CN103705465B - 一种微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域，涉及一种微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统及其制备方法。本发明采用微酸环境靶向多肽修饰表面富氨基的树状高分子材料包封基因自组装制成微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。本发明选用来源于细菌视紫红质的跨膜螺旋蛋白C的多肽修饰高分子载体，以pH敏感的细胞膜插入方式浓集附着于细胞和静电吸附介导的内吞方式进入细胞，提高肿瘤细胞对药物的摄取，并降低毒副作用。所述肿瘤靶向纳米给药系统具有肿瘤微酸环境下的细胞膜作为靶点和多肽作为靶向头基的优点，靶向和治疗效率高、制备简捷，可用于制备靶向治疗人体来源或动物来源的肿瘤细胞药物。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及药物递送系统，具体涉及一种微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统及其制备方法。
背景技术
近年来，对抗癌药物递送的研究是引人注目的热点。所述抗癌药物不同于普通药物，其毒副作用大，对机体正常器官造成的损害非常大；有效专一地将抗癌药物运输到肿瘤部位减少毒副作用以及由此引起的经济损失是当务之急。
有研究指出，肿瘤靶向给药系统是治疗肿瘤的新型药物递送策略。所述靶向给药系统的构建主要有两种策略：被动靶向和主动靶向；被动靶向主要是基于肿瘤组织特有的EPR效应，而主动靶向则是利用可特异性结合肿瘤细胞表面过度表达受体的头基修饰给药系统达到靶向输送的作用。目前，肿瘤靶向给药系统的研究取得了很大的进展，但肿瘤靶向递送仍然需要更深的研究以及更好的完善。
近来pH敏感靶向策略成为设计肿瘤靶向给药系统的研究热点。目前已知，几乎所有的实体瘤都存在微酸环境，肿瘤细胞对葡萄糖的高摄取，在无氧条件下葡萄糖被酵解成乳酸，形成酸性环境；另一方面，肿瘤的异常血管引起肿瘤供氧不足、肿瘤细胞转化的生长失控引起缺氧和代谢失常增加了无氧代谢；肿瘤细胞自身通过上调低氧诱导因子以适应低氧环境和相应糖酵解产生乳酸后的酸性环境，因此，以微酸环境作为靶点介导肿瘤靶向递送具有比被动靶向和主动靶向更广泛的适用性。
目前已知，来源于细菌视紫红质的跨膜螺旋蛋白C的pH敏感肽pHLIP，在弱酸性条件下（pH6～6.5）可插入细胞膜，形成跨细胞膜螺旋；所述pHLIP肽修饰的药物或纳米载药系统，经EPR效应进入肿瘤组织后，可在肿瘤组织细胞外的酸性环境下插入肿瘤细胞膜，实现从肿瘤组织间隙向肿瘤细胞的定位。此外，新型纳米级树枝状合成高分子聚赖氨酸具有高度分枝，单分散性，末端氨基丰富等良好性质，通过亲水性双功能高分子聚乙二醇连接在pHLIP肽末端，合成载体DGL-PEG-pHLIP，可将pHLIP特异性插入酸性环境下的肿瘤细胞膜的性质转移到载体上。
还有研究证实，促血管形成因子是肿瘤生长所必需的，而最重要的促血管形成因子是血管内皮生长因子VEGF。所述VEGF是一种选择性的内皮细胞分裂原，其能增加微血管的通透性，选择性刺激内皮细胞分裂。有研究发现，下调VEGF表达可有效抑制肿瘤的生长，因此，可选用有效下调VEGF表达的小干扰RNA作为治疗基因、载体包封治疗基因形成微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。但迄今为止，尚未见有关微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统及其制备方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统，以更好地解决现有肿瘤靶向给药系统存在的靶向效率低的问题。
本发明采用微酸环境靶向多肽修饰的表面富氨基的树枝状高分子材料包封治疗基因自组装制成微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统；所述肿瘤靶向纳米给药系统选用来源于细菌视紫红质的跨膜螺旋蛋白C的多肽修饰高分子载体，以pH敏感的细胞膜插入方式浓集附着于细胞和静电吸附介导的内吞方式进入细胞，提高肿瘤细胞对药物的摄取，降低毒副作用。
具体而言，本发明的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统，为微酸环境靶向多肽修饰的聚赖氨酸型树枝状高分子作为载体包封治疗基因自组装构建的纳米给药系统，其特征在于，由高分子材料、聚乙二醇、多肽和治疗基因组成，所述多肽修饰高分子材料包封治疗基因自组装形成纳米粒；
其中，所述高分子材料与聚乙二醇的摩尔比是1:10，高分子材料与多肽的摩尔比是1:1，高分子材料与治疗基因的质量比是6:1；
所述高分子材料为表面富氨基的聚赖氨酸型树状分枝物，选自聚赖氨酸型树状分枝物；
所述聚乙二醇选自马来酰亚胺-聚乙二醇3500-琥珀酰亚胺；
所述多肽是序列为AEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT的pHLIP肽，所述pHLIP肽来源于细菌视紫红质的跨膜螺旋蛋白C；所述多肽pHLP在微酸环境下插入细胞膜形成跨细胞膜结构；
所述治疗基因选自可特异性沉默肿瘤细胞内血管内皮生长因子的基因或其它所有具有抗肿瘤效果的基因；
