CN109467593A - 低pH插入肽的胞外段作为抗原的应用 - Google Patents

低pH插入肽的胞外段作为抗原的应用 Download PDF

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魏化伟
杨承刚
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Abstract

本发明公开了已知低pH插入肽的胞外段具有抗原性，利用低pH插入肽的胞外段作为抗原可以制备出抗体，该抗体可以用于肿瘤治疗。本发明的研究成果为临床肿瘤治疗提供了新的候选药物。

Description

低pH插入肽的胞外段作为抗原的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种低pH插入肽，本发明还涉及由低pH插入肽胞外段作为抗原的应用。
背景技术
来源于细菌视紫红质的跨膜螺旋蛋白C的低pH插入肽(pHLIP，pH low insertionpeptide)是一种水溶性的多肽，能够插入细胞双层脂膜形成稳定的跨膜α螺旋。肽折叠和膜插入是由中性或碱性(pH>7.4)pH下降至弱酸性(pH＝7.0-6.5或者更低)驱动的。pHLIP具有三种主要形态：在中性pH下无结构溶于水的形态I，在中性pH下无结构且结合到细胞膜表面上的状态II，在酸性pH下插入并以α螺旋穿过细胞膜的状态III。因为容易凝集产生的溶解性差是膜肽的性质，pHLIP作为膜肽也有凝集的趋势，尤其是在高浓度和/或低pH的条件下，在中性pH的水溶液中，pHLIP单体存在的浓度小于30μg/ml，在低pH条件下，状态II和状态III的pHLIP肽全部以单体形式存在。许多研究显示，由于结构上的改变导致的肽溶解性的降低会导致肽与膜的结合能力以及整个肽的构象发生改变。在血液中肽的稳定性是非常重要的性质，因为血液中的蛋白酶能在数分钟内降解L型氨基酸构成的肽。尽管D型氨基酸构成的多肽相对稳定的多，但是由于它们可变的手性，并不适合用于与特异性受体结合。因为pHLIP和脂质双分子层之间不存在特异性的相互作用，所以人们并不意外由L型或D型构成的pHLIP具有相同的生物物理学和肿瘤定位的特性，越来越多的证据表明，pHLIP定位并不需要任何特异性分子结合事件的发生。仅有一个显著的区别在于，D-pHLIP形成跨膜的左手螺旋，而L-pHLIP形成跨膜的右手螺旋。与穿透细胞的肽相比，pHLIP在插入细胞膜之后停留在细胞膜中，一端进入细胞质，另一端进入细胞外空间。因此，肽具有双重传递能力：一种能力是它能将货物分子系到细胞表面，另一种能力是它能将不能穿膜的货物分子注射或释放到细胞质中。为了实现第一种能力，可将货物分子连接到pHLIP的N端，这样的货物分子具有宽泛的极性和大小，一个应用的实例如将成像探针递送到酸性组织并将其稳定的系于细胞膜表面。为了实现第二种能力，可将货物分子通过一个可以在细胞质内被剪切的键连接到pHLIP的C端，这样的可以被剪切的键入二硫键，一个应用的实例是将抗肿瘤药物递送到肿瘤组织并将其导入肿瘤细胞质内发挥作用，如荧光染料、环肽、极性毒素和肽核酸等。
由于pHLIP的特殊性质，其被广泛应用于以下领域：(1)荧光染色、荧光图像导航手术；(2)核成像，包括PET和SPECT；(3)疾病治疗，如靶向运输毒素、靶向基因治疗；(4)纳米技术，用于加强金纳米粒子或胶囊化脂质体负载运输到肿瘤细胞。
但是现有技术还未报道低pH插入肽具有抗原属性，利用抗原性质制备抗体的应用。本申请则是填补了这一研究方向的空白，为制备靶向肿瘤抗体药物提供了新的靶点。
发明内容
本发明提供了一种抗原，所述抗原包括低pH插入肽的胞外段。
进一步，所述低pH插入肽包括以下多肽：
WT:ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT(SEQ ID NO.1)；
Var1:ACEDQNPYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDG(SEQ ID NO.2)；
Var2:ACEDQNPYWRAYADLFTPLTLLDLLALWDG(SEQ ID NO.3)；
Var3:ACDDQNPWRAYLDLLFPTDTLLLDLLW(SEQ ID NO.4)；
Var4:ACEEQNPWRAYLELLFPTETLLLELLW(SEQ ID NO.5)；
Var5:ACDDQNPWARYLDWLFPTDTLLLDL(SEQ ID NO.6)；
Var6:CDNNNPWRAYLDLLFPTDTLLLDW(SEQ ID NO.7)；
Var7:ACEEQNPWARYLEWLFPTETLLLEL(SEQ ID NO.8)；
Var8:CEEQQPWAQYLELLFPTETLLLEW(SEQ ID NO.9)；
Var9:CEEQQPWRAYLELLFPTETLLLEW(SEQ ID NO.10)；
Var10:ACEDQNPWARYADWLFPTTLLLLD(SEQ ID NO.11)；
Var11:ACEEQNPWARYAEWLFPTTLLLLE(SEQ ID NO.12)；
Var12:ACEDQNPWARYADLLFPTTLAW(SEQ ID NO.13)；
Var13:ACEEQNPWARYAELLFPTTLAW(SEQ ID NO.14)；
Var14:TEDADVLLALDLLLLPTTFLWDAYRAWYPNQECA(SEQ ID NO.15)；
Var15:CDDDDDNPNYWARYANWLFTTPLLLLNGALLVEAEET(SEQ ID NO.16)；
Var16:CDDDDDNPNYWARYAPWLFTTPLLLLPGALLVEAEET(SEQ ID NO.17)；
上述序列中划横线的部分即为低pH插入肽的胞外段序列。
虽然本发明仅仅以SEQ ID NO.8所示的低pH插入肽的胞外段进行了抗原性质的鉴定，但由于低pH插入肽的胞外段性质的相似性，所以本发明的实验结果表明了低pH插入肽的胞外段具有抗原性质的共性。
本发明的抗原具有以下功能：(1)抗原性；(2)与载体蛋白连接后作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体。
本发明的抗原的制备方法可用化学合成法：利用多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原。
本发明还提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前面所述的抗原。
本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体由空载体和插入该空载体的目的基因组成，所述目的基因为前面所述的核酸分子。
在本发明中，所述“空载体”(或称“载体”)可选用本领域己知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等。所述空载体可以包括多种常用的检测标记(例如荧光标记、抗生素标记等报告基因)和酶切位点。重组载体构建可采用空载体本身多克隆位点的各种核酸内切酶进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。
