CN1173181C - 盐酸克伦特罗快速检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测受体兴奋剂的器具，特别是涉及一种盐酸克伦特罗(clenbuterol)即瘦肉精快速检测试纸条。它含有支撑层，反应试剂载体吸附层，支撑层为不吸水薄片层，吸附层固定在支撑层上，吸附层从样品端依次为纤维层，吸附瘦肉精金标抗体纤维层，纤维素膜层，由吸水材料层构成的手柄端，以偶联瘦肉精的载体蛋白溶液在纤维素膜层上印制检测印迹带，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液在纤维素膜层上印制对照印迹带。本发明特异性强，敏感性高，操作简便快捷，检测结果显示形象，直观，准确，成本低，投资少，不需要专用仪器及专业人员，容易推广实施。

Description

盐酸克伦特罗快速检测试纸条

(一)技术领域：本发明涉及一种检测受体兴奋剂的器具，特别是涉及一种盐酸克伦特罗(clenbuterol)即瘦肉精快速检测试纸条。

(二)背景技术：现代畜牧业为人类提供了极其丰富的肉、禽、奶、蛋等营养价值高、品质优良的各种食品，为人类的物质生活，提高人们健康水平，延长人类寿命做出了很大贡献。与此同时，现代科学研究证明，由于畜牧业现代化，大量使用饲料添加剂以及防病、治病需要，大量使用抗生素、激素以及其它合成药物，造成畜禽食品中药物残留，激素残留等。通过食物链的传递，药物残留和激素残留物质对人体健康和生命构成威胁和危害，如癌症人发病率增加，人类生育畸形比例增大，人体抗药性增强，青少年性早熟，中老年心血管疾病漫延以及某些食物中毒等问题。往往与畜禽食品种的药物残留、激素残留密切相关。如盐酸克伦特罗(CIenbuterol)俗称瘦肉精，是一种人工合成的肾上腺素神经兴奋剂，属β-兴奋剂类激素。低剂量时主要用于防治人、畜的支气管哮喘和支气管痉挛，肺气肿等疾病，但应有严格的剂量限制。用量超标人体会产生心悸、呕吐、肌肉不自主震颤等症状，甚至有生命危险，长期过量摄入会积蓄中毒，还有导致染色体畸变的可能。因其具有提高肌肉力量作用，很早就有一些运动员非法使用该药，国际上早就禁止在饲料和畜牧生产中使用。若剂量增加到治疗量的5～10倍，则有使胴体的脂肪重新分布，促进蛋白质合成和促进生长作用。所以增被用作畜禽饲料添加剂，添加到猪、牛、羊、兔、鸭、鹅等畜禽饲料中，以降低胴体脂肪含量，提高瘦肉率，促进生长，人在食用含有瘦肉精残留的畜禽肉、蛋、奶食品时，容易发生食物中毒事件。因此，欧美各国均禁止瘦肉精作为生长促进剂和饲料添加剂使用。我国农业部也正式下文严禁瘦肉精作为饲料添加剂使用。但是某些畜禽饲养户及养殖场在经济利益的驱动下，暗地里非法使用瘦肉精做为饲料添加剂，如用含有瘦肉精饲料饲养的猪，由于瘦肉率高，对顾客具有强大的吸引力，使其欺骗性和危害性更大，严重威胁人类健康。同时瘦肉精等β-兴奋剂类药物也被国际奥委会公布为违禁药物。

当前对瘦肉精常用的检测方法主要有色谱技术和酶联免疫吸附试验等。色谱技术是国际上用于瘦肉精检测的常用经典技术，包括高效液相色谱(HPLC)，液相色谱/质谱连用(LC/MS)，气相色谱/质谱连用(GC/MS)，气相色普/傅立叶红外联用(GC/FTIR)等。目前香港及内地研究单位多采用GC/MS和HPLC技术进行动物组织和毛发中瘦肉精的残留检测，应该说色谱技术对瘦肉精检测是非常有效、准确、敏感的。但待检样品需经一系列的予处理，繁琐费时，从样品予处理到得出检测结果至少需要2天时间；另外这种检测方法还需要价格昂贵的仪器设备，且需专业人员操作，每次只能检测一个样品，严重阻碍了这种检测方法的普及推广，更无法实现现场检测。ELISA，也是一种常用检测技术，已有商品化的试剂盒出售。是以竞争性酶联反应为检测原理，以β-兴奋剂抗体包被酶标板，检测时将被检样品和酶标结合物同时加入酶标板，反应后显色测OD值，OD值愈低表示被检样品中含瘦肉精含量愈高。检测全过程约需2-4小时。ELISA一次可检测多个样品，即可定性检测，也可定量检测。但存在着假阳性或假阴性问题。由于ELISA是一种敏感性很强的技术，不同人操作往往会出现不同结果，对结果的判定需要有一定操作经验的专业人员，所以该检测方法也常常造成人为的误检和漏检。同时，β-兴奋剂的种类较多，各药物之间也存在一定的抗原性差异，这也是造成漏检原因之一，加之检测时间较长，很难实施现场检测。