本发明中，所述的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统，可在纳米给药系统表面结合肝素形成表面负电的纳米给药系统；其中，所述肝素与基因质量比1:1～32:1。
本发明的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统的制备方法，其特征在于，步骤为：
将高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物溶于适量适当的溶剂甲醇中配制成储备液，取适量于西林瓶中吹干，称取适量的聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺溶解到pH8.0的磷酸盐缓冲液中配制成适宜浓度的溶液，加入到上述容器中，与高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物摩尔比为1:10，一定温度下搅拌反应数小时后；称取适量的pHLIP肽溶于适量二甲基亚砜中配制成适宜浓度的溶液，加入到高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物—聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺溶液中，与高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物摩尔比1:1，再加入pH7.0磷酸盐缓冲溶液，一定温度下反应24h，制得微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体，转移到MWCO5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的聚乙二醇3500和多肽pHLIP；再与治疗基因以质量比6:1涡旋反应30s，制得微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
（1）利用可在微酸环境下插入细胞膜形成跨细胞膜结构的多肽修饰纳米给药系统制备本肿瘤靶向纳米给药系统，具有肿瘤微酸环境作为肿瘤靶点的优点，靶向和治疗效率高、制备简捷；
（2）所述纳米给药系统上修饰的多肽可将插入微酸环境下的细胞膜的特性赋予纳米给药系统，使纳米给药系统具有更高的肿瘤靶向效率；该纳米给药系统表面的正电性具有细胞摄取的性质，提高对细胞的摄取效率和治疗效率；
（3）本发明的制备方法简单，不需特殊的处理，可直接用于细胞和动物试验。
本发明的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统，提高了纳米给药系统靶向肿瘤细胞的效率，多肽的修饰使载治疗基因纳米给药系统具有了高效定位肿瘤细胞的能力，可在相对较短的时间内得到较高的摄取效率，并避免了其他正常细胞的摄取，提高给药系统对肿瘤的治疗效率，可用于制备靶向治疗人体来源或动物来源的肿瘤细胞药物。
附图说明
图1是氢核磁共振表征聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体DGL-PEG-pHLIP，其中，
A：氢核磁共振表征聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺，
B：微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体DGL-PEG-pHLIP。
图2是紫外光谱表征DGL-PEG-pHLIP、未修饰载体DGL-PEG、pHLIP肽以及多肽溶剂。
图3是透射电镜表征微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统的粒径及表面形态。
图4是琼脂糖凝胶电泳考察纳米给药系统中包封基因的影响，其中，肝素加入可改变纳米给药系统表面的正电位，使纳米给药系统表面呈负电位，从而避免纳米给药系统进入细胞。
图5是马尔文纳米粒度分析仪表征未修饰的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统的粒径和ε电位。
图6是萤光显微镜定性考察“中性环境正常细胞”和“酸性环境肿瘤细胞”与未修饰的含肝素的纳米给药系统，及微酸环境靶向多肽修饰的含肝素的肿瘤靶向纳米给药系统孵育30min后细胞结合纳米给药系统的效率；其中，
A、B：萤光显微镜定性考察“中性环境正常细胞”和“酸性环境肿瘤细胞”与未修饰的含肝素的纳米给药系统孵育30min后细胞结合纳米给药系统的效率；
C、D：微酸环境靶向多肽修饰的含肝素的肿瘤靶向纳米给药系统孵育30min后细胞结合纳米给药系统的效率。
图7是共聚焦显微镜考察微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统pHLIP修饰纳米给药系统的细胞靶向机制和内吞机制，其中，
A：“酸性环境肿瘤细胞”标记细胞膜，与微酸环境靶向多肽修饰的含肝素的肿瘤靶向纳米给药系统5min；
B：“酸性环境肿瘤细胞”标记细胞膜，与微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统孵育10min；
C：“酸性环境肿瘤细胞”标记酸性细胞器，与微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统孵育15min；
D：“酸性环境肿瘤细胞”标记细胞核，与微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统孵育20min；
