CN117169181A - 一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂及其代谢产物量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂及其代谢产物量的方法，涉及肿瘤治疗技术领域，包括由硼化合物和运送载体构成。本发明采用提供的硼递送剂，硼化合物运送载体是铁蛋白纳米颗粒，其受体TfR1是肿瘤标志分子，所以铁蛋白具有直接靶向过表达TfR1受体的肿瘤细胞和肿瘤组织的特性，可以富集到肿瘤组织内，其它组织和器官分布量少，铁蛋白纳米颗粒表面还有许多修饰位点，通过肿瘤靶向分子修饰，可以提高其肿瘤靶向性，实现硼化合物在肿瘤组织内的高浓度富集，铁蛋白纳米载体理化性质稳定，不易变性，对外部环境耐受性强，适用范围广，制备的产品货架期长。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂及其代谢产物量的方法。
背景技术
硼中子俘获治疗(boronneutroncapturetherapy,BNCT)是一种可以选择性杀死肿瘤细胞的放射疗法，与肿瘤细胞具有特异性亲和力的硼递送剂进入人体后，会选择性富集到肿瘤细胞中，非放射性同位素10B俘获低能热中子(0.025eV)后发生核裂变反应产生α粒子(4He)和反冲锂核-7(7Li)，由于产生高线性能量转移可以杀死肿瘤细胞。α粒子的路径长度(5～9μm，近似一个细胞直径)很短，其破坏作用仅限于含硼的细胞，不影响相邻的正常细胞，因而对肿瘤周边组织的破坏较小。因此，BNCT是一种二元、细胞尺度、强靶向性与高传能线密度的放射疗法，是实现精准放射治疗的最佳手段之一。2020年3月，世界上第一台加速器BNCT设备正式获得日本厚生劳动省的批准，并已经开始接收患者治疗，这是硼中子俘获疗法在世界上首次正式进入临床应用。2020年8月13日，中国科学院高能物理研究所召开专家评审会，我国首台加速器BNCT实验装置成功通过评审，并启动首轮细胞实验和小动物实验，为开展临床试验做好了前期技术准备。因此，BNCT有望快速成为恶性肿瘤治疗的一线治疗手段。
例如公开号为CN114259563B中国专利公开了一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂及其代谢产物量的方法。只是解决了4-二羟基硼基苯丙氨酸(BPA)、十一氢巯基十二硼化钠(BSH)是目前仅有的两种获批在临床上使用的硼化合物，虽然具有较好的治疗效果，但是肿瘤靶向性较低，因此设计和开发具有更高肿瘤特异性的新型硼递送剂是提高肿瘤靶向性的关键的问题。
针对现有技术存在以下问题：
在对于肝脏对药物代谢和解毒至关重要，硼输送剂在该器官的任何积聚都可能对肝功能和毒性产生重大影响，检测和量化肿瘤患者肝脏中硼递送剂及其代谢产物量的方法的开发可以为优化硼中子捕获治疗的疗效和安全性提供有价值的信息检测的问题；硼递送剂在利用荷瘤小鼠肝组织中的积聚证明了与硼中子捕获治疗相关的潜在风险，特别是在肝脏中，这强调了需要进一步研究受硼递送剂及其代谢物掺入影响的特定蛋白质和细胞过程，开发策略以最大限度地降低肝脏和其他器官中硼中子捕获治疗的潜在风险；铁蛋白硼递送剂具有肿瘤靶向、理化性质不稳定、硼化合物装载方法复杂、生物相容性不高、分散性不高、粒径均一不高的问题。
发明内容
本发明提供一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂及其代谢产物量的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂及其代谢产物量的方法，包括由硼化合物和运送载体构成，运送载体为铁蛋白纳米颗粒，铁蛋白包括马脾铁蛋白、植物铁蛋白、原核微生物表达铁蛋白H链、真核微生物表达铁蛋白H链及其它来源的铁蛋白。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述硼化合物包括4-二羟基硼基苯丙氨酸BPA、十一氢巯基十二硼化钠BSH及其它含硼化合物。