CN110290816A - 用于靶向施用的放射性标记材料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含聚合物、放射性同位素和固定剂的放射性标记材料，其中所述固定剂能够将所述放射性同位素固定在所述聚合物上或所述聚合物中，并且其中所述固定剂是包含具有多个侧基式金属螯合侧链的聚阳离子的大分子。本发明还涉及一种用于制备放射性标记材料的方法、放射性标记材料用于制备用于治疗癌症和/或用于辐射成像的药物的用途以及放射性标记材料在治疗癌症中的用途。还描述固定剂用于将放射性同位素固定在聚合物上或聚合物中的用途。

Description

用于靶向施用的放射性标记材料
技术领域
本发明涉及放射性标记材料、诸如用于医疗应用的放射性标记聚合物的制备。特别地，本发明涉及放射性标记材料在局部和靶向放射治疗以及在放射性成像中的用途。
背景技术
放射性材料的局部施用可用作癌症、并且尤其是难以单独通过外科手术成功治疗的癌症的治疗方法。放射性材料被并入到直接植入到癌症中的诸如微颗粒、种子和导线的装置中。
选择性内放射(SIRT)是涉及将放射性材料的微球注射到供给肿瘤的动脉中的形式的放射治疗。
例如，基于树脂的(是Sirtex SIR-Spheres Pty有限公司的注册商标)微球承载90Y同位素并且用于SIRT。在肝癌治疗中具有特定应用。90Y非常适用于β辐射治疗，因为肿瘤细胞在1mm至2mm的半径内被杀死。然而，β辐射成像非常差。韧致辐射成像(其使用当β衰变期间产生的颗粒被组织中的其他带电颗粒偏转时的减速和随后的动能损失产生的光子)并不非常准确，因为它不是同位素所实际存在的地方的真实表示并且给出分辨率差的图像。因此，可能难以探知放射是否被成功地递送到靶器官以及达到何种程度。
已在肝癌治疗中具有特定应用。仍然需要将放射性同位素靶向施用到其他靶器官以用于治疗性和成像应用两者。
肺癌是所有癌症中最具攻击性中的一种，其具有仅大约10％的5年存活率。外科手术在肺癌患者中并不常见，并且虽然存在多种可用的化学疗法，但是仍然需要用于肺癌的改进疗法。若干种其他类型的癌症转移到肺，从而为对于肺癌的改进治疗的需要提供另一个原因。然而，由于缺少成像特性而并不特别适用于肺癌治疗，如以上所讨论的。另外，90Y是一种非常高能量的同位素，其并不如同对于肝一样适用于肺。肺比肝对于放射更具敏感性，其具有一定的损伤后再生能力。
在WO 2009/129577中，显示施用聚-D-赖氨酸(PDL)包衣的Tc-99m纳米颗粒(FibrinLite)是在肺的血管网络中产生放射性标记物的特异性积累、从而实现所述网络的成像的有效方式。聚-D-赖氨酸治疗的Tc-99mFibrinLite是用于肺诊断/预后的靶向成像剂的实例。然而，这些聚-D-赖氨酸包衣的Tc-99m纳米颗粒不适于治疗性应用，因为Tc-99m仅适于γ成像技术。另外，PDL包衣的FibrinLite纳米颗粒仅在肺中保留大约3小时的半衰期。虽然3小时的半衰期对于成像剂是足够的，但是对于治疗性应用，需要放射性标记材料在肺中保留更长的时间段以提供辐射的治疗剂量。
仍然需要将放射性标记物在肺中保留更长的时间以便递送β辐射的治疗剂量的替代性放射性标记物和手段。此外，使用的颗粒一定不能产生影响呼吸的栓塞或闭塞。
现有的治疗还产生以下问题。
放射性元素经常具有短半衰期，并且制造放射性材料与向患者施用之间消逝的时间可能导致显著的活性丧失。这进而导致与放射性材料的制造和向医院和患者运输相关联的高成本。
放射性核素在装置上的不完全保留可能导致放射性核素的浸出和向非靶器官的非预期散播。因此，希望在辐射的给药期间具有尽可能的最大控制，以便优先于向健康组织而向靶器官递送辐射。
放射性材料经常仅可容纳一种特定的放射性元素而非两种或更多种放射性元素，这可能限制治疗方案的多用性。
因此，本发明的目标在于提供一种用于癌症、特别是肺癌的治疗的放射性标记材料，其克服以上问题中的一种或多种。特别地，希望开发一种可更准确地预测治疗性微球的随后器官分布的方法。此外，如果施用治疗性微球，则希望具有用于确定在患者体内辐射暴露的精确部位以便确定治疗的有效性和未来治疗的必要性的可靠方法。
发明内容
在本发明的第一方面，提供一种放射性标记材料，其包含：
(i)聚合物；
(ii)放射性同位素；以及
(iii)固定剂；
其中所述聚合物是包含阴离子取代基团的阳离子交换树脂；并且
其中所述固定剂能够将所述放射性同位素固定在所述聚合物上或所述聚合物中，并且其中所述固定剂是包含具有多个侧基式(pendant)金属螯合剂侧链的聚阳离子的大分子。
在本发明的第二方面，提供一种双重放射性标记材料，其包含：
(i)聚合物；
(ii)第一放射性同位素；
(iii)第二放射性同位素；
(iv)第一固定剂；以及
(v)第二固定剂；
其中所述聚合物是包含阴离子取代基团的阳离子交换树脂；并且
其中所述第一固定剂能够将所述第一放射性同位素固定在所述聚合物上或所述聚合物中，并且其中所述第一固定剂是包含具有多个侧基式金属螯合剂侧链的聚阳离子的大分子；并且其中所述第二固定剂能够将所述第二放射性同位素固定在所述聚合物上或所述聚合物中，并且其中所述第二固定剂是包含具有多个侧基式金属螯合剂侧链的聚阳离子的大分子。
在本发明的第三方面，提供一种双重放射性标记材料，其包含：
(i)聚合物；
(ii)第一放射性同位素；
(iii)第二放射性同位素；以及
(iv)固定剂；
其中所述聚合物是包含阴离子取代基团的阳离子交换树脂；并且
其中所述固定剂能够将所述第一放射性同位素和所述第二放射性同位素固定在所述聚合物上或所述聚合物中，并且其中所述固定剂是包含具有多个侧基式金属螯合剂侧链的聚阳离子的大分子。
在本发明的第四方面，提供一种用于制备根据以上第一方面的放射性标记材料的方法，其包括：
(i)将根据以上第一方面的聚合物与根据以上第一方面的固定剂混合；
(ii)任选地洗涤所得的混合物；
(iii)进一步添加根据第一方面的放射性同位素；以及
(iv)任选地洗涤所得的混合物。
所述方法中步骤的以上顺序不具有限制性；步骤的顺序也可以是：
(i)将根据以上第一方面的聚合物与根据以上第一方面的放射性同位素混合；
(ii)任选地洗涤所得的混合物；
(iii)进一步添加根据第一方面的固定剂；以及
(iv)任选地洗涤所得的混合物。
在本发明的第五方面，提供固定剂用于将放射性同位素固定在聚合物上或聚合物中的用途，其中所述固定剂、所述放射性同位素和所述聚合物是根据本发明的第一方面所述。
在本发明的第六方面，提供根据本发明的第一方面的放射性标记材料或本发明的第二方面或第三方面的双重放射性标记材料用于制造用于治疗癌症和/或辐射成像的药物的用途。
在本发明的第七方面，提供一种对患者进行放射治疗的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的第一方面的放射性标记材料或本发明的第二方面或第三方面的双重放射性标记材料。
在一个实施方案中，所述放射治疗是针对肺的内放射治疗。例如，所述放射治疗用于治疗原发性和/或转移性肺肿瘤。
在本发明的第六方面，提供一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的根据本发明的第一方面的放射性标记材料或本发明的第二方面或第三方面的双重放射性标记材料。
在一个实施方案中，癌症是原发性肉瘤、原发性或继发性黑素瘤、原发性头颈癌、原发性或继发性脑癌、原发性或继发性肺癌、原发性或继发性肝癌、原发性或继发性乳腺癌、原发性或继发性肾癌(肾癌(renal carcinoma))、原发性或继发性卵巢癌、原发性或继发性前列腺癌或神经内分泌癌。
在一个实施方案中，所述癌症是原发性或继发性肺癌。
在本发明的第七方面，提供一种医疗装置，其包括根据本发明的第一方面的放射性标记材料或本发明的第二方面或第三方面的双重放射性标记材料。
在一个实施方案中，所述医疗装置是微球、种子、支架、导管、导线或晶片。
在本发明的第八方面，提供一种对患者中的医疗程序进行成像的方法，所述方法包括向所述患者施用根据本发明的第一方面的放射性标记材料或本发明的第二方面或第三方面的双重放射性标记材料，以及在受试者中检测所述放射性标记材料或所述双重放射性标记材料。
在一个实施方案中，所述检测包括对所述放射性进行γ相机成像。
附图说明
图1示出基于共价连接到聚-L-鸟氨酸(PLO)的DTPA的聚合物固定剂的表示。PLO主链由左侧具有通过酰胺键连接的DTPA的侧基式取代基的线圈表示。PLO的未取代的氨基基团自由接受质子并且形成如所指示的正电荷。
图2示出针对以不同试剂浓度制备的五种构建体的DTPA与PLO(关于5kD分子量的PLO)的摩尔比。(应注意，5kD PLO聚合物含有43-44个鸟氨酸残基)。
图3示出在与聚苯乙烯磺酸酯微球(1mg)混合之后不同量的荧光标记的DTPA-PLO固定剂的结合产率。
图4示出在静脉内注射177Lu-DPTA-PLO-微球(3mg/kg)之后五具解剖的小鼠尸体的γ相机图像。它们的切除的心脏/肺、肝和脾在图4A中示出。图4B示出在从肺去除心脏之后肺和心脏的γ相机图像。
图5示出在静脉内注射177Lu-DPTA-PLO-微球(3mg/kg)之后肺和骨骼/尸体的注射剂量百分比(％ID)/克组织重量。
图6示出与接受在水中高压灭菌的177Lu-DPTA-PLO-微球配制品的小鼠的肺中存在的活度相比，接受在盐水中高压灭菌的177Lu-DPTA-PLO-微球配制品的小鼠的肺中存在增加的活度水平。
图7示出来自静脉内(通过尾静脉)注射在Hank氏平衡盐溶液中的25000个、50000个或100000个4T1-luc2细胞的小鼠的肺的生物发光通量测量。在注射细胞后第3、6、9和13天测量肺肿瘤生长。向小鼠腹腔内(IP)注射萤光素，并且对小鼠进行麻醉，并且用IVISSpectrum体内成像系统测量肺生物发光。
图8示出来自177Lu-DPTA-PLO-微球的内电离辐射对于小鼠肺4T1-luc2肿瘤的生长的影响。示出两组小鼠的结果；治疗组(177Lu)，其接受177Lu-DTPA-PLO-微球；和阴性对照组(Ctrl)，其接受175Lu-DTPA-PLO-微球。
图9示出使用177Lu-DTPA-PLO-微球延迟小鼠肺4T1-luc2肿瘤的生长的到健康终点的改善存活。
图10示出来自177Lu-DTPA-PLO-微球的三个不同剂量的内电离辐射对于小鼠肺4T1-luc2肿瘤的生长的影响。示出四组小鼠的结果；阴性对照组(Ctrl)，其接受175Lu-DTPA-PLO-微球；和三个治疗组，其接受具有0.82、1.1和1.37MBq的放射性活度的177Lu-DTPA-PLO-微球。
图11示出来自177Lu-DTPA-PLO-微球的内电离辐射对于小鼠肺B16-F10-luc2肿瘤的生长的影响。示出两组小鼠的结果；治疗组(177Lu)，其接受177Lu-DTPA-PLO-微球；和阴性对照组(Ctrl)，其接受175Lu-DTPA-PLO-微球。
图12示出来自暴露于静脉内注射的177Lu-DTPA-PLO-微球24天的正常小鼠的肺的组织学检查。图12示出在40×放大率下来自用苏木精和伊红染色的小鼠的肺组织。一些微球用箭头突出显示，白条示出50微米(μm)。
图13示出暴露于静脉内注射的177Lu-DTPA-PLO-微球5天的具有4T1-luc2肿瘤的小鼠肺的组织学检查。图13示出在40×放大率下来自用苏木精和伊红染色的小鼠的肺组织。一些微球用箭头突出显示。
图14示出5天内静脉内注射的177Lu-DTPA-PLO-微球对于小鼠的全血计数的影响。内放射对于全白细胞计数、淋巴细胞计数和中性粒细胞计数的影响分别在图14A、图14B和图14C中示出。
图15示出来自对5天内由于静脉内注射的177Lu-DTPA-PLO-微球引起的外周血单核细胞(PBMC)的DNA损伤的分析的结果。使用共焦显微镜对分离的PBMC成像，并且用γH2AX(左)和53BP1(右)抗体鉴定DNA损伤灶。
图16示出3个月之后静脉内注射的177Lu-DTPA-PLO-微球对于小鼠的全血计数的影响。内放射对于全白细胞计数、淋巴细胞计数和中性粒细胞计数的影响分别在图16A、图16B和图16C中示出。
图17示出来自对3个月之后由于静脉内注射的177Lu-DTPA-PLO-微球引起的外周血单核细胞(PBMC)的DNA损伤的分析的结果。使用共焦显微镜对分离的PBMC成像，并且用γH2AX(左)和53BP1(右)抗体鉴定DNA损伤灶。
图18示出在麻醉状态下静脉内(通过耳静脉)注射177Lu-DTPA-PLO-微球(3.9mg/kg)的2只兔的γ相机图像。微球直径为8μm并且在5％右旋糖溶液中注射。在处于麻醉状态下时，在注射之后立即以及在注射后1、2和3小时获得γ相机图像。图像的计数乘以50的因数以用于可视化。