标尺：10μm。
图8是萤光显微镜定性考察未修饰的纳米给药系统（B、E）和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统（C、F）在“酸性环境肿瘤细胞”上介导绿色萤光蛋白报告基因表达的效率。
图9是定性表征“酸性环境肿瘤细胞”孵育纳米给药系统后目的基因VEGF的mRNA，其中，
1、2、3、4分别代表空白对照、载对照基因的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统、载治疗基因的未修饰纳米给药系统和载治疗基因的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统，AdobePhotoshopCS3对上述结果进行半定量。
图10是活体成像系统定性考察微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统在荷皮下实体瘤裸鼠模型上的肿瘤靶向效率，白色线圈内为肿瘤区域。
图11是定性考察未修饰的纳米给药系统（A-C）和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统（D-F）在荷皮下实体瘤裸鼠模型上介导肿瘤细胞表达红色萤光蛋白的效率。
图12是定性评价荷皮下实体瘤裸鼠模型静脉注射纳米给药系统48h后肿瘤细胞内目的基因VEGF的mRNA，其中，
1、2、3、4分别代表空白对照、载对照基因的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统、载治疗基因的未修饰纳米给药系统和载治疗基因的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统，AdobePhotoshopCS3对上述结果进行半定量。
图13是定性评价荷皮下实体瘤裸鼠模型静脉注射纳米给药系统48h后肿瘤细胞内目的基因VEGF的蛋白表达，其中，
1、2、3、4分别代表空白对照、载对照基因的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统、载治疗基因的未修饰纳米给药系统和载治疗基因的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统，AdobePhotoshopCS3对上述结果进行半定量。
图14是定量评价纳米给药系统对皮下移植肿瘤生长抑制效率，其中，
A：体积变化；B：第28d肿瘤称重；C：肿瘤生长抑制效果组间差异的统计学评价；
*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；浅色星代表载治疗基因的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统与其它组间差异的显著性；黑色星代表载治疗基因的未修饰纳米给药系统与其它组间差异；灰色星代表载对照基因的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统与其它组间差异；斜线表示差异不显著。
图15是定性检测肿瘤血管密度探讨肿瘤生长抑制机制；肿瘤功能性血管通过绿色萤光共价连接的蕃茄凝集素标记；肿瘤相关血管则通过识别血管性血友病因子的抗体进行标记，其中，
A、B、C、D分别为生理盐水组、载对照基因的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统、载治疗基因的未修饰纳米给药系统和载治疗基因的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。
具体实施方式
实施例1
将聚赖氨酸溶于适量甲醇中配制成10mg/ml的溶液，取100μl于西林瓶中吹干；将聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺溶于适量的0.035MpH8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成5mg/ml工作溶液，取318μl聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h，制得聚赖氨酸-聚乙二醇（DGL-PEG10）；pHLIP的N-末端连接一个半胱氨酸，形成含有游离巯基的pHLIP。再将pHLIP肽溶于适量二甲基亚砜中，配制成1mg/ml的多肽溶液，取182μl加入到聚赖氨酸-聚乙二醇溶液中，再加入500μlpH7.0磷酸盐缓冲溶液，于室温搅拌反应24h，将制得的聚赖氨酸-聚乙二醇-多肽（DGL-PEG10-pHLIP1）转移到MWCO5000超滤离心管中，12000rpm超滤30min去除未反应的聚乙二醇3500和多肽pHLIP，制得微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体。
实施例2