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述由硼化合物和运送载体构成，运送载体为铁蛋白纳米颗粒，铁蛋白为酵母菌表达的铁蛋白H链，分子量2.5kD，硼化合物为4-二羟基硼基苯丙氨酸BPA。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述苯丙氨酸非常相似的BPA可能被细胞膜表面的L型氨基酸转运蛋白1(LAT-1)大量摄取并进入正常肝细胞，LAT-1被认为是BPA的结合和主要摄取位点，向肝正常细胞wrl-68细胞在含BPA-Naph(20μM)的培养基中培养不同时间(0、3和6小时)，而后以PBS洗去小分子化合物，以PBS将其重悬并置于荧光显微镜下观察。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述BPA-Naph和Biotin-VD有潜力作为监测工具来研究硼传递剂在细胞中的分布，并作为治疗癌症的靶向硼传递剂。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述将两种反应物(BPA和生物素邻二醇，生物素VD)在具有等量和浓度物质的缓冲溶液中均匀混合，并在不同时间点分离和测试，两种反应物的吸收峰面积的减少和产物峰的吸收峰的增加表明BPA和生物素VD之间的反应可以在生理条件下快速有效地发生。
本发明技术方案的进一步改进在于：所述使用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对所有细胞进行染色，确定其位置，并确认BPA Naph的分布。在肝组织中观察到绿色荧光表明BPA稳定存在，这与之前在细胞模型中的观察结果一致，是最直观的证据。我们立即切除经过BPA干预的荷瘤小鼠的肝脏，提取其蛋白质，使其变性，然后用生物素VD捕获苯基硼酸酯基团，采用与之前相同的治疗方法。
本发明技术方案的进一步改进在于：包括步骤：
(1)铁蛋白溶于pH为7.4Tris-HCl缓冲液，缓慢加入0.1MHCl溶液调pH至2.0；
(2)硼化合物溶于pH为7.4的Tris-HCl缓冲液，加入乙腈调节硼化合物溶解度，制成硼化合物溶液；
(3)步骤(2)中硼化合物溶液缓慢加入铁蛋白溶液中，添加乙腈至终浓度10.0％(v/v)，室温下搅拌2h，向溶液中缓慢加入0.1MNaOH溶液调pH至9.0，在冰箱中静置2h；
(4)BPA溶于pH为7.4的Tris-HCl缓冲液，加入乙腈调节BPA溶解度；
(5)BPA溶液缓慢加入铁蛋白溶液中，添加乙腈至终浓度10.0％(v/v)，室温下搅拌2h，向溶液中缓慢加入0.1MNaOH溶液调pH至9.0，在冰箱中静置2h；
(6)步骤(3)中溶液在pH为9.0的Tris-HCl缓冲液中透析，截留分子量为7.0kD，12小时后更换为pH9.0的Tris-HCl缓冲液透析液，在冰箱中继续透析48h，得到硼化合物-铁蛋白纳米颗粒。
本发明技术方案的进一步改进在于：步骤(2)中硼化合物装载量为1.0～6.0wt％，步骤(2)中硼化合物装载量为2.0～5.0wt％。
由于采用了上述技术方案，本发明相对现有技术来说，取得的技术进步是：
1、本发明提供一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂及其代谢产物量的方法，采用提供的硼递送剂，硼化合物运送载体是铁蛋白纳米颗粒，其受体TfR1是肿瘤标志分子，所以铁蛋白具有直接靶向过表达TfR1受体的肿瘤细胞和肿瘤组织的特性，可以富集到肿瘤组织内，其它组织和器官分布量少，铁蛋白纳米颗粒表面还有许多修饰位点，通过肿瘤靶向分子修饰，可以提高其肿瘤靶向性，实现硼化合物在肿瘤组织内的高浓度富集，铁蛋白纳米载体理化性质稳定，不易变性，对外部环境耐受性强，适用范围广，制备的产品货架期也长，可以耐受高浓度变性剂和70～80℃的高温而不变性，物装载方法简单。
