CN102408482A - 一种β-伴大豆球蛋白单克隆抗体制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种β-伴大豆球蛋白单克隆抗体制备方法。本发明方法首先采用化学法或基因工程技术制备含β-伴大豆球蛋白α亚基IgE抗原表位的表位小肽，然后将表位小肽耦联到载体蛋白或载体多肽上免疫动物，取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经克隆、筛选获得分泌β-伴大豆球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，采用细胞培养和腹水法制备β-伴大豆球蛋白单克隆抗体。本发明制备的单克隆抗体，针对β-伴大豆球蛋白中的过敏表位，特异性强，明显优于现有技术制备的抗体，在大豆品种选育与改良、β-伴大豆球蛋白分离纯化与检测、β-伴大豆球蛋白致敏机理研究等领域具有广泛用途。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种β-伴大豆球蛋白单克隆抗体制备方法。
背景技术
大豆及其制品含有丰富的蛋白质和平衡的氨基酸，是人和畜禽优质的植物性蛋白源。但大豆中含有胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素、致敏原、低聚糖、植酸、脲酶及致甲状腺肿素等抗营养因子，干扰人和动物肠道内营养物质的消化吸收，破坏正常的新陈代谢，诱发过敏反应（尤其是婴幼儿及幼龄畜禽），在很大程度上限制了其在食品和饲料行业尤其是婴幼儿食品及幼龄畜禽饲料中的应用。胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素等抗营养因子热稳定性较差，可以通过高温处理消除。大豆中的致敏原主要包括大豆球蛋白（glycinin）和三种伴大豆球蛋白（α-conglycinin、β-conglycinin和γ-conglycinin），其中β-conglycinin是免疫原性最强的致敏原，其热稳定性较高，常规加工处理方法很难消除。大豆与牛奶、鸡蛋、鱼、贝类、小麦、花生、坚果被列为最易引起人类过敏的8种食物。在养猪生产中，仔猪断奶前后连续饲喂含大豆蛋白日粮，会引起过敏反应，致肠粘膜受损，肠绒毛脱落，隐窝加深，肠壁通透性增加，肥大细胞数量和组胺释放量增加，进而导致腹泻、生长受阻。人们一直在探索消减大豆蛋白制品致敏性的方法，包括挤压膨化加工、微生物发酵、酶解处理等，并取得了一些进展。高效、灵敏、快捷的致敏原检测技术，是大豆及其制品利用技术开发取得成功的重要保障。
目前，大豆蛋白致敏原检测常用方法有高效液相色谱（HPLC）、聚合酶链式反应（PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。HPLC具有分离效率高、分析速度快、检测限低等优点，被认为是迄今为止对复杂混合物分离效能最高的一种分离分析技术，但它并不能区分被检物的免疫活性（致敏性）。PCR被广泛用于大豆、榛子、花生等食品中微量抗原成分的检测，具有敏感性和特异性高等特点。但该技术是建立在特异DNA片段PCR扩增基础上，特异性DNA的检出，并不能直接反应出样品中含有具免疫活性的致敏原的情况，从而限制了该方法在致敏原检测中的应用。致敏原的免疫原性是发生过敏反应的前提条件。以抗原、抗体特异性反应为基础的ELISA是致敏原检测的最佳选择。ELISA能够快速、准确地对样品中致敏原进行定性定量检测，并且不需要昂贵的设备和复杂的操作步骤，被广泛应用在食品和饲料行业。ELISA的关键是合适抗体的研发。彭楠等（2007）制备了大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白多克隆抗体，并在此基础上建立了间接竞争ELISA方法（彭楠, 刘建峰, 梁运祥, 葛向阳. 间接竞争ELISA检测大豆11S球蛋白和7S伴球蛋白. 华中农业大学学报，2007，26（5）: 661-664）。多克隆抗体是大豆蛋白中多个抗原表位同时刺激动物产生的针对不同抗原表位的抗体混合物，既可与大豆蛋白中无致敏性的抗原表位结合，又可能与大豆蛋白以外的其它蛋白上的抗原表位结合（即交叉反应），因此以其为基础建立的大豆蛋白致敏原检测技术其结果并不完全可靠。游金明等（2008）采用人工合成β-伴大豆球蛋白上一段表位肽作为免疫抗原，制备了单克隆抗体，在此基础上建立了ELISA检测方法（游金明, 王自蕊, 谯仕彦, 贺平丽, 李德发. 致仔猪过敏性大豆抗原蛋白β-conglycinin单克隆抗体的制备与鉴定. 中国畜牧杂志，2008，44（17）: 46-48）。但由于该表位是选自β-伴大豆球蛋白上的任意抗原表位，依然不能解决大豆蛋白中致敏性成分的特异性检测问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种针对β-伴大豆球蛋白α亚基IgE过敏抗原表位的单克隆抗体制备方法。用本发明方法制备的单克隆抗体，能与β-伴大豆球蛋白各组成亚基中致敏性最强的α亚基中引起IgE过敏反应的抗原表位结合，表位明确、特异性强，明显优于现有技术制备的抗体，在大豆品种选育与改良、β-伴大豆球蛋白分离纯化与检测、β-伴大豆球蛋白致敏机理研究等领域具有广泛用途。
