼药浓度不断上升。
（2）参照（1）的培养方法，取化合物3加入到培养24小时的B16F10细胞中，控制其终浓度为50 μg/ml，分别37℃培养1h，2h，4h，ICP-MS检测硼药在不同时间点对细胞的结合作用，结果见图5，随着培养时间不断延长，细胞内的硼含量不断上升，证明该化合物能快速被细胞吸收。
实施例7 具有双重靶向硼药制剂BNCT的药物毒性结果
本实验以B16F10（小鼠黑色素瘤细胞）为研究对象，对比市售BPA，研究硼药制剂的细胞毒性。
将3000个B16F10细胞接种于96孔板中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于培养箱中，37℃，5%CO2培养24小时后，加入不同浓度的化合物3和BPA（终浓度分别为0,10, 50, 100, 200, 300 μg/ml），孵育24h后，加入10 μl CCK8试剂，2 h后酶标仪检测450nm的吸光值。
结果如图6所示，实验结果证明，市售BPA和化合物3对B16F10细胞的存活率的影响无显著性差异，且药物浓度在100μg /ml以下时，细胞的存活率无显著变化。
实施例8 具有双重靶向硼药制剂BNCT照射后的CCK8实验结果
本实验以B16F10（小鼠黑色素瘤细胞）为研究对象，研究硼药制剂的放射治疗效果。
将1×106个B16F10细胞接种于0.2 ml离心管中，并加入不同浓度的化合物3和BPA（终浓度分别为10, 50, 100 μg/ml），随后将离心管置于BNCT中子照射仪模具中进行中子束照射（功率为3kW），2小时后，将1×103个经过照射处理的B16F10细胞分别接种于96孔板中，孵育48 h后，加入10 μl CCK8试剂，2 h后酶标仪检测450 nm的吸光值，结果如图7所示，经过照射后，化合物3组中细胞活性的降低程度明显提高，证明该化合物相较BPA的治疗效果有显著提升。
实施例9 具有双重靶向硼药制剂给药处理2h后小鼠各部位的硼含量检测
本实验选用C57小鼠，于裸鼠右侧腋窝处皮下注射接种1×106个B16F10细胞，一周后成瘤，随机分成两组，每组4只，对其尾静脉注射化合物3（注射量为100mg/kg，药物浓度为30mg/ml，单次注射）后，分别在2 h处死并取出各小鼠的肿瘤、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、肌肉、骨、脑和血，利用ICP-MS检测各组织的硼含量。结果如图8～9所示，药物尾静脉注射2 h后，肿瘤硼含量是24.45 μg/g ， 2 h 后T/N比（肿瘤吸收的硼与正常组织的硼浓度比）是17.46，2 h后T/B比（肿瘤对血液的硼浓度比）是2.97，实验结果证明该化合物能够有效被肿瘤组织吸收，且能够在肿瘤组织内滞留，具有良好的应用前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种双重靶向高水溶性小分子硼药，其特征在于结构通式如下：
；
其中，R基团为葡萄糖衍生物中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的双重靶向高水溶性小分子硼药，其特征在于R基团为式I～IV中的至少一种：
。
3.根据权利要求1所述的双重靶向高水溶性小分子硼药，其特征在于：
所述的双重靶向高水溶性小分子硼药，其中的B为10B。
4.权利要求1～3任一所述的双重靶向高水溶性小分子硼药的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）称取BPA溶于溶剂，随后加入NaOH，然后边搅拌边滴加二碳酸二叔丁酯溶液，惰性气氛下室温搅拌反应，反应结束后，分离纯化获得化合物1；
（2）称取7-(BOC-氨基)庚酸和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐，加入溶剂搅拌溶解，然后加入N,N-二异丙基乙胺，搅拌反应，随后加入葡萄糖衍生物，继续搅拌反应，随后加入三氟乙酸，继续搅拌反应，反应结束后，旋蒸去除溶剂，分离纯化得到化合物R；
（3）称取化合物1和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐，加入溶剂搅拌溶解，然后加入N,N-二异丙基乙胺，搅拌反应，随后加入化合物R，继续搅拌反应，随后加入三氟乙酸，继续搅拌反应，反应结束后，旋蒸去除溶剂，分离纯化，得到双重靶向高水溶性小分子硼药。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
步骤（1）所述的BPA与二碳酸二叔丁酯的质量比为100：2～5；
步骤（1）所述的BPA与NaOH的质量比为3～10：1；
步骤（2）所述的7-(BOC-氨基)庚酸、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺和葡萄糖衍生物的质量比为2～7：5～12：10～20：10～20；
步骤（2）所述的三氟乙酸与7-(BOC-氨基)庚酸质量的质量比为1～5：100；
步骤（3）所述的化合物1、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺和化合物R的质量比为1～3：4～6：5～10：5～10。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
步骤（2）所述的葡萄糖衍生物包括2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖、3-氨基-3-脱氧-D-葡萄糖、6-氨基-6-脱氧-D-吡喃葡萄糖和4-氨基苯基-D-吡喃葡萄糖苷中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
步骤（1）所述的溶剂为有机溶剂；
步骤（1）所述的二碳酸二叔丁酯溶液的溶剂为有机溶剂；
步骤（1）所述的惰性气氛为氩气气氛；
步骤（1）所述的反应的时间为10～20h；
步骤（2）所述的溶剂为有机溶剂；
步骤（2）中第一次搅拌反应的条件为室温下反应30～90min；
步骤（2）中第二次搅拌反应的条件为室温下反应10～15h；
步骤（2）中第三次搅拌反应的条件为室温下反应1～3h；
步骤（3）所述的溶剂为有机溶剂；
步骤（3）中第一次搅拌反应的条件为室温下反应1～3h；
步骤（3）中第二次搅拌反应的条件为室温下反应20～30h；
步骤（3）中第三次搅拌反应的条件为室温下反应4～10h。
8.权利要求1～3任一所述的双重靶向高水溶性小分子硼药在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
9.权利要求1～3任一所述的双重靶向高水溶性小分子硼药在制备用于治疗肿瘤的硼中子俘获治疗药物中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：
所述肿瘤包括恶性黑色素瘤、头颈部鳞癌、神经脑胶质瘤、鼻咽癌、乳腺癌中的至少一种。
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