2、本发明提供一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂及其代谢产物量的方法，采用在短时间内，细胞表现出强烈的荧光，随着时间的推移，荧光迅速减少，但仍保持可观察和清晰，在用PBS多次洗涤后，对细胞中残留荧光的观察表明，BPA可能已经内化到细胞中和/或代谢为保留在细胞内的其他形式，突出了研究BPA和其他硼递送剂在细胞中的代谢命运的重要性，以了解其潜在的长期毒性和对细胞功能的影响。
3、本发明提供一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂及其代谢产物量的方法，采用pH变复变方法就可以装载硼试剂，调节铁蛋白溶液pH至2.0，蛋白壳结构会发生解体，当pH恢复到7.0以上时解体的蛋白亚基又能重新组装成完整的铁蛋白，从而将共混的硼化合物包封在铁蛋白纳米颗粒核中。
附图说明
图1为本发明的BPA与生物素VD反应示意图；
图2为本发明的荧光示踪探针在细胞反应结构示意图；
图3为本发明的荧光显微镜下观察结构示意图；
图4为本发明的加入反应SDS结构示意图；
图5为本发明的合成结构示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：
实施例1
如图1-5所示，本发明提供了一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂及其代谢产物量的方法，包括由硼化合物和运送载体构成，运送载体为铁蛋白纳米颗粒，铁蛋白包括马脾铁蛋白、植物铁蛋白、原核微生物表达铁蛋白H链、真核微生物表达铁蛋白H链及其它来源的铁蛋白。
在本实施例中，通过铁蛋白是良好的抗肿瘤药物靶向递送系统，由蛋白质外壳和铁内核组成，蛋白质外壳由24个亚基自组装形成，每3个亚基组成一个三聚体亚单位，8个三聚体亚单位再组装成球形空心笼状结构，内径和外径分别为8nm和12nm，铁内核处于笼状结构中心，可以存储4500个铁离子。清除内核中铁离子得到的铁蛋白外壳可以装载金属离子及小分子药物成为纳米药物递送系统。铁蛋白的受体TfR1是肿瘤标志分子，并且TfR1受体的过度表达与肿瘤恶性程度正相关，所以铁蛋白具有直接靶向过表达TfR1受体的肿瘤细胞和肿瘤组织的特性。铁蛋白纳米颗粒表面还有许多修饰位点，通过物理化学改性与修饰，可以在时间、空间及剂量上调控药物在生物体内的分布，实现控制药物释放、靶向递送药物、增强药物稳定性和调节药物在体内循环时间等目的，提高药物利用率和疗效，降低对正常组织的毒副作用，除了靶向性能，铁蛋白还具有独特的物理和化学性质：(1)铁蛋白对pH敏感，在pH2.0的酸性条件下蛋白壳结构会发生解体，当pH恢复到7.0时解体的蛋白亚基又能重新组装成完整的铁蛋白；(2)铁蛋白非常稳定，能够耐受较高浓度的变性剂，8.0M的脲或6.0M的盐酸胍才能够使蛋白壳完全解聚；(3)铁蛋白能够耐受高温，在70～80℃的高温环境下保持10min以上其天然结构不受影响。
实施例2
如图1-5所示，在实施例1的基础上，本发明提供一种技术方案：优选的，所述硼化合物包括4-二羟基硼基苯丙氨酸BPA、十一氢巯基十二硼化钠BSH及其它含硼化合物，所述由硼化合物和运送载体构成，运送载体为铁蛋白纳米颗粒，铁蛋白为酵母菌表达的铁蛋白H链，分子量2.5kD，硼化合物为4-二羟基硼基苯丙氨酸BPA，所述苯丙氨酸非常相似的BPA可能被细胞膜表面的L型氨基酸转运蛋白1(LAT-1)大量摄取并进入正常肝细胞，LAT-1被认为是BPA的结合和主要摄取位点，向肝正常细胞wrl-68细胞在含BPA-Naph(20μM)的培养基中培养不同时间(0、3和6小时)，而后以PBS洗去小分子化合物，以PBS将其重悬并置于荧光显微镜下观察。
在本实施例中，通过(图1、图2、图3)在含有高浓度BPA(1mM)的培养基中培养癌症细胞，在短时间内，细胞表现出强烈的荧光，随着时间的推移，荧光迅速减少，但仍保持可观察和清晰，在用PBS多次洗涤后，对细胞中残留荧光的观察表明，BPA可能已经内化到细胞中和/或代谢为保留在细胞内的其他形式，这突出了研究BPA和其他硼递送剂在细胞中的代谢命运的重要性，以了解其潜在的长期毒性和对细胞功能的影响，荧光示踪探针在细胞和动物模型组织当中对BPA的定位向肝正常细胞wrl-68细胞在含BPA-Naph(20μM)的培养基中培养不同时间(0、3和6小时)，而后以PBS洗去小分子化合物，以PBS将其重悬并置于荧光显微镜下观察；