图19示出在麻醉状态下静脉内(通过耳静脉)注射177Lu-DTPA-PLO-微球(3mg/kg)的2只兔的γ相机图像。微球直径为8μm并且在盐水中注射。在注射之后立即以及在注射后1、6、12和19天获得γ相机图像，在每种情况下均处于麻醉状态下。图像的计数乘以5的因数以用于可视化。
图20示出在静脉内注射177Lu-DPTA-PLO微球之后在19天时间过程内递送到兔肺、骨骼和肾的注射剂量百分比(％ID)/克组织湿重。
图21示出静脉内注射的177Lu-DTPA-PLO-微球随时间对于小鼠的全血计数的影响。内放射对于全白细胞计数、淋巴细胞计数和中性粒细胞计数的影响分别在图21A、图21B和图21C中示出。
图22示出暴露于静脉内注射的177Lu-DTPA-PLO-微球3个月的兔肺的组织学检查。图13示出在40×放大率下来自用苏木精和伊红染色的兔的肺组织。一只兔具有在整个肺实质内随机分布的小肉芽肿(左)，其在任何其他兔样品中均不存在。一些微球用箭头突出显示。
图23示出在注入177Lu-DTPA-PLO-微球之后切除的具有两个VX2肿瘤的兔肝的γ相机图像。
图24示出在直接肿瘤内注射并暴露4天之后177Lu-DTPA-PLO-微球(1μm；15mg/kg)对于皮下小鼠肿瘤生长的影响。注射之前肿瘤生长8天，并且在肿瘤生长的第8天与第12天之间在腹腔内注射萤光素之后将肿瘤表面积变化测量为来自4T1-luc2细胞的生物荧光面积的变化。对照组接受相同大小和量的非放射性175Lu-DTPA-PLO-微球。
缩写和定义
为了方便起见，在本说明书中使用的以下缩写在以下列出。
如本文所用，术语“SPECT”是单光子发射计算机断层扫描的缩写。
如本文所用，术语“PET”是正电子发射断层扫描的缩写。
如本文所用，术语“CT”是计算机断层扫描的缩写。
如本文所用，术语“MRI”是磁共振成像的缩写。
如本文所用，术语“SIRT”是选择性内放射治疗的缩写。
如本文所用，术语“PDL”是聚-D-赖氨酸的缩写。
如本文所用，术语“PLO”是聚-L-鸟氨酸的缩写。
如本文所用，术语“EDTA”是乙二胺四乙酸的缩写。
如本文所用，术语“DOTA”是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-N,N',N",N'"-四乙酸的缩写。
如本文所用，术语“DTPA”是二乙烯三胺五乙酸的缩写。
如本文所用，术语金属“螯合剂(chelating agent)”或“螯合剂(chelator)”是指与单个中心原子、具体地与放射性同位素形成两个或更多个单独配位键的多齿配体。
如本文所用，术语“治疗有效量”在其含义内包括在本发明中用于提供所需的治疗作用的非毒性但足够量的化合物或组合物。所需的精确量将根据诸如以下的因素而在不同受试者之间变化：所治疗的种类,受试者的年龄、体重和整体状况,共病症,所治疗的病状的严重性,所施用的具体药剂和施用模式等等。因此，对于任何给定的情况，适当的“有效量”可由本领域普通技术人员仅使用常规方法确定。
在本说明书的上下文中，术语“包括”意指“主要包括但是并不一定仅包括”。此外，词语“包括(comprising)”的变型，诸如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”具有对应变化的含义。因此，术语“包括”及其变型以包含性而非排他性的含义使用，使得另外的整数或特征可任选地存在于描述为包括整数A或包括整数A和B等的组合物、方法等中。
在本说明书的上下文中，术语“约”将被理解为指示技术受访者将其与给定值结合起来的一般公差。
在本说明书的上下文中，在对参数规定范围的情况下，将理解，所述参数包括在所规定的范围内的所有值，包括范围的所规定的端值在内。例如，范围“5至10”将被理解为包括值5、6、7、8、9和10以及所规定的范围内的任何子范围，诸如包括6至10、7至10、6至9、7至9等的子范围，并且包括在所规定的范围的情况下合理的整数之间的任何值和范围，诸如5.5、6.5、7.5、5.5至8.5以及6.5至9等。
在本说明书的上下文中，术语“多个”意指多于一个的任何数量。
在其被允许的范围内，本文引用的所用文献均以引用的方式整体并入。
应注意，本文中用于医学的文献将被理解为等同地适用于人类和非人类诸如兽医应用。因此，应理解，除了另外指示的情况，否则对于患者、受试者或个体的提及意指人类或非人类，诸如具有任何种类的社会、经济或研究重要性的个体，包括但不限于兔类动物、绵羊、牛、马、猪、猫、犬、灵长类动物和啮齿动物种类。
相似地，应注意，本文中对于“医疗”装置的提及将被理解为等同地适用于适于在人类和非人类诸如兽医应用中使用的医疗装置。
如本文所用，术语“装置”将被理解为包括可用于治疗(包括实际病状或症状的预防和治疗)的装置，以及可用于诊断(包括在患者的身体上或身体中进行诊断的情况和在从患者的身体获得的样品上进行诊断或用所述样品进行诊断的情况)的那些装置。因此，如其中所用，术语“装置”包括治疗装置和诊断装置。
如本文所用，“诊断”将被理解为包括在疑似疾病或病状的情况下进行的调查程序，诸如用于疾病或病状的初始调查、预后、进展(无论是存在或不存在治疗的情况下)，以及在不存在这种怀疑但需要调查的情况下进行的调查程序，诸如用于健康检查、人群筛查或研究的目的。
具体实施方式
本发明提供一种放射性标记材料，其包含：
(i)聚合物；
(ii)放射性同位素；以及
(iii)固定剂；
其中所述聚合物是包含阴离子取代基团的阳离子交换树脂；并且
其中所述固定剂能够将所述放射性同位素固定在所述聚合物上或所述聚合物中，并且其中所述固定剂是包含具有多个侧基式金属螯合剂侧链的聚阳离子的大分子。
固定剂
固定剂是能够将放射性同位素固定在聚合物上或聚合物内的化合物。在一个实施方案中，固定剂是包含具有多个侧基式金属螯合剂侧链的聚阳离子的大分子。
在一个实施方案中，所述大分子是组织特异性、器官特异性、细胞类型特异性或疾病状态特异性大分子。在一个实施方案中，所述大分子对于肺是特异性的。在一个实施方案中，所述大分子与肺中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)结合。在一个实施方案中，所述大分子是聚阳离子。在一个实施方案中，所述聚阳离子选自聚-D-赖氨酸(PDL)和聚-L-鸟氨酸(PLO)。在一个实施方案中，所述聚阳离子是PDL。在一个实施方案中，所述PDL具有约4kD至约15kD的分子量。在另一个实施方案中，所述聚阳离子是PLO。在一个实施方案中，所述PLO具有约5kD至约15kD的分子量。
所述固定剂优选地是聚阳离子大分子，其包含由PDL或PLO构成以赋予不可由内源性蛋白酶生物降解的优点的多肽主链。优选地，所述聚阳离子大分子具有多肽主链，所述多肽主链具有在沿其长度间隔处共价附接的侧基式侧链，使得存在以2至6个氨基酸残基间隔开的侧基式侧链和在其之间的未经取代的带正电荷的氨基酸侧链。在一个实施方案中，所述聚阳离子沿多肽主链保留足够的带正电荷的氨基酸侧链，以便不影响聚阳离子对于肺中的HSPG的结合亲和力。
优选地，共价附接的侧基式侧链包含金属螯合剂。
在一个实施方案中，固定剂是具有金属螯合剂的多个共价连接侧链的聚阳离子。在一个实施方案中，固定剂是具有金属螯合剂的多个共价连接侧链的聚氨基酸。在一个实施方案中，固定剂选自具有金属螯合剂的多个共价连接侧链的PDL或PLO。
在一个实施方案中，金属螯合剂选自由以下组成的组中：乙二胺四乙酸(EDTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-N,N',N",N'"-四乙酸(DOTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、巯基乙酰三甘氨酸(MAG3)、6-肼基吡啶-3-羧酸(Hynic)、二巯基琥珀酸(DMSA)、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、三乙烯四胺(TETA)、1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7,10-N,N',N",N'"-四乙酸(TRITA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、去铁胺(desferral)、sarcophagine(SarAr)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-N,N',N",N'"-四(亚甲基)膦酸(DOTMP)；1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7,10-N,N',N",N'"-四(亚甲基)膦酸；1,4,7,10-四氮杂环十四烷-1,4,7,10-N,N',N",N'"-四(亚甲基)膦酸；二乙烯三胺-N,N',N"-五乙酸以及其异构衍生物；穴状化合物[2,2,2]、穴状化合物[3,2,2]、穴状化合物[2,2,1]以及其单苯并和二苯并衍生物；含有富电子(供体)基团(羟基、羧基、酯、酰胺、胺)的桥接杯[4]芳烃；1,10-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂环十八烷-1,10-N,N'-双乙酸；以及1,10-二氮杂-4,7,13,16四氧杂环十八烷-1,10-N,N'-双丙二酸酯；以及这些金属螯合剂中的任一种的衍生物和本领域技术人员已知的任何其他多齿或大环金属螯合剂。
优选地，选择金属螯合剂来维持所选的放射性同位素在体内条件下的固定作用。
本领域技术人员将认识到，金属螯合剂的选择将取决于待螯合的放射性同位素。适于一种放射性同位素的金属螯合物将不一定是对于另一种放射性同位素的最佳金属螯合物。
具有DTPA或DOTA的侧基式共价连接侧链的PDL或PLO是本发明的优选固定剂，因为它们不可由内源性蛋白酶生物降解。
在一个实施方案中，所述侧基式金属螯合剂是DTPA，并且所述聚阳离子是PLO。在另一个实施方案中，所述侧基式金属螯合剂是DOTA，并且所述聚阳离子是PLO。在另一个实施方案中，所述侧基式金属螯合剂是DTPA，并且所述聚阳离子是PDL。在另一个实施方案中，所述侧基式金属螯合剂是DOTA，并且所述聚阳离子是PDL。
在一个实施方案中，在聚阳离子链中每2至6个氨基酸残基处具有一个侧基式螯合剂分子。在一个实施方案中，在聚阳离子链中每2、3、4、5或6个氨基酸残基处具有一个侧基式螯合剂分子。在一个实施方案中，在聚阳离子链中每2至5个氨基酸残基处具有一个侧基式螯合剂分子。在另一个实施方案中，在聚阳离子链中每2至4个氨基酸残基处具有一个侧基式螯合剂分子。
在一个实施方案中，侧基式金属螯合剂与聚阳离子的摩尔比在约7与20之间。在另一个实施方案中，侧基式金属螯合剂与聚阳离子的摩尔比在约12与18之间。在另一个实施方案中，侧基式金属螯合剂与聚阳离子的摩尔比在约13与17之间。
在一个实施方案中，所述侧基式金属螯合剂是DTPA，并且所述聚阳离子是PLO。在一个实施方案中，DTPA与PLO的摩尔比在约7与20之间。在另一个实施方案中，DTPA与PLO的摩尔比在约12与18之间。在另一个实施方案中，DTPA与PLO的摩尔比在约13与17之间。
聚合物
本发明的聚合物可以是具有可与血液生物相容(即，不促进通过所谓的内在途径进行的血液凝固或通过促进血小板粘附进行的血栓形成)的任何聚合物。
在一个实施方案中，本发明的聚合物是包含阴离子取代基团(诸如硫酸根、磺酸根、羧酸根和磷酸根基团)以便结合聚阳离子的阳离子交换树脂。
例如，所述聚合物可以是本领域已知的任何血液可生物相容的聚合物，包括但不限于聚苯乙烯、聚苯乙烯磺酸酯、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、发泡聚四氟乙烯(EPTFE)、聚氨酯、聚氯乙烯、聚酰胺、特氟隆、聚酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚(对苯二甲酸丁二酯)(PBT)、聚(氧化乙烯)(PEO)、聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(e-己内酯)、聚对二氧环己酮、三亚甲基碳酸酯、聚酸酐以及聚[双(对羧基苯氧基)丙烷:癸二酸。优选地，所述聚合物是聚苯乙烯磺酸酯。
特别地，聚四氟乙烯(PTFE)、发泡聚四氟乙烯(EPTFE)、聚氨酯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚苯乙烯和特氟隆可用作本发明中的聚合物。
可用于血管移植物的聚合物包括聚酯，例如聚对苯二甲酸乙二酯、聚氨酯和聚四氟乙烯。