本发明方法包括以下步骤：
步骤(1).制备抗原：采用化学法或基因工程技术制备含β-伴大豆球蛋白α亚基IgE抗原表位的表位小肽，然后将此表位小肽耦联到载体蛋白或载体多肽上，制备免疫用抗原；所述的载体蛋白或载体多肽包括但不限于牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白。
所述的表位小肽中氨基酸序列如下述SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.7的任意1条：
①NH2-repqqpgekeededeqprpC-CONH2；
②NH2-EWPRKEEKRGEKGC-CONH2；
③NH2-khnkclqscnserdsyrn-CONH2；
④NH2-IlefnskpnC-CONH2；
⑤NH2-LQRFNQRSPQLQNLRC-CONH2；
⑥NH2-SELRRHKNKNPFLFGC-CONH2；
⑦NH2-KNPFLFGSNRFETLFC-CONH2；
所述的表位小肽氨基酸序列，在不改变表位小肽抗原表位结构的前提下，小肽一端或两端增加有氨基酸。
步骤(2).免疫动物：将耦联载体的表位小肽与弗氏佐剂混合免疫动物，第一次用完全弗氏佐剂，以后用不完全弗氏佐剂，每两周免疫一次，并于融合前2～4天等量抗原加强免疫。
其中，供免疫动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔。
步骤(3).细胞融合、筛选及克隆化：选取抗血清效价最高的动物取脾细胞与骨髓瘤细胞体外融合，经三次亚克隆获得稳定分泌抗β-伴大豆球蛋白单克隆抗体的细胞株。
步骤(4).细胞培养：将上述细胞株体外扩大培养后，收集上清液。
步骤(5).腹水制备：将扩大培养后的杂交瘤细胞株注入动物腹腔，以大量生产腹水，提取、纯化后即可得到β-伴大豆球蛋白单克隆抗体。
本发明与目前常用的多克隆抗体或单克隆抗体相比，具有以下技术效果：（1）与多克隆抗体相比，本发明制备的单克隆抗体特异性强，与其它蛋白无交叉反应，且来源可靠，质量稳定均一；（2）与常规单克隆抗体相比，本发明制备的单克隆抗体能与β-伴大豆球蛋白各组成亚基中致敏性最强的α亚基的IgE过敏抗原表位结合，表位明确、特异性强，该单克隆抗体使用时反映的是真正具有致敏活性的β-伴大豆球蛋白；而常规单克隆抗体所针对的是抗原蛋白中的任意表位，使用此类单克隆抗体时并不能准确获取有关具致敏活性的β-伴大豆球蛋白信息，从而使其应用价值受到影响，应用范围受到限制。
具体实施方式
1材料
雌性Balb/c小鼠购自苏州爱尔麦特生物科技有限公司，弗氏完全佐剂、HAT、HT、鲁米诺、香豆酸、Na2-EDTA 、TMB均购自sigma，IMDM培养基和青链霉素购自hyclone，DMSO购自biomol，PEG购自roche，胎牛血清购自上海依科赛公司，HRP标记二抗购自苏州百奇公司，浓硫酸和丙三醇购自上海试一化学试剂公司，柠檬酸购自国药化试公司，H2O2购自上海三鹰化学试剂公司。含β-伴大豆球蛋白α亚基IgE抗原表位的表位小肽“NH2-KNPFLFGSNRFETLFC-CONH2”及与载体耦联的免疫抗原委托苏州百奇生物公司制备。
2 方法
2.1 免疫动物 将免疫抗原与弗氏完全佐剂混合乳化后注射到小鼠腹腔，分别在初次免疫后第2、4、6、8周将抗原与弗氏不完全佐剂混合后进行加强免疫。取小鼠脾脏前36-48小时用等量免疫抗原不加佐剂，加强免疫一次。
2.2 细胞融合、筛选及克隆化 于融合前36-48小时内，对经间接ELISA法检测血清效价最高的小鼠，按常规方法取脾细胞与SP2/0细胞（5：1）融合，HAT选择培养，用间接ELISA法筛选，阳性孔经3次有限稀释克隆化。
2.3 细胞培养 经过克隆的杂交瘤细胞扩大培养后，每隔3天收集1次上清液，1000r/min离心10min，上清液经硫酸铵分级沉淀法纯化后-20℃冻存。
2.4 腹水制备 在每只BALB/C小鼠腹腔内注入0.5ml液体石蜡，7天后每只小鼠腹腔注入已培养的杂交瘤细胞106个，1周后可见小鼠腹腔明显涨大，收集腹水。1500r/min离心30min，收集上清。小心挑去上层脂肪，使用饱和硫酸铵沉淀粗提抗体，50%的硫酸铵与33%的硫酸铵先后各沉淀一次，再将粗提后的抗体溶解在PBS缓冲液中，经PBS缓冲液透析，换液2-3次，每次间隔1个小时以上，最后将透析好的抗体加入蛋白G柱子中，以每毫升蛋白G结合5-10毫克的IgG计算，穿透液可以多次上柱，使未结合的抗体充分结合，用PH2.5的甘氨酸溶液洗脱结合抗体，PBS透析，并换液三次，每次间隔1个小时以上，即得到纯化抗体。
2.5 抗体鉴定 用间接ELISA法检测腹水抗体效价。包被抗原为合成的含β-伴大豆球蛋白α亚基IgE抗原表位的表位小肽。采用BD亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚型。采用western blot法分析单克隆抗体特异性。