当人们食用了残留较高浓度的瘦肉精动物组织后，会出现心动过速，肌肉震颤，心悸和神经过敏等症状。例如1997年上半年，在我国香港17人食用含有瘦肉精的猪肺汤，出现手指震颤、头晕、心悸、口干、失眠、瘫痪等症状，引起香港特别行政区和我国政府高度重视。浙江、北京、广东、河南等地也发现多人由于吃残留克伦特罗(即瘦肉精)的猪肉造成食物中毒，引起农业部和当地政府的高度重视。各级食品检验部门和外贸出口单位，都加强对瘦肉精检测力度，以确保人民吃上放心肉。因此科技人员研制灵敏、快速，准确的瘦肉精检测方法，检测家畜组织及饲料中是否含瘦肉精的残留有着十分重要的意义。

(三)发明内容：

本发明的目的是：研制出特异、敏感、快速、简便的盐酸克伦特罗快速检测试纸条。

本发明的技术方案是：一种盐酸克伦特罗快速检测试纸条，含有支撑层，反应试剂载体吸附层，支撑层为不吸水薄片层，吸附层固定在支撑层上，吸附层从样品端依次为纤维层，吸附瘦肉精金标抗体纤维层，纤维素膜层，由吸水材料层构成的手柄端，其中以偶联瘦肉精的载体蛋白溶液在纤维素膜层上印制检测印迹带，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液在纤维素膜层上印制对照印迹带。

不吸水的支撑层薄片层可用硬质塑胶片条，或不吸水的硬纸条，纤维层可用玻璃棉，吸水材料层可用吸水纸，纤维素膜层可用硝酸纤维素膜，金标抗体纤维层可用吸附瘦肉精金标抗体玻璃棉，瘦肉精金标抗体为胶金标记瘦肉精的单克隆抗体或多克隆抗体，偶联瘦肉精的载体蛋白的溶液为瘦肉精与载体蛋白偶联结合的复合溶液，在玻璃棉与瘦肉精金标抗体玻璃棉及吸水纸层上覆盖有保护膜，在玻璃棉与金标抗体交界处对应的保护膜偏向玻璃棉一侧约0.5cm处印制样品标记线。

偶联瘦肉精的载体蛋白可为牛血清白蛋白，或为鸡卵清白蛋白，或为铁蛋白，或为血蓝蛋白，在纤维素膜层上的检测印迹带和对照印迹带可为平行组合排列。

本发明具有有益的积极效果，瘦肉精快速检测试纸条具有下列各项优点：

(1)特异性强，敏感性高。瘦肉精快速检测试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸条具有较高的特异性和敏感性。可检测到0.1纳克。

(2)操作简便快速。使用快速检测试纸条时无需任何其它试剂，只要将其插入待检样品10秒左右，在2分钟内即可判定检测结果。

(3)显示检测结果形象、直观准确。快速检测试纸条以显示红棕色“|”及“‖”印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色“|”印迹表示在被检测样品液中含有瘦肉精，两条棕红色“‖”印迹表示在被检样品中不含瘦肉精，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。

(4)成本低，投资少。使用快速检测试纸条，不需另配仪器设备及其它试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。

(5)易于大范围推广应用。快速检测试纸操作简单，人人都可操作，能较好满足不同层次人员的需要，如专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

(四)附图说明：

图1为盐酸克伦特罗快速检测试纸条结构示意图。

图2为盐酸克伦特罗快速检测试纸条俯视结构示意图。

(五)具体实施例：

要制成盐酸克伦特罗快速检测试纸条首先需制备藕联瘦肉精的载体蛋白，用于印制检测印迹，进而制备瘦肉精的金标抗体，用于金标抗体纤维，其次需制备羊或兔抗小鼠IgG抗体，用于印制对照印迹。