聚合物可附着到导管、纤维、棒或丝、导线、膜、晶片、网、纱布、多孔海绵、管、支架、珠、胶囊、微颗粒、微球、纳米颗粒和脂质体或呈这些物品的形式。优选地，聚合物呈微球、种子、支架、导管、导线或晶片的形式。支架可与放射性同位素一起用于血管内近距离放射治疗以在短期术后时间段期间预防再闭塞，其中支架包含放射性同位素以抑制平滑肌细胞的增殖。
聚合物微球适当地定尺寸以提供在肺的动脉网络的前毛细血管水平下的保留。微球优选地具有在0.5微米与200微米之间、0.5微米至50微米之间、高达35微米或在0.5微米与35微米之间的中值直径。含有放射性核素的微球的实例描述于美国申请号11/192,299中。
在一个实施方案中，聚合物呈具有在0.5微米与100微米之间的中值直径的粒状微球的形式。在一个实施方案中，粒状微球具有0.5微米至50微米的中值直径。在一个实施方案中，粒状微球具有高达35微米的中值直径。在一个实施方案中，粒状微球具有0.5微米至35微米的中值直径。在一个实施方案中，粒状微球具有8微米至12微米的中值直径。在另一个实施方案中，粒状微球具有8微米的中值直径。在另一个实施方案中，粒状微球具有1微米的中值直径。在又一个实施方案中，粒状微球具有30微米的中值直径。
用于本发明的聚合物微球包括用于制造(是Sirtex SIR-Spheres Pty有限公司的注册商标)微球的那些，所述微球是包含聚苯乙烯磺酸酯的基于树脂的微球。
放射性同位素
本发明的放射性同位素能够实现成像和/或治疗。优选地，成像包括SPECT成像和/或PET成像。
单光子发射计算机断层扫描(SPECT)是使用γ射线的核医学断层成像技术并且能够提供真实的3D信息。该信息经常呈现为贯穿患者的横截面切片。由于同位素的γ放射，能够看到放射性标记材料在患者体内积聚的地方。这种真实的3D呈现可有助于肿瘤成像。
正电子发射断层扫描(PET)是产生3D图像的核医学成像技术，并且比传统的SPECT成像具有更高的敏感性。该系统检测由正电子发射放射性核素(示踪剂)间接发射的γ射线对，所述正电子发射放射性核素引入到体内。然后通过计算机分析构建体内示踪剂浓度的3D图像，并且3D成像经常在相同的机器中在相同的会话过程中在患者上进行的计算机断层扫描(CT)X射线扫描的帮助下完成。正电子发射同位素也可结合CT使用以提供标记的医疗装置的解剖分布的3D成像。
在一个实施方案中，放射性同位素能够实现成像和/或治疗。在一个实施方案中，成像包括SPECT成像和/或PET成像。在一个实施方案中，放射性同位素选自Ac-225、Au-198、Bi-212、Bi-213、Co-57、Cr-51、Cu-64、Cu-67、Dy-165、Er-169、Fe-59、Ga-67、Ga-68、Gd-153、Ho-166、In-111、Ir-192、Lu-177、Pd-103、Rb-81、Rb-86、Re-186、Re-188、Ru-103、Sc-47、Sm-153、Sn-117m、Sr-89、Tb-161、Tc-99m、Tl-201、Y-90、Yb-169和Zr-89。在一个实施方案中，放射性同位素选自元素周期表的XIII族。在一个实施方案中，放射性同位素是Ga-67、In-111、Lu-177、Tl-201或Y-90。
本发明的放射性同位素可包括放射性金属或半金属同位素。优选地，放射性同位素是水溶性金属阳离子。
本发明的合适的放射性金属同位素的实例包括Ac-225、Au-198、Bi-212、Bi-213、Co-57、Cr-51、Cu-64、Cu-67、Dy-165、Er-169、Fe-59、Ga-67、Ga-68、Gd-153、Ho-166、ln-111、Ir-192、Lu-177、Pd-103、Rb-81、Rb-86、Re-186、Re-188、Ru-103、Sc-47、Sm-153、Sn-117m、Sr-89、Tb-161、Tc-99m、Tl-201、Y-90、Yb-169和Zr-89。
特别地，本发明的放射性同位素包括元素周期表的XIII族(硼族)中的那些元素，其包括Ga和In。
特别地，优选的放射性同位素包括Ga-67、Ga-68、Lu-177、Y-90和In-111。最优选地，放射性同位素是Lu-177和Y-90。在一个实施方案中，放射性同位素是Lu-177。
本发明的放射性同位素还包括过渡金属，诸如Lu-177、Y-90、Cu-64、Cu-67和Tb-161。优选地，放射性同位素是Lu-177或Y-90。
本发明的同位素应被理解为还包括母同位素。
本发明的放射性标记材料可包括至少两种放射性同位素的组合以能够实现成像和/或治疗。放射性同位素的组合可选自Ga-68和Lu-177；Ga-67和Y-90；Ga-68和Y-90；In-111和Y-90；Lu-177和Y-90，以及Ga-67和Tb-161。
本发明还可包括使用至少一种非放射性、非毒性载体金属。例如，载体金属可选自Bi和Fe。
特别地，非放射性载体金属实现MRI成像(例如，Fe)或X射线相衬成像(例如，Bi)。
载体金属的另外的实例包括三价铋，其另外提供微球中的X射线对比，使得它们可在CT中成像。
根据本发明的放射性标记材料可发射α、β、γ和/或正电子辐射。
放射性标记材料
本发明的放射性标记材料包含聚合物、放射性同位素和固定剂，其中所述固定剂能够将所述放射性同位素固定在所述聚合物上或所述聚合物中，并且其中所述固定剂是包含具有多个侧基式金属螯合剂侧链的聚阳离子的大分子。
在本发明的一个实施方案中，放射性标记材料利用固定剂的聚阳离子作为将共价连接的多个侧基式金属螯合剂锚定到聚合物的表面的离子对。在一个实施方案中，所述聚合物是阴离子聚苯乙烯磺酸酯微球，并且固定剂的聚阳离子与聚合物微球的阴离子磺化表面形成离子对。将固定剂的聚阳离子侧链的螯合物取代保持至最小程度，以便保留足够的聚阳离子特征，以用于离子对附接到聚合物的磺化表面。聚阳离子:磺酸酯多位点相互作用然后充当强“拉链(zipper)”以将复合物保持在一起，其中放射性同位素与侧基式螯合物结合。通过这种方式，本发明人已发现能够长期负载足够的放射性同位素活度以实现治疗范围内的辐射剂量，其在体内条件下稳定地保留在聚合物上。
本发明的固定剂能够将一种或多种放射性元素固定在聚合物上，每种放射性元素产生不同水平和类型的辐射(诸如γ和β辐射)并且具有不同的半衰期。因此，本发明的放射性标记材料可包含能够实现成像(诸如通过SPECT或PET)的放射性同位素和/或能够实现治疗的放射性同位素。因此，可在研究性成像程序(即，作为“模拟(mimic)”颗粒)和治疗程序中采用相同的聚合物颗粒。以这种方式，模拟颗粒可准确地预测治疗颗粒的器官分布，以便给出被认为适于治疗颗粒的患者数量的准确估计。
在一个实施方案中，本发明的放射性标记材料是包含聚合物、第一放射性同位素、第二放射性同位素和固定剂的双重放射性标记材料，其中所述固定剂能够将第一放射性同位素和第二放射性同位素固定在所述聚合物上或所述聚合物中，并且其中所述固定剂是包含具有多个侧基式金属螯合剂侧链的聚阳离子的大分子。在一个实施方案中，所述固定剂包含具有多个侧基式第一金属螯合侧链和多个侧基式第二金属螯合侧链的聚阳离子。在一个实施方案中，所述第一金属螯合侧链固定第一放射性同位素，并且所述第二金属螯合侧链固定第二放射性同位素。在一个实施方案中，所述第一放射性同位素能够实现成像，并且第二放射性同位素能够实现治疗。
在一个实施方案中，本发明的双重放射性标记材料包含聚合物、第一放射性同位素、第二放射性同位素、第一固定剂和第二固定剂，其中第一固定剂能够将第一放射性同位素固定在聚合物上或聚合物中，并且第二固定剂能够将第二放射性同位素固定在聚合物上或聚合物中，并且其中第一固定剂和第二固定剂各自是包含具有多个侧基式金属螯合剂侧链的聚阳离子的大分子。在一个实施方案中，第一固定剂是DPTA-PLO，并且第二固定剂是DOTA-PLO。
此外，本发明的固定剂能够同时将适于成像和治疗的一种或多种放射性同位素固定在聚合物上。可采用可确定患者体内治疗辐射暴露的精确部位的成像技术，并且因此能够确定治疗的有效性和未来治疗的必要性。
固定剂明显减少放射性同位素从聚合物浸出。因此，可在聚合物微球上获得足够的比活度(放射性活度/单位质量)用于成像和疗法的，使得微球的数量可最小化。这避免使用过量的微球来实现成像或治疗剂量，否则使用过量的微球会使过多的血管闭塞并且因此损害器官的血液灌注，并且还通过在血管中产生微球的局部积聚或结块而降低成像分辨率和治疗功效。此外，减少治疗同位素从微球浸出减少了非靶器官中的非预期组织损坏。
例如，本发明的固定剂能够结合重要且临床上可用的放射性同位素Lu-177。Lu-177具有β和γ放射两者，从而使其适于一些肿瘤的疗法和成像两者。Lu-177表现出6天的半衰期。此相对长的半衰期是有利的，因为在产生放射性元素的显著的活性损失之前，在制造放射性标记材料与向患者施用之间存在更多的可用时间，从而产生更低的相关成本。Lu-177具有仅0.2mm的短范围组织细胞毒性。因此，Lu-177是提供成像和治疗能力两者的合适同位素的优选实例。
在另一个实例中，本发明的固定剂能够将重要且临床上可用的镓同位素Ga-67(用于SPECT成像)和Ga-68(用于PET成像)与聚合物结合。Ga-67在衰减时产生γ辐射。因此，可使用由光子放射制成的SPECT或闪烁扫描图像确认辐射的位置，这使用γ相机检测来自放射性同位素的γ辐射。Ga-68在其衰减时产生正电子发射。正电子发射断层扫描(PET)是提供优于SPECT的成像分辨率的较新的核医学成像方法，并且也逐渐变得更常用。Ga-67表现出3.26天的半衰期，并且因此赋予在运输和分布过程中维持足够的活性的另外优点。
在一个实施方案中，固定剂能够将最佳成像同位素(诸如用于SPECT和/或PET)和最佳治疗同位素(诸如软或硬的β辐射源)结合在一种材料中。优选地，固定剂能够结合具有相当的半衰期的至少两种同位素。这是有利的，因为之后放射性标记材料的成像特性和治疗特性两者在运输和分布至使用点所需的时间段内被相似地保存。例如，In-111具有与治疗同位素Y-90的半衰期(2.67天)相当的2.8天半衰期。
本发明的优选组合包括Ga-67或In-111(SPECT成像)和Lu-177(SPECT成像和β疗法)；Ga-67或In-111(SPECT成像)和Y-90(β疗法)；以及Ga-68(PET成像)和Y-90(β疗法)。最优选的实例是Ga-67和Y-90。
固定不同放射性同位素的能力还实现更灵活的癌症治疗程序。固定剂可被设计为使放射性同位素适于被固定，并且可方便地选择同位素或同位素组合来适合癌症类型和体内肿瘤部位。
固定剂在酸性pH下发挥作用，使得放射性同位素不从聚合物阴离子基团偏移。另外，固定剂能够使放射性同位素在4至7的pH范围内并且在体内暴露于血液之后保留在聚合物上。
固定剂的合成
本发明的固定剂可易于由本领域技术人员使用本领域已知的方法和材料并参考标准教科书(诸如Jerry March的“Advanced Organic Chemistry”(第三版,1985,JohnWiley and Sons)或Richard C.Larock的“Comprehensive Organic Transformations”(1989,VCH Publishers))制备。
例如，固定剂可通过在聚阳离子大分子上的氨基基团与金属螯合剂上的羧酸反应来进行标准酰胺形成来制备。在一个实施方案中，可采用偶联剂来活化羧酸以促进伯胺与羧酸之间的偶联，以形成酰胺键。在一个实施方案中，所述偶联剂是二环己基碳二亚胺(DCC)或1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。优选地，偶联剂是EDC，因为EDC是水溶性碳二亚胺。
在另一个实施方案中，除偶联剂之外，还可采用活化剂来促进酰胺键形成。在一个实施方案中，活化剂选自由以下组成的组：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、磺基-N-羟基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)和五氟苯酚。在一个实施方案中，活化剂是水溶性磺基-NHS。催化酰胺键形成的替代性条件可见于文献中，例如见于G.T.Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,2013。
在一个实施方案中，固定剂通过在EDC和磺基-NHS的存在下聚阳离子(诸如PLO或PDL)和金属螯合剂(诸如DTPA、DOTA或EDTA)的反应来制备。
方案1中示出通过使用EDC和磺基-NHS来催化反应使PLO与DTPA反应制备的固定剂的代表性合成。在方案1中，m+n代表PLO聚阳离子中鸟氨酸残基的数量。例如，5kD聚鸟氨酸具有43-44个鸟氨酸残基，所以m+n＝43-44。在固定剂产物中，m代表未取代的氨基基团侧链的数量，并且n代表固定剂的聚阳离子主链上的金属螯合剂的数量。
方案1.
