CN111220802B - 基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸及其制备方法 - Google Patents

基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸及其制备方法，检测试纸中金标垫吸附胶体金纳米颗粒标记的抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb，检测膜上的检测线T为盐酸克伦特罗小分子CL与牛血清白蛋白BSA的偶联物BSA‑CL印迹，检测膜上的质控线C为抗BSA蛋白兔源多克隆抗体pAb印迹。本发明还具体公开了基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸的制备方法。本发明制得的基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸检测操作简便，特异性强，敏感性高，可快速给出可视化结果，易在生活实践中推广应用。

Description

基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸及其制备方法
技术领域
本发明属于确定食品安全的高敏感性检测器具技术领域，具体涉及一种基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸及其制备方法。
背景技术
免疫层析试纸检测技术是基于单克隆抗体技术、免疫标记技术及免疫层析技术发展起来的一种新型轻简化检测技术，可用于抗原、抗体及半抗原的定性、半定量和定量检测，具有简便、特异、快速、敏感的特点。与高效液相色谱法和气相色谱法等分析方法相比较而言，试纸检测技术不依赖于专业的技术人员及昂贵的仪器设备，成本较低且耗时较少。试纸检测的样品类型包括血液、尿液、乳液、口腔粘液、组织液等，可用于食品及水质安全检测、环境监测、传染病检测及慢性非传染性疾病检测。利用免疫层析试纸对半抗原进行定性、半定量及定量检测时通常采用竞争法，即当待测样品中的半抗原(Hapten)与金标抗体结合后，可阻断金标抗体与检测线上固化的人工抗原(BSA-Hapten)结合，此时胶体金颗粒不在检测线上聚集显色，多余的金标抗体与质控线上的抗抗体结合，使金颗粒聚集显色，从而确定试纸检测的有效性。如果待测样品中不含有半抗原(Hapten)，那么就不能阻断金标抗体与检测线上固化的人工抗原(BSA-Hapten)结合，此时胶体金标记的抗体将在检测线聚集显色；同上，质控线也因金颗粒的聚集而显色。因此，使用免疫层析试纸检测阴性样品时，结果同时出现检测线和质控线两条显色条带；检测阳性样品时，仅出现质控线，不出现检测线。半抗原检测试纸的检测靶标通常为抗生素、农药残留、兽药残留、生物毒素、激素等小分子物质。常见的基于竞争法检测小分子半抗原的试纸检测模式有两种：(1)金标单抗，人工抗原被用作检测线拦截金标单抗；(2)金标人工抗原，单抗被用作检测线拦截金标人工抗原，以上两种检测模式均依赖于抗小分子半抗原特异性的单克隆抗体。单抗是一种“Y”字形结构的免疫球蛋白，具有两个与抗原或半抗原分子特异结合的Fab区，单抗与对应抗原表位或半抗原表位的特异结合决定了检测方法的特异性，单抗的亲和力决定了检测方法的敏感性。
盐酸克伦特罗(Clenbuterol，CL)是一种仅具有免疫反应性而不具有免疫原性的小分子半抗原，分子量只有313.7，仅含有一个半抗原表位，在临床上常被用作为治疗哮喘和支气管痉挛的药物。此外，盐酸克伦特罗可以明显减少动物机体内脂肪的合成，提高瘦肉率，因此通常被人们称为“瘦肉精”。另外，盐酸克伦特罗易被机体吸收，在体内的半衰期较长，动物食用了含盐酸克伦特罗的饲料后，可通过食物链将这些小分子残留带到人体内。人食用了含有盐酸克伦特罗药物残留的肉制品后，会出现不同程度的中毒现象，严重时甚至损伤肾脏等器官，所以该药物被明令禁止用于食品生产过程。当前，盐酸克伦特罗小分子的检测方法主要有液质联用分析(LC-MS)、气质联用分析(GC-MS)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及胶体金法。其中，LC-MS、GC-MS和ELISA法均需要专业技术人员操作、依赖于各类仪器设备，故通常局限于实验室使用。而胶体金法摆脱了对大型仪器设备的依赖，且操作简便，结果易于判定，因此可满足快速检测和现场检测(point of care testing)的需求，能够较好地适用于卫生监督及日常检测需要。
纳米抗体(Nanobody)是一种基于羊驼体内的重链抗体可变区制备的重组单域抗体，仅存在一个与抗原或半抗原结合的位点，是目前已知的能与抗原结合的最小片段。采集免疫或未免疫的羊驼淋巴细胞，使用分子克隆技术构建噬菌体文库，通过噬菌体展示技术可筛选得到抗原或半抗原特异性的纳米抗体，并可利用大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物表达系统进行大量表达制备以用于疾病的检测和治疗。与单抗相比，纳米抗体分子小(15kDa)，结构稳定性强，亲和力高，水溶性好，易于表达和纯化，且仅为抗原、半抗原的检测提供单一结合位点，在疾病检测和药物残留检测领域具有巨大发展前景。研究表明：一个胶体金纳米颗粒表面可以结合60个抗体分子，而要实现对某一半抗原进行检测，仅需10～15个抗体分子即可。因此，理论上一个胶体金纳米颗粒表面可以结合5种不同的抗体分子用于检测。关于胶体金纳米颗粒同时标记5种抗体分子对多种半抗原进行多联试纸检测的研究已在相关实验室开展。基于这些研究，标记有60个单抗分子的胶体金纳米颗粒能够为检测提供120个结合位点，而标记有60个纳米抗体分子的胶体金颗粒，理论上只为检测提供60个结合位点，这样将会明显提高基于竞争法制备的小分子半抗原检测试纸的敏感性。
本发明针对提高胶体金免疫层析试纸检测盐酸克伦特罗小分子半抗原敏感性的关键技术问题，通过分子克隆和噬菌体展示技术筛选鉴定了盐酸克伦特罗小分子特异性的纳米抗体，研制了基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原胶体金快速检测试纸，为在检测现场实时对盐酸克伦特罗小分子开展检测、保障食品安全提供了更为快速敏感的检测方法，对保护人群健康维护公共卫生安全具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸及其制备方法，该检测试纸检测操作简便，特异性强，敏感性高，可快速给出可视化结果，易在生活实践中推广应用。
本发明为实现上述目的采用如下技术方案，基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸，包括支撑板及由样品端到手柄端依次设置于支撑板上的样品垫、金标垫、检测膜和吸水垫，样品垫和金标垫上设有样品垫保护膜，吸水垫上设有手柄端保护膜，其特征在于：所述金标垫吸附胶体金纳米颗粒标记的抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb，检测膜上的检测线T为盐酸克伦特罗小分子CL与牛血清白蛋白BSA的偶联物BSA-CL印迹，检测膜上的质控线C为抗BSA蛋白兔源多克隆抗体pAb印迹。
