CN102636640A

CN102636640A - 一种瘦肉精分型检测试纸及其制备方法

Info

Publication number: CN102636640A
Application number: CN2011100647412A
Authority: CN
Inventors: 汤石军
Original assignee: NANTONG DIAGNOS BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: NANTONG DIAGNOS BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2011-03-17
Filing date: 2011-03-17
Publication date: 2012-08-15

Abstract

本发明公开了一种瘦肉精分型检测试纸，包括PVC胶板，作为试纸的反应基片，PVC胶板有胶的一面从下到上依次为上样垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫；相邻的每一部分均在边接处交叠边接；其特征在于：所述硝酸纤维素膜上依次包被有检测T1线（盐酸克伦特罗～BSA）、检测T2线（莱克多巴胺）、质控C线（羊抗鼠IgG）；所述金标垫上喷涂有纳米级金颗粒标记的盐酸克伦特罗单克隆抗体和莱克多巴胺单克隆抗体混合液。本发明工艺制得的瘦肉精的检测试纸，具有灵敏度高，且不交叉反应的特征。在实际使用中，只要一次检测，便可得到两种成分的检测结果。

Description

一种瘦肉精分型检测试纸及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种检测试纸及其制备方法，具体是一种包括PVC胶板，作为试纸的反应基片，PVC胶板有胶的一面从下到上依次为上样垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫；相邻的每一部分均在边接处交叠边接的瘦肉精分型检测试纸及其制备方法。

背景技术

目前市场上使得的瘦肉精主要是盐酸克伦特罗成分的瘦肉精和莱克多巴胺成分的瘦肉精。由于这两种成分的瘦肉精能有效促使猪的瘦肉率提高，人们将瘦肉精添加于饲料中，以便增加动物的瘦肉量、减少饲料使用、使肉品提早上市、降低成本。但因为考虑对人体会产生副作用，各国开放使用的标准不一。中国目前是禁止在饲料中添加该成分的。

由于利益的促使，有些不法养殖户还是会偷偷的在饲料中增加该成分，对食品安全造成人为的干扰。为了检测该类成分是否残留在猪肉内，市场上已经有瘦肉精的快速检测试纸。并且根据不同成分的瘦肉精有不同的检测试纸，只是由于技术原因，目前的试纸为一种成分的瘦肉精检测为一个试纸，检测不同成分的瘦肉精，要按其成分一个个检测过去，重复劳动多。

发明内容

本发明的主要任务在于提供一种瘦肉精分型检测试纸及其制备方法，具体是一种能同时检测两种成分的瘦肉精的、灵敏度高的瘦肉精分型检测试纸及其制备方法。

为了解决以上技术问题，本发明的一种一种瘦肉精分型检测试纸，包括PVC胶板，作为试纸的反应基片，PVC胶板有胶的一面从下到上依次为上样垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫；相邻的每一部分均在边接处交叠边接；其特征在于：所述硝酸纤维素膜上依次包被有检测T1线（盐酸克伦特罗～BSA）、检测T2 线（莱克多巴胺）、质控C线（羊抗鼠IgG）；所述金标垫上喷涂有纳米级金颗粒标记的盐酸克伦特罗单克隆抗体和莱克多巴胺单克隆抗体混合液。

进一步地，所述试纸的上样垫应是亲水性材料，其长度为25～30mm，宽为2～5mm；胶体金垫为5～10mm，宽为2～5mm；硝酸纤维素垫长度为20～25mm，宽为2～5mm；吸水垫长25～30mm，宽为2～5mm；相邻各垫的交叠长度为1～3mm。

进一步地，所述分型检测试纸各条包被线的位置：T1线、T2线、C线距膜下边缘的距离分别为7mm、 10mm、 13mm，且相邻两条线间的距离为3mm。

进一步地，分型检测试纸的特征在于：所述硝酸纤维素膜上包被浓度为：检测T1线（盐酸克伦特罗－BSA ）为0.1～0.8mg/ml，检测T2线（莱克多巴胺－BSA）为0.1～0.8mg/ml；和质控C线（羊抗鼠IgG）浓度为0.1～1.0mg/ml。