(1)瘦肉精与载体蛋白的偶联

采用碳化二亚胺法、重氮化法或戊二醛法，将瘦肉精与载体蛋白进行藕联制备免疫抗原。将5mg盐酸克伦特罗溶解于预冷(2-8℃)的稀盐酸(pH3.0)中，加入10mg亚硝酸钠(重量比为2∶1)，室温避光搅拌6小时，溶液颜色变为黄色。将载体牛血清白蛋，或鸡卵清白蛋白或为铁蛋白，或血蓝蛋白溶于PBS缓冲液中，按摩尔比25∶1加入上反应中，温室搅拌过夜。将反应液用PBS缓冲液透析即可。

(2)抗瘦肉精单克隆抗体的制备

以50μg-100μg/只的偶联瘦肉精的载体蛋白免疫BALB/c系小鼠三次，每次间隔15-30天；第三次加强免疫后3-4天，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75％酒精浸泡5-10min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞；将1×10⁸的脾细胞与2-5×10⁷的NSO浆细胞瘤细胞混合，1000r/min离心10min弃上清，细胞沉淀于37℃的水溶中缓缓加入0.7-1ml的40％-50％PEG4000(Ph8.5-9.0)作用1min，然后缓慢加入无血清1640培养基15ml，以终止PEG的作用，37℃水浴5-10min，1000r/min离心10min弃上清，将细胞沉淀重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔培养板(100μl-200μl)孔，置37℃5％CO₂培养箱中培养。培养7-10天后，以5μg-10μg/ml的偶联瘦肉精的载体蛋白包被酶标板(40孔/块)，以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测杂交瘤的培养上清，挑取强性细胞克隆(OD₄₉₂＝0.8以上)，进行连续三次的有限稀释法克隆化，所生产的杂交瘤细胞染色体数为92-98，其分泌的单克隆抗体特异地与瘦肉精反应，而不与其它蛋白发生交叉反应，亲和力常数达10^9-10，轻链亚型为κ或λ，重链亚型为IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃，针对瘦肉精特异抗原决定簇的单克隆抗体，用于制备金标抗体棉。

(3)瘦肉精金标抗体和金标抗体棉的制备

以柠檬酸钠还原法制备金溶胶，即在沸腾的50-100ml0.01-0.05％氯金酸水溶液中加入2-4ml的0.5-2％柠檬酸三钠溶液，获得直径15mm左右的胶体金。以0.1mol/L的K₂CO₃调胶体金PH至8.5-9.5，以1∶1000～1∶1300的标记比将待标记的瘦肉精单克隆抗体加入pH8.5-9.5，金溶胶中，标记10min后，加20％PEG10000至终浓度0.05％，4℃1500-3000g离心20min，除去未结合的金颗粒，4℃15000g离心1h，弃上清，获初步纯化金蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析，分离纯化金标蛋白，获得瘦肉精胶体金标记抗体。将1∶100～1∶1500稀释的胶金标记抗体吸附于精制玻璃棉中，4℃低温真空干燥，制备瘦肉精金标抗体棉。

(4)羊或兔抗小鼠IgG抗体的制备

以饱和硫酸铵提取小鼠血清IgG，取1份小鼠血清加2份PBS(7.2)混匀，加等体积饱和硫酸铵混匀，置4℃冰箱2h，4℃1200r/min离心15min，弃上清；以适量PBS(7.2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵至终浓度33％，置4℃冰箱2h，4℃1200r/min离心15min，弃上清，以少量PBS(7.2)  溶解沉淀，置4℃冰箱内用PBS(7.2)过夜透析，换液2-3次，4℃12000r/min离心15min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以50μg-100μg/kg体重的小鼠血清IgG经皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3-4次，末次免疫10天后，静脉采血，以ELISA测定其血清抗体效价在1∶2000以上，心脏采血或颈动脉放血，收集其高免血清，以饱和硫酸铵提取羊或兔抗小鼠IgG抗体(方法与提取小鼠血清IgG相同，不重述)，用于瘦肉精快速检测试纸条对照显示印迹的制备。

(5)瘦肉精快速检测试纸条实施检测反应原理

当瘦肉精快速检测试纸条样品端插入待检测样品溶液后，待检溶液通过虹吸带动待检瘦肉精及金标抗体

棉中的金标抗体一起向硝酸纤维素膜扩散，并最终渗入滤纸中，扩散过程中待检瘦肉精可与的金标抗体相结合，进而封闭金标抗体上瘦肉精的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜上偶联瘦肉精的载体蛋白的检测印迹结合，不能显示检测印迹，而羊或兔抗小鼠IgG抗体则可与金标抗体结合，形成红棕色对照印迹带“|”，即一条红棕色带“|”印迹为阳性标记，反之样品溶液中无瘦肉精则不能阻止金标抗体与纤维素膜上藕联瘦肉精的载体蛋白检测印迹结合，显示红棕色检测印迹带“|”，同样羊或兔抗小  鼠IgG抗体也与金标抗体结合，显示红棕色对照印迹带“|”，形成两条红棕色带“‖”阴性标记，如果纤维素膜上没有红棕色标记显示，则表明试纸条已失效。