将聚赖氨酸溶于适量甲醇中配制成10mg/ml的溶液，取100μl于西林瓶中吹干；将聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺溶于适量的0.035MpH8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成5mg/ml工作溶液，取318μl聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h，制得聚赖氨酸-聚乙二醇（DGL-PEG10）；pHLIP的N-末端连接一个半胱氨酸，形成含有游离巯基的pHLIP。再将pHLIP肽溶于适量二甲基亚砜中，配制成1mg/ml的多肽溶液，取182μl加入到聚赖氨酸-聚乙二醇溶液中，再加入500μlpH7.0磷酸盐缓冲溶液，于室温搅拌反应24h，将制得的聚赖氨酸-聚乙二醇-多肽（DGL-PEG10-pHLIP1）转移到MWCO5000超滤离心管中，12000rpm超滤30min去除未反应的聚乙二醇3500和多肽pHLIP，制得微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体，超纯水复溶到离心管中，冷冻干燥，取1mg产物500μl重水溶解并转移至核磁管中，以聚乙二醇纯品作为对照进行核磁共振氢谱表征。
实施例3
将聚赖氨酸溶于适量甲醇中配制成10mg/ml的溶液，取100μl于西林瓶中吹干；将聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺溶于适量的0.035MpH8.0磷酸盐缓冲溶液中配制成5mg/ml工作溶液，取318μl聚乙二醇工作液加入到西林瓶中，于室温搅拌反应2h，制得聚赖氨酸-聚乙二醇（DGL-PEG10），一半转移到MWCO5000超滤离心管中，12000rpm超滤30min去除未反应的聚乙二醇3500，制得未修饰载体，超纯水复溶到离心管中；pHLIP的N-末端连接一个半胱氨酸，形成含有游离巯基的pHLIP。另一半继续反应，将pHLIP肽溶于适量二甲基亚砜中，配制成1mg/ml的多肽溶液，取91μl加入到聚赖氨酸-聚乙二醇溶液中，再加入250μlpH7.0磷酸盐缓冲溶液，于室温搅拌反应24h，将制得的聚赖氨酸-聚乙二醇-多肽（DGL-PEG10-pHLIP1）转移到MWCO5000超滤离心管中，12000rpm超滤30min去除未反应的聚乙二醇3500和多肽pHLIP，制得微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体，将载体用超纯水复溶到离心管中；取未修饰载体和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体，以pHLIP多肽纯品和空白溶剂作为对照进行紫外光谱表征。
实施例4
将治疗基因溶解在50mM硫酸钠溶液中，稀释成100μg/ml，将新鲜制得的未修饰载体溶液或者微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体溶液分别加入到基因溶液中，使聚赖氨酸与治疗基因的质量比为6:1，涡旋30s，制成载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。
实施例5
将治疗基因溶解在50mM硫酸钠溶液中，稀释成100μg/ml，将新鲜制得的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体溶液加入到基因溶液中，使聚赖氨酸与治疗基因的质量比为6:1，涡旋30s，制成载治疗基因的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。取适量新鲜制得的载治疗基因的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统于铜片上加热晾干，冷冻电镜下观察载治疗基因的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统的外观形态和粒径。
实施例6
将肝素钠溶解在pH7.4磷酸盐缓冲液中，稀释成100μg/ml，分别加入到新鲜制得的载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统中，使肝素与治疗基因的质量比为1:1，分别制得载治疗基因的含肝素的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。
实施例7
将肝素钠溶解在pH7.4磷酸盐缓冲液中，稀释成100μg/ml，分别加入到新鲜制得的载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统中，使肝素与治疗基因的质量比为2:1，分别制得载治疗基因的含肝素的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。
实施例8
将肝素钠溶解在pH7.4磷酸盐缓冲液中，稀释成100μg/ml，分别加入到新鲜制得的载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统中，使肝素与治疗基因的质量比为4:1，分别制得载治疗基因的含肝素的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。
实施例9
将肝素钠溶解在pH7.4磷酸盐缓冲液中，稀释成100μg/ml，分别加入到新鲜制得的载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统中，使肝素与治疗基因的质量比为8:1，分别制得载治疗基因的含肝素的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。
实施例10