优选的，所述抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb特异识别盐酸克伦特罗小分子的半抗原表位，且每个抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb仅提供单一结合位点用于结合单个盐酸克伦特罗小分子，较天然单抗mAb提供的抗原结合位点减半，当待测样品中不含盐酸克伦特罗小分子时，检测膜显现检测线T和质控线C两条红色条带“││”，当待测样品中含有盐酸克伦特罗小分子时只显现质控线C一条红色条带“│”，不显示检测线T，该检测试纸能够在待测样品中存在微量或痕量盐酸克伦特罗小分子半抗原时即阻断金标纳米抗体Nb与检测线上的BSA-CL偶联物结合，阻止检测线T出现红色条带，显著提升了检测试纸检测的敏感性，进而能够实现对待测样品中盐酸克伦特罗小分子的高敏感性快速检测。
优选的，所述盐酸克伦特罗小分子CL与牛血清白蛋白BSA的偶联物BSA-CL由以下方法制备得到：采用重氮偶合反应制备盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白偶联物，将5mg盐酸克伦特罗CL溶解于4mL、0.01mol/L的稀盐酸中，加入10mg亚硝酸钠，在4℃条件下搅拌6h得到CL溶液，将20mg牛血清白蛋白BSA提前溶解于2mL、0.1mol/L、pH 8.6的磷酸盐缓冲液PBS中，并将其加入到上述CL溶液中，在4℃条件下再次搅拌6h，将获得的溶液对0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲液作透析后，4000r/min离心10min，收集上清液即为BSA-CL偶联物，分装后保存于-20℃，待用于羊驼免疫或检测线印制。
优选的，所述抗BSA蛋白兔源多克隆抗体pAb由以下方法制备得到：
(1)兔抗牛血清白蛋白多克隆抗体的制备，以弗氏完全佐剂乳化牛血清白蛋白BSA抗原，以200μg/只的剂量通过背部皮下多点注射2.0kg健康新西兰兔，进行首次免疫，间隔3周后，以弗氏不完全佐剂乳化BSA抗原分别进行第二次、第三次和第四次免疫，最后一次加强免疫2周后，采集酶联免疫吸附试验中效价最高的兔全血，以4000r/min离心20min分离高免血清；
(2)兔抗BSA蛋白多克隆抗体IgG的提取，以辛酸-硫酸铵法从高免兔血清中提取IgG，取2mL高免兔血清，向其中加入4mL、0.06mol/L、pH 5.0的乙酸钠缓冲液，以0.1mol/L的盐酸溶液调节至pH 4.5，于室温搅拌下，逐滴加入90μL辛酸，于4℃静置2h，15000r/min离心30min，弃沉淀，在离心上清中加入1/10体积0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲溶液，以0.1mol/L氢氧化钠溶液调节至pH 7.4，于冰浴条件下加入饱和硫酸铵至其终质量浓度为45％，4℃静置2h，10000r/min离心30min，弃上清，以0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲溶液重悬沉淀，对0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲溶液透析后，收集所纯化的兔抗BSA蛋白多克隆抗体IgG，用于检测试纸质控线C印迹的印制。
优选的，所述胶体金纳米颗粒标记的抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb由以下方法制备得到：
(1)抗盐酸克伦特罗纳米抗体的制备
(1.1)盐酸克伦特罗-卵清蛋白偶联物OVA-CL的制备
采用重氮偶合反应制备盐酸克伦特罗-卵清蛋白偶联物，将5mg盐酸克伦特罗CL溶解于4mL、0.01mol/L的盐酸溶液中，加入10mg亚硝酸钠，在4℃条件下搅拌6h得到CL溶液，将20mg卵清蛋白OVA提前溶解于2mL、0.1mol/L、pH 8.6的磷酸盐缓冲液PBS中，并将其加入上述CL溶液中，在4℃条件下再次搅拌6h，将获得的溶液对0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲液作透析后，4000r/min离心10min，收集上清液即为OVA-CL偶联物，分装后保存于-20℃，待用于纳米抗体筛选；
(1.2)羊驼免疫与采血
首免时，通过羊驼颈部淋巴结部位注射400μg的BSA-CL与弗氏完全佐剂混合液，两周后，将BSA-CL与弗氏不完全佐剂混合乳化，同上进行第二次免疫，共进行4次免疫，颈部静脉采血，以免疫印迹Westernblot检测抗体，以OVA-CL偶联物作为包被抗原建立的间接ELISA测定抗体效价，分离外周血淋巴细胞，提取总RNA，纯化mRNA，并经反转录合成第一链cDNA；
(1.3)噬菌体肽库的制备
利用特异扩增羊驼IgG2和IgG3重链抗体可变区的引物进行PCR反应，获得长度450bp的DNA片段，通过限制性内切酶Sac I和Spe I对目的基因进行酶切并将其克隆至pComb3XSS噬菌粒载体，连接产物电转化TG1感受态细胞得到可能包含编码羊驼全部重链抗体可变区基因的重组噬粒库，随机挑选20个单菌落，提取质粒进行双酶切鉴定，使用辅助噬菌体M13KO7感染上述细菌文库，以使细菌中的噬粒DNA包装成完整的噬菌体，完成噬菌体拯救，释放重组噬菌体，获得噬菌体展示文库，利用Westernblot确定VHH-pIII融合蛋白的表达，使用固相化的OVA蛋白和BSA蛋白对噬菌体文库进行预处理，再以固相化的OVA-CL偶联物抗原筛选噬菌体展示库，筛选过程以5wt％BSA和5wt％OVA作封闭液，经过3-5轮的“吸附-洗脱-扩增”过程，获得与CL小分子半抗原高特异性、高亲和力结合的重组噬菌体克隆；
(1.4)噬菌体文库VHH-pIII蛋白表达的检测
将噬菌体文库与适量上样缓冲液混匀，煮沸15min后作为样品进行SDS-PAGE，转移至PVDF膜，以辣根过氧化物酶HRP标记的小鼠抗M13 pIII单克隆抗体作为反应抗体于37℃反应1小时，通过增强型化学发光法曝光检测反应信号；
(1.5)阳性噬菌体克隆的ELISA鉴定
以碳酸盐缓冲液将OVA-CL偶联物抗原或OVA蛋白包被至96孔酶标板，4℃过夜，以5wt％脱脂奶于37℃封闭2小时，以PBST溶液即PBS+0.05wt％Tween-20洗涤三次，4℃条件下3000r/min离心15min收集过夜培养的菌液上清，加入酶标板，37℃孵育1小时，之后加入辣根过氧化物酶HRP标记的小鼠抗M13 pIII单克隆抗体，37℃孵育1小时。加入TMB底物缓冲液显色，于酶标仪上读取OD450值；
(1.6)纳米抗体的原核表达与纯化