本领域技术人员将认识到，通过改变各种试剂的量，可改变并入到聚阳离子主链上的金属螯合剂的数量。例如，通过改变连接试剂(EDC)的浓度，同时保持所有其他反应条件恒定，可以使用金属螯合剂与聚阳离子的不同摩尔比制备不同的PLO-DTPA构建体。将每个聚阳离子链上的金属螯合剂的数量计算为平均值，并且不实施反应产物的分离。此外，本领域技术人员将认识到，如方案1中描绘的固定剂仅是代表性的-金属螯合剂侧链将沿聚鸟氨酸主链的长度分布。
并入到固定剂中的金属螯合剂的数量可使用本领域技术人员已知的标准方法计算。在一个实施方案中，可采用络合结合测定来计算固定剂中金属螯合剂的数量。
在一个实施方案中，每2至6个氨基基团侧链具有一个金属螯合剂。换言之，金属螯合剂与聚阳离子的摩尔比在约7与约20之间。将聚阳离子侧链的螯合物取代保持至最小程度，以便保留足够的聚阳离子特征，以用于离子对附接到聚合物的磺化表面。
本领域技术人员将认识到，可通过选择替代性聚阳离子和金属螯合剂来制备替代性固定剂。本领域技术人员还将认识到，可使用两种不同的侧基式金属螯合剂制备固定剂。例如，聚阳离子可与两种不同的金属螯合剂反应以产生具有两种不同金属螯合剂的固定剂，每种针对固定两种不同的放射性同位素进行优化。例如，可制备包含具有多个侧基式第一金属螯合侧链和多个侧基式第二金属螯合侧链的聚阳离子的固定剂。
在一个实施方案中，固定剂可用其他报道分子共价标记。例如，荧光标签(诸如荧光素)可缀合到固定剂。在一个实施方案中，可使用荧光标记的固定剂来定量固定剂与聚合物的结合。
制备放射性标记材料的方法
本发明还提供一种用于制备如上所述的放射性标记材料的方法，其包括：
(i)将在标题为‘聚合物’的部分中如上所述的聚合物与在标题为‘固定剂’的部分中如上所述的固定剂混合；
(ii)任选地，洗涤所得的混合物；
(iii)进一步添加在标题为‘放射性同位素’中如上所述的放射性同位素；以及
(iv)任选地，洗涤所得的混合物。
可替代地，步骤的顺序可以是：
(i)将在标题为‘聚合物’的部分中如上所述的聚合物与在标题为‘放射性同位素’的部分中如上所述的放射性同位素混合；
(ii)任选地，洗涤所得的混合物；
(iii)进一步添加在标题为‘固定剂’的部分中如上所述的“固定剂”；以及
(iv)任选地，洗涤所得的混合物。
可替代地，步骤的顺序可以是：
(i)将在标题为‘固定剂’的部分中如上所述的固定剂与在标题为‘放射性同位素’的部分中如上所述的放射性同位素混合；
(ii)进一步添加在标题为‘聚合物’的部分中如上所述的聚合物；以及
(iii)任选地，洗涤所得的混合物。
在一个实施方案中，将放射性同位素添加在酸性溶液中。在一个实施方案中，将放射性标记物添加在0.05M HCl溶液中。在一个实施方案中，所述方法包括将悬浮液的pH调整至中性的另外步骤。在一个实施方案中，用0.05M NaOH溶液将悬浮液的pH调整至中性。
在一个实施方案中，固定剂的浓度在约0.5至100μg/mg聚合物之间。在另一个实施方案中，固定剂的浓度在约1至50μg/mg聚合物之间。在另一个实施方案中，固定剂的浓度在约5至30μg/mg聚合物之间。在另一个实施方案中，固定剂的浓度在约10至30μg/mg聚合物之间。在另一个实施方案中，固定剂的浓度为约20μg/mg聚合物。
在一个实施方案中，提供制备放射性标记材料的方法，所述方法包括另外的步骤：
(v)在水或盐水中对所得的混合物进行高压灭菌并且递送至灭菌周期；
(vi)任选地，洗涤所得的混合物；以及
(vii)任选地，将所得的混合物重悬浮在溶液中。
在步骤(v)的一个实施方案中，将所得的混合物在水中进行高压灭菌。在步骤(v)的另一个实施方案中，将所得的混合物在盐水中高压灭菌。
本发明还提供固定剂用于将放射性同位素固定在聚合物上或聚合物中的用途，其中所述固定剂、所述放射性同位素和所述聚合物是如上所述。
本发明还提供双重放射性标记材料。在一个实施方案中，聚合物与第一固定剂和第二固定剂混合。在一个实施方案中，第一固定剂和第二固定剂同时与聚合物混合。在另一个实施方案中，第一固定剂和第二固定剂顺序地与聚合物混合。在一个实施方案中，第一固定剂固定第一放射性剂，并且第二固定剂固定第二放射性剂。
放射性标记材料的治疗用途
放射性标记材料可用于基于大分子与疾病标记物的特异性生物学相互作用，在体内预先确定的疾病部位处积聚治疗同位素。在一个实施方案中，靶疾病部位是肺。在一个实施方案中，本发明的放射性标记材料包含具有强的肺亲和力的大分子，诸如选自PDL和PLO的聚阳离子。
选择性内放射治疗(SIRT)涉及通过导管将聚合物微球施用到靶器官的动脉血供应中，并且因此将靶向内放射治疗直接递送到肿瘤。优选地，微球固定在肿瘤的脉管中。这提供以下优点：放射优先地以缓慢且连续的方式递送到靶器官。还可能使用适当的药物调控血供应，以便增加到靶器官(而不是周围的健康组织)的放射水平。如先前所提及的，本发明的固定剂明显预防浸出，并且因此一旦微球到达靶器官，适当的放射就被递送到肿瘤。
然而，通过导管将聚合物微球施用到靶器官的动脉血供应中是创伤性手术。在本发明的放射性标记材料的优选实施方案中，放射性标记材料对于肺具有高特异性。在一个实施方案中，本发明的放射性标记材料可静脉内施用以靶向肺，以用于治疗肺癌，这是一种创伤性远远更小的施用模式。随着所有静脉将血液返回到心脏右侧，并且血液然后通过肺动脉被引导到肺，被静脉施用的任何放射性标记材料最终进入动脉供应到达肺，从而允许放射性标记材料被递送到肺并保留在肺中而不进入心脏左侧，在心脏左侧所述放射性标记材料将被输出到身体其余部分。
在本发明的一个实施方案中，所述放射性标记材料对于保留在肺中具有高特异性，从而使对于其他器官的任何损伤最小化。在一个实施方案中，在静脉内施用放射性标记材料之后，所述放射性标记材料在肺中具有大于90％保留，并且小于10％的施用剂量到达肝。在另一个实施方案中，在静脉内施用放射性标记材料之后，在肝中未检测到放射性标记材料。
为了治疗性地用于治疗肺癌，需要放射性标记材料在肺中保留足够长的时间段以提供治疗辐射剂量。在一个实施方案中，在静脉内施用放射性标记材料之后，大于50％的放射性标记材料在肺中保留长达2天。在另一个实施方案中，在静脉内施用放射性标记材料之后，大于50％的放射性标记材料在肺中保留长达3天。在另一个实施方案中，在静脉内施用放射性标记材料之后，大于50％的放射性标记材料在肺中保留长达4天。在另一个实施方案中，在静脉内施用放射性标记材料之后，大于50％的放射性标记材料在肺中保留长达5天。
在一个实施方案中，放射性标记材料被分散到肿瘤血管生成的最细血管，同时仍然保留在肺中。
当靶向肺时，需要确保施用的放射性标记材料的量对于肺功能(即，呼吸)不产生显著影响。在本发明的一个实施方案中，治疗剂量的放射性同位素(尤其是Lu-177)可携载在足够少量的放射性标记材料中，以便对于肺功能不产生影响。
在另外的实施方案中，根据本发明的放射性标记材料可施用到其他内部器官，诸如肝。这与用于治疗肝肿瘤或其他内部器官中存在的肿瘤的内放射治疗的任何潜在临床用途具有相关性。
在另外的实施方案中，根据本发明的放射性标记材料可施用到皮下肿瘤或在身体表面或通过直接注射到肿瘤中而易于通过手术到达的其他实体瘤。
本发明还提供根据本发明和如上所述的放射性标记材料用于制造治疗癌症和/或辐射成像的药物的用途。在一个实施方案中，所述癌症是原发性或继发性肺癌。
本发明还提供一种对患者进行放射治疗的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的第一方面的放射性标记材料。
在一个实施方案中，所述放射治疗是针对肺的内放射治疗。例如，所述放射治疗用于治疗原发性和/或转移性肺肿瘤。
本发明还提供一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据本发明和如上所述的放射性标记材料。
所述癌症可以是原发性肉瘤、原发性或继发性黑素瘤、原发性头颈癌、原发性或继发性脑癌、原发性或继发性肺癌、原发性或继发性肝癌、原发性或继发性乳腺癌、原发性或继发性肾癌(肾肿瘤)、原发性或继发性卵巢癌、原发性或继发性前列腺癌或神经内分泌癌。
在本发明的方法的一个实施方案中，通过静脉内注射施用根据本发明的放射性标记材料。
在本发明的方法的另一个实施方案中，通过直接肿瘤内注射施用根据本发明的放射性标记材料。
在一个实施方案中，所述癌症是原发性或继发性肺癌。
肺中原发性肺癌或转移性肿瘤的静脉内注射治疗的优选实例是8微米直径聚苯乙烯磺酸酯微球，其包覆有包含具有DTPA螯合剂的侧基式侧链的PLO的固定剂并负载有Lu-177或Y-90同位素以提供肿瘤的β颗粒放射。
在身体表面或易于通过手术到达的实体瘤的直接肿瘤内注射治疗的优选实例是1微米直径聚苯乙烯磺酸酯微球，包覆有包含具有DTPA螯合剂的侧基式侧链的PLO的固定剂并负载有Lu-177或Y-90同位素以提供肿瘤的β颗粒放射。
本发明还提供一种对患者中的医疗程序进行成像的方法，所述方法包括向所述患者施用根据本发明的放射性标记材料，以及检测在所述受试者中的所述放射性标记材料。
在一个实施方案中，所述检测包括对所述放射性进行γ相机成像。
本发明还提供一种医疗装置，其包括根据本发明和如上所述的放射性标记材料。
所述医疗装置可以是微球、种子、支架、导管、导线或晶片。
在一个实施方案中，可通过注射施用本发明的放射性标记材料。在可注射溶液的情况下，所述载体可以是含有以下物质的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。适当的流动性可例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)来维持，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小来维持，以及通过使用表面活性剂来维持。预防微生物的作用可通过包括各种抗细菌剂和/或抗真菌剂来实现。合适的剂是本领域技术人员熟知的，并且包括例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、苄醇、抗坏血酸、硫柳汞等。在很多情况下，可优选在组合物中包含等渗剂，例如糖，诸如甘露糖醇、山梨糖醇的多元醇，氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包含延缓吸收的剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
在一个实施方案中，通过静脉内注射施用本发明的放射性标记材料。用于静脉内施用的合适载体包括等渗盐水、5％右旋糖、哈特曼氏溶液(Hartmann’s solution)、Hank氏平衡盐溶液或本领域技术人员已知的适于静脉内使用的类似溶液。
在一个实施方案中，通过腹腔内注射施用放射性标记材料，以便将放射性标记材料引入到身体的腹腔中。在一个实施方案中，将放射性标记材料引入到身体的腹腔中可用于治疗来自远侧原发性肿瘤部位的扩散的肿瘤细胞，所述扩散的肿瘤细胞作为腹水填充腹腔，并且在腹腔脏器的外侧上建立转移瘤。在一个实施方案中，所述扩散的肿瘤细胞是扩散的卵巢癌细胞。这是在姑息性癌症治疗中延迟腹水增生并因此缓解腹腔中癌症生长的显著症状的常见问题。在一个实施方案中，当注射到腹腔中时，本发明的放射性标记材料可有助于缓解这些症状。
在一个实施方案中，对于除肺以外的器官中的肿瘤治疗，动脉内施用放射性标记材料。例如，对于肝肿瘤的治疗，动脉内施用放射性标记材料到肝。用于动脉内注射的合适载体包括等渗盐水、5％右旋糖、哈特曼氏溶液、Hank氏平衡盐溶液或本领域技术人员已知的适于静脉内使用的相似溶液。
在一个实施方案中，例如在实体瘤在皮下、在身体表面或易于通过手术到达的情况下，本发明的放射性标记材料通过直接注射施用到肿瘤，即，本发明的放射性标记材料在肿瘤内施用。用于直接注射到肿瘤的合适载体包括等渗盐水、5％右旋糖、哈特曼氏溶液、Hank氏平衡盐溶液或本领域技术人员已知的适于静脉内使用的类似溶液。
可实施根据本发明的放射性标记材料的单次或多次施用。在一个实施方案中，根据本发明的放射性标记材料适于分次和分级的重复剂量。本领域技术人员将能够通过常规实验确定本发明的放射性标记材料的有效非毒性剂量水平以及适于治疗放射性标记材料所适用于的疾病和/或感染的施用模式。
此外，对于本领域普通技术人员明显的是，可使用治疗测定试验的常规过程确定治疗的最佳过程，诸如每天所给予的本发明的放射性标记材料的剂量数量，持续所限定的天数。
通常，有效剂量/24小时可在约0.0001mg至约1000mg/kg体重的范围内；例如约0.001mg至约750mg/kg体重；约0.01mg至约500mg/kg体重；约0.1mg至约500mg/kg体重；约0.1mg至约250mg/kg体重；或约1.0mg至约250mg/kg体重。更合适地，有效剂量/24小时可在约1.0mg至约200mg/kg体重的范围内；约1.0mg至约100mg/kg体重；约1.0mg至约50mg/kg体重；约1.0mg至约25mg/kg体重；约5.0mg至约50mg/kg体重；约5.0mg至约20mg/kg体重；或约5.0mg至约15mg/kg体重。在一个实施方案中，有效剂量/24小时可在约1.0mg至约10mg/kg体重的范围内；或约3.0mg至约5mg/kg体重的范围内。
根据本发明的放射性标记材料可与其他药物作为治疗方案的一部分一起施用。可能希望施用有效化合物的组合，例如以用于治疗特定疾病或病状的目的。因此，在本发明的范围内的是，两种或更多种药物组合物(其中至少一种含有本发明的放射性标记材料)可以适于共施用组合物的试剂盒的形式组合。
本文的说明书通过参考优选实施方案和实施例来说明。基于本文的描述，技术受访者将认识到，在使用替代方案的情况下，可凭经验确定适当的条件，此类替代方案包括放射性同位素、固定剂和聚合物。
现在将仅通过例示的方式参考以下非限制性实施例更详细地描述本发明。实施例旨在用于说明本发明，并且不应被解释为限制贯穿本说明书的描述的公开内容的普遍性。
实施例
实施例1：聚合的DTPA-PLO固定剂的合成