将肝素钠溶解在pH7.4磷酸盐缓冲液中，稀释成100μg/ml，分别加入到新鲜制得的载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统中，使肝素与治疗基因的质量比为16:1，分别制得载治疗基因的含肝素的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。
实施例11
将肝素钠溶解在pH7.4磷酸盐缓冲液中，稀释成100μg/ml，分别加入到新鲜制得的载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统中，使肝素与治疗基因的质量比为32:1，分别制得载治疗基因的含肝素的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。
实施例12
称取0.14g琼脂糖于三角烧瓶中，加入电泳液1×TAE，加入10μl500μg/ml溴乙啶，微波加热至沸，使琼脂糖完全溶解，室温放置约50°C，倒入电泳槽中，置入梳子，冷凝成凝胶。新鲜制备（1）载治疗基因的含不同量肝素的纳米给药系统、（2）载治疗基因的不含肝素的纳米给药系统、（3）载治疗基因的含不同量肝素的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统、（4）载治疗基因的不含肝素的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。将各组样品加入至凝胶中，并以游离治疗基因作为对照，加入基因分子量标记物，开启电源，电压为100V，约25min停止，紫外灯下观察基因的迁移。
实施例13
新鲜制备（1）载治疗基因的含不同量肝素的纳米给药系统、（2）载治疗基因的不含肝素的纳米给药系统、（3）载治疗基因的含不同量肝素的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统、（4）载治疗基因的不含肝素的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。马尔文纳米粒度分析仪表征未修饰的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统的粒径和ε电位。
实施例14
治疗基因用绿色荧光探针YOYO-1标记。基因用0.05MpH8.0Tris缓冲液稀释到2mg/ml，取200μl加入到60μl0.1mM的YOYO-1水溶液，基因与荧光探针体积比为10:3混合，室温避光孵育60min；以此标记了YOYO-1的治疗基因制备载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。将肝素钠溶解在pH7.4磷酸盐缓冲液中，稀释成100μg/ml，分别加入到上述新鲜制得的载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统中，使肝素与治疗基因的质量比为2:1，分别制得萤光标记的载治疗基因的含肝素的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。以Bel-7402细胞作为细胞模型，pH7.4环境下该细胞模拟“中性环境正常细胞”，pH6.0环境下该细胞模拟“酸性环境肿瘤细胞”；采用新鲜制备的上述系统分别以pH6.0和pH7.4磷酸盐缓冲液稀释；然后分别与“中性环境正常细胞”和“酸性环境肿瘤细胞”孵育5min，剂量为5μg每孔，用OLYMPUSIX71显微镜观察细胞结合结果并拍照。
实施例15
治疗基因用红色荧光探针YOYO-3标记。基因用0.05MpH8.0Tris缓冲液稀释到2mg/ml，取200μl加入到60μl0.1mM的YOYO-3水溶液，基因与荧光探针体积比为10:3混合，室温避光孵育60min；以此标记了YOYO-3的治疗基因制备载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。将肝素钠溶解在pH7.4磷酸盐缓冲液中，稀释成100μg/ml，分别加入到上述新鲜制得的载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统中，使肝素与治疗基因的质量比为2:1，分别制得萤光标记的载治疗基因的含肝素的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。以Bel-7402细胞作为细胞模型，pH6.0环境下该细胞模拟“酸性环境肿瘤细胞”，采用麦胚凝集素连接的萤光探针标记细胞膜；采用新鲜制备的纳米给药系统以pH6.0磷酸盐缓冲液稀释，与“酸性环境肿瘤细胞”孵育5min，剂量为5μg每孔，用共聚焦显微镜观察细胞结合结果并拍照。
实施例16
治疗基因用红色荧光探针YOYO-3标记。基因用0.05MpH8.0Tris缓冲液稀释到2mg/ml，取200μl加入到60μl0.1mM的YOYO-3水溶液，基因与荧光探针体积比为10:3混合，室温避光孵育60min。以此标记了YOYO-3的治疗基因制备载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。以Bel-7402细胞作为细胞模型，pH6.0环境下该细胞模拟“酸性环境肿瘤细胞”，采用麦胚凝集素连接的萤光探针标记细胞膜；采用新鲜制备的纳米给药系统以pH6.0磷酸盐缓冲液稀释，与“酸性环境肿瘤细胞”孵育10min，剂量为5μg每孔，用共聚焦显微镜观察内吞结果并拍照。
实施例17