将最后一轮筛选得到的噬菌体感染TG1感受态细胞，挑取单菌落，提取噬粒DNA，进行双酶切分析，将阳性单菌落噬菌体粒进行测序，并对氨基酸序列进行比对分析，鉴别重复序列及重链抗体可变区标志性的半胱氨酸残基，获得两种重复序列，分别命名为VHH37和VHH64。将编码纳米抗体的DNA片段亚克隆至原核表达载体pET28a(+)中，构建重组表达质粒pET28a-VHH37和pET28a-VHH64，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在15℃，以0.2mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导蛋白表达8小时，以Ni-NTA亲和层析和分子排阻色谱纯化重组蛋白；
(2)纳米抗体的胶体金标记
(2.1)胶体金纳米颗粒的制备，向500mL洁净的锥形瓶中分别加入100mL超纯水和1mL、1％w/v的氯金酸溶液，加热煮沸，在搅拌状态下迅速加入1mL新鲜配制的1％w/v柠檬酸钠溶液用作还原剂，煮沸3min时溶液颜色由黄色变为紫红色，再次煮沸2min后停止，待溶液冷却至室温，以超纯水将溶液体积补充至100mL，以0.2mol/L K2CO3调节pH至9.0，4℃避光保存；
(2.2)最适标记蛋白浓度的确定，取待标记的纳米抗体对20mmol/LpH 8.0Tris-HCl缓冲液于4℃过夜透析，在12孔微孔板中预先加入25μL超纯水，稀释待标记的纳米抗体，留超纯水对照孔，向各孔中加入125μL上述制备的胶体金纳米颗粒溶液，室温静置5min后向各孔中加入125μL、1mol/LNaCl溶液，发现各孔颜色随纳米抗体浓度的降低而由红色变为蓝色，以颜色未变蓝的纳米抗体最高稀释度对应浓度的120％作为胶体金颗粒标记时的最适蛋白浓度；
(2.3)盐酸克伦特罗小分子特异性纳米抗体的胶体金标记，取2mL稀释至最适标记浓度的纳米抗体，迅速加入10mLpH 9.0的胶体金溶液并充分混匀，室温孵育10～15min，加入1/10体积含10％w/v牛血清白蛋白BSA的20mmol/L硼酸钠溶液，迅速混匀，室温作用10～15min，在4℃条件下，以15000g离心30min，弃上清，以含1％w/v BSA的20mmol/L硼酸钠溶液重悬沉淀，同上离心，弃上清，重复洗涤1次，以1mL含1％w/v BSA的20mmol/L硼酸钠溶液重悬沉淀，即为胶体金纳米颗粒标记的抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb，4℃避光保存，用于金标垫的喷附。
本发明所述的基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸的制备方法，其特征在于具体步骤为：
(1)金标垫的制备
将玻璃纤维切成1.5×30cm2的长条，置于XYZ 3000三维喷点仪平台上，展平并以压条固定，将胶体金标记的盐酸克伦特罗小分子特异性纳米抗体溶液放于Airjet的贮存池中，利用Airjet Quanti 3000以15μL/cm将上述溶液喷点于玻璃纤维，置于50℃干燥箱干燥30min后密闭保存备用；
(2)样品垫的制备
将玻璃纤维切割成1.5×30cm2的长条，置于含0.1mol/LNaCl、0.2％v/v Tween 20和0.1％w/v叠氮钠的pH 7.4的PBS溶液中浸泡，置50℃干燥箱干燥30min后，密闭保存备用；
(3)检测膜的制备
将硝酸纤维素膜即NC膜切成2.5×30cm2的长条，展平后以压条固定，将BSA-CL偶联物和兔抗BSA蛋白多抗IgG分别放于XYZ 3000三维喷点仪的贮存池1和2中，利用Biojet1和Biojet2以1.0μL/cm分别将BSA-CL偶联物和兔抗BSA蛋白多抗IgG溶液喷点于检测膜中央，分别形成检测线T印迹和质控线C印迹，检测线T与质控线C相距0.5cm，置于室温自然干燥后，将检测膜密闭保存备用；
(4)吸水垫的制备
将吸水棉切割成2.5×30cm2的长条，密闭保存备用；
(5)支撑板的制备
将双面胶贴于PVC塑料支撑板，切成7.5×30cm2的长板，制备试纸支撑板；
(6)检测试纸的组装
将样品垫、金标垫、检测膜和吸水垫等材料按特定排列方式粘贴在支撑板上，先将检测膜粘贴于支撑板中央，再将样品垫和金标垫依次粘贴于检测膜的样品端，然后将吸水垫粘贴于检测膜的另一端，相邻层间重叠2mm，之后将粘贴好的试纸板置于压膜机上，真空压膜5min，利用CM4000切割机将装配好的试纸板切成宽度为0.4cm的检测试纸条，密闭保存。
本发明所述的基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸的检测过程为：将盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸样品端插入待检测样品溶液后，待检溶液中的盐酸克伦特罗小分子在吸水垫的吸引作用下向硝酸纤维素膜扩散并最终渗透到滤纸层，在扩散过程中待测样品溶液水合金标纳米抗体Nb，金标纳米抗体Nb与待检盐酸克伦特罗小分子相结合，形成金标纳米抗体Nb-CL半抗原复合物，结合过盐酸克伦特罗小分子的金标纳米抗体Nb不能再与检测膜上的检测线印迹物BSA-CL结合，不能生成红棕色“|”条带，金标纳米抗体Nb继续向手柄端扩散，在检测膜上与质控线印迹中的兔抗BSA蛋白多克隆抗体pAb结合，生成红棕色标记“|”，即仅有质控线C显现红棕色标记“|”，同时检测线T不显色，表示待测样品溶液中含有盐酸克伦特罗小分子；当样品中不含盐酸克伦特罗小分子时，被待测样品溶液水化后的金标纳米抗体Nb在向硝酸纤维素膜扩散过程中，没有与CL结合，不形成金标纳米抗体Nb-CL半抗原复合物，此时金标纳米抗体Nb与检测膜上的检测线印迹BSA-CL结合，生成红棕色“|”标记，部分金标纳米抗体继续扩散，与质控线印迹中的兔抗BSA蛋白多克隆抗体pAb结合，生成红棕色标记“|”，形成两条红棕色阳性标记“||”，表示样品中不含有盐酸克伦特罗小分子，如果检测膜上没有红棕色标记显示或仅有检测线出现红棕色“|”标记，表明检测试纸已失效，需要使用新的检测试纸对待测样品溶液进行再次检测。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：本发明提供的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸实现了在现场对更低浓度盐酸克伦特罗小分子的快速即时检测，操作简单，无需专业技术人员或其他大型仪器设备，可在卫生检验检疫、卫生监督、海关检疫、集约化养殖到个体养殖、日常检疫等范围推广应用，市场前景广阔，可产生较大的社会效益和经济效益。
本发明提供的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸具有以下优点：
(1)高敏感性。筛选的纳米抗体亲和力高，且每个纳米抗体仅为检测盐酸克伦特罗小分子提供单一结合位点，显著提升了检测敏感性。因此，基于胶体金颗粒标记的纳米抗体制备的盐酸克伦特罗小分子半抗原检测试纸可在检测现场实现对痕量样品的即时快速检测。