将BPA-Naph以0.01mg/kg的量对于荷瘤免疫缺陷小鼠给药(建立胶质瘤模型，使用立体定向固定装置，将5×105个U87细胞在大脑右半球的5μLPBS中进行颅内注射)，尾静脉注射后12小时，取出小鼠的肝组织，立即将其冷冻随后制作冰冻切片，经过dapi染色，在荧光显微镜下观察。
实施例3
如图1-5所示，在实施例1的基础上，本发明提供一种技术方案：优选的，所述BPA-Naph和Biotin-VD有潜力作为监测工具来研究硼传递剂在细胞中的分布，并作为治疗癌症的靶向硼传递剂，所述将两种反应物(BPA和生物素邻二醇，生物素VD)在具有等量和浓度物质的缓冲溶液中均匀混合，并在不同时间点分离和测试，两种反应物的吸收峰面积的减少和产物峰的吸收峰的增加表明BPA和生物素VD之间的反应可以在生理条件下快速有效地发生，所述使用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对所有细胞进行染色，确定其位置，并确认BPA Naph的分布，在肝组织中观察到绿色荧光表明BPA稳定存在，这与之前在细胞模型中的观察结果一致，是最直观的证据。我们立即切除经过BPA干预的荷瘤小鼠的肝脏，提取其蛋白质，使其变性，然后用生物素VD捕获苯基硼酸酯基团，采用与之前相同的治疗方法。
在本实施例中，通过(图3)Biotin-VD捕获插入细胞内蛋白后的BPA将肝正常细胞wrl-68细胞在含BPA(100μM)的培养基中培养2天，随后将其裂解获得细胞裂解液，加入终浓度为1％的SDS使其中蛋白全部变性以避免空间邻二醇的影响，加入Biotin-VD(终浓度20μM)共孵育，经过丙酮沉淀富集蛋白，以WB监测BPA的插入程度，抗体为strepavidin-HRP。
(图4)Biotin-VD捕获动物模型中插入BPA后白蛋白将BPA以0.05mg/kg的量对于荷瘤免疫缺陷小鼠给药(建立胶质瘤模型，使用立体定向固定装置，将5×105个U87细胞在大脑右半球的5μLPBS中进行颅内注射)，尾静脉注射后维持3天，而后取出小鼠的器官组织，加入RIPA buffer(含蛋白酶抑制剂、PMSF)并研碎，合理出组织内蛋白。将这些蛋白加入终浓度为1％的SDS使其中蛋白全部变性，再加入Biotin-VD(终浓度20μM)共孵育，经过丙酮沉淀富集蛋白，并除去体系内过量的Biotin-VD及其他小分子杂质，将这些样品浓度统一至1mg/ml，每个样品均吸取1μl，点在PVDF膜上，送入烘箱彻底烘干，以TBST浸润，再以10％脱脂牛奶封闭，再以TBST洗膜，然后加入streptavidin-HRP孵育膜，最后经过TBST洗膜，以发光液对其进行曝光，来监测BPA的插入程度。
实施例4
如图1-5所示，在实施例1的基础上，本发明提供一种技术方案：优选的，包括步骤：
(1)铁蛋白溶于pH为7.4Tris-HCl缓冲液，缓慢加入0.1MHCl溶液调pH至2.0；
(2)硼化合物溶于pH为7.4的Tris-HCl缓冲液，加入乙腈调节硼化合物溶解度，制成硼化合物溶液；
(3)步骤(2)中硼化合物溶液缓慢加入铁蛋白溶液中，添加乙腈至终浓度10.0％(v/v)，室温下搅拌2h，向溶液中缓慢加入0.1MNaOH溶液调pH至9.0，在冰箱中静置2h；
(4)BPA溶于pH为7.4的Tris-HCl缓冲液，加入乙腈调节BPA溶解度；
(5)BPA溶液缓慢加入铁蛋白溶液中，添加乙腈至终浓度10.0％(v/v)，室温下搅拌2h，向溶液中缓慢加入0.1MNaOH溶液调pH至9.0，在冰箱中静置2h；
(6)步骤(3)中溶液在pH为9.0的Tris-HCl缓冲液中透析，截留分子量为7.0kD，12小时后更换为pH9.0的Tris-HCl缓冲液透析液，在冰箱中继续透析48h，得到硼化合物-铁蛋白纳米颗粒。
同步步骤(2)中硼化合物装载量为1.0～6.0wt％，步骤(2)中硼化合物装载量为2.0～5.0wt％