治疗基因用红色荧光探针YOYO-3标记。基因用0.05MpH8.0Tris缓冲液稀释到2mg/ml，取200μl加入到60μl0.1mM的YOYO-3水溶液，基因与荧光探针体积比为10:3混合，室温避光孵育60min。以此标记了YOYO-3的治疗基因制备载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。以Bel-7402细胞作为细胞模型，pH6.0环境下该细胞模拟“酸性环境肿瘤细胞”，采用Lysotracker标记与静电吸附介导内吞有关的酸性细胞器；采用新鲜制备的纳米给药系统以pH6.0磷酸盐缓冲液稀释，与“酸性环境肿瘤细胞”孵育15min，剂量为5μg每孔，用共聚焦显微镜观察内吞结果并拍照。
实施例18
治疗基因用红色荧光探针YOYO-3标记。基因用0.05MpH8.0Tris缓冲液稀释到2mg/ml，取200μl加入到60μl0.1mM的YOYO-3水溶液，基因与荧光探针体积比为10:3混合，室温避光孵育60min。以此标记了YOYO-3的治疗基因制备载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。以Bel-7402细胞作为细胞模型，pH6.0环境下该细胞模拟“酸性环境肿瘤细胞”，采用Hoechst33258标记细胞核；采用新鲜制备的纳米给药系统以pH6.0磷酸盐缓冲液稀释，与“酸性环境肿瘤细胞”孵育20min，剂量为5μg每孔，用共聚焦显微镜观察入核结果并拍照。
实施例19
以编码绿色萤光蛋白基因作为报告基因，以报告基因代替治疗基因，将报告基因溶解在50mM硫酸钠溶液中，稀释成100μg/ml，将新鲜制得的未修饰载体溶液或者微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体溶液分别加入到基因溶液中，使聚赖氨酸与报告基因的质量比为6:1，涡旋30s，制成载报告基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。以Bel-7402细胞作为细胞模型，pH6.0环境下该细胞模拟“酸性环境肿瘤细胞”；采用新鲜制备的上述系统以pH6.0磷酸盐缓冲液稀释；然后分别与“酸性环境肿瘤细胞”孵育2h后，用新鲜培养基置换培养基，继续孵育48h，剂量为5μg每孔，用OLYMPUSIX71显微镜观察绿色萤光蛋白表达结果并拍照。
实施例20
将治疗基因溶解在50mM硫酸钠溶液中，稀释成100μg/ml，将新鲜制得的未修饰载体溶液或者微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体溶液分别加入到基因溶液中，使聚赖氨酸与治疗基因的质量比为6:1，涡旋30s，制成载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。以阴性对照基因代替治疗基因，将阴性基因溶解在50mM硫酸钠溶液中，稀释成100μg/ml，将新鲜制得的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体溶液加入到基因溶液中，使聚赖氨酸与阴性对照基因的质量比为6:1，涡旋30s，制成载阴性对照基因的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。以Bel-7402细胞作为细胞模型，pH6.0环境下该细胞模拟“酸性环境肿瘤细胞”；采用新鲜制备的上述系统以pH6.0磷酸盐缓冲液稀释；然后分别与“酸性环境肿瘤细胞”孵育2h后，用新鲜培养基置换培养基，继续孵育48h。Trizol试剂提取全RNA。260nm处UV-vis法确定RNA浓度。采用TaKaRaone-stepRNAPCR试剂盒取0.5mg全RNA进行RT-PCR。GAPDHRNA作为内参；VEGF引物序列为：正向，5’-GGCAGAATCATCACGAAGTGGTG-3’；反向，5’-GGGTCTCGATTGGATGGCAGTAG-3’；利用这些引物生成VEGF265个碱基对的PCR产物；RT-PCR条件为：反转录，42°C*45min和85°C*10min；变性，95°C*3min；扩增40循环，95°C*12s；退火，62°Cfor40s；反应后，产物在1%琼脂糖凝胶上电泳。结果采用AdobePhotoshopCS3定量。
实施例21
Balb/c裸鼠腹腔注射10%水合氯醛（5ml/kg）麻醉，Bel-7402细胞经胰酶消化，离心后将其悬浮于Hank’s液中，计数调节浓度至2～4×107/ml。将人肝肿瘤细胞株以包含2～8×106个处于对数生长期的瘤细胞的0.1～0.2ml细胞悬液接种于裸鼠背侧部近腋下部皮下。
实施例22
DGL-PEG或DGL-PEG-pHLIP（2mgDGL/ml溶于100mMHEPES8.3）与近红外萤光探针NIR783（5mg/ml二甲基甲酰胺溶液）摩尔比为1:5，室温下反应2h，MWCO3000超滤纯化，12000rpm离心30min×3次以除去未反应的探针。以此荧光探针标记的载体制备纳米给药系统。将治疗基因溶解在50mM硫酸钠溶液中，稀释成100μg/ml，将新鲜制得的未修饰载体溶液或者微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体溶液分别加入到基因溶液中，使聚赖氨酸与治疗基因的质量比为6:1，涡旋30s，制成载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。选取皮下肿瘤直径大于0.5cm且体重相近的荷瘤裸鼠两只，尾静脉注射荷Bel-7402人肝癌细胞皮下移植瘤裸鼠模型，剂量为30μg基因每鼠，在2h和4h，实施动物麻醉，活体成像法测定各组的体内的分布。