本发明还提供了一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞含有前面所述的重组载体。
可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化；所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母(如毕赤酵母)或各种动植物细胞，更优选所述宿主细胞为本领域常用的基因工程菌，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母。
可以使用本领域常用的方法从重组宿主细胞中分离和纯化本发明的抗原。例如，离心分离培养基和重组宿主细胞，高压匀浆破碎细胞、离心过滤去除细胞碎片，亲和层析纯化新抗原。对于分离纯化所得的新抗原的产物，可以使用本领域常用的方法进行纯度鉴定。例如，考马斯亮蓝法、凯氏定氮法、双缩脲法、lowry法、紫外吸收法、亲和层析、抗原抗体法、电泳分析(例如十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)、沉降分析、扩散分析、恒溶度法、蛋白质谱等。
本发明还提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括前面所述的抗原以及与所述抗原连接的蛋白或多肽。
进一步，所述融合蛋白包括前面所述的抗原与所述抗原偶联的载体蛋白。
可用于本发明的载体蛋白包括但不限于KLH(钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(钥孔血蓝蛋白)免疫原性强，结合位点多，免疫效果较好，并且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。
本发明的融合蛋白具有免疫原性和特异性，是一种免疫原，可用来免疫动物从而制备特异性的针对前面所述的抗原的抗体。
本发明还提供了一种抗体，所述抗体是以前面所述的抗原或以前面所述的融合蛋白制备而成。
优选地，本发明的上述抗体是单克隆抗体。
本发明的单克隆抗体可以使用本领域的常规技术制备而成，现有技术中常用的制备抗体的方法包括：
(1)基于小鼠/兔子的杂交瘤技术。
基本步骤：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、单抗的鉴定及制备等。
(2)基于噬菌体抗体展示库的抗体筛选技术。
基本步骤：①从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并反转录为cDNA；②应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段；③构建噬菌体载体；④表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多轮的抗原亲和吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。
(3)基于单克隆抗体库的筛选技术。
本发明前面所述的低pH插入肽，可以使用本领域的常规技术制备而成，这样的合成技术包括：固相合成、液相合成。
固相合成的原理在于：将氨基酸的羧基末端通过适当连接分子固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上经过脱去氨基保护基依次缩合氨基酸，延长肽链、直到得到所需多肽。最后用适当试剂除去侧链保护基并从树脂上裂解产物。与液相相比，多肽固相合成优点在于：(1)每步反应只需简单的过滤和洗涤树脂，便可达到纯化目的，克服了经典液相合成法中的每一步产物都需要纯化的困难，操作省时，省力；(2)可溶性试剂可以过量以使反应完全和获得高产率，过量试剂可简单的用溶剂冲洗，过滤清除；(3)所有的反应都可以在一个容器中进行，因此避免了反应中间体转移的手续和损失；(4)如果选择适当的连接分子和裂解条件，高分子树脂可再生重复利用。
固相合成多肽的策略包括Boc固相法、Fmoc固相法。在本发明的具体实施方式中，本发明使用了Fmoc固相法。
本发明还提供了前面所述的抗原在制备前面所述的融合蛋白，或前面所述的抗体中的应用。
本发明还提供了前面所述的抗体的应用，所述应用包括以下任一项所述的应用：
(1)制备检测前面所述的抗原的产品中的应用；
(2)制备抗肿瘤药物中的应用；
(3)在制备CAR-T序列中的应用。
文中术语“CAR-T”，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。根据肿瘤微环境这一特性，科学家优化了一系列的CART序列，使其在不同的pH值情况下和抗原的亲和力有完全不同的亲和力，从而在不同pH值情况下激活。
文中术语“单克隆抗体”单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。
本发明中的多肽序列均是按照从N端到C端的顺序列出。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了低pH插入肽胞外段的抗原性，利用该抗原可以制备治疗肿瘤的抗体。
具体实施方式
通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1以var7低pHLIP插入肽胞外段作为抗原制备抗体
实验材料：MC38细胞，购自ATCC；var7低pHLIP插入肽，委托北京华大蛋白质研发中心有限公司合成，溶于PBS，浓度为40μM；var7低pHLIP插入肽的胞外段(Ala-Cys-Glu-Glu-Gln-Asn-Pro，SEQ ID NO.18)连接KLH(北京金斯瑞生物科技有限公司合成)；6-8周龄雌性C57/BL6鼠购自维通利华。
用KLH连接的var7的胞外段免疫Balb/c鼠，制备杂交瘤，获得单抗，ELISA检测抗体与抗原的特异结合以及抗体亚型。
实施例2抗体抑瘤效果评价
(1)建立小鼠结肠癌MC38移植瘤模型：MC38接种于C57/BL6鼠，待肿瘤直径长至1cm时，无菌剥离肿瘤，剪碎，匀浆，滤网，制成单细胞悬液，在1640完全培养基中培养扩增，将细胞注射于C57/BL6鼠侧腹部皮下，2x106个细胞/只，待肿瘤直径长至0.8-1cm，剔除过大和过小的肿瘤，将肿瘤大小基本一致的小鼠分组。共分3组：var7单独注射组，10只；var7联合抗体注射组，10只；生理盐水N.S注射组，10只。每隔3天测量肿瘤大小。
(2)给药方法：var7给药：每次每只静脉注射40μM/100μl(约为16μg，参考之前活体成像的实验结果，相同剂量的注射能够观察到荧光在肿瘤部位的聚集，但到第三天时基本消退)，从分组完成后当天开始注射，一天注射一次，每隔2天注射一次；抗体给药：腹腔注射，剂量5mg/kg(抗体和var7的摩尔比约为1:5)，注射频率与var7相同，注射时间在var7给药后6-12小时，直至结束。
(3)结果：