使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)偶联法将二乙烯三胺五乙酸(DTPA)共价缀合到沿聚-L-鸟氨酸主链(PLO，Sigma P4538；分子量5-15kD)的随机伯氨基基团(Hermanson,G.T.,2013.Bioconjugate Techniques,Academic Press)。例如，将PLO(10mg/mL，500μL)添加到DTPA(20mM)、EDC(20mM)和磺基-NHS(10mM，N-羟基琥珀酰亚胺)在磷酸盐缓冲液pH 7(0.02M，500μL)中的溶液。将溶液在室温下混合2小时，并且然后通过PD-10脱盐柱(GE Healthcare 17-0851-01)纯化。
图1示出基于共价连接到PLO的DTPA的聚合的固定剂的表示。PLO主链由左侧具有通过酰胺键连接的DTPA的侧基式取代基的线圈表示。未取代的PLO的氨基基团自由接受质子并且形成如所指示的正电荷。
通过改变连接试剂(EDC)的浓度，同时保持所有其他反应条件恒定，制备具有不同的金属螯合剂与聚阳离子的摩尔比的五种不同的PLO-DTPA构建体(图2)。
实施例2：计算固定剂的DTPA与PLO的摩尔比
使用络合指示物二甲苯酚橙(XO)及其与Fe3+的有色络合物(C.Gay,J.Collins,J.M.Gebicki,Determination of iron in solutions with the ferric-xylenol orangecomplex,Anal.Biochem.273(1999)143–148.doi:10.1006/abio.1999.4207)来确定连接的螯合剂(DPTA)与聚阳离子聚合物(PLO)的摩尔比。将已知浓度的螯合物-聚阳离子添加到已知浓度的FeCl3溶液，并且通过有色XO:Fe3+络合物的形成确定游离Fe3+。样品吸光度与XO:Fe3+络合物的标准曲线相关，所述标准曲线关于μM范围内的Fe3+浓度是线性的。
实施例3：向聚合的DTPA-PLO固定剂添加荧光标签
可用其他报道分子共价标记聚合物DTPA-PLO固定剂。例如，可通过反应将荧光标签、荧光素与荧光素异硫氰酸酯(FITC，Sigma F4274)缀合。简而言之，将DTPA-PLO(1.4mg/mL，500μL)添加到FITC(0.1mg/mL)在碳酸盐缓冲液pH 9(0.02M，500μL)中的溶液。将溶液在4℃下静置过夜，并且通过添加1M氯化铵(50μL)来使反应停止。通过PD-10脱盐柱(GEHealthcare 17-0851-01)纯化荧光标记的聚阳离子。
实施例4：定量DTPA-PLO固定剂与聚苯乙烯磺酸酯微球的结合
使用如以上实施例3中制备的荧光标记的DTPA-PLO来定量固定剂与聚苯乙烯磺酸酯微球表面的结合。将各种量的荧光DTPA-PLO(5、10、20、30μg)与聚苯乙烯磺酸酯微球(1mg，8μm直径)在室温下在水或盐水(1mL)中混合1h。通过在3000g下离心2min来使微球制成丸粒状，并且各自在Varioskan LUX多模式板读取器(ex.485nm；em.525nm，ThermoFisher Scientific)中测量上清液(200μL)中的荧光。
图3示出在与聚苯乙烯磺酸酯微球混合之后不同量的荧光标记的DTPA-PLO固定剂的结合产率。针对与1mg的8μm微球混合的10μg DTPA-PLO-FITC观察到完全结合，并且似乎在17-18μg的聚阳离子下发生饱和。值得注意的是，可能由于DTPA羧酸根基团与PLO胺基团之间的分子间键的中断，在盐水的存在下结合的聚阳离子的量可增加，从而允许产生结合的固定剂的更延长的构象。这将允许聚阳离子的更多带正电的基团结合到带负电的微球，从而产生更强的结合。在盐水的存在下，在25μg下观察到DTPA-PLO-FITC与微球的结合的饱和，从而实现结合的固定剂/mg微球的大约39％增加。
实施例5： 177Lu-DTPA-PLO-微球的制备
表1示出制备177Lu放射性标记的微球的示例性过程。
表1：177Lu标记的微球的示例性制备
实施例6：静脉内注射的微球的肺分布和安全性影响
用两个群组的BALB/c小鼠研究体内微球的最佳肺负载以及重复肺微球负载策略的安全性。对于第一群组，三组5只健康小鼠静脉内(通过尾静脉)接受在5％右旋糖溶液中的非放射性微球(8μm直径)的单次负载。微球负载在各组中递进地从6mg/kg增加至9mg/kg，并且然后增加至12mg/kg。每日仔细监测小鼠的健康，并且针对若干标准小鼠模型准则对小鼠进行评分(0-3)。在注射后7天，宰杀小鼠，并且收获其肺以用于组织学检查。将来自每组的两个肺送到公认的兽医病理学实验室以用于组织学检查，并且由有资格的病理学家报告。
仔细监测小鼠的健康，并且没有由静脉内微球注射引起的明显影响。肺组织学结果的总结在表2中示出，并且病理学家的报告声明，“微球在整个肺中在间质组织中广泛分布。在微球周围具有非常少的炎症，并且微球周围大部分没有炎症。微球在整个间质组织中随机分散，并且似乎没有聚集在大血管周围，它们也没有邻近大气道聚集。在小鼠1至6中确实没有发现微球分散的任何明显差异。它们全部似乎随机分散，并且没有实际的分布差异。可能在微球数量增加的情况下，存在发现微球呈两个或三个的小簇形式的一定趋势。但是这是相当主观的。在微球数量增加的情况下没有明显的炎症”。
向第二个群组的小鼠注射不存在放射性的分次负载的微球。将负载分开，并且经三次静脉内注射3mg/kg来递送，每7天一次(总负载为9mg/kg)，并且在最后一次注射之后另外监测小鼠7天。同样，仔细监测小鼠的健康，并且没有由静脉内微球注射引起的明显影响。
表2
实施例7：不同177Lu配制品的生物分布和消除
向四组3只BALB/c小鼠静脉内(通过尾静脉)注射177Lu-DTPA-PLO-微球的配制品(8μm；3mg/kg；第1组)、没有微球的177Lu-DTPA-PLO(第2组)、没有聚合固定剂的与微球直接结合的177Lu(3mg/kg；第3组)或游离177LuCl3(第4组)。3小时之后，对全部12只小鼠进行安乐死并解剖以测量肺、肝、脾和尸体中的放射性活度。结果在表3中示出。
表3中示出接受以下物质的不同配制品的4组小鼠的肺、肝/脾和尸体中存在的放射性活度：177Lu同位素；177Lu-DTPA-PLO-微球(第1组)；没有微球的177Lu-DTPA-PLO(第2组)，没有聚合固定剂的直接与微球结合的177Lu(第3组)，或游离177LuCl3(第4组)。对于177Lu-DTPA-PLO-微球(第1组)观察到肺中的高水平177Lu保留(93％)，而其他配制品没有保留在肺中，但是反而发现以高水平存在于尸体中，位于骨骼中。没有聚合固定剂的与微球结合的177Lu(第3组)具有高的尸体活度，与游离177LuCl3(第4组)非常相似，从而证明DTPA-PLO固定剂对于标记的微球的高的体内稳定性是重要的。除吸收在尸体骨骼中之外，与DTPA-PLO络合但是没有微球的177Lu(第2组)也通过肝/脾从血液去除，肝/脾含有32％的测量活度。然而，平均而言，第2组的总计数(873)是其他组的总计数的25％，指示177Lu-DTPA-PLO主要通过另一个途径，可能是通过肾系统被除去。
表3
实施例8：体内177Lu-DTPA-PLO-微球的稳定性测试–长期小鼠肺保留测试
向5只BALB/c小鼠静脉内(通过尾静脉)注射177Lu-DTPA-PLO-微球的配制品(3mg/kg)。微球直径为8μm，并且负载有26MBq177Lu/毫克，并且以在5％右旋糖溶液中的悬浮液(0.17mL)的形式注射，使得每只小鼠接受1.66MBq的平均活度。注射之后5天，对小鼠进行安乐死并解剖以测量肺、肝和尸体中的放射性活度。用Infinia Hawkeye 4 SPECT扫描仪(GEHealthcare)对解剖的小鼠进行成像，并且用CRC-Ultra室(Capintec)测量肺中的活度。结果在图4和表4中总结。
五只解剖小鼠尸体以及其切除的心脏/肺、肝和脾的γ相机图像在图4A中示出。图像的计数乘以20的因数以用于可视化。清楚的是，即使在注射后5天之后，心脏/肺中的177Lu保留也很高。将心脏从肺移除(图4B)清楚地证明微球确实越过心脏并且停留在肺的毛细管网络中。
表4示出静脉内注射177Lu-DTPA-PLO-微球之后5天5只小鼠的肺、肝和尸体中存在的放射性活度。在注射后5天，57％的注射活度仍然存在于小鼠的切除的肺中(针对放射性衰减校正时间)。来自γ图像的感兴趣的区域(图4A)示出在5天之后小鼠剩余的活度中，79％存在于肺中，20％存在于尸体中，并且1％存在于肝/脾中(表4)。
表4
实施例9：针对177Lu-DTPA-PLO-微球和吸收的剂量在小鼠中的平均体内肺保留的总结
在多个(n＝8)单独实验的过程中，向总计64只BALB/c小鼠静脉内(通过尾静脉)注射177Lu-DTPA-PLO-微球的配制品(3mg/kg)。微球直径为8μm，并且以在5％右旋糖溶液中的悬浮液(0.17mL)形式注射，使得每只小鼠接受1.6MBq的平均活度。在注射后多个时间点(24至552个小时)，对小鼠进行安乐死并解剖以测量肺、肝和尸体中的放射性活度。用InfiniaHawkeye 4 SPECT扫描仪(GE Healthcare)对解剖的小鼠进行成像，并且用CRC-Ultra室(Capintec)测量肺中的活度。结果在表5和图5中总结。
表5总结注射177Lu-DTPA-PLO-微球的64只小鼠随时间推移的肺活度和γ相机计数。注射后5天之后肺中的平均活度为注射活度的53％(针对衰减校正时间)。截止注射后23天，平均肺保留仍然是注射活度的16％，但是考虑到177Lu的半衰期是6.647天，所以肺中的实际活度仅是注射活度的1％。
使用来自表5的数据计算针对肺和骨骼的注射剂量百分比(％ID)/克组织重量/个尸体(图5)。进行此计算时假设小鼠肺的平均组织湿重为0.18g，并且小鼠骨骼重量为1.5g(20g小鼠的7.5％；Di Masso,R.J.,Celoria,G.C.&Font,M.T.,1998.Morphometricskeletal traits,femoral measurements,and bone mineral deposition in mice withagonistic selection for body conformation.Bone,22(5),第539–543页。)。清楚地，肺随时间推移接受大部分剂量/克组织。使用医学内放射剂量(Medical Internal RadiationDose，MIRD)方案并忽略由于来自177Lu的γ放射的小贡献来估计放射吸收剂量(RadiationAbsorbed Dose)。估计注射1.6MBq活度的177Lu-DTPA-PLO-微球的肺在23天内接受的剂量为75.4戈瑞，而估计骨骼的吸收剂量仅为2.8戈瑞。
表5
实施例10：固定剂的DTPA与PLO的摩尔比对于体内小鼠肺保留的影响
用不同的DTPA与PLO的摩尔比合成若干不同的DTPA-PLO构建体(实施例1)。使用具有17.5、13.8和7.3的DTPA与PLO的摩尔比的这些聚合物中的三个来构建三种177Lu-DTPA-PLO-微球配制品(8μm直径)。将这些以在5％右旋糖溶液中的悬浮液(0.15mL)形式静脉内(通过尾静脉)注射到三组四只BALB/c小鼠中，使得每只小鼠接受0.9MBq的平均活度。注射之后4天，对小鼠进行安乐死并解剖以用CRC-Ultra室(Capintec)测量肺中的放射性活度。肺保留结果在表6中总结。
表6中的结果指示需要更高的DTPA与PLO的摩尔比来得到在4天内小鼠的肺中放射性同位素(177Lu)的高保留。13.8的摩尔比产生57％的注射活度的最高保留。增加摩尔比轻微降低保留。然而，7.3的摩尔比在4天内仅产生5％的注射活度的保留。似乎存在DTPA与PLO聚阳离子的最佳比率，借此存在足够的DTPA分子来保留177Lu，还同时提供PLO上足够数量的游离胺基团以促进固定剂与聚苯乙烯磺酸酯微球的强结合。具有3摩尔比的构建体(图2)甚至在体外稳定性测试中也未能表现良好，其中它们在哈特曼氏溶液(其模拟存在于血浆中的2mM Ca2+)的存在下未将177Lu保留在微球上。
表6
DTPA与PLO的摩尔比 同位素结合产率 注射的平均体内肺保留％(n＝4)±sem
17.5 93.7 47.3±2.6
13.8 90.7 56.8±3.3
7.3 94.6 5.0±1.3
实施例11：灭菌条件的优化
可遵循实施例5中的方法由无菌材料开始并使用无菌技术(步骤1-5)产生无菌177Lu-DTPA-PLO-微球配制品。然而，如果完整配制品对于标准高压灭菌条件(步骤6，实施例5)是稳定的并且仍然提供高体内保留，则将是有利的。这种配制品的任何临床使用的要求是，在分配和静脉内注射到患者中之前，通过高压灭菌对最终配制品进行灭菌。四种不同的无菌配制品在BALB/c小鼠中的体内肺保留在图6中总结为在各个时间点处注射剂量百分比/克组织湿重。在无菌条件下制备的177Lu-DTPA-PLO-微球的数据作为与拟合指数曲线(数据来自实施例8)的十字形记号示出。除这些数据之外，产生三种不同的高压灭菌的177Lu-DTPA-PLO-微球配制品。第一(+数据点)，177Lu-DTPA-PLO-微球通过在水中执行的步骤2和6(实施例5)制备。第二(三角形数据点)，177Lu-DTPA-PLO-微球通过在水中执行的步骤2和在盐水中执行的步骤6(实施例5)制备。第三(圆数据点)，177Lu-DTPA-PLO-微球通过在盐水中执行的步骤2和6两者(实施例5)制备。将这三种177Lu-DTPA-PLO-微球配制品以在盐水中的悬浮液(0.17mL)的形式静脉内(通过尾静脉)注射到三组10只BALB/c小鼠中，使得每只小鼠接受1.3MBq的平均活度。在注射后6天，对来自每组的5只小鼠进行安乐死并解剖以用CRC-Ultra室(Capintec)测量肺中的放射性活度。在注射之后12天，对于每组中剩余的5只小鼠重复此过程。
图6示出与接受在水中高压灭菌的配制品的小鼠的肺中存在的活度相比，接受在盐水中高压灭菌的配制品的小鼠的肺中存在增加的活度水平；此增加在实验的时间过程中维持。这些结果指示在盐水中对微球配制品进行高压灭菌是灭菌的优选方法。
实施例12：小鼠肺中小鼠4T1-luc2乳腺癌细胞系的生长