实施例23
以编码红色萤光蛋白基因作为报告基因，以报告基因代替治疗基因，将报告基因溶解在50mM硫酸钠溶液中，稀释成100μg/ml，将新鲜制得的未修饰载体溶液或者微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体溶液分别加入到基因溶液中，使聚赖氨酸与报告基因的质量比为6:1，涡旋30s，制成载报告基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。尾静脉注射荷Bel-7402人肝癌细胞皮下移植瘤裸鼠模型，剂量为30μg基因每鼠，48h后取出肿瘤，冷冻切片，切片厚度20μm，DAPI复燃，用OLYMPUSIX71显微镜观察肿瘤细胞的红色萤光蛋白表达结果并拍照。
实施例24
将治疗基因溶解在50mM硫酸钠溶液中，稀释成100μg/ml，将新鲜制得的未修饰载体溶液或者微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体溶液分别加入到基因溶液中，使聚赖氨酸与治疗基因的质量比为6:1，涡旋30s，制成载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。以阴性对照基因代替治疗基因，将阴性基因溶解在50mM硫酸钠溶液中，稀释成100μg/ml，将新鲜制得的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体溶液加入到基因溶液中，使聚赖氨酸与阴性对照基因的质量比为6:1，涡旋30s，制成载阴性对照基因的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统；尾静脉注射荷Bel-7402人肝癌细胞皮下移植瘤裸鼠模型，48h后取出肿瘤，剂量为30μg基因每鼠，Trizol试剂提取全RNA；260nm处UV-vis法确定RNA浓度；采用TaKaRaone-stepRNAPCR试剂盒取0.5mg全RNA进行RT-PCR；GAPDHRNA作为内参；VEGF引物序列为：正向，5’-GGCAGAATCATCACGAAGTGGTG-3’；反向，5’-GGGTCTCGATTGGATGGCAGTAG-3’；利用上述引物生成VEGF265个碱基对的PCR产物。RT-PCR条件为：反转录，42°C*45min和85°C*10min；变性，95°C*3min；扩增40循环，95°C*12s；退火，62°Cfor40s；反应后，产物在1%琼脂糖凝胶上电泳。结果采用AdobePhotoshopCS3定量。
实施例25
将治疗基因溶解在50mM硫酸钠溶液中，稀释成100μg/ml，将新鲜制得的未修饰载体溶液或者微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体溶液分别加入到基因溶液中，使聚赖氨酸与治疗基因的质量比为6:1，涡旋30s，制成载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。以阴性对照基因代替治疗基因，将阴性基因溶解在50mM硫酸钠溶液中，稀释成100μg/ml，将新鲜制得的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体溶液加入到基因溶液中，使聚赖氨酸与阴性对照基因的质量比为6:1，涡旋30s，制成载阴性对照基因的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。尾静脉注射荷Bel-7402人肝癌细胞皮下移植瘤裸鼠模型，剂量为30μg基因每鼠，48h后取出肿瘤，肿瘤样品液氮下研磨，加入RIPA强裂解液，冰上超声400W共10min，14000g离心5min，取上清，BCA试剂盒测定蛋白总浓度；12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上样45μg蛋白，电泳后转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂牛奶封闭2h，VEGF一抗室温孵育过夜，TBST和TBS分别清洗两次和一次，二抗室温下孵育2h，曝光。采用AdobePhotoshop对蛋白条带定量。
实施例26
将治疗基因溶解在50mM硫酸钠溶液中，稀释成100μg/ml，将新鲜制得的未修饰载体溶液或者微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体溶液分别加入到基因溶液中，使聚赖氨酸与治疗基因的质量比为6:1，涡旋30s，制成载治疗基因的纳米给药系统和微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。以阴性对照基因代替治疗基因，将阴性基因溶解在50mM硫酸钠溶液中，稀释成100μg/ml，将新鲜制得的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体溶液加入到基因溶液中，使聚赖氨酸与阴性对照基因的质量比为6:1，涡旋30s，制成载阴性对照基因的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统；采用尾静脉注射给药，在皮下肿瘤体积达到150mm3后第0、6、12、18、24d给药，共5次，每次注射含30μg基因的小干扰RNA纳米载药系统（系统中DGL与基因的质量比为6:1），或同等体积的生理盐水。实验中，如遇到以下任一情况，则施以安乐死手术：（1）动物体重下降至给药前85%以下；（2）肿瘤任一方向长度超过2cm；（3）动物状况虚弱不能进食；（4）肿瘤溃疡腐烂。第一次给药28d后，对所有动物施行安乐死手术，结束实验。荷皮下肝肿瘤裸鼠按照上述方式分组并给药，每组12只裸鼠。每隔1d记录皮下肿瘤的最长径与最短径（第0d为第一次给药），以下面公式计算肿瘤体积，比较各组对肿瘤生长抑制效率的差异。
