CN103163296A - 检测猪尿液中莱克多巴胺残留的免疫胶体金试纸 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于快速检测动物尿液中莱克多巴胺残留的免疫胶体金检测试纸条及其制备方法，属于兽药及违禁药物残留的免疫化学速测技术领域。本发明的试纸条(图1)，包括样品垫(1)、胶体金结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)和PVC背衬(7)，其特征在于，在PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)；所述的结合垫(2)上包被有莱克多巴胺单克隆抗体-胶体金标记物，该单克隆抗体由杂交瘤细胞系所分泌得到的。所述的硝酸纤维素膜(3)上分别包被有莱克多巴胺-载体蛋白偶联物构成的检测线(5)和兔抗鼠IgG构成的质控线(6)。本发明的试纸条有灵敏度高、特异性强、操作简单、检测迅速等优点。

Description

检测猪尿液中莱克多巴胺残留的免疫胶体金试纸

技术领域

本发明属于兽药残留的免疫化学速测技术领域，具体地说，是一种借助胶体金标记显色的免疫层析反应，用于快速检测猪尿液中莱克多巴胺残留的免疫胶体金检测试纸。

背景技术

莱克多巴胺/又称雷托巴胺(Ractopamine)是比较特殊的“瘦肉精”。它的效率非常高，一吨饲料中加入不到20g，就可以让最后长肉阶段的猪增加24％的瘦肉，减少34％的脂肪。这种物质在体内几乎不积累，动物实验和小规模的人体试验发现每公斤体重的摄入量在67ug之下时对于人体没有明显损害。

FDA制定的雷托巴胺残留允许值是猪肉中50ppb(十亿分之一，50ppb相当于每公斤中含50微克)，牛肉中的安全标准则为30ppb。其它的国家或机构标准比美国的要严格一些。比如，加拿大和WHO的猪肉标准都是40ppb，而联合国粮农组织则是10ppb。日本和新西兰规定本国生产不许使用，但进口猪肉中则允许有小于10ppb的残留。中国禁止使用包括雷托巴胺在内的任何“瘦肉精”。

目前检测莱克多巴胺残留的方法主要为色谱分析法，如高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、气相色谱-质谱法(GC-MS)等。色谱技术对莱克多巴胺检测是非常有效、准确的，但也存在以下缺点：(1)待测样品预处理程序繁琐费时；(2)需要经过专业培训的技术人员操作，操作人员要有丰富的经验，必须了解影响色谱分析的各种干扰因素，了解所使用方法的优缺点，才能获得可靠的分析结果；(3)需要昂贵的仪器设备辅助，难以在中小企业中普及；(4)仪器保养的要求高，保养的好坏直接影响分析结果的准确性；(5)检测费用高。

酶联免疫吸附法(ELISA)是以竞争性酶联反应为检测原理，以莱克多巴胺抗体包被酶标板，检测时将被检样品和酶结合物同时加入酶标板，反应后通过显色测OD值来判断结果。ELISA一次可检测多个样品，即可定性检测，也可定量检测。但仍存在以下缺点：(1)需要专门的仪器设备如酶标仪来配合使用，不利于基层单位进行推广使用；(2)检测操作人员需要经过专业培训；(3)操作比较复杂，检测时间较长，全程需要2-4小时。

胶体金免疫层析(GICA)是以胶体金作为示踪物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。它简便、快速、特异性强、灵敏度高、费用低等优点。依据胶体金免疫层析技术，在国内外无论人医用方面，还是兽医用方面，都已经研制出了多种胶体金免疫层析快速检测试纸条。现有的莱克多巴胺胶体金免疫层析检测试纸条，在检测过程中莱克多巴胺和检测线处固相化的莱克多巴胺偶联物竞争胶体金标记的单克隆抗体，当样品中含有3ppb以上的莱克多巴胺时检测线不显色，莱克多巴胺含量低于3ppb时检测线显色。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、操作简单、检测快速、准确的专门用于检测莱克多巴胺的试纸条。

为实现本发明的目的，采用如下的技术方案：

一种适用于检测莱克多巴胺残留的试纸条，它包括样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)和PVC背衬(7)，其特征在于，在PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)；所述的结合垫(2)上包被有所述的莱克多巴胺单克隆抗体-胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜(3)上分别包被有莱克多巴胺-载体蛋白偶联物构成的检测线(5)和兔抗鼠IgG构成的质控线(6)。

一种适用于检测猪尿液中莱克多巴胺残留的免疫胶体金检测试纸条的制备方法，其步骤包括：

1)将莱克多巴胺与载体蛋白偶联，形成莱克多巴胺-载体蛋白偶联物；

2)用莱克多巴胺-载体蛋白偶联物免疫小鼠，得到分泌抗莱克多巴胺的单克隆抗体的细胞系；

3)提取免疫小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗体；

4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

5)将步骤3)制备的抗莱克多巴胺单克隆抗体加入步骤4)制备的胶体金中，得到抗莱克多巴胺单克隆抗体-胶体金标记物；

6)将抗莱克多巴胺单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合垫(2)上；

7)将莱克多巴胺-载体蛋白偶联物包被在硝酸纤维素膜(3)上构成的检测线(5)；并将制备得的兔抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜(3)上构成的质控线(6)；