3 结果
3.1 杂交瘤细胞系的建立与克隆 免疫小鼠血清ELISA效价均达1:104以上，取脾细胞与SP2/0细胞融合后HAT选择培养，经克隆和间接ELISA筛选，获得了1株稳定分泌抗β-伴大豆球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
3.2 单克隆抗体鉴定 用ELISA法检测腹水型单抗效价为1:3.2×104。单克隆抗体梯度稀释后ELISA测定OD值如下：
| 稀释度 | 1/1000 | 1/4000 | 1/16000 | 1/32000 | 1/64000 | 阴性对照 | 阳性对照 |
| OD值 | 3.572 | 1.407 | 0.402 | 0.296 | 0.129 | 0.064 | 1.706 |
经鉴定，该单克隆抗体为IgG1型，轻链类型为κ。
。
western blot鉴定结果表明，该单克隆抗体可与β-伴大豆球蛋白α亚基在分子量72KD附近发生特异性结合。
间接竞争ELISA结果表明，该单克隆抗体与大豆球蛋白酸性多肽链及碱性多肽链、β-伴大豆球蛋白α＇亚基及β亚基、菜籽蛋白、棉籽蛋白、鱼粉蛋白等均无交叉反应。
筛选的杂交瘤细胞株连续传代培养2个月，其分泌抗体的能力未发生明显的变化；经冻存复苏后，杂交瘤细胞长势良好，并能稳定地分泌抗体。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种β-伴大豆球蛋白单克隆抗体制备方法
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白
<400> 1
Arg Glu Pro Gln Gln Pro Gly Glu Lys Glu Glu Asp Glu Asp Glu Gln
1 5 10 15
Pro Arg Pro Cys
20
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白
<400> 2
Glu Trp Pro Arg Lys Glu Glu Lys Arg Gly Glu Lys Gly Cys
1 5 10
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> 牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白
<400> 3
Lys His Asn Lys Cys Leu Gln Ser Cys Asn Ser Glu Arg Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Arg Asn
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白
<400> 4
Ile Leu Glu Phe Asn Ser Lys Pro Asn Cys
1 5 10
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白
<400> 5
Leu Gln Arg Phe Asn Gln Arg Ser Pro Gln Leu Gln Asn Leu Arg Cys
1 5 10 15
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白
<400> 6
Ser Glu Leu Arg Arg His Lys Asn Lys Asn Pro Phe Leu Phe Gly Cys
1 5 10 15
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白
<400> 7
Lys Asn Pro Phe Leu Phe Gly Ser Asn Arg Phe Glu Thr Leu Phe Cys
1 5 10 15
Claims (5)
1.一种β-伴大豆球蛋白单克隆抗体制备方法,其特征在于该方法具体步骤是：
步骤(1).制备抗原：采用化学法或基因工程技术制备含β-伴大豆球蛋白α亚基IgE抗原表位的表位小肽，然后将此表位小肽耦联到载体蛋白或载体多肽上，制备免疫用抗原；
步骤(2).免疫动物：将耦联载体的表位小肽与弗氏佐剂混合免疫动物，第一次用完全弗氏佐剂，以后用不完全弗氏佐剂，每两周免疫一次，并于融合前2～4天等量抗原加强免疫；
步骤(3).细胞融合、筛选及克隆化：选取抗血清效价最高的动物取脾细胞与骨髓瘤细胞体外融合，经三次亚克隆获得稳定分泌抗β-伴大豆球蛋白单克隆抗体的细胞株；
步骤(4).细胞培养：将上述细胞株体外扩大培养后，收集上清液；
步骤(5).腹水制备：将扩大培养后的杂交瘤细胞株注入动物腹腔，以大量生产腹水，提取、纯化后即可得到β-伴大豆球蛋白单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的一种β-伴大豆球蛋白单克隆抗体制备方法,其特征在于步骤(1)所述的表位小肽中氨基酸序列如下述7条的任意1条：
①NH2-repqqpgekeededeqprpC-CONH2；