(2)特异性强。盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸是基于高特异性、高亲和力的纳米抗体制备而成的。纳米抗体在制备过程中经多轮筛选，特异性强、敏感性高，其与胶体金颗粒之间以非共价形式结合对其反应特性不存在影响，且具有较高的标记效率，充分保留了纳米抗体与盐酸克伦特罗小分子结合的高特异性。
(3)操作简便快速。使用盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸开展检测时无需任何其它实验试剂，不依赖于专业仪器设备及技术人员，只需将试纸插入待检样品溶液中，在5～10min内即可判定检测结果，结果具有可视化，易读易懂。
(4)结果显示直观准确。盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸以质控线C显示红棕色“│”印迹，同时检测线T不显示印迹作为检测的阳性标记，即在检测膜上T线位置不出现棕红色条带“│”，C线位置出现棕红色条带“│”为盐酸克伦特罗小分子阳性，表示被检测样品中含有盐酸克伦特罗小分子；试纸出现两条红棕色条带“││”为盐酸克伦特罗小分子阴性，表示被检样品中不含有盐酸克伦特罗小分子，结果判定直观、准确、方便易懂。检测膜上的检测线T为盐酸克伦特罗小分子CL与牛血清白蛋白BSA的偶联物BSA-CL印迹“│”，质控线C为抗BSA蛋白兔源多抗pAb印迹“│”。检测时，在检测膜上显现两条红色条带“││”为不含盐酸克伦特罗小分子的样品，只显现质控线C一条红色条带“│”为含有盐酸克伦特罗小分子的样品。
(5)成本低，易于推广使用。使用盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸，可在现场实现一步检测和即时检测，不需另配仪器设备及其它实验试剂，不依赖于专业的技术人员，成本低廉，易于在卫生检验检疫、卫生监督、食品安全检测等领域推广使用。
附图说明
图1是盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸的侧视结构示意图；
图2是盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸的俯视结构示意图。
图中：1-支撑板，2-样品垫，3-金标垫，4-检测膜，5-吸水垫，6-检测线T，7-质控线C，8-1-样品端保护膜，8-2-手柄端保护膜。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸可广泛应用于食品中盐酸克伦特罗小分子半抗原残留物的快速检测。制备盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸，首先需制备盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白偶联物BSA-CL和盐酸克伦特罗-卵清蛋白偶联物OVA-CL，进而制备抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb及抗牛血清白蛋白BSA的兔源多克隆抗体pAb，识别盐酸克伦特罗小分子的纳米抗体Nb用于制备胶体金纳米颗粒标记物，盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白偶联物BSA-CL用于印制检测膜上的检测线印迹“│”，识别牛血清白蛋白BSA的兔源抗体pAb用于印制检测膜上的质控线印迹“│”。
(1)盐酸克伦特罗-载体蛋白偶联物的制备
(1.1)盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白偶联物(BSA-CL)的制备
采用重氮偶合反应制备盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白偶联物：将5mg盐酸克伦特罗CL溶解于4mL的稀盐酸溶液(0.01mol/L)中，加入10mg亚硝酸钠，在4℃条件下搅拌6h，将20mg牛血清白蛋白BSA提前溶解于2mL的磷酸盐缓冲液PBS(0.1mol/L，pH 8.6)中，并将其加入上述CL溶液中，在4℃条件下再次搅拌6h。将上述获得的溶液对PBS(0.01mol/L，pH 7.4)缓冲液作透析后，4000r/min离心10min，收集上清液即为BSA-CL偶联物，分装后保存于-20℃，待用于羊驼免疫或检测线印制。
(1.2)盐酸克伦特罗-卵清蛋白偶联物(OVA-CL)的制备
采用重氮偶合反应制备盐酸克伦特罗-卵清蛋白偶联物：将5mg盐酸克伦特罗CL溶解于4mL的盐酸溶液(0.01mol/L)中，加入10mg亚硝酸钠，在4℃条件下搅拌6h，将20mg卵清蛋白OVA提前溶解于2mL的磷酸盐缓冲液PBS(0.1mol/L，pH 8.6)中，并将其加入上述CL溶液中，在4℃条件下再次搅拌6h。将上述获得的溶液对PBS(0.01mol/L，pH 7.4)缓冲液作透析后，4000r/min离心10min，收集上清液即为OVA-CL偶联物，分装后保存于-20℃，待用于纳米抗体筛选。
(2)抗盐酸克伦特罗纳米抗体的制备
(2.1)羊驼免疫与采血
首免时，通过羊驼颈部淋巴结部位注射400μg的BSA-CL与弗氏完全佐剂混合液。两周后，将BSA-CL与弗氏不完全佐剂混合乳化，同上进行第二次免疫，共进行4次免疫。颈部静脉采血，以免疫印迹(Westernblot)检测抗体，以OVA-CL作为包被抗原建立的间接ELISA测定抗体效价。分离外周血淋巴细胞，提取总RNA，纯化mRNA，并经反转录合成第一链cDNA。
(2.2)噬菌体肽库的制备
利用特异扩增羊驼IgG2和IgG3重链抗体可变区的引物进行PCR反应，获得长度450bp的DNA片段。通过限制性内切酶Sac I和Spe I对目的基因进行酶切并将其克隆至pComb3XSS噬菌粒载体，连接产物电转化TG1感受态细胞得到可能包含编码羊驼全部重链抗体可变区基因的重组噬粒库(细菌文库)。随机挑选20个单菌落，提取质粒进行双酶切鉴定。使用辅助噬菌体M13KO7感染上述细菌文库，以使细菌中的噬粒DNA包装成完整的噬菌体，完成噬菌体拯救，释放重组噬菌体，获得噬菌体展示文库。利用Westernblot确定VHH-pIII融合蛋白的表达；使用固相化的OVA蛋白和BSA蛋白对噬菌体文库进行预处理，再以固相化的OVA-CL偶联物抗原筛选噬菌体展示库，筛选过程以5wt％BSA和5wt％OVA作封闭液，经过3～5轮的“吸附-洗脱-扩增”过程，获得与CL小分子半抗原高特异性、高亲和力结合的重组噬菌体克隆。
(2.3)噬菌体文库VHH-pIII蛋白表达的检测
将噬菌体文库与适量上样缓冲液混匀，煮沸15min后作为样品进行SDS-PAGE，转移至PVDF膜，以辣根过氧化物酶HRP标记的小鼠抗M13 pIII单克隆抗体作为反应抗体于37℃反应1小时，通过增强型化学发光法(ECL)曝光检测反应信号。
(2.4)阳性噬菌体克隆的ELISA鉴定