在本实施例中，通过(1)铁蛋白溶于pH为7.4的Tris-HCl缓冲液，缓慢加入0.1MHCl溶液调pH至2.0；
(2)BPA溶于pH为7.4的Tris-HCl缓冲液，加入乙腈调节BPA溶解度；
(3)BPA溶液缓慢加入铁蛋白溶液中，添加乙腈至终浓度10.0％(v/v)，室温下搅拌2h，向溶液中缓慢加入0.1MNaOH溶液调pH至9.0，在冰箱中静置2h；
(4)上述溶液在pH为9.0的Tris-HCl缓冲液中透析，截留分子量为7.0kD，12小时后更换pH9.0的Tris-HCl缓冲液透析液，在冰箱中继续透析48h，得到BPA-铁蛋白纳米颗粒。
3、实验结果
(1)铁蛋白纳米颗粒粒径：10.5±0.9nm；BPA-铁蛋白纳米颗粒粒径：12.7±1.3nm。
(2)BPA包封率：80.4±4.1％，装载量：3.98±2.2％。
实施例4铁蛋白硼递送剂体内肿瘤靶向实验[0 057]1、铁蛋白硼递送剂制备
(1)大肠杆菌表达铁蛋白H链溶于pH为7.4的Tris-HCl缓冲液，缓慢加入0.1MHCl溶液调pH至2.0；
(2)BPA溶于pH为7.4的Tris-HCl缓冲液，加入乙腈调节BPA溶解度；
(3)BPA溶液缓慢加入铁蛋白溶液中，添加乙腈至终浓度10.0％(v/v)，室温下搅拌2h，加入吲哚菁绿ICG作为近红外成像试剂，向溶液中缓慢加入0.1MNaOH溶液调pH至9.0，在冰箱中静置2h；
(4)上述溶液在pH为9.0的Tris-HCl缓冲液中透析，截留分子量为7.0kD，12小时后更换pH9.0的Tris-HCl缓冲液透析液，在冰箱中继续透析48h，得到BPA-ICG-铁蛋白纳米颗粒。
2、U87裸鼠肿瘤模型构建：
10.0％FBS的DMEM培养基培养U87细胞，对数期U87细胞使用含10.0％matrigel的生理盐水稀释至细胞密度为5×106/mL，冰浴、无菌条件下注射100.0μL细胞悬液于裸鼠侧腹皮下注射接种肿瘤细胞。裸鼠饲养10～15天后，U87细胞迅速生长形成直径在4.0～10.0mm的肿瘤，完成裸鼠肿瘤模型构建。
3、小动物近红外成像考察铁蛋白硼递肿瘤靶向性能：
当肿瘤体积增长至100.0～200.0mm3，荷瘤小鼠尾静脉注射200.0μL硼递送剂溶液，小动物活体成像仪CRiMeastro实时成像观察，成像仪参数ex:735nm；em：805nm；每10nm收集780-900nm发射。
4、实验结果：
(1)铁蛋白纳米颗粒粒径：11.5±1.8nm；BPA-ICG-铁蛋白纳米颗粒粒径：13.2±2.1nm。
(2)BPA包封率：79.2±5.7％，装载量：4.27±3.5％；
ICG包封率：70.7±3.1％，装载量：1.52±1.1％。
铁蛋白硼递体内肿瘤靶向性能。
综合(图5)中的合成说明
3的合成：
将1(12g，0.049mol)，2(5g，0.049mol)加入乙醇(50mL)中，回流过夜，TLC反应完全，冷却，过滤，干燥的：13g。
5的合成：
将3(3g,0.01mol)，4(5g,0.03mol),DIEA(7.8g,0.06mol)加入NMP(10mL)中，90℃过夜，TLC反应完全，倾入水中，DCM萃取，干燥，过柱得：0.4g。
7的合成：
将5(0.4g,0.97mmol)，3-胺基-1，2-丙二醇(0.5g,0.0048mol),HBTU(0.45g,1.16mmol)加入DMF(10ml)中，rt过夜，TLC检测反应完全，加水，DCM萃取，干燥，过柱得：0.4g。
9的合成：
将7(6.6mg,0.013mmol)，BPA，即化合物8(2.6mg,0.013mmol)，加入DMF(1ml)中，rt过夜，旋干得：0.015g