小鼠4T1-luc2乳腺癌细胞系是最常用的肺转移模型，因为能够非创伤性地对体内肿瘤生长进行成像。用萤火虫荧光素酶基因(luc2)转染细胞系，使得在萤光素的存在下，活细胞产生可用生物发光相机检测的光。为了开始用此肺转移模型进行研究，将12只BALB/c小鼠分为三组，并且静脉内(通过尾静脉)注射在Hank氏平衡盐溶液(150μL)中的25000、50000或100000个4T1-luc2细胞。在注射细胞后第3、6、9和13天测量肺肿瘤生长。简而言之，向小鼠腹腔内(IP)注射荧光素酶底物萤光素，并且然后对小鼠进行麻醉，并且用IVISSpectrum体内成像系统(PerkinElmer)测量肺生物发光。来自小鼠肺的生物发光通量测量值在图7中示出。发现注射50000个细胞产生在生物发光通量的适宜范围内的生长曲线，并且此数量的细胞适于进行进一步的实验研究。
实施例13：来自177Lu-DTPA-PLO-微球的内放射对于小鼠肺中小鼠4T1-luc2肿瘤生长的影响
通过静脉内(通过尾静脉)注射4T1-luc2细胞(5000个细胞)使肿瘤在18只BALB/c小鼠的肺中生长。在肿瘤生长5天时，用IVIS Spectrum体内成像系统(PerkinElmer)测量肺生物发光，并且将小鼠分为两组；治疗组(n＝9)，和携带大约相等的总肿瘤负荷的阴性对照组(n＝9)。然后向治疗组中的小鼠静脉内(通过尾静脉)注射177Lu-DTPA-PLO-微球的配制品(3mg/kg)，使得每只小鼠接受1.59MBq的平均活度。向阴性对照组中的小鼠注射非放射性175Lu-DTPA-PLO-微球配制品(3mg/kg)。微球直径为8μm，并且以在5％右旋糖溶液中的悬浮液(0.17mL)形式注射。在生长11天时(暴露于内放射6天之后)，测量肿瘤生物发光，并且结果在图8中示出。
图8示出来自177Lu-DTPA-PLO-微球的内电离辐射对于小鼠肺4T1-luc2肿瘤的生长的影响。示出两组小鼠的结果；治疗组(177Lu)，其接受177Lu-DTPA-PLO-微球；和阴性对照组(Ctrl)，其接受175Lu-DTPA-PLO-微球。经治疗的小鼠显示在第5天与第11天之间肿瘤生长的统计上显著的减少(p＝0.0012)，如通过由荧光素酶转染的肿瘤细胞产生的生物发光通量的变化降低所测量的。阴性对照组具有比经治疗组大6.58倍的生物发光的中值变化。
实施例14：使用177Lu-DTPA-PLO-微球延迟小鼠肺4T1-luc2肿瘤的生长的到健康终点的改善存活
通过静脉内(通过尾静脉)注射4T1-luc2细胞(5000个细胞)使肿瘤在20只BALB/c小鼠的肺中生长。在肿瘤生长5天时，用IVIS Spectrum体内成像系统(PerkinElmer)测量肺生物发光，并且将小鼠分为两组；治疗组，和携带大约相等的总肿瘤负荷的阴性对照组。然后向治疗组中的小鼠静脉内(通过尾静脉)注射177Lu-DTPA-PLO-微球的配制品(3mg/kg)，使得每只小鼠接受1.59MBq的平均活度。向阴性对照组中的小鼠注射非放射性175Lu-DTPA-PLO-微球配制品(3mg/kg)。微球直径为8μm，并且以在5％右旋糖溶液中的悬浮液(0.17mL)形式注射。每日仔细监测小鼠的健康，并且针对若干标准小鼠模型准则对小鼠进行评分(0-3)。对小鼠进行评分的人并不知道哪些小鼠被分配到每个组，并且如果在所有准则下达到大于或等于3的总评分，则立即测量肺生物发光，并且将动物宰杀。经常构成终点的常规准则是皮毛外观、活动、移动、呼吸和体重。使用宰杀小鼠的时间点来估计两个组的存活函数，其在图9中示出。
图9所示的存活函数清楚地示出小鼠肺肿瘤的内放射治疗产生小鼠到健康终点的存活延长。存活中值差值为4天，这是统计上显著的(p＝0.02)。
实施例15：不同剂量的内放射对于小鼠肺中小鼠4T1-luc2肿瘤生长的影响
研究对于暴露于177Lu-DTPA-PLO-微球上的不同的放射性活度的小鼠肺肿瘤的生长的影响。通过静脉内(通过尾静脉)注射4T1-luc2细胞(50000个细胞)使肿瘤在40只BALB/c小鼠的肺中生长。在肿瘤生长5天时，用IVIS Spectrum体内成像系统(PerkinElmer)测量肺生物发光，并且将小鼠分为两组；阴性对照组(n＝10)，和携带大约相等的总肿瘤负荷的三个治疗组(3×n＝10)。然后向三个治疗组中的小鼠静脉内(通过尾静脉)注射177Lu-DTPA-PLO-微球的配制品(3mg/kg)，使得每只小鼠接受0.82、1.1或1.37MBq的平均活度。向阴性对照组中的小鼠注射非放射性175Lu-DTPA-PLO-微球配制品(3mg/kg)。微球直径为8μm，并且以在5％右旋糖溶液中的悬浮液(0.17mL)形式注射。在生长11天时(暴露于内放射6天之后)，测量肿瘤生物发光，并且结果在图10中示出。
图10示出来自177Lu-DTPA-PLO-微球的三个不同剂量的内电离辐射对于小鼠肺4T1-luc2肿瘤的生长的影响。示出四组小鼠的结果；阴性对照组(Ctrl)，其接受175Lu-DTPA-PLO-微球；和三个治疗组，其接受具有0.82、1.1和1.37MBq的放射性活度的177Lu-DTPA-PLO-微球。对于三个治疗组(0.82、1.1和1.37MBq)中的每个，在第5天与第11天之间存在肿瘤生长的统计上显著减少，如通过由荧光素酶转染的肿瘤细胞产生的生物发光通量的变化降低所测量的(分别为p＝0.011、0.026和0.0017)。阴性对照组具有分别比治疗组(0.82、1.1和1.37MBq)大1.9、1.8和2.3倍的生物发光的中值变化。
实施例16：来自177Lu-DTPA-PLO-微球的内放射对于小鼠肺中小鼠B16-F10-luc2肿瘤的生长的影响
肺被鉴定为远距离黑素瘤转移的最频繁位点，具有非常差的患者结果(Tas,F.,&Erturk,K.(2017).Recurrence behavior in early-stage cutaneous melanoma:pattern,timing,survival,and influencing factors.Melanoma Research,27(2),134–139.http://doi.org/10.1097/CMR.0000000000000332)。C57BL/6衍生的B16黑素瘤是常用的小鼠肺转移模型。研究来自177Lu-DTPA-PLO-微球的内放射对于BALB/c小鼠的肺中用荧光素酶转染的B16-F10-luc2细胞系的生长的影响。
通过静脉内(通过尾静脉)注射B16-F10-luc2细胞(100 000个细胞)使肿瘤在18只BALB/c小鼠的肺中生长。在肿瘤生长7天时，用IVIS Spectrum体内成像系统(PerkinElmer)测量肺生物发光，并且将小鼠分为两组；治疗组(n＝10)，和携带大约相等的总肿瘤负荷的阴性对照组(n＝10)。然后向治疗组中的小鼠静脉内(通过尾静脉)注射177Lu-DTPA-PLO-微球的配制品(3mg/kg)，使得每只小鼠接受1.60MBq的平均活度。向阴性对照组中的小鼠注射非放射性175Lu-DTPA-PLO-微球配制品(3mg/kg)。微球直径为8μm，并且以在盐水中的悬浮液(0.17mL)形式注射。在生长12天时(暴露于内放射5天之后)，测量肿瘤生物发光，并且针对单个小鼠计算两个测量之间的生物发光差值。这些结果在图11中示出。
图11示出来自177Lu-DTPA-PLO-微球的内电离辐射对于小鼠肺B16-F10-luc2肿瘤的生长的影响。示出两组小鼠的结果；治疗组(177Lu)，其接受177Lu-DTPA-PLO-微球；和阴性对照组(Ctrl)，其接受175Lu-DTPA-PLO-微球。经治疗的小鼠显示在第7天与第12天之间肿瘤生长的统计上显著的减少(p＝0.0004)，如通过由荧光素酶转染的肿瘤细胞产生的生物发光通量的变化降低所测量的。阴性对照组具有比经治疗组大5.56倍的生物发光的中值变化。
实施例17：来自暴露于静脉内注射的177Lu-DTPA-PLO-微球24天的正常小鼠的肺的组织学检查
此研究测试内放射治疗对于没有肿瘤的正常小鼠的影响，以提供一些耐受证据。向5只BALB/c小鼠静脉内(通过尾静脉)注射177Lu-DTPA-PLO-微球(3只小鼠)或175Lu-DTPA-PLO-微球(2只小鼠)的配制品。微球直径为8μm，并且以3mg/kg的负载的在5％右旋糖溶液中的悬浮液(0.17mL)形式注射。接受177Lu的小鼠接受1.66MBq的平均活度。每日仔细监测小鼠的健康，并且针对若干标准小鼠模型准则对小鼠进行评分(0-3)，如以上对于具有肿瘤的小鼠所进行的。在注射24天之后，对小鼠进行安乐死，并且将肺取出并固定在10％中性缓冲福尔马林中。将来自每只小鼠的单个肺送到公认的兽医病理学实验室以用于组织学检查，并且由有资格的病理学家报告，所述病理学家并不知道哪些小鼠接受了内放射治疗并且哪些接受了对照治疗。
由此研究获得的结果显示，第一，在24天每日仔细监测期间，内放射治疗对于正常小鼠的健康具有可忽略的影响。经治疗的小鼠和对照小鼠的总体行为和状况是无法区分的。第二，关于组织学发现，图12示出在40×放大率下来自用苏木精和伊红染色的小鼠的肺组织。一些微球用箭头突出显示，并且白条示出50μm。病理学家的报告声明，“存在广泛且随机散布在整个肺中的大量微球。总体上，来自5只小鼠中的每只的肺样品基本上是相同的。没有与微球相关联的炎症的显著组织学证据。也没有肺中纤维变性的证据。此外，没有纤维蛋白沉积的证据，并且没有肺巨核细胞(血小板)的证据。似乎没有由于辐射暴露产生的对于此研究中的小鼠的肺组织的任何不利影响”。
实施例18：暴露于静脉内注射的177Lu-DTPA-PLO-微球5天的具有4T1-luc2肿瘤的小鼠肺的组织学检查
通过静脉内(通过尾静脉)注射4T1-luc2细胞(50000个细胞)使肿瘤在20只BALB/c小鼠的肺中生长。在肿瘤生长5天时，用IVIS Spectrum体内成像系统(PerkinElmer)测量肺生物发光，并且将小鼠分为两组；治疗组(n＝9)，和携带大约相等的总肿瘤负荷的阴性对照组(n＝9)。然后向治疗组中的小鼠静脉内(通过尾静脉)注射177Lu-DTPA-PLO-微球的配制品(3mg/kg)，使得每只小鼠接受1.6MBq的平均活度。向阴性对照组中的小鼠注射非放射性175Lu-DTPA-PLO-微球配制品(3mg/kg)。微球直径为8μm，并且以在5％右旋糖溶液中的悬浮液(0.17mL)形式注射。在生长10天时(暴露于内放射5天之后)，宰杀小鼠并且取出肺以用于组织学分析。将来自每个组的4个肺送到公认的兽医病理学实验室以用于组织学检查，并且由有资格的病理学家报告，所述病理学家并不知道哪些小鼠接受了内放射治疗并且哪些接受了对照治疗。
最后，在实验过程中，仔细监测小鼠，并且没有来自内放射治疗对于其健康的影响。第二，关于组织学发现，图13示出在40×放大率下来自用苏木精和伊红染色的小鼠的肺组织。一些微球用箭头突出显示。病理学家的报告声明，“微球广泛且随机分布在整个肺中。一般情况下，肺的间质组织中的微球多于在肿瘤内的微球。我发现来自不同小鼠的结果相当地一致，并且在任何小鼠之间没有可辨别的差异。在微球周围具有非常少的炎症，并且微球周围大部分没有炎症。微球周围没有炎症。或者在一些小鼠中，在少量微球周围具有非常轻微的中性粒细胞浸润。所有小鼠在肿瘤内均具有微球。微球也可被发现邻近于肿瘤。在所有肿瘤中均存在细胞死亡和坏死，不管它们中是否有微球。我寻找肺的普遍炎症，以评估对于肺的放射损伤的可能性。我并不认为存在肺组织的显著普遍炎症，并且因此我并不认为存在对于肺的明显放射。没有肺合胞体细胞的证据，并且没有肺中纤维变性的证据。肿瘤中存在炎症并且无论肿瘤中是否有微球都存在基本上相同轻微程度的炎症。存在肿瘤细胞的变性和坏死。我在不知道哪些小鼠经治疗并且哪些小鼠是对照的情况下查看这些情况。然而，所有小鼠基本上是相同的，并且小鼠之间似乎没有显著差异”。
实施例19：静脉内注射的177Lu-DTPA-PLO-微球在5天内对于小鼠的全血计数的短期影响
BALB/c小鼠品系可能不是研究内放射对于肺的生物影响的最适当模型。已经建议CBA小鼠品系作为研究放射肺炎和肺纤维变性的更好模型(Dabjan,M.B.等人,2016.Asurvey of changing trends in modelling radiation lung injury in mice:Bringingout the good,the bad,and the uncertain.Laboratory Investigation,96(9),第936–949页。)
此研究测试内放射治疗对于全血细胞计数的短期影响，以提供进一步的耐受证据。向5组5只CBA小鼠静脉内(通过尾静脉)注射177Lu-DTPA-PLO-微球(3×5只小鼠)或175Lu-DTPA-PLO-微球(5只小鼠)的配制品。剩余5只小鼠留下作为非注射对照以研究静脉内微球注射的影响。微球直径为8μm，并且以3mg/kg的负载的在盐水中的悬浮液(0.17mL)形式注射。接受177Lu的小鼠接受1.6MBq的平均活度。每日仔细监测小鼠的健康，并且针对若干标准小鼠模型准则对小鼠进行评分(0-3)。在注射后5小时、24小时和5天，对三个治疗组小鼠进行麻醉，并且通过心脏穿刺将血液采集到预负载有抗凝剂的注射器中。在注射后5小时，对阴性对照小鼠进行麻醉，并且通过心脏穿刺将血液采集到预负载有抗凝剂的注射器中。通过相同程序也从非注射对照组的小鼠采集血液。在Advia 2120血液学系统(Siemens)上分析采集的血液，并且结果在图14中试示出。
内放射治疗对于全白细胞计数、淋巴细胞计数和中性粒细胞计数的影响分别在图14A、图14B和图14C中示出。在暴露于内放射5小时之后观察到细胞计数轻微降低；然而，这不是统计上显著的，并且截止24小时恢复细胞水平。在5天暴露之后，测量到中性粒细胞水平轻微升高，虽然这也不是统计上显著的。在全红细胞计数和参数(诸如测量的血红蛋白、平均红细胞体积和红细胞压积)中未观察到其他变化。
还治疗从对照组和治疗组的小鼠采集的血液以分离外周血单核细胞(PBMC)并用于评估DNA损伤。通过Ficoll-Paque密度梯度离心分离PBMC，附着到显微镜载玻片，并且用γH2AX和53BP1抗体染色以指示双链DNA断裂(被称为灶(foci))的存在。使用共焦显微镜(Leica SP1，Leica Microsystems)对PBMC进行成像，并且使用Fiji成像软件定量DNA损伤灶。灶分析旨在针对γH2AX和53BP1标记定量最少100个PBMC。
来自PBMC对于内放射治疗的DNA损伤响应的分析的结果在图15中示出。在注射后5小时，在经治疗的组中观察到具有γH2AX和53BP1灶的PBMC的百分比增加。然而，当与阴性对照组相比时，此增加不是统计上显著的，并且在注射后5天返回到与阴性对照组相似的水平。与非注射小鼠相比，注射175Lu-DTPA-PLO-微球的阴性对照小鼠显示增加的灶百分比，然而，此增加不是统计上显著的。