(6)盐酸克伦特罗(瘦肉精)快速检测试纸条检测实例操作方法。

检测样品液的制备，若检测肉或肉制品可将样品剪碎、研磨，以生理盐制成1∶2～1∶10待检测样品悬液，如果检测的对象是蛋或奶，可直接将蛋或奶用生理盐水制成1∶2～1∶10待检测样品悬液。

若用动物的血液作为待测样品，则提取血清，用血清作为待测样品，或直接取动物的尿液作为检测样品。

将瘦肉精快速检测试纸条样品端插入待检测样品液中，插入深度不超过标记线9，约10秒后取出检测试纸条，水平放置约2分钟，观察结果。

检测结果判断：如果在纤维素膜上有一条红棕色标记带“|”显示，表示测检结果呈阳性，说明在被检测的样品液中含有盐酸克伦特罗，即该动物饲喂过含有违禁的盐酸克伦特罗(瘦肉精)添加剂饲料，这样的动物肉料和肉制品是不能在市场上流通的，人吃了上述肉类将发生食品中毒，影响健康。

如果瘦肉精快速检测试纸条上的纤维素膜出现有两条红棕色标记带带“‖”，表示检测结果呈阴性，即在待检样品中不含盐酸克伦特罗成份，则呈阴性结果的动物肉类和肉制品中不含瘦肉精成份，其食用是安全的。

实施例一，参见图1，图2，图中，1为支撑层，用塑胶薄片条制成，2为样品端的纤维层，用玻璃棉制成，3为吸附有克伦特罗简称瘦肉精，俗称瘦肉精的金抗体纤维层，根据上述实施例(3)制备方法，制备吸附有克伦特罗金标抗体玻璃棉，简称瘦肉精金标抗体棉，4为纤维素膜层，本实施例采用硝酸纤维素膜，5为吸水材料层即手柄端用滤纸制成，将编号2，3，4，5各层从左至右粘贴在塑胶薄片条1上，在硝酸纤维素膜层4上，6为用偶联克伦特罗(瘦肉精)的载体！蛋白溶液印上检测印迹带“|”，另外，7为用羊或兔抗小鼠IgG抗体溶液在硝酸纤维素膜4上印上对照印迹带“|”，两个印迹并排形成，组合印迹带“‖”。8-1为白色保护膜，覆盖在玻璃棉2和吸附有瘦肉精金标抗体棉上，在2和3交界处对应保护膜8-1位置上偏向于玻璃棉2-方0.5cm处印有标记线9，9的右端印有箭头及max字样，滤纸层5即吸水层(手柄端)上覆盖有黄色保护膜8-2。待测样品溶液的制备及检测操作步骤，详见具体实施例中的(6)，这里就不重述了。

Claims (3)

1.一种盐酸克伦特罗即瘦肉精快速检测试纸条，含有支撑层，反应试剂载体吸附层，支撑层为不吸水薄片层，吸附层固定在支撑层上，其特征是：吸附层从样品端依次为纤维层，吸附瘦肉精金标抗体纤维层，纤维素膜层，由吸水材料层构成的手柄端，其中以偶联瘦肉精的载体蛋白溶液在纤维素膜层上印制检测印迹带，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液在纤维素膜层上印制对照印迹带。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：不吸水的支撑层薄片层可用硬质塑胶片条，或不吸水的硬纸条，纤维层可用玻璃棉，吸水材料层可用吸水纸，纤维素膜层可用硝酸纤维素膜，金标抗体纤维层可用吸附瘦肉精金标抗体玻璃棉，瘦肉精金标抗体为胶金标记瘦肉精的单克隆抗体或多克隆抗体，(偶联瘦肉精的载体蛋白的溶液为瘦肉精与载体蛋白偶联结合的复合溶液，在玻璃棉与瘦肉精金标抗体玻璃棉及吸水纸层上覆盖有保护膜，在玻璃棉与金标抗体交界处对应的保护膜偏向玻璃棉一侧约0.5cm处印制样品标记线。

3.根据要求1或2所述的试纸条，其特征是偶联瘦肉精的载体蛋白可为牛血清白蛋白，或为鸡卵清白蛋白，或为铁蛋白，或为血蓝蛋白，在纤维素膜层上的检测印迹带和对照印迹带可为平行组合排列。

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