综上，如图1-5所示，铁蛋白是良好的抗肿瘤药物靶向递送系统，由蛋白质外壳和铁内核组成，蛋白质外壳由24个亚基自组装形成，每3个亚基组成一个三聚体亚单位，8个三聚体亚单位再组装成球形空心笼状结构，内径和外径分别为8nm和12nm，铁内核处于笼状结构中心，可以存储4500个铁离子。清除内核中铁离子得到的铁蛋白外壳可以装载金属离子及小分子药物成为纳米药物递送系统。铁蛋白的受体TfR1是肿瘤标志分子，并且TfR1受体的过度表达与肿瘤恶性程度正相关，所以铁蛋白具有直接靶向过表达TfR1受体的肿瘤细胞和肿瘤组织的特性。铁蛋白纳米颗粒表面还有许多修饰位点，通过物理化学改性与修饰，可以在时间、空间及剂量上调控药物在生物体内的分布，实现控制药物释放、靶向递送药物、增强药物稳定性和调节药物在体内循环时间等目的，提高药物利用率和疗效，降低对正常组织的毒副作用，除了靶向性能，铁蛋白还具有独特的物理和化学性质：(1)铁蛋白对pH敏感，在pH2.0的酸性条件下蛋白壳结构会发生解体，当pH恢复到7.0时解体的蛋白亚基又能重新组装成完整的铁蛋白；(2)铁蛋白非常稳定，能够耐受较高浓度的变性剂，8.0M的脲或6.0M的盐酸胍才能够使蛋白壳完全解聚；(3)铁蛋白能够耐受高温，在70～80℃的高温环境下保持10min以上其天然结构不受影响，(图1、图2、图3)在含有高浓度BPA(1mM)的培养基中培养癌症细胞，在短时间内，细胞表现出强烈的荧光，随着时间的推移，荧光迅速减少，但仍保持可观察和清晰，在用PBS多次洗涤后，对细胞中残留荧光的观察表明，BPA可能已经内化到细胞中和/或代谢为保留在细胞内的其他形式，这突出了研究BPA和其他硼递送剂在细胞中的代谢命运的重要性，以了解其潜在的长期毒性和对细胞功能的影响，荧光示踪探针在细胞和动物模型组织当中对BPA的定位向肝正常细胞wrl-68细胞在含BPA-Naph(20μM)的培养基中培养不同时间(0、3和6小时)，而后以PBS洗去小分子化合物，以PBS将其重悬并置于荧光显微镜下观察；将BPA-Naph以0.01mg/kg的量对于荷瘤免疫缺陷小鼠给药(建立胶质瘤模型，使用立体定向固定装置，将5×105个U87细胞在大脑右半球的5μLPBS中进行颅内注射)，尾静脉注射后12小时，取出小鼠的肝组织，立即将其冷冻随后制作冰冻切片，经过dapi染色，在荧光显微镜下观察，(图3)Biotin-VD捕获插入细胞内蛋白后的BPA将肝正常细胞wrl-68细胞在含BPA(100μM)的培养基中培养2天，随后将其裂解获得细胞裂解液，加入终浓度为1％的SDS使其中蛋白全部变性以避免空间邻二醇的影响，加入Biotin-VD(终浓度20μM)共孵育，经过丙酮沉淀富集蛋白，以WB监测BPA的插入程度，抗体为strepavidin-HRP，(图4)Biotin-VD捕获动物模型中插入BPA后的蛋白将BPA以0.05mg/kg的量对于荷瘤免疫缺陷小鼠给药(建立胶质瘤模型，使用立体定向固定装置，将5×105个U87细胞在大脑右半球的5μL PBS中进行颅内注射)，尾静脉注射后维持3天，而后取出小鼠的器官组织，加入RIPAbuffer(含蛋白酶抑制剂、PMSF)并研碎，分离出组织内蛋白。将这些蛋白加入终浓度为1％的SDS使其中蛋白全部变性，再加入Biotin-VD(终浓度20μM)共孵育，经过丙酮沉淀富集蛋白，将这些样品浓度统一至1mg/ml，每个样品均吸取1μl，点在PVDF膜上，送入烘箱彻底烘干，以TBST浸润，再以10％脱脂牛奶封闭，再以TBST洗膜，然后加入streptavidin-HRP孵育膜，最后经过TBST洗膜，以发光液对其进行曝光，来监测BPA的插入程度。
上文一般性的对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对于技术领域的一般技术人员是显而易见的。因此，在不脱离本发明思想精神的修改或改进，均在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂，其特征在于：由硼化合物和运送载体构成，运送载体为铁蛋白纳米颗粒，铁蛋白包括马脾铁蛋白、植物铁蛋白、原核微生物表达铁蛋白H链、真核微生物表达铁蛋白H链及其它来源的铁蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂，其特征在于：所述硼化合物包括4-二羟基硼基苯丙氨酸BPA、十一氢巯基十二硼化钠BSH及其它含硼化合物。