以碳酸盐缓冲液将OVA-CL偶联物抗原或OVA蛋白包被至96孔酶标板，4℃过夜，以5％脱脂奶于37℃封闭2小时，以PBST溶液(PBS+0.05wt％Tween-20)洗涤三次，4℃条件下3000r/min离心15min收集过夜培养的菌液上清，加入酶标板，37℃孵育1小时，之后加入辣根过氧化物酶HRP标记的小鼠抗M13 pIII单克隆抗体，37℃孵育1小时。加入TMB底物缓冲液显色，于酶标仪上读取OD450值。
(2.5)纳米抗体的原核表达与纯化
将最后一轮筛选得到的噬菌体感染TG1感受态细胞，挑取单菌落，提取噬粒DNA，进行双酶切分析。将阳性单菌落噬菌体粒进行测序，并对氨基酸序列进行比对分析，鉴别重复序列及重链抗体可变区标志性的半胱氨酸残基，获得两种重复序列，分别命名为VHH37和VHH64。将编码纳米抗体的DNA片段亚克隆至原核表达载体pET28a(+)中，构建重组表达质粒pET28a-VHH37和pET28a-VHH64，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在15℃，以0.2mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达8小时，以Ni-NTA亲和层析和分子排阻色谱纯化重组蛋白。
(2.6)纳米抗体的功能分析
(2.6.1)Western blot：将OVA-CL、BSA-CL、BSA和OVA分别作为样品进行SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，以表达的纳米抗体作为一抗于37℃反应1小时，以辣根过氧化物酶HRP标记的小鼠抗His标签单抗作为二抗，37℃孵育1小时，通过增强型化学发光法(ECL)曝光检测反应信号。
(2.6.2)间接ELISA：以碳酸盐缓冲液将OVA-CL偶联物抗原包被至96孔酶标板，4℃过夜，以5％脱脂奶于37℃封闭2小时，PBST洗涤三次，将不同稀释度的重组纳米抗体加入酶标板，37℃孵育1小时，之后加入HRP酶标记的小鼠抗His标签单克隆抗体，37℃孵育1小时，加入TMB缓冲液显色，于酶标仪上读取OD450值。
(2.6.3)阻断ELISA：以碳酸盐缓冲液将OVA-CL偶联物抗原包被至96孔酶标板，4℃过夜，以5％脱脂奶于37℃封闭2小时，PBST洗涤三次，将CL标准品溶液与1:2000稀释的重组纳米抗体加入酶标板，37℃孵育1小时，之后加入HRP酶标记的小鼠抗His标签单克隆抗体，37℃孵育1小时，加入TMB缓冲液显色，于酶标仪上读取OD450值。
(2.6.4)夹心ELISA：以碳酸盐缓冲液将重组纳米抗体包被至96孔酶标板，4℃过夜，以5％脱脂奶于37℃封闭2小时，PBST洗涤三次，将不同稀释度的BSA-CL偶联物加入上述酶标板，37℃孵育1小时，之后加入HRP酶标记的兔抗BSA抗体，37℃孵育1小时，加入TMB缓冲液显色，于酶标仪上读取OD450值。
(2.6.5)阻断ELISA：以碳酸盐缓冲液将重组纳米抗体包被至96孔酶标板，4℃过夜，以5％脱脂奶于37℃封闭2小时，PBST洗涤三次，将不同稀释度的CL标准品溶液与1:500稀释的BSA-CL偶联物加入上述酶标板，37℃孵育1小时，之后加入HRP酶标记的兔抗BSA抗体，37℃孵育1小时，加入TMB缓冲液显色，于酶标仪上读取OD450值。
(2.6.6)Dot-ELISA：采用Dot-ELISA并结合序列比对结果验证重组纳米抗体的羊驼源性。以碳酸盐缓冲液分别稀释重组表达的纳米抗体、无关的纳米抗体及羊驼血清，点在NC膜上，37℃作用1小时，以5％脱脂奶在37℃作用2小时封闭NC膜。将NC膜放入稀释后的HRP酶标记的山羊抗羊驼抗体中，37℃作用1小时，加入DAB显色液显色，双蒸水终止显色，观察结果。
(3)兔抗牛血清白蛋白多克隆抗体IgG的制备
(3.1)兔抗牛血清白蛋白多克隆抗体的制备：以弗氏完全佐剂乳化牛血清白蛋白BSA抗原，以200μg/只的剂量通过背部皮下多点注射2.0kg左右健康新西兰兔，进行首次免疫。间隔3周后，以弗氏不完全佐剂乳化BSA抗原分别进行第二次、第三次和第四次免疫。最后一次加强免疫2周后，采集酶联免疫吸附试验(ELISA)中效价最高的兔全血，以4000r/min离心20min分离高免血清。
(3.2)兔抗BSA蛋白多克隆抗体IgG的提取：以辛酸-硫酸铵法从高免兔血清中提取IgG。取2mL高免兔血清，向其中加入4mL、0.06mol/L乙酸钠缓冲液(pH 5.0)，以0.1mol/LHCl调节至pH 4.5；于室温搅拌下，逐滴加入90μL辛酸，4℃静置2h，15000r/min离心30min，弃沉淀；在离心上清中加入1/10体积PBS(0.01mol/L，pH 7.4)，以0.1mol/LNaOH调节至pH7.4；于冰浴条件下加入饱和硫酸铵至其终浓度为45％，4℃静置2h，10000r/min离心30min，弃上清；以适量PBS重悬沉淀，对PBS(0.01mol/L，pH 7.4)透析后，收集所纯化的兔抗BSA蛋白多克隆抗体IgG，用于检测试纸质控线C印迹的印制。
(4)纳米抗体的胶体金标记
(4.1)胶体金纳米颗粒的制备：向500mL洁净的锥形瓶中分别加入100mL超纯水和1mL、1％(w/v)的氯金酸溶液，加热煮沸，在搅拌状态下迅速加入1mL新鲜配制的1％(w/v)柠檬酸钠溶液用作还原剂，煮沸约3min时溶液颜色由黄色变为紫红色，再次煮沸2min后停止；待溶液冷却至室温，以超纯水将溶液体积补充至100mL，以0.2mol/LK2CO3调节pH至9.0，4℃避光保存。
(4.2)最适标记蛋白浓度的确定：取待标记的纳米抗体对20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH 8.0)于4℃过夜透析。在12孔微孔板中预先加入25μL超纯水，以1:2、1:4、1:8等倍比稀释待标记的纳米抗体，留超纯水对照孔；向各孔中加入125μL上述制备的胶体金纳米颗粒溶液，室温静置5min后向各孔中加入125μL、1mol/LNaCl溶液，发现各孔颜色随纳米抗体浓度的降低而由红色变为蓝色。以颜色未变蓝的纳米抗体最高稀释度对应浓度的120％作为胶体金颗粒标记时的最适蛋白浓度。
(4.3)盐酸克伦特罗小分子特异性纳米抗体的胶体金标记：取2mL稀释至最适标记浓度的纳米抗体，迅速加入10mL胶体金溶液(pH 9.0)并充分混匀，室温孵育10～15min；加入1/10体积含10％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的20mmol/L硼酸钠溶液，迅速混匀，室温作用10～15min；于4℃条件下，以15000g离心30min，弃上清；以含1％(w/v)BSA的20mmol/L硼酸钠溶液重悬沉淀，同上离心，弃上清；重复洗涤1次，以1mL含1％(w/v)BSA的20mmol/L硼酸钠溶液重悬沉淀，即为胶体金标记的纳米抗体，4℃避光保存，用于金标垫的喷附。
(5)金标垫的制备
将玻璃纤维切成1.5×30cm2的长条，置于XYZ 3000三维喷点仪平台上，展平并以压条固定。将胶体金标记的盐酸克伦特罗小分子特异性纳米抗体溶液放于Airjet的贮存池中，利用Airjet Quanti 3000以15μL/cm将上述溶液喷点于玻璃纤维；置于50℃干燥箱干燥30min后密闭保存备用。