8)在所述的PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)，得到所述的检测莱克多巴胺残留的免疫胶体金检测试纸条。

本发明选用莱克多巴胺-载体蛋白偶联物作为检测线，抗莱克多巴胺特异性单克隆抗体用胶体金进行标记，利用竞争法来检测待测样品中是否含有莱克多巴胺。通过待测样品中的莱克多巴胺与包被于硝酸纤维素膜上的莱克多巴胺-载体蛋白偶联物共同竞争抗莱克多巴胺单克隆抗体-胶体金标记物，在检测线上出现颜色深浅不同的红色条带或不出线条带，质控线处出现红色条带。若待测样品试纸条检测线上出现红色条带，同时质控线上出现红色条带则判断为阴性样品，即待测样品中莱克多巴胺的浓度在3ppb范围内；若待测样品试纸条检测线无颜色出现，同时质控线上出现红色条带，判断为阳性样品，即待测样品中莱克多巴胺的浓度高于3ppb；如果质控线上没有红色条带出现，即该试纸条无效。

本发明所述的莱克多巴胺检测试纸具有以下突出优点：

(1)本发明的检测莱克多巴胺的免疫胶体金试纸条具有特异性强、敏感性高、检测时间短等优点。

(2)本发明的检测试纸条不需要任何特殊仪器设备，检测成本低。

(3)本发明的检测试纸条操作简便，不需要专业人员操作。

(4)本发明的检测试纸条储存方便，对温度要求不高，室温下保存12个月。

附图说明

图1：本发明的总体技术路线图

图2：本发明检测试纸条的组装示意图

图3：本发明检测试纸条结果判定示意图

(3-A：为阴性样品结果，3-B：为阳性样品结果，3-C：为试纸条失效)

具体实施方式

实施例1莱克多巴胺检测试纸的制备方法

1.莱克多巴胺RAC与载体蛋白BSA的偶联

采用重氮化法将Rac与载体蛋白进行偶联制备免疫抗原。将5mg莱克多巴胺溶解于预冷(2-8℃)的稀盐酸(pH3.0)中，加入10mg亚硝酸钠(重量比为5∶1)，室温避光搅拌6小时，溶液颜色变为黄色。将载体牛血清白蛋溶于PBS缓冲液中，按摩尔比25∶1加入上反应中，温室搅拌过夜。将反应液用PBS缓冲液透析即可。

2.抗莱克多巴胺Rac单克隆抗体(W1)的制备

以50ug-100ug/只的偶联载体蛋白的Rac免疫BALB/c系小鼠三次，每次间隔15-30天；第三次加强免疫后3-4大，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75％酒精浸泡5-10min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞；将1×10⁸的脾细胞与2-5×10⁷的NSO浆细胞瘤细胞混合，1000r/min离心10min弃上清，细胞沉淀于37℃的水溶中缓缓加入0.7-1ml的40-50％PEG4000(pH 8.5-9.0)作用1min，然后缓慢加入无血清1640培养基15ml，以终止PEG的作用，37℃水浴5-10min，1000r/min离心10min弃上清，将细胞沉淀重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养板(100ul～200ul/孔)，置于37℃5％CO₂培养箱中培养。培养7-10天后，以5ug-10ug/ml的偶联载体蛋白的Rac包被酶标板(40孔/块)，以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测杂交瘤的培养上清，挑取强性细胞克隆(OD₄₉₂＝0.8以上)，进行连续三次的有限稀释法克隆化，所生产的杂交瘤细胞染色体数为92-98，其分泌的单克隆抗体(W1)特异地与RAC反应，而不与其它蛋白发生交又反应，亲和力常数达10^9-10，轻链亚型为K或入，重链亚型为IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3，针对RAC特异抗原决定簇的单克隆抗体(W1)，用于制备金标抗体。

3.莱克多巴胺Rac金标抗体(W1)和金标抗体(W1)玻璃棉的制备

以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在50-100ml沸腾的0.01-0.05％氯金酸水溶液中加入2-4ml的0.5-2％柠檬酸三钠溶液，获得直径15nm左右的胶体金。以0.1mol/L的K₂CO₃调胶体金pH至8.5-9.5，置于以1∶1000-1300的标记比将待标记的Rac单克隆抗体(M1)加入pH8.5-9.5的金溶胶中，标记10min后，加20％PEG10000至终浓度0.05％，4℃、1500-3000rpm离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000rpm离心1h，弃上清，获初步纯化金标抗体蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得Rac胶体金标记抗体。将1∶(100-500)稀释的胶金标记抗体吸附于精制玻璃棉中，4℃低温真空干燥，制备Rac金标抗体棉。