结果显示，抗体能够显著抑制肿瘤生长。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京泽勤生物医药有限公司
<120> 低pH插入肽的胞外段作为抗原的应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Cys Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala
20 25 30
Asp Glu Gly Thr
35
<210> 2
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu
1 5 10 15
Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Gly
20 25 30
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Tyr Trp Arg Ala Tyr Ala Asp Leu Phe
1 5 10 15
Thr Pro Leu Thr Leu Leu Asp Leu Leu Ala Leu Trp Asp Gly
20 25 30
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ala Cys Asp Asp Gln Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Asp Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Leu Leu Trp
20 25
<210> 5
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu Leu Trp
20 25
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Cys Asp Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Leu Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Leu
20 25
<210> 7
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Cys Asp Asn Asn Asn Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Asp Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Asp Thr Leu Leu Leu Asp Trp
20
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Leu Glu Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Leu
20 25
<210> 9
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Cys Glu Glu Gln Gln Pro Trp Ala Gln Tyr Leu Glu Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Trp
20
<210> 10
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Cys Glu Glu Gln Gln Pro Trp Arg Ala Tyr Leu Glu Leu Leu Phe Pro
1 5 10 15
Thr Glu Thr Leu Leu Leu Glu Trp
20
<210> 11
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Leu Leu Leu Asp
20
<210> 12
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Trp Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Leu Leu Leu Glu
20
<210> 13
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Ala Cys Glu Asp Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Ala Trp
20
<210> 14
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Trp Ala Arg Tyr Ala Glu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Thr Thr Leu Ala Trp
20
<210> 15
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Thr Glu Asp Ala Asp Val Leu Leu Ala Leu Asp Leu Leu Leu Leu Pro
1 5 10 15
Thr Thr Phe Leu Trp Asp Ala Tyr Arg Ala Trp Tyr Pro Asn Gln Glu
20 25 30
Cys Ala
<210> 16
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Cys Asp Asp Asp Asp Asp Asn Pro Asn Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asn
1 5 10 15
Trp Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asn Gly Ala Leu Leu Val
20 25 30
Glu Ala Glu Glu Thr
35
<210> 17
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Cys Asp Asp Asp Asp Asp Asn Pro Asn Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Pro
1 5 10 15
Trp Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ala Leu Leu Val
20 25 30
Glu Ala Glu Glu Thr
35
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Ala Cys Glu Glu Gln Asn Pro Gly Gly Gly Ser Ala Cys Glu Glu Gln
1 5 10 15
Asn Pro