(6)样品垫的制备
将玻璃纤维切割成1.5×30cm2的长条，置于含0.1mol/LNaCl、0.2％Tween 20(v/v)和0.1％(w/v)叠氮钠的PBS(pH 7.4)溶液中浸泡；置50℃干燥箱干燥30min后，密闭保存备用。
(7)检测膜的制备
切割硝酸纤维素膜(NC膜)成2.5×30cm2的长条，展平后以压条固定。将BSA-CL偶联物和兔抗BSA蛋白多抗IgG分别放于XYZ 3000三维喷点仪的贮存池1和2中，利用Biojet1和Biojet2以1.0μL/cm分别将BSA-CL偶联物和兔抗BSA蛋白多抗IgG溶液喷点于检测膜中央，分别形成检测线T和质控线C印迹，T线与C线相距0.5cm；置室温自然干燥后，将检测膜密闭保存备用。
(8)吸水垫的制备
将吸水棉切割成2.5×30cm2的长条，密闭保存备用。
(9)支撑板的制备
将双面胶贴于PVC塑料支撑板，切成7.5×30cm2的长板，制备试纸支撑板。
(10)试纸的组装
将样品垫、金标垫、检测膜和吸水垫等材料按一定排列方式粘贴在支撑板上。先将NC膜粘贴于支撑板中央，再将样品垫和金标垫依次粘贴于NC膜的样品端，然后将吸水垫粘贴于NC膜的另一端，各层间重叠约2mm，之后将粘贴好的试纸板置于压膜机上，真空压膜5min。利用CM4000切割机将装配好的试纸板切成宽度为0.4cm的检测试纸条，密闭保存。
(11)盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸的实施结构
参见图1-2，图中1为支撑板，实施中采用塑胶薄片条；2为样品端的样品垫，实施中采用玻璃纤维；3为金标垫，实施中采用吸附有胶体金标记的纳米抗体的金标玻璃纤维；4为检测膜，实施中采用硝酸纤维素膜(NC膜)；5为手柄端的吸水垫，实施中采用吸水棉；6为检测线T，实施中为采用BSA-CL偶联物印制的检测线印迹“|”；7为质控线C，实施中为采用兔抗BSA蛋白多抗IgG印制的质控线印迹“|”；8为保护膜，实施中8-1为覆盖在样品垫玻璃纤维和金标玻璃纤维上的样品端保护膜，8-2为覆盖在吸水垫滤纸层上的手柄端保护膜；实施中，样品垫2、金标垫3、检测膜4及吸水垫5的玻璃纤维依次互相重叠0.2cm，图2中箭头方向为样品溶液的流动方向。
(12)盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸实施检测反应原理
当将盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸样品端插入待检测样品溶液后，待检样品溶液中的盐酸克伦特罗小分子在吸水垫的吸引作用下向硝酸纤维素膜扩散并最终渗透到滤纸层。在扩散过程中样品溶液水合金标纳米抗体Nb，金标纳米抗体Nb与待检盐酸克伦特罗小分子相结合，形成金标纳米抗体Nb-CL半抗原复合物，结合过盐酸克伦特罗小分子的金标纳米抗体Nb不能再与检测膜上的检测线印迹物BSA-CL结合，不能生成红棕色“|”条带，金标纳米抗体继续向手柄端扩散，在检测膜上与质控线印迹中的兔抗BSA蛋白多克隆抗体pAb结合，生成红棕色标记“|”，即仅有质控线C显现红棕色标记“|”，同时检测线T不显色，表示样品中含有盐酸克伦特罗小分子；当样品中不含盐酸克伦特罗小分子时，被样品溶液水化后的金标纳米抗体Nb在向硝酸纤维素膜扩散过程中，没有与CL结合，不形成金标纳米抗体Nb-CL半抗原复合物，金标纳米抗体Nb与检测膜上的检测线印迹BSA-CL结合，生成红棕色“|”标记，部分金标纳米抗体继续扩散，与质控线印迹中的兔抗BSA蛋白多克隆抗体pAb结合，生成红棕色标记“|”，形成两条红棕色阳性标记“||”，表示样品中不含有盐酸克伦特罗小分子。如果检测膜上没有红棕色标记显示或仅有检测线出现红棕色“|”标记，表明检测试纸已失效，需要使用新的试纸对样品进行再次检测。
(13)盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸检测实例操作方法
(13.1)待检样品溶液的准备：(1)尿液样品：使用洁净容器收集生猪尿液，可直接检测。(2)肉样：取约5克肉泥样品置于离心管中，煮沸10min，取上清液检测。(3)饲料：取约5克研磨后的饲料，加约5mL水，煮沸10min，取上清液检测。
(13.2)试纸检测：将盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸样品端浸入待检样品溶液10～20s；取出检测试纸水平放置5～10min，观察显色结果。
(13.3)检测结果判定：检测试纸显现两条红棕色条带(检测线和质控线)“||”为盐酸克伦特罗阴性，表示待检样品溶液中不含有盐酸克伦特罗小分子；仅显现一条红棕色条带(质控线)“|”为盐酸克伦特罗阳性，表示待检样品溶液中含有盐酸克伦特罗小分子；试纸未显现任何条带或仅显现检测线“|”表明检测操作不当或试纸失效，需另取检测试纸重新检测。
实施例1
生猪尿液样品中盐酸克伦特罗小分子的检测，使用洁净容器收集尿液样品，可直接检测。如有浑浊，以3000r/min离心5min，取上清液检测。以盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸检测按上述(13)操作方法进行检测和结果判定，确定生猪是否食用盐酸克伦特罗小分子药物。检测试纸显现两条红棕色条带(检测线和质控线)“||”为盐酸克伦特罗阴性，表示待检生猪未食用盐酸克伦特罗小分子药物；仅出现一条红棕色条带(质控线)“|”为盐酸克伦特罗阳性，表示待检生猪食用了盐酸克伦特罗小分子药物；试纸未显现任何条带或仅显现一条红棕色条带(检测线)“|”，表明检测操作不当或试纸失效，需另取检测试纸重新检测。
实施例2
生猪肉样样品中盐酸克伦特罗小分子的检测，取约5克肉泥样品置于离心管中，煮沸10min，取上清液检测。如有浑浊，以3000r/min离心5min，取上清液检测。以盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸检测按上述(13)操作方法进行检测和结果判定，确定生猪是否食用盐酸克伦特罗小分子药物。检测试纸显现两条红棕色条带(检测线和质控线)“||”为盐酸克伦特罗阴性，表示待检猪未食用盐酸克伦特罗小分子药物；一条红棕色条带(质控线)“|”为盐酸克伦特罗阳性，表示待检猪食用了盐酸克伦特罗小分子药物；检测试纸未显现任何条带或仅显现一条红棕色条带(检测线)“|”，表明检测操作不当或试纸失效，需另取检测试纸重新检测。
实施例3
饲料样品中盐酸克伦特罗小分子的检测，取约5克研磨后的饲料，加约5mL水，煮沸10min，取上清液检测。如有浑浊，以3000r/min离心5min，取上清液检测。以盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸检测按上述(13)操作方法进行检测和结果判定，确定饲料样品中是否添加了盐酸克伦特罗小分子药物。检测试纸显现两条红棕色条带(检测线和质控线)“||”为盐酸克伦特罗阴性，表示饲料样品中未添加盐酸克伦特罗小分子药物；一条红棕色条带(质控线)“|”为盐酸克伦特罗阳性，表示饲料样品中添加了盐酸克伦特罗小分子药物；检测试纸未显现任何条带或仅显现一条红棕色条带(检测线)“|”，表明检测操作不当或试纸失效，需另取检测试纸重新检测。