进一步地，所述金标垫所用的纳米金的粒径为20～45nn；金标垫上标记的胶体金OD540浓度值为2～9，喷量为1.5～9ul/cm。

本发明还提供了一种制备瘦肉精分型检测试纸的方法，其特征在于:步骤如下：

A、吸收垫的制备：将吸水纸剪裁成相应的宽度。

B、分型检测试纸的包被工作液A的制备：10～80mg盐酸克伦特罗－BSA 偶联物，1～2g 蔗糖、0. 05-0.2g叠氮钠、0.8～1.5g氯化钠，0.29g 十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钠，加水定溶至100ml。

包被工作液B组成：10～80mg莱克多巴胺－BSA 偶联物，1～2g 蔗糖、0.05-0.2g叠氮钠、0.8～1.5g氯化钠，0.29g 十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钠，加水定溶至100ml。

C、检测线的制备

将市售的盐酸克伦特罗～BSA 及莱克多巴胺～BSA配制成0.1～0.8mg/ml的包被工作液A，于硝酸纤维素膜下边缘7mm和 10mm处用点膜机点膜头连续横向包被于硝酸纤维素膜上。再于30～40℃条件下干燥30～120分钟，再密封干燥保存。

D、质控线的制备

将羊抗鼠IgG多克隆抗体配制成0.2～1.0mg/ml的包被工作液B，于硝酸纤维素膜下边缘13mm处用点膜机点膜头连续横向包被于硝酸纤维素膜上。再于30～40℃条件下干燥30～120分钟，再密封干燥保存。

E、分型检测试纸所述单克隆抗体标记方法：分别量取市售浓度为0.01%纳米胶体金溶液100ml，放置于两个玻璃容器内，调节胶体金的溶液的PH值为5.8～6.8之间，在搅拌的情况下分别缓慢加入2ml 的 0.5mg/ml盐酸克伦特罗单克隆抗体和莱克多巴胺单克隆抗体溶液。继续搅拌45～120分钟，加入10%牛血清白蛋白至溶液终浓度为1%。继续搅拌30分钟后离心。离心为12000r/min，30分钟，弃上清，收集沉淀，加入25ml 金标洗涤保存液于12000 r/min离心30分钟，弃上清，再次收集沉淀，沉淀重悬于5ml金标洗涤保存液中待用。分别以少量胶体金工作液稀释胶体金后得一组梯度浓度的胶体金液，于OD540时测定一组值2～9的胶体金溶液，进行喷金干燥试验，再与已经包被膜匹配试验，优选工作参数后进行胶体金的喷制干燥。

金标洗涤保存液为1.0g 聚乙二醇－20000，0.2g 叠氮钠，0.1235g硼酸，加水定容至1000ml后0.22um 滤膜过滤后备用。

胶体金工作液为1g 牛血清白蛋白， 20g 蔗糖、5克海藻糖，0. 05-0.2g叠氮钠、0.29g 十二水磷酸氢二钠，0.02g磷酸二氢钠，0.025%Berol-08，加水定溶至100ml后0.22 um 滤膜过滤后备用。

F、胶体金垫的制备

用点喷方式将纳米金标记的盐酸克伦特罗单克隆抗体及莱克多巴胺单克隆抗体溶液喷涂于胶体金垫上，金标垫上标记的胶体金OD540浓度值为2～9，喷量为1.5～9ul/cm。置于30～40℃条件下干燥60～120分钟，再密封干燥保存。

G、分型检测试纸上样垫工作液为1～2g 牛血清白蛋白，0.1～0.2ml 曲拉通X－100，0.3～0.5g聚乙烯吡咯烷酮，2～5g 蔗糖、0. 05-0.2g叠氮钠、0.8～1.5g氯化钠，0.29g 十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钠，加水定溶至100ml。