V=a2×b×π/6，a是最长径，b是最短径
实施例27
在小干扰RNA纳米载药系统对皮下肝肿瘤生长抑制效果考察实验结束时，对各组动物施行安乐死，并获得各组具代表性肿瘤样品，石蜡包埋，进行免疫染色；AlexaFluor555红色荧光修饰的CD34抗体标记切片上的肿瘤相关血管；生物素化番茄凝集素结合肿瘤新生的功能血管，采用AlexaFluor488绿色荧光连接的链霉素识别。
SEQUENCELISTING
<110>复旦大学
<120>一种微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统及其制备方法
<160>3
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>35
<212>PRT
<213>来源于细菌视紫红质的跨膜螺旋蛋白C的pHLIP肽
<400>1
AlaGluGlnAsnProIleTyrTrpAlaArgTyrAlaAspTrpLeuPhe
151015
ThrThrProLeuLeuLeuLeuAspLeuAlaLeuLeuValAspAlaAsp
202530
GluGlyThr
35
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>引物
<400>2
ggcagaatcatcacgaagtggtg23
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>引物
<400>3
gggtctcgattggatggcagtag23
Claims (5)
1.一种微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统，其特征在于，由高分子材料、聚乙二醇、多肽和治疗基因组成，所述多肽修饰高分子材料包封治疗基因自组装形成纳米粒，其中，
高分子材料为表面富氨基的聚赖氨酸型树状分枝物，聚乙二醇为马来酰亚胺-聚乙二醇3500-琥珀酰亚胺，多肽为序列AEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT的pHLIP肽，所述治疗基因选自特异性沉默肿瘤细胞内血管内皮生长因子的基因或其它所有具有抗肿瘤效果的基因；
所述高分子材料与聚乙二醇的摩尔比是1:10，
所述高分子材料与多肽的摩尔比是1:1，
所述高分子材料与治疗基因的质量比是6:1；
通过高分子材料、聚乙二醇和多肽制得微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体聚赖氨酸-聚乙二醇-多肽。
2.按权利要求1所述的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统，其特征在于，所述纳米给药系统表面结合肝素形成表面负电的纳米给药系统。
3.按权利要求2所述的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统，其特征在于，所述肝素与纳米给药系统中的治疗基因的质量比为1:1～32:1。
4.权利要求1所述的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统的制备方法，其特征在于，其包括步骤：
将高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物溶于适量适当的溶剂甲醇中配制成储备液，取适量于西林瓶中吹干，称取适量的聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺溶解到pH8.0的磷酸盐缓冲液中配制成适宜浓度的溶液，加入到上述容器中，与高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物摩尔比为1:10，一定温度下搅拌反应数小时后；称取适量的pHLIP肽溶于适量二甲基亚砜中配制成适宜浓度的溶液，加入到高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物—聚乙二醇马来酰亚胺－聚乙二醇3500－琥珀酰亚胺溶液中，与高分子材料聚赖氨酸型树状分枝物摩尔比1:1，再加入pH7.0磷酸盐缓冲溶液，一定温度下反应24h，制得微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向载体，转移到MWCO5000超滤离心管中以12000rpm超滤30min去除未反应的聚乙二醇3500和多肽pHLIP；再与治疗基因以质量比6:1涡旋反应30s，制得微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统。
5.权利要求1的微酸环境靶向多肽修饰的肿瘤靶向纳米给药系统在制备靶向治疗人或动物的肿瘤药物中的用途。
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