4.羊抗或兔抗小鼠IgG的制备

以饱和硫酸铵提取小鼠血清IgG，取1份小鼠血清加2份PBS(pH 7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵混匀，置4℃冰箱2h，4℃、1200r/min离心15min，弃上清；以适量PBS(pH7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵至终浓度33％，置4℃冰箱2h，4℃、1200r/min离心15min，弃上清，以少量PBS(pH7.2)溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS(pH′7.2)过夜透析，换液2-3次，4℃、12000r/min离心15min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以50ug-100ug/kg体重(小鼠血清IgG)经皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3-4次，末次免疫10天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1∶2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵提取羊抗或兔抗小鼠IgG(方法与提取小鼠血清IgG相同，不重述)，用于RAC快速检测试纸条对照显示印迹的制备。

5.试纸条的组装

将样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)按图2所述顺序依次粘附在PVC背衬(7)上，切成3mm宽小条，装于塑料壳中，用铝箔袋密封保存。常温保存，有效期一年。

实施例2

莱克多巴胺快速检测试纸条检测操作方法

1.样品的预处理

猪尿的预处理

将供试尿液2ml，2000rpm离心10min，取上清液供检测备用。

2.检测

将待检样品用滴管吸取，滴3滴于检测卡样品孔内的，5分钟后观察结果。

3.结果判定

如图3所示，若待检样品试纸条检测线和质控线同时出现红色条带则判定为阴性样品，即待测样品中莱克多巴胺的浓度低于3ppb(如图3-A所示)；若待测样品试纸条检测线无颜色出现，同时质控线出现红色条带则判断为阳性样品，即待测样品中莱克多巴胺的浓度高于3ppb(如图3-B所示)；若质控线上无红色条带出现，则该试纸条无效(如图3-C所示)。

实施例3

检测莱克多巴胺的免疫胶体金试纸条的应用

1.特异性试验

将克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布他林配制成浓度为5ppb的样品。按实施例2所述方法进行试验。试验结果(见表1)表明，莱克多巴胺样品检测线无颜色出现，同时质控线上出现红色条带，而克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布他林样品试纸条检测线颜色与标准品试纸条检测线颜色一致，同时质控线上出现红色条带，这表明克伦特罗、沙丁胺醇、妥布特罗、特布他林与本发明的试纸条无交叉反应，显示本试纸条具有好的特异性。

表1本发明试纸条特异性试验结果

检测样品	莱克多巴胺	克伦特罗	沙丁胺醇	妥布特罗	特布他林
						检测结果	+	-	-	-	-

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。

2.敏感性试验

按实施例2所述方法，用本发明昀检测试纸条分别检测0、1、2、3、5、6ppb的莱克多巴胺标准品，重复10次。发现当标准品浓度在1ppb-3ppb范围内，肉眼很容易判定结果，当莱克多巴胺标准品浓度高于3ppb时检测线无颜色出现，故产品的敏感度为3ppb。

3.猪尿中莱克多巴胺的模拟检测试验

分别向猪尿液中添加莱克多巴胺标准品，使猪尿中莱克多巴胺浓度为3ppb，制成3ppb莱克多巴胺猪尿样品。按实施例2所述方法，用本发明检测试纸条对3ppb莱克多巴胺猪尿样品进行检测，重复10次，结果显示，3ppb莱克多巴胺猪尿样品检测线不显色，判为阳性样品。说明本发明检测试纸条可以用来检测猪尿样品。

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种适用于检测猪尿液中莱克多巴胺残留的免疫胶体金试纸，它包括样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)和PVC背衬(7)，其特征在于，在PVC背衬(7)上按顺序一次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)；所述的结合垫(2)上包被有所述的莱克多巴胺单克隆抗体-胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜(3)上分别包被有莱克多巴胺-载体蛋白偶联物构成的检测线(5)和兔抗鼠IgG构成的质控线(6)。

2.权利要求1所述的试纸条，其特征在于，偶联莱克多巴胺的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，或鸡卵清白蛋白(OVA)，或为铁蛋白，或为血蓝蛋白。

3.权利要求1所述的一种适用于检测莱克多巴胺残留的免疫胶体金检测试纸条的制备方法，其步骤包括：

1)将莱克多巴胺与载体蛋白偶联，形成莱克多巴胺-载体蛋白偶联物；

2)用莱克多巴胺-载体蛋白偶联物免疫小鼠，得到分泌抗莱克多巴胺的单克隆抗体的细胞系；

3)提取免疫小鼠IgG免疫健康家兔，得到兔抗鼠IgG抗体；

4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

5)将步骤3)制备的抗莱克多巴胺单克隆抗体加入步骤4)制备的胶体金中，得到抗莱克多巴胺单克隆抗体-胶体金标记物；

6)将抗莱克多巴胺单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合垫(2)上；

7)将莱克多巴胺-载体蛋白偶联物包被在硝酸纤维素膜(3)上构成的检测线(5)；并将制备得的兔抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜(3)上构成的质控线(6)；

8)在所述的PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)，得到所述的检测莱克多巴胺残留的免疫胶体金检测试纸条。

4.权利要求所述的试纸条在检测各种动物性食品中莱克多巴胺残留的应用。

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