Claims (10)

1.一种抗原，其特征在于，所述抗原包括低pH插入肽的胞外段。
2.根据权利要求1所述的抗原，其特征在于，所述低pH插入肽包括序列为SEQ ID NO.2的低pH插入肽或其变体；优选地，所述变体包括SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.18所示的多肽。
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1或2所述的抗原。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体由空载体和插入该空载体的目的基因组成，所述目的基因为权利要求3所述的核酸分子。
5.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞含有权利要求4所述的重组载体。
6.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括权利要求1或2所述的抗原以及与所述抗原连接的蛋白或多肽。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括权利要求1或2所述的抗原以及与所述抗原偶联的载体蛋白；优选地，所述载体蛋白包括KLH、BSA、或OVA。
8.一种抗体，其特征在于，所述抗体是由权利要求1或2所述的抗原，或权利要求6或7所述的融合蛋白制备而成。
9.权利要求1或2所述的抗原在制备权利要求6或7所述的融合蛋白，或权利要求8所述的抗体中的应用。
10.权利要求8所述的抗体的应用，其特征在于，所述应用包括以下任一项所述的应用：
(1)制备检测权利要求1或2所述的抗原的产品中的应用；
(2)制备抗肿瘤药物中的应用；
(3)在制备CAR-T序列中的应用。
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