H、上样垫的制备

将亲水性材料（如玻纤）浸入上样垫工作液中浸泡后取出，于30～40℃条件下除湿干燥60～240分钟。干燥后的样品垫应密封干燥保存。

本发明的优点在于：本发明工艺制得的瘦肉精的检测试纸，具有灵敏度高，且不交叉反应的特征。在实际使用中，只要一次检测，便可得到两种成分的检测结果。

附图说明

图1为本发明的结构示意图。

具体实施方式

本发明的一种瘦肉精分型检测试纸，如图1所示，以PVC胶板1作为试纸的反应基片，PVC胶板1有胶的一面从下到上依次为上样垫2、金标垫3、硝酸纤维素膜4、吸收垫5；相邻的每一部分均在边接处交叠边接。

在本发明中，试纸的上样垫2应是亲水性材料，其长度为25～30mm，宽为2～5mm，所述亲水性材料为无纺布、玻纤；金标垫3为5～10mm，宽为2～5mm，其所用的纳米金的粒径为20～45nn；标记的胶体金OD540浓度值为2～9，喷量为1.5～9ul/cm；硝酸纤维素膜4长度为20～25mm，宽为2～5mm；吸收垫5长25～30mm，宽为2～5mm；相邻各垫的交叠长度为1～3mm。

上述硝酸纤维素膜4上依次包被有检测T1线6（盐酸克伦特罗～BSA）、检测T2 线7（莱克多巴胺）、质控C线8（羊抗鼠IgG），金标垫3上喷涂有纳米级金颗粒标记的盐酸克伦特罗单克隆抗体和莱克多巴胺单克隆抗体混合液。

上述检测试纸各条包被线的位置：检测T1线6、检测T2线7、质控C线8距硝酸纤维素膜4下边缘的距离分别为7mm、 10mm、 13mm，且相邻两条线间的距离为3mm。

上述述硝酸纤维素膜4上包被线浓度为：检测T1线6（盐酸克伦特罗－BSA ）为0.1～0.8mg/ml，检测T2线7（莱克多巴胺－BSA）为0.1～0.8mg/ml；和质控C线8（羊抗鼠IgG）浓度为0.1～1.0mg/ml。

以上结构为本发明的瘦肉精分型检测试纸，该试纸的特点在于：有两条检测线，可以一次检测出两种成分的瘦肉精成分，操作简单，重要的是两种成分的检测中，本试纸不会交叉反应，灵敏度高。

本试纸的使用方法如下：

I、样本收集及处理

新鲜的肉类或内脏可以直接取样检测，冰冻的肉类样品则需要解冻后待测。称取已剁碎的样品加入浓度为60～80%的甲醇溶液中，待测样品与甲醇的质量体积比为2g/ml，混匀，在50 ～60℃水浴5～10分钟，取上层清亮液体用水稀释2.5倍后用于本发明的试纸检测。检测时用塑料吸管垂直滴加1 滴无气泡冷却样本渗出液（约20-30μl）于加样孔，5 秒后再加入加样缓冲液1滴（约30-40μl），开始计时，10分钟内读取结果。

尿样样本可以用干燥、洁净的离心管或适当容器采集20ml左右尿液。如果不立即检测，可将尿样冷冻保存；短期可进行冷藏保存，要注意避免腐败造成失效或污染。如果尿样出现沉淀或浑浊物，请离心后再检测。检测时用塑料吸管垂直滴加2滴尿样（约50-60μl）于加样孔内，开始计时，10分钟内读取结果。

J、结果判读

阴性结果: 检测区（T线）显示出两条色带、质控区（C线）显示一条色带总共显示三条色带，表明样本中克伦特罗含量小于3ng/ml，莱克多巴胺含量小于3ng/ml。符合国家无公害食品瘦肉精检测标准。（注：只要肉眼可见T线显现，即使T线很浅也应判读为有T线）