实施例20：静脉内注射的177Lu-DTPA-PLO-微球在3个月内对于小鼠的全血计数的长期影响
此研究评估内放射治疗对于全血细胞计数的长期影响，以提供进一步的177Lu-DTPA-PLO-微球的耐受证据。向三组CBA小鼠静脉内(通过尾静脉)注射175Lu-DTPA-PLO-微球(第1组，3只小鼠，非放射性对照)、0.55MBq的177Lu-DTPA-PLO-微球(第2组，5只小鼠)或1.1MBq的177Lu-DTPA-PLO-微球(第3组，5只小鼠)的配制品。微球直径为8μm，并且以3mg/kg的负载的在盐水中的悬浮液(0.17mL)形式注射。对于第2组和第3组，接受177Lu的小鼠分别接受0.51和1.0MBq的平均活度。对于第2组合第3组，基于过去的保留数据计算估计的平均肺吸收剂量分别为23.2和46.1Gy。每日仔细监测小鼠的健康，持续14天，接着一周两次进行健康评估。针对若干标准小鼠模型准则对小鼠进行评分(0-3)。在注射后3个月，对小鼠进行麻醉，并且通过心脏穿刺将血液采集到预负载有抗凝剂(在PBS中的0.18％EDTA)的注射器中。在Advia2120血液学系统(Siemens)上分析采集的血液样品，并且结果在图16中试示出。
内放射治疗对于全白细胞计数、淋巴细胞计数和中性粒细胞计数的影响分别在图16A、图16B和图16C中示出。第3组中的小鼠表现出轻微升高的白细胞计数，然而，这不是统计上显著的。对照组与177Lu注射组之间的淋巴细胞和中性粒细胞计数没有显示出显著变化。在红细胞计数中或在其他参数(诸如测量的血红蛋白、平均红细胞体积和红细胞压积)中未观察到变化。
还治疗从对照组和治疗组的小鼠采集的血液以分离外周血单核细胞(PBMC)并用于评估DNA损伤。通过Ficoll-Paque密度梯度离心分离PBMC，附着到显微镜载玻片，并且用γH2AX和53BP1抗体染色以指示双链DNA断裂(被称为灶)的存在。使用共焦显微镜(LeicaSP1，Leica Microsystems)对PBMC进行成像，并且使用Fiji成像软件定量DNA损伤灶。灶分析旨在针对γH2AX和53BP1标记定量最少100个PBMC。
来自PBMC对于内放射治疗的DNA损伤响应的分析的结果在图17中示出。γH2AX和53BP1灶的百分比在对照组与177Lu注射组之间未观察到显著差异。
实施例21：暴露于静脉内注射的177Lu-DTPA-PLO-微球3个月的小鼠肺的组织学检查
向三组CBA小鼠静脉内(通过尾静脉)注射175Lu-DTPA-PLO-微球(第1组，3只小鼠，非放射性对照)、0.55MBq的177Lu-DTPA-PLO-微球(第2组，5只小鼠)或1.1MBq的177Lu-DTPA-PLO-微球(第3组，5只小鼠)的配制品，如实施例20中所示。每日仔细监测小鼠的健康，持续14天，接着一周两次进行健康评估。针对若干标准小鼠模型准则对小鼠进行评分(0-3)。在注射后3个月，并且在血液采集(实施例20)之后，通过颈脱臼法对小鼠进行安乐死，并且采集肺和心脏。将来自每只小鼠的肺和心脏组织的样品送到公认的兽医病理学实验室以用于组织学检查，并且由有资格的病理学家报告，所述病理学家并不知道哪些小鼠接受了内放射治疗并且哪些接受了对照治疗。
由此研究获得的结果显示，第一，在24天每日仔细监测期间，内放射治疗对于正常小鼠的健康具有可忽略的影响。经治疗的小鼠和对照小鼠的总体行为和状况是无法区分的。第二，关于组织学发现，病理学家的报告声明，“检查的小鼠是31、41、51、23、24、45、15、42、44。所有的肺含有微球。还检查心脏和心包膜。还检查其他临近组织，包括食道、气管、骨骼肌和支气管淋巴结。在所有小鼠的所有肺中，肺泡巨噬细胞的数量轻微增加。我认为这是由于肺水肿引起的，并且可能是与安乐死相关联的偶然发现。在肺中，在微球中和在微球周围，没有炎症、纤维蛋白沉积、血小板合胞体、坏死或纤维变性的证据。在心脏或心包膜中，没有与放射暴露相关联的任何炎症或坏死或其他组织反应的证据。在其他相关联的组织(诸如食道、气管、骨骼肌和支气管淋巴结)中也没有任何炎症或坏死的证据”。病理学家的报告的总结可见于表7。
表7
实施例22：体内177Lu-DTPA-PLO-微球的稳定性测试–短期兔肺保留测试
先前的测试全部被称为小鼠模型，并且希望在不同的动物物种，优选地非啮齿动物中验证生物分布和稳定性结果。选择兔是由于a)它们较大的尺寸能够在相关器官中实现生物分布的更好成像，和b)能够通过静脉内注射、即通过耳静脉施用微球。在麻醉状态下，向2只新西兰白兔静脉内(通过耳静脉)注射177Lu-DTPA-PLO-微球(3.9mg/kg)。微球直径为8μm，并且在5％右旋糖溶液(3mL)中注射，使得每只兔接受107MBq的平均活度。在处于麻醉状态下时，在注射之后立即以及在注射后1、2和3小时获得兔的γ相机图像(图18)。图像的计数乘以50的因数以用于可视化。另外，在麻醉状态下，向2只新西兰白兔静脉内(通过耳静脉)注射177Lu-DTPA-PLO聚合物(没有微球)，并且向2只兔静脉内(通过耳静脉)注射在5％右旋糖溶液中的分别具有120和112MBq的平均放射性活度的游离177LuCl3。
177Lu-DTPA-PLO-微球停留在其中γ发射同位素持续的直径受限的肺循环处。图18描绘放射性标记在捕获在肺的血管网络中的微球上的有效保留。在3小时之后，将动物宰杀并且解剖肺和肝。器官和尸体的单独γ相机图像揭示，发现总放射性活度的95.7±0.3％保留在肺中，0.2±0.02％在肝中，并且4.1±0.2％在尸体中(表8)。相比之下，游离177LuCl3未保留在肺中，并且快速与尸体的骨缔合。未结合微球的聚合物177Lu-DTPA-PLO也未保留在肺中，然而在兔的肾和膀胱中发现高水平的放射性活度，分别为11.5％和63.3％。这指示177Lu的聚合物结合形式通过肾系统快速除去。
表8
实施例23：体内177Lu-DTPA-PLO-微球的稳定性测试–长期兔肺保留测试
在麻醉状态下，向2只新西兰白兔静脉内(通过耳静脉)注射177Lu-DTPA-PLO-微球(3mg/kg)。微球直径为8μm，并且在盐水(3mL)中注射，使得每只兔接受74.9MBq的平均活度。在注射之后立即以及在注射后1、6、12和19天获得兔的γ相机图像，每种情况在麻醉状态下(图19)。图像的计数乘以5的因数以用于可视化。注射后每日紧密监测兔的总体行为和状况以评估对于健康的任何影响。通过在图像上描画感兴趣的区域来从图19中的兔γ相机图像获得单个器官的γ计数。通过用已知来源进行单点校准来将这些γ计数转换为实际活度。这些数据在表9中总结。
如同以上的小鼠实验，在兔的肺中放射性微球的静脉内注射和持续存在在19天内是良好耐受的；对于健康没有可辨别的影响。在施用期间兔的γ相机成像证明，通过耳静脉途径注射的放射性标记的微球定量地将静脉回流过渡到心脏，也到右侧心室，并且然后随后保留在肺中(图19)。清楚的是，6天之后显著量的活度(所注射活度的平均40.9％(针对衰减校正))保留在肺中，这与放射性微球在小鼠的肺中的保留(44.6％，表5)是相当的。
表9
实施例24：递送到暴露于静脉内注射的177Lu-DTPA-PLO-微球的兔器官的吸收剂量
使用表9中所示的新西兰白兔肺、骨骼和肾的γ计数和活度来计算在19天时间过程内递送到这些器官的注射剂量百分比/克组织湿重(图20)。进行此计算时假设兔肺的平均组织湿重为20g，肾的平均组织湿量为15g，并且兔骨骼的重量为265.2g(平均兔体重的6％；Stephen W Barthold,2015.Pathology of Laboratory Rodents and Rabbits,第四版)。与小鼠一样，兔肺随时间推移接受大部分的剂量/克组织。使用医学内放射剂量(MIRD)方案并忽略由于来自177Lu的γ放射的小贡献来估计放射吸收剂量。注射177Lu-DTPA-PLO-微球上的74.9MBq活度的肺在19天内接受的吸收剂量估计为31.1戈瑞，而估计肾和骨骼的吸收剂量分别估计为仅1.5和1.1戈瑞。
实施例25：静脉内注射的177Lu-DTPA-PLO球对于兔的全血计数随时间推移的影响
此研究测试内放射治疗对于全血细胞计数的影响，以提供进一步的耐受证据。在麻醉状态下，向10只新西兰白兔静脉内(通过耳静脉)注射177Lu-DTPA-PLO-微球(2mg/kg；2×4只兔)或175Lu-DTPA-PLO-微球(2mg/kg；2只兔)作为阴性对照。微球直径为8μm，并且在盐水(3mL)中注射，并且注射177Lu的兔接受47或94MBq的平均活度。注射后每日紧密监测兔的总体行为和状况以评估对于健康的任何影响。在即将注射之前和在注射后5小时、24小时、7天、14天和21天，通过耳静脉将血液采集到预负载有抗凝剂的注射器中。在Advia 2120血液学系统(Siemens)上分析采集的血液，并且结果在图21中示出。
内放射治疗对于全白细胞计数、淋巴细胞计数和中性粒细胞计数的影响分别在图21A、B和C中示出。在暴露于内放射治疗5小时时，最高活度组94MBq的平均总白细胞计数增加，虽然这在同一组(n＝4)内是高度变化的。对于两个治疗组还测量到淋巴细胞降低和中性粒细胞增加，并且截止到24小时，这些细胞计数返回到正常水平。在全红细胞计数和参数(诸如测量的血红蛋白、平均红细胞体积和红细胞压积)中未观察到其他变化。
实施例26：暴露于静脉内注射的177Lu-DTPA-PLO-微球3个月的兔肺的组织学检查
在麻醉状态下，以3mg/kg的负载向三组新西兰白兔静脉内(通过耳静脉)注射175Lu-DTPA-PLO-微球(第1组，1只兔)或177Lu-DTPA-PLO-微球(第2组和第3组，各自2只兔)。微球直径为8μm，并且在盐水(3mL)中注射，并且第2组和第3组分别接受39和90MBq的平均放射性活度。注射后每日紧密监测兔的总体行为和状况以评估对于健康的任何影响。在注射后3个月，宰杀兔并且采集心脏和肺。将来自肺、心脏和心包膜的组织样品送到公认的兽医病理学实验室以用于组织学检查，并且由有资格的病理学家报告，所述病理学家并不知道哪些兔接受了内放射治疗并且哪些接受了对照治疗。
最后，在实验过程中，仔细监测兔，没有来自内放射治疗对于其健康的影响。第二，关于组织学发现，图22示出在40×放大率下来自用苏木精和伊红染色的兔的肺组织。来自第2组的一只兔呈现经常与微球相关联的适度炎性反应(图22，左侧)。然而，这在第2组的其他兔中不存在，并且接受较高剂量的放射性活度的第3组兔中也不存在。
病理学家的报告声明，“兔254具有随机分散在整个肺实质中的多个小的清晰显示的肉芽肿。这些肉芽肿大多在其中心含有微球。肉芽肿通过巨噬细胞和淋巴细胞的聚集形成，但是没有坏死或纤维蛋白沉积的显著证据。兔260、263、274、272没有显著的肺病变，虽然有大量微球广泛分散在整个肺中。即，没有纤维变性、细胞死亡、血小板合胞体、纤维蛋白沉积或炎症或肺组织细胞增多症。在兔254、260、263、274、272的心包膜或心脏中没有组织学病变。更具体地，没有纤维变性、细胞死亡、血小板合胞体、纤维蛋白沉积或炎症。在与肺接触的心脏一侧和不与肺接触的心脏一侧中没有组织学差异”。报告的总结在表10中示出。
表10
组 编号 肺炎症 心脏炎症 心包膜炎症 炎症类型
1 272 否 否 否 无炎症
2 254 适度反应 否 否 多发性肉芽肿肺
2 260 否 否 否 无炎症
3 263 否 否 否 无炎症
3 274 否 否 否 无炎症
实施例27：体内177Lu-DTPA-PLO-微球的稳定性测试–短期兔肝保留测试
此测试作为在不同内器官的环境中、即在肝中的标记微球稳定性相对于微球保留在肺中的情况下所得到的以上所有结果的指示物来进行。这与用于治疗肝肿瘤的本发明的内放射治疗的任何潜在临床用途具有相关性。将5只新西兰白兔用异氟烷麻醉，插管，静脉内给予流体(哈特曼氏溶液)，并且置于加热充气床上以进行外科手术。通过中线剖腹术(开放性手术)将肝动脉暴露，并且通过微手术插入导管以用于安装177Lu-DTPA-PLO-微球(3只兔)或177LuCl3(2只兔)。微球直径为8μm，并且在5mL的5％右旋糖溶液中以13mg/kg的平均负载注射，平均活度为109MBq。在5mL的5％右旋糖溶液中注射具有105MBq的平均活度的177LuCl3。重新建立到肝的正常血液流动，并且用Infinia Hawkeye 4 SPECT扫描仪(GEHealthcare)对兔进行成像。在手术和成像之后1小时，仍然在麻醉下通过致死性心内注射戊巴比妥钠对兔进行安乐死，并且取出器官以用于进一步SPECT成像。器官计数在表11中示出。
这些结果确认了，与兔肺相比，微球在兔肝中的短期保留比例甚至更高(分别为99.7％相对于95.7％)，这明显满足在肝肿瘤的内放射治疗中应用标记微球的重要要求。相比之下，可溶性177Lu从肝快速缺失并且全身性地分布到尸体中。
表11
剂 肝％总量 肺％总量 血液％总量 尸体％总量
<sup>177</sup>Lu-DTPA-PLO-MS 99.9 0.08 0.19 0.02
<sup>177</sup>Lu-DTPA-PLO-MS 99.9 0.06 ND ND
<sup>177</sup>Lu-DTPA-PLO-MS 99.3 0.54 ND 0.2
平均值±SEM 99.7±0.2 0.2±0.16 0.06±0.06 0.073±0.064
<sup>177</sup>LuCl<sub>3</sub> 20 1.3 15.7 78.2
<sup>177</sup>LuCl<sub>3</sub> 3.82 5.4 12.1 90.4
平均值±SEM 11.9±8.1 3.4±2.1 13.9±1.8 84.3±6.1
实施例28：体内177Lu-DTPA-PLO-微球的稳定性测试–短期兔肝VX2肿瘤保留测试
使用锁孔手术(keyhole surgery)将肝VX2肿瘤移植到新西兰白兔的主肝叶中的一个中，以将两个大约1mm3肿瘤组织立方体植入到小切口中。使用无菌区准备用高压灭菌的设备执行对肝移植接受者的所有手术，并且用异氟烷对兔进行麻醉。在肿瘤生长3周之后，将9只兔用异氟烷麻醉，插管，静脉内给予流体(哈特曼氏溶液)，并且置于加热充气床上以进行外科手术。通过中线剖腹术(开放性手术)将肝动脉暴露，并且通过微手术插入导管以用于安装177Lu-DTPA-PLO-微球(7只兔)或177LuCl3(2只兔)。微球直径为8μm，并且在5mL的5％右旋糖溶液中以12mg/kg的平均负载注射，平均活度为112MBq。在5mL的5％右旋糖溶液中注射具有82MBq的平均活度的177LuCl3。重新建立到肝的正常血液流动，并且用InfiniaHawkeye 4 SPECT扫描仪(GE Healthcare)对兔进行成像。在手术和成像之后1小时，仍然在麻醉下通过致死性心内注射戊巴比妥钠对兔进行安乐死，并且取出器官以用于进一步SPECT成像。器官计数在表12中示出。