以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围。

Claims (4)

1.基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸，包括支撑板及由样品端到手柄端依次设置于支撑板上的样品垫、金标垫、检测膜和吸水垫，样品垫和金标垫上设有样品垫保护膜，吸水垫上设有手柄端保护膜，其特征在于：所述金标垫吸附胶体金纳米颗粒标记的抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb，检测膜上的检测线T为盐酸克伦特罗小分子CL与牛血清白蛋白BSA的偶联物BSA-CL印迹，检测膜上的质控线C为抗BSA蛋白兔源多克隆抗体pAb印迹；
所述盐酸克伦特罗小分子CL与牛血清白蛋白BSA的偶联物BSA-CL由以下方法制备得到：采用重氮偶合反应制备盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白偶联物，将5mg盐酸克伦特罗CL溶解于4mL、0.01mol/L的稀盐酸中，加入10mg亚硝酸钠，在4℃条件下搅拌6h得到CL溶液，将20mg牛血清白蛋白BSA提前溶解于2mL、0.1mol/L、pH 8.6的磷酸盐缓冲液PBS中，并将其加入到上述CL溶液中，在4℃条件下再次搅拌6h，将获得的溶液对0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲液作透析后，4000r/min离心10min，收集上清液即为BSA-CL偶联物，分装后保存于-20℃，待用于羊驼免疫或检测线印制；
所述抗BSA蛋白兔源多克隆抗体pAb由以下方法制备得到：
(1)兔抗牛血清白蛋白多克隆抗体的制备：以弗氏完全佐剂乳化牛血清白蛋白BSA抗原，以200μg/只的剂量通过背部皮下多点注射2.0kg健康新西兰兔，进行首次免疫，间隔3周后，以弗氏不完全佐剂乳化BSA抗原分别进行第二次、第三次和第四次免疫，最后一次加强免疫2周后，采集酶联免疫吸附试验中效价最高的兔全血，以4000r/min离心20min分离高免血清；
(2)兔抗BSA蛋白多克隆抗体IgG的提取：以辛酸-硫酸铵法从高免兔血清中提取IgG，取2mL高免兔血清，向其中加入4mL、0.06mol/L、pH 5.0的乙酸钠缓冲液，以0.1mol/L的盐酸溶液调节至pH 4.5，于室温搅拌下，逐滴加入90μL辛酸，于4℃静置2h，15000r/min离心30min，弃沉淀，在离心上清中加入1/10体积0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲溶液，以0.1mol/L氢氧化钠溶液调节至pH 7.4，于冰浴条件下加入饱和硫酸铵至其终质量浓度为45％，4℃静置2h，10000r/min离心30min，弃上清，以0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲溶液重悬沉淀，对0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲溶液透析后，收集所纯化的兔抗BSA蛋白多克隆抗体IgG，用于检测试纸质控线C印迹的印制；
所述胶体金纳米颗粒标记的抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb由以下方法制备得到：
(1)抗盐酸克伦特罗纳米抗体的制备
(1.1)盐酸克伦特罗-卵清蛋白偶联物OVA-CL的制备
采用重氮偶合反应制备盐酸克伦特罗-卵清蛋白偶联物，将5mg盐酸克伦特罗CL溶解于4mL、0.01mol/L的盐酸溶液中，加入10mg亚硝酸钠，在4℃条件下搅拌6h得到CL溶液，将20mg卵清蛋白OVA提前溶解于2mL、0.1mol/L、pH 8.6的磷酸盐缓冲液PBS中，并将其加入上述CL溶液中，在4℃条件下再次搅拌6h，将获得的溶液对0.01mol/L、pH 7.4的PBS缓冲液作透析后，4000r/min离心10min，收集上清液即为OVA-CL偶联物，分装后保存于-20℃，待用于纳米抗体筛选；
(1.2)羊驼免疫与采血
首免时，通过羊驼颈部淋巴结部位注射400μg的BSA-CL与弗氏完全佐剂混合液，两周后，将BSA-CL与弗氏不完全佐剂混合乳化，同上进行第二次免疫，共进行4次免疫，颈部静脉采血，以免疫印迹Western blot检测抗体，以OVA-CL偶联物作为包被抗原建立的间接ELISA测定抗体效价，分离外周血淋巴细胞，提取总RNA，纯化mRNA，并经反转录合成第一链cDNA；
(1.3)噬菌体肽库的制备
利用特异扩增羊驼IgG2和IgG3重链抗体可变区的引物进行PCR反应，获得长度450bp的DNA片段，通过限制性内切酶Sac I和Spe I对目的基因进行酶切并将其克隆至pComb3XSS噬菌粒载体，连接产物电转化TG1感受态细胞得到可能包含编码羊驼全部重链抗体可变区基因的重组噬粒库，随机挑选20个单菌落，提取质粒进行双酶切鉴定，使用辅助噬菌体M13KO7感染上述细菌文库，以使细菌中的噬粒DNA包装成完整的噬菌体，完成噬菌体拯救，释放重组噬菌体，获得噬菌体展示文库，利用Western blot确定VHH-pIII融合蛋白的表达，使用固相化的OVA蛋白和BSA蛋白对噬菌体文库进行预处理，再以固相化的OVA-CL偶联物抗原筛选噬菌体展示库，筛选过程以5wt％BSA和5wt％OVA作封闭液，经过3-5轮的“吸附-洗脱-扩增”过程，获得与CL小分子半抗原高特异性、高亲和力结合的重组噬菌体克隆；
(1.4)噬菌体文库VHH-pIII蛋白表达的检测
将噬菌体文库与适量上样缓冲液混匀，煮沸15min后作为样品进行SDS-PAGE，转移至PVDF膜，以辣根过氧化物酶HRP标记的小鼠抗M13 pIII单克隆抗体作为反应抗体于37℃反应1小时，通过增强型化学发光法曝光检测反应信号；
(1.5)阳性噬菌体克隆的ELISA鉴定
以碳酸盐缓冲液将OVA-CL偶联物抗原或OVA蛋白包被至96孔酶标板，4℃过夜，以5wt％脱脂奶于37℃封闭2小时，以PBST溶液即PBS+0.05wt％Tween-20洗涤三次，4℃条件下3000r/min离心15min收集过夜培养的菌液上清，加入酶标板，37℃孵育1小时，之后加入辣根过氧化物酶HRP标记的小鼠抗M13 pIII单克隆抗体，37℃孵育1小时，加入TMB底物缓冲液显色，于酶标仪上读取OD450值；
(1.6)纳米抗体的原核表达与纯化