②NH2-EWPRKEEKRGEKGC-CONH2；
③NH2-khnkclqscnserdsyrn-CONH2；
④NH2-IlefnskpnC-CONH2；
⑤NH2-LQRFNQRSPQLQNLRC-CONH2；
⑥NH2-SELRRHKNKNPFLFGC-CONH2；
⑦NH2-KNPFLFGSNRFETLFC-CONH2。
3.如权利要求1所述的一种β-伴大豆球蛋白单克隆抗体制备方法,其特征在于：步骤(1)中所述的载体蛋白或载体多肽包括但不限于牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白。
4.如权利要求1所述的一种β-伴大豆球蛋白单克隆抗体制备方法,其特征在于步骤(2)中供免疫动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔。
5.如权利要求2所述的一种β-伴大豆球蛋白单克隆抗体制备方法,其特征在于：所述的表位小肽的氨基酸序列，在不改变表位小肽抗原表位结构的前提下，小肽一端或两端增加有氨基酸。
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| 《中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十一次全国动物营养学术研讨会论文集》 20121019 李永明等 beta-伴大豆球蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 第201页 1-6 , * |
| 《动物生产》 20081231 游金明等 致仔猪过敏性大豆抗原蛋白beta-conglycinin单克隆抗体的制备与鉴定 第46-49页 1-5 , * |
| 《食品科学》 20091231 郑树贵等 beta - 伴大豆球蛋白天然活性亚基的分离纯化 第137-141页 1-5 , * |
| CHUNJIANG J. FU ET AL.: "Identification, Characterization, Epitope Mapping, and Three-Dimensional Modeling of the r-Subunit of â-Conglycinin of Soybean, a Potential Allergen for Young Pigs", 《J. AGRIC. FOOD CHEM.》, 31 December 2007 (2007-12-31), pages 4014 - 4020 * |
| OGAWA T ET AL.: "Alpha-subunit of beta-conglycinin, an allergenic protein recognized by IgE antibodies of soybean-sensitive patients with atopic dermatitis", 《BIOSCI BIOTECHNOL BIOCHEM.》, 31 May 1995 (1995-05-31), pages 831 - 3 * |
| 李永明等: "β-伴大豆球蛋白单克隆抗体的制备及鉴定", 《中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十一次全国动物营养学术研讨会论文集》, 19 October 2012 (2012-10-19), pages 201 * |
| 游金明等: "致仔猪过敏性大豆抗原蛋白β-conglycinin单克隆抗体的制备与鉴定", 《动物生产》, 31 December 2008 (2008-12-31), pages 46 - 49 * |
| 郑树贵等: "β - 伴大豆球蛋白天然活性亚基的分离纯化", 《食品科学》, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 137 - 141 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN108727481A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-11-02 | 河南工业大学 | 一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏的β-伴大豆球蛋白α’亚基抗原区域及筛选方法 |
| CN108727481B (zh) * | 2018-05-31 | 2021-07-09 | 河南工业大学 | 一种基于噬菌体展示技术定位的加工破坏的β-伴大豆球蛋白α’亚基抗原区域及筛选方法 |
| CN109467593A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-03-15 | 北京泽勤生物医药有限公司 | 低pH插入肽的胞外段作为抗原的应用 |
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