所切除的肝的γ相机成像(图23)显示在两个植入肿瘤的外周生长区域中、可能是肿瘤诱导的血管生成丛中具有增强放射性的圆形光晕。动脉内施用的可溶性177Lu如以上对于正常肝一样从肝快速丧失，并且不提供肿瘤的可用成像。
表12
实施例29：体内177Lu-DTPA-PLO-微球的稳定性测试–长期皮下小鼠4T1-luc2肿瘤保留测试
进行此研究以显示在治疗皮下肿瘤中的用途，如与用肺和肝肿瘤进行的以上实施例不同。使用DTPA-PLO作为固定剂，用177Lu放射性标记聚合物微球(1μm直径)。在生长8天时，将微球悬浮液(16.7mg/mL；245MBq/mL；18μL)直接注射到皮下生长的小鼠4T1-luc2肿瘤中。肿瘤从皮下注射的在30μLHank氏平衡盐溶液中的2 000 000个4T1-luc2细胞生长。在肿瘤再生长4天时，解剖小鼠，并且通过用Infinia Hawkeye 4 SPECT扫描仪(GE Healthcare)进行的γ相机成像确定肿瘤、肝和尸体中的放射性活度分布。结果在表13中示出。在第12天时(即，同位素注射后4天)，发现切除的肿瘤含有高比例的总放射性活度(平均值97.4％)。
表13
实施例30： 177Lu-DTPA-PLO-微球对于皮下小鼠4T1-luc2肿瘤生长的影响
图24示出177Lu放射性标记的微球对于小鼠4T1-luc2皮下肿瘤生长的影响，使用IVIS Spectrum体内成像系统(PerkinElmer)在麻醉小鼠中进行测量，其测量荧光素注射(IP)之后肿瘤生物发光放射。示出两组具有肿瘤的小鼠的结果；在第8天时向非治疗组(对照；n＝10)肿瘤内注射非放射性175Lu-DTPA-PLO-微球，并且在第8天时，向治疗组(177Lu；n＝9)肿瘤内注射177Lu-DTPA-PLO-微球。微球直径为1μm，并且在0.3mg负载的18μL的5％右旋糖溶液中注射，平均活度为4.4MBq。使用每个肿瘤作为其本身的对照，并且通过从第12天时在肿瘤中成像的生物发光放射面积减去第8天时的面积来计算生长增量。用177Lu-DTPA-PLO-微球治疗的小鼠皮下肿瘤的尺寸小59％(p＝0.058)。

Claims (45)

1.一种放射性标记材料，其包含：
(i)聚合物；
(ii)放射性同位素；以及
(iii)固定剂；
其中，所述聚合物是包含阴离子取代基团的阳离子交换树脂；并且
其中，所述固定剂能够将所述放射性同位素固定在所述聚合物上或所述聚合物中，并且其中所述固定剂是包含具有多个侧基式金属螯合剂侧链的聚阳离子的大分子。
2.根据权利要求1所述的放射性标记材料，其中所述聚阳离子具有多肽主链，所述多肽主链具有每2至6个氨基酸残基间隔开而共价附接的侧基式侧链。
3.根据任一前述权利要求所述的放射性标记材料，其中所述金属螯合剂选自由以下组成的组：乙二胺四乙酸(EDTA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-N,N',N",N'"-四乙酸(DOTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、巯基乙酰三甘氨酸(MAG3)、6-肼基吡啶-3-羧酸(Hynic)、二巯基琥珀酸(DMSA)、乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、三乙烯四胺(TETA)、1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7,10-N,N',N",N'"-四乙酸(TRITA)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、去铁胺(desferral)、sarcophagine(SarAr)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-N,N',N",N'"-四(亚甲基)膦酸(DOTMP)；1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7,10-N,N',N",N'"-四(亚甲基)膦酸；1,4,7,10-四氮杂环十四烷-1,4,7,10-N,N',N",N'"-四(亚甲基)膦酸；二乙烯三胺-N,N',N"-五乙酸以及其异构衍生物；穴状化合物[2,2,2]、穴状化合物[3,2,2]、穴状化合物[2,2,1]以及其单苯并和二苯并衍生物；含有富电子(供体)基团(羟基、羧基、酯、酰胺、胺)的桥接杯[4]芳烃；1,10-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂环十八烷-1,10-N,N'-双乙酸；以及1,10-二氮杂-4,7,13,16四氧杂环十八烷-1,10-N,N'-双丙二酸酯。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的放射性标记材料，其中，所述金属螯合剂选自DOTA和DTPA。
5.根据任一前述权利要求所述的放射性标记材料，其中，选择所述金属螯合剂来维持所选的放射性同位素在体内条件下的固定作用。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的放射性标记材料，其中，所述大分子是聚-D-赖氨酸(PDL)或聚-L-鸟氨酸(PLO)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的放射性标记材料，其中，所述固定剂是具有多个侧基式共价连接的DTPA或DOTA侧链的PDL或PLO。
8.根据权利要求1所述的放射性标记材料，其中，所述聚合物是包含硫酸根、磺酸根、羧酸根和磷酸根基团中的至少一种的阳离子交换树脂。
9.根据任一前述权利要求所述的放射性标记材料，其中，所述聚合物是聚苯乙烯磺酸酯。
10.根据任一前述权利要求所述的放射性标记材料，其中，所述聚合物呈具有在0.5微米与100微米之间的中值直径的粒状微球的形式。
11.根据权利要求10所述的放射性标记材料，其中，所述粒状微球具有0.5微米至50微米的中值直径。
12.根据权利要求10或11所述的放射性标记材料，其中，所述粒状微粒具有高达35微米的中值直径。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的放射性标记材料，其中，所述粒状微球具有0.5微米至35微米的中值直径。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的放射性标记材料，其中，所述粒状微球具有8微米至12微米的中值直径。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的放射性标记材料，其中，所述粒状微球具有8微米的中值直径。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的放射性标记材料，其中，所述放射性同位素能够实现成像和/或治疗。
17.根据权利要求16所述的放射性标记材料，其中，所述成像包括SPECT成像和/或PET成像。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的放射性标记材料，其中，所述放射性同位素选自由以下组成的组：Ac-225、Au-198、Bi-212、Bi-213、Co-57、Cr-51、Cu-64、Cu-67、Dy-165、Er-169、Fe-59、Ga-67、Ga-68、Gd-153、Ho-166、In-111、Ir-192、Lu-177、Pd-103、Rb-81、Rb-86、Re-186、Re-188、Ru-103、Sc-47、Sm-153、Sn-117m、Sr-89、Tb-161、Tc-99m、Tl-201、Y-90、Yb-169和Zr-89。
19.根据任一前述权利要求所述的放射性标记材料，其中，所述放射性同位素选自周期表的XIII族。
20.根据权利要求1至18中任一项所述的放射性标记材料，其中，所述放射性同位素选自由Ga-67、In-111、Lu-177或Y-90组成的组。
21.根据任一前述权利要求所述的放射性标记材料，其包括至少两种放射性同位素的组合以能够实现成像和/或治疗。
22.根据权利要求21所述的放射性标记材料，其中，所述放射性同位素的组合选自Ga-68和Lu-177；Ga-67和Y-90；Ga-68和Y-90；In-111和Y-90；Lu-177和Y-90，以及Ga-67和Tb-161。
23.根据任一前述权利要求所述的放射性标记材料，其还包含至少一种非放射性载体金属。
24.根据权利要求23所述的放射性标记材料，其中，所述非放射性载体金属选自Bi和Fe。
25.根据权利要求23或24所述的放射性标记材料，其中，所述非放射性载体金属能够实现MRI成像和/或X射线相衬成像。
26.根据权利要求23所述的放射性标记材料，其中，所述非放射性载体金属是Fe以能够实现MRI成像，并且/或者所述非放射性载体金属是Bi以能够实现X射线相衬成像。
27.根据任一前述权利要求所述的放射性标记材料，其中，所述放射性同位素发射γ、β和/或正电子辐射。
28.一种双重放射性标记材料，其包含：
(i)聚合物；
(ii)第一放射性同位素；
(iii)第二放射性同位素；
(iv)第一固定剂；以及
(v)第二固定剂；
其中，所述聚合物是包含阴离子取代基团的阳离子交换树脂；并且
其中，所述第一固定剂能够将所述第一放射性同位素固定在所述聚合物上或所述聚合物中，并且其中所述第一固定剂是包含具有多个侧基式金属螯合剂侧链的聚阳离子的大分子；并且其中所述第二固定剂能够将所述第二放射性同位素固定在所述聚合物上或所述聚合物中，并且其中所述第二固定剂是包含具有多个侧基式金属螯合剂侧链的聚阳离子的大分子。
29.一种双重放射性标记材料，其包含：
(i)聚合物；
(ii)第一放射性同位素；
(iii)第二放射性同位素；以及
(iv)固定剂；
其中，所述聚合物是包含阴离子取代基团的阳离子交换树脂；并且
其中，所述固定剂能够将所述第一放射性同位素和所述第二放射性同位素固定在所述聚合物上或所述聚合物中，并且其中所述固定剂是包含具有多个侧基式金属螯合剂侧链的聚阳离子的大分子。
30.一种用于制备根据权利要求1所述的放射性标记材料的方法，其包括：
(i)将根据任一前述权利要求所述的聚合物与根据任一前述权利要求所述的固定剂混合；
(ii)任选地，洗涤所得的混合物；
(iii)进一步添加根据任一前述权利要求所述的放射性同位素；以及
(iv)任选地，洗涤所得的混合物。
31.固定剂用于将放射性同位素固定在聚合物上或聚合物中的用途，其中，所述固定剂、所述放射性同位素和所述聚合物是根据权利要求1至27中任一项所述。
32.根据权利要求1至27中任一项所述的放射性标记材料或根据权利要求28或29所述的双重放射性标记材料用于制造用于治疗癌症和/或用于辐射成像的药物的用途。
33.患者的放射治疗的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的根据权利要求1至27中任一项所述的放射性标记材料或根据权利要求28或29所述的双重放射性标记材料。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述放射治疗是针对肺的内放射治疗。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中，所述放射治疗用于治疗原发性和/或转移性肺肿瘤。
36.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求1至27中任一项所述的放射性标记材料或根据权利要求28或29所述的双重放射性标记材料。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述癌症是原发性肉瘤、原发性或继发性黑素瘤、原发性头颈癌、原发性或继发性脑癌、原发性或继发性肺癌、原发性或继发性肝癌、原发性或继发性乳腺癌、原发性或继发性肾癌(肾肿瘤)、原发性或继发性卵巢癌、原发性或继发性前列腺癌或神经内分泌癌。
38.根据权利要求33至37中任一项所述的方法，其中，根据权利要求1至27中任一项所述的放射性标记材料或根据权利要求28或29所述的双重放射性标记材料通过静脉内注射施用。
39.根据权利要求33、36或37所述的方法，其中，根据权利要求1至27中任一项所述的放射性标记材料或根据权利要求28或29所述的双重放射性标记材料通过直接肿瘤内注射施用。
40.根据权利要求33、36或37所述的方法，其中，根据权利要求1至27中任一项所述的放射性标记材料或根据权利要求28或29所述的双重放射性标记材料通过腹腔内注射施用。
41.根据权利要求33、36或37所述的方法，其中，根据权利要求1至27中任一项所述的放射性标记材料或根据权利要求28或29所述的双重放射性标记材料通过动脉内注射施用。
42.一种医疗装置，其包括根据权利要求1至27中任一项所述的放射性标记材料或根据权利要求28或29所述的双重放射性标记材料。
43.根据权利要求42所述的医疗装置，其是微球、种子、支架、导管、导线或晶片。
44.一种对患者中的医疗程序进行成像的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求1至27中任一项所述的放射性标记材料或根据权利要求28或29所述的双重放射性标记材料，以及检测在所述受试者中的所述放射性标记材料。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述检测包括对所述放射性进行γ相机成像。
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