将最后一轮筛选得到的噬菌体感染TG1感受态细胞，挑取单菌落，提取噬粒DNA，进行双酶切分析，将阳性单菌落噬菌体粒进行测序，并对氨基酸序列进行比对分析，鉴别重复序列及重链抗体可变区标志性的半胱氨酸残基，获得两种重复序列，分别命名为VHH37和VHH64，将编码纳米抗体的DNA片段亚克隆至原核表达载体pET28a(+)中，构建重组表达质粒pET28a-VHH37和pET28a-VHH64，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在15℃，以0.2mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导蛋白表达8小时，以Ni-NTA亲和层析和分子排阻色谱纯化重组蛋白；
(2)纳米抗体的胶体金标记
(2.1)胶体金纳米颗粒的制备：向500mL洁净的锥形瓶中分别加入100mL超纯水和1mL1％w/v的氯金酸溶液，加热煮沸，在搅拌状态下迅速加入1mL新鲜配制的1％w/v柠檬酸钠溶液用作还原剂，煮沸3min时溶液颜色由黄色变为紫红色，再次煮沸2min后停止，待溶液冷却至室温，以超纯水将溶液体积补充至100mL，以0.2mol/LK2CO3调节pH至9.0，4℃避光保存；
(2.2)最适标记蛋白浓度的确定：取待标记的纳米抗体对20mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液于4℃过夜透析，在12孔微孔板中预先加入25μL超纯水，稀释待标记的纳米抗体，留超纯水对照孔，向各孔中加入125μL上述制备的胶体金纳米颗粒溶液，室温静置5min后向各孔中加入125μL、1mol/L的NaCl溶液，发现各孔颜色随纳米抗体浓度的降低而由红色变为蓝色，以颜色未变蓝的纳米抗体最高稀释度对应浓度的120％作为胶体金颗粒标记时的最适蛋白浓度；
(2.3)盐酸克伦特罗小分子特异性纳米抗体的胶体金标记：取2mL稀释至最适标记浓度的纳米抗体，迅速加至10mL、pH 9.0的胶体金溶液并充分混匀，室温孵育10～15min，加入1/10体积含10％w/v牛血清白蛋白BSA的20mmol/L硼酸钠溶液，迅速混匀，室温作用10～15min，在4℃条件下，以15000g离心30min，弃上清，以含1％w/v BSA的20mmol/L硼酸钠溶液重悬沉淀，同上离心，弃上清，重复洗涤1次，以1mL含1％w/v BSA的20mmol/L硼酸钠溶液重悬沉淀，即为胶体金纳米颗粒标记的抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb，4℃避光保存，用于金标垫的喷附。
2.根据权利要求1所述的基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸，其特征在于：所述抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb特异识别盐酸克伦特罗小分子的半抗原表位，且每个抗盐酸克伦特罗小分子半抗原的纳米抗体Nb仅提供单一结合位点用于结合单个盐酸克伦特罗小分子，较天然单抗mAb提供的抗原结合位点减半，当待测样品中不含盐酸克伦特罗小分子时，检测膜显现检测线T和质控线C两条红色条带“││”，当待测样品中含有盐酸克伦特罗小分子时只显现质控线C一条红色条带“│”，不显示检测线T，该检测试纸能够在待测样品中存在微量或痕量盐酸克伦特罗小分子半抗原时即阻断金标纳米抗体Nb与检测线上的BSA-CL偶联物结合，阻止检测线T出现红色条带，显著提升了检测试纸检测的敏感性，进而能够实现对待测样品中盐酸克伦特罗小分子的高敏感性快速检测。
3.一种权利要求1-2中任意一项所述的基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸的制备方法，其特征在于具体步骤为：
(1)金标垫的制备
将玻璃纤维切成1.5×30cm2的长条，置于XYZ 3000三维喷点仪平台上，展平并以压条固定，将胶体金标记的盐酸克伦特罗小分子特异性纳米抗体溶液放于Airjet的贮存池中，利用Airjet Quanti 3000以15μL/cm将上述溶液喷点于玻璃纤维，置于50℃干燥箱干燥30min后密闭保存备用；
(2)样品垫的制备
将玻璃纤维切割成1.5×30cm2的长条，置于含0.1mol/LNaCl、0.2％v/v Tween 20和0.1％w/v叠氮钠的pH 7.4的PBS溶液中浸泡，置50℃干燥箱干燥30min后，密闭保存备用；
(3)检测膜的制备
切割硝酸纤维素膜即NC膜切成2.5×30cm2的长条，展平后以压条固定，将BSA-CL偶联物和兔抗BSA蛋白多抗IgG分别放于XYZ 3000三维喷点仪的贮存池1和2中，利用Biojet1和Biojet2以1.0μL/cm分别将BSA-CL偶联物和兔抗BSA蛋白多抗IgG溶液喷点于检测膜中央，分别形成检测线T印迹和质控线C印迹，检测线T与质控线C相距0.5cm，置于室温自然干燥后，将检测膜密闭保存备用；
(4)吸水垫的制备
将吸水棉切割成2.5×30cm2的长条，密闭保存备用；
(5)支撑板的制备
将双面胶贴于PVC塑料支撑板，切成7.5×30cm2的长板，制备试纸支撑板；
(6)检测试纸的组装
将样品垫、金标垫、检测膜和吸水垫等材料按特定排列方式粘贴在支撑板上，先将检测膜粘贴于支撑板中央，再将样品垫和金标垫依次粘贴于检测膜的样品端，然后将吸水垫粘贴于检测膜的另一端，相邻层间重叠2mm，之后将粘贴好的试纸板置于压膜机上，真空压膜5min，利用CM4000切割机将装配好的试纸板切成宽度为0.4cm的检测试纸条，密闭保存。
4.一种权利要求1-2中任意一项所述的基于纳米抗体的盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸的应用，其特征在于具体检测过程为：将盐酸克伦特罗小分子半抗原高敏感性检测试纸样品端插入待检测样品溶液后，待检溶液中的盐酸克伦特罗小分子在吸水垫的吸引作用下向硝酸纤维素膜扩散并最终渗透到滤纸层，在扩散过程中待测样品溶液水合金标纳米抗体Nb，金标纳米抗体Nb与待检盐酸克伦特罗小分子相结合，形成金标纳米抗体Nb-CL半抗原复合物，结合过盐酸克伦特罗小分子的金标纳米抗体Nb不能再与检测膜上的检测线印迹物BSA-CL结合，不能生成红棕色“|”条带，金标纳米抗体Nb继续向手柄端扩散，在检测膜上与质控线印迹中的兔抗BSA蛋白多克隆抗体pAb结合，生成红棕色标记“|”，即仅有质控线C显现红棕色标记“|”，同时检测线T不显色，表示待测样品溶液中含有盐酸克伦特罗小分子；当样品中不含盐酸克伦特罗小分子时，被待测样品溶液水化后的金标纳米抗体Nb在向硝酸纤维素膜扩散过程中，没有与CL结合，不形成金标纳米抗体Nb-CL半抗原复合物，此时金标纳米抗体Nb与检测膜上的检测线印迹BSA-CL结合，生成红棕色“|”标记，部分金标纳米抗体继续扩散，与质控线印迹中的兔抗BSA蛋白多克隆抗体pAb结合，生成红棕色标记“|”，形成两条红棕色阳性标记“||”，表示样品中不含有盐酸克伦特罗小分子，如果检测膜上没有红棕色标记显示或仅有检测线出现红棕色“|”标记，表明检测试纸已失效，需要使用新的检测试纸对待测样品溶液进行再次检测。
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