3.根据权利要求2所述的一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂，其特征在于：所述由硼化合物和运送载体构成，运送载体为铁蛋白纳米颗粒，铁蛋白为酵母菌表达的铁蛋白H链，分子量2.5kD，硼化合物为4-二羟基硼基苯丙氨酸BPA。
4.根据权利要求1所述的一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂，其特征在于：苯丙氨酸非常相似的BPA可能被细胞膜表面的L型氨基酸转运蛋白1(LAT-1)大量摄取并进入正常肝细胞，LAT-1被认为是BPA的结合和主要摄取位点，向肝正常细胞wrl-68细胞在含BPA-Naph(20μM)的培养基中培养不同时间(0、3和6小时)，而后以PBS洗去小分子化合物，以PBS将其重悬并置于荧光显微镜下观察。
5.根据权利要求1所述的一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂，其特征在于：BPA-Naph和Biotin-VD有潜力作为监测工具来研究硼传递剂在细胞中的分布，并作为治疗癌症的靶向硼传递剂。
6.一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂的代谢产物量，由权利要求1-5任意一项，所述的一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂，其特征在于：将两种反应物(BPA和生物素邻二醇，生物素VD)在具有等量和浓度物质的缓冲溶液中均匀混合，并在不同时间点分离和测试，两种反应物的吸收峰面积的减少和产物峰的吸收峰的增加表明BPA和生物素VD之间的反应可以在生理条件下快速有效地发生。
7.根据权利要求6所述的一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂的代谢产物量，其特征在于：使用6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对所有细胞进行染色，确定其位置，并确认BPA Naph的分布，在肝组织中观察到绿色荧光表明BPA稳定存在，这与之前在细胞模型中的观察结果一致，是最直观的证据，我们立即切除经过BPA干预的荷瘤小鼠的肝脏，提取其蛋白质，使其变性，然后用生物素VD捕获苯基硼酸酯基团，采用与之前相同的治疗方法。
8.一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂代谢产量的方法，由权利要求1-5任意一项，所述的一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂，其特征在于：包括步骤：
(1)铁蛋白溶于pH为7.4Tris-HCl缓冲液，缓慢加入0.1MHCl溶液调pH至2.0；
(2)硼化合物溶于pH为7.4的Tris-HCl缓冲液，加入乙腈调节硼化合物溶解度，制成硼化合物溶液；
(3)步骤(2)中硼化合物溶液缓慢加入铁蛋白溶液中，添加乙腈至终浓度10.0％(v/v)，室温下搅拌2h，向溶液中缓慢加入0.1MNaOH溶液调pH至9.0，在冰箱中静置2h；
(4)BPA溶于pH为7.4的Tris-HCl缓冲液，加入乙腈调节BPA溶解度；
(5)BPA溶液缓慢加入铁蛋白溶液中，添加乙腈至终浓度10.0％(v/v)，室温下搅拌2h，向溶液中缓慢加入0.1MNaOH溶液调pH至9.0，在冰箱中静置2h；
(6)步骤(3)中溶液在pH为9.0的Tris-HCl缓冲液中透析，截留分子量为7.0kD，12小时后更换为pH9.0的Tris-HCl缓冲液透析液，在冰箱中继续透析48h，得到硼化合物-铁蛋白纳米颗粒。
9.根据权利要求8所述的一种检测肿瘤患者肝脏中硼递送剂代谢产量的方法，其特征在于：步骤(2)中硼化合物装载量为1.0～6.0wt％，步骤(2)中硼化合物装载量为2.0～5.0wt％。
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