阳性结果: 只在质控区出现一条C线，或者检测区只出现一条T线，表示样本中有某种瘦肉精存在，或者同时存在两种有害物，或者T1不显色证明有克伦特罗残留，并且其含量大于3ng/ml；T2不显色证明有莱克多巴胺残留，并且其含量大于3ng/ml（注：T线完全不显现，可判读为阳性结果）。

无效结果：不论检测区是否出现T线，只要C线未出现，就表明此检测卡已经失效、过期或样本处理不当，需更换检测卡另做一次测试。

以下是本发明试纸的制备方法：

A、吸收垫的制备：将吸水纸剪裁成相应的宽度。

C、检测线的制备

D、质控线的制备

F、胶体金垫的制备

H、上样垫的制备

Claims

1.一种瘦肉精分型检测试纸，包括PVC胶板，作为试纸的反应基片，PVC胶板有胶的一面从下到上依次为上样垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫；相邻的每一部分均在边接处交叠边接；其特征在于：所述硝酸纤维素膜上依次包被有检测T1线（盐酸克伦特罗～BSA）、检测T2 线（莱克多巴胺）、质控C线（羊抗鼠IgG）；所述金标垫上喷涂有纳米级金颗粒标记的盐酸克伦特罗单克隆抗体和莱克多巴胺单克隆抗体混合液。

2.根据权利要求1所述的一种瘦肉精分型检测试纸，其特征在于：所述试纸的上样垫应是亲水性材料，其长度为25～30mm，宽为2～5mm；金标垫为5～10mm，宽为2～5mm；硝酸纤维素膜长度为20～25mm，宽为2～5mm；吸收垫长25～30mm，宽为2～5mm；相邻各垫的交叠长度为1～3mm。

3.根据权利要求1所述的一种瘦肉精分型检测试纸，其特征在于：所述分型检测试纸各条包被线的位置：T1线、T2线、C线距膜下边缘的距离分别为7mm、 10mm、 13mm，且相邻两条线间的距离为3mm。

4.根据权利要求1所述的一种瘦肉精分型检测试纸，其特征在于：分型检测试纸的特征在于：所述硝酸纤维素膜上包被浓度为：检测T1线（盐酸克伦特罗－BSA ）为0.1～0.8mg/ml，检测T2线（莱克多巴胺－BSA）为0.1～0.8mg/ml；和质控C线（羊抗鼠IgG）浓度为0.1～1.0mg/ml。

5.根据权利要求1所述的一种瘦肉精分型检测试纸，其特征在于：所述金标垫所用的纳米金的粒径为20～45nn；金标垫上标记的胶体金OD540浓度值为2～9，喷量为1.5～9ul/cm。

6.一种制备瘦肉精分型检测试纸的方法，其特征在于:步骤如下：

A、吸收垫的制备：将吸水纸剪裁成相应的宽度；

B、分型检测试纸的包被工作液A的制备：10～80mg盐酸克伦特罗－BSA 偶联物，1～2g 蔗糖、0. 05-0.2g叠氮钠、0.8～1.5g氯化钠，0.29g 十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钠，加水定溶至100ml；包被工作液B组成：10～80mg莱克多巴胺－BSA 偶联物，1～2g 蔗糖、0.05-0.2g叠氮钠、0.8～1.5g氯化钠，0.29g 十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钠，加水定溶至100ml；

C、检测线的制备：将市售的盐酸克伦特罗～BSA 及莱克多巴胺～BSA配制成0.1～0.8mg/ml的包被工作液A，于硝酸纤维素膜下边缘7mm和 10mm处用点膜机点膜头连续横向包被于硝酸纤维素膜上；再于30～40℃条件下干燥30～120分钟，再密封干燥保存；

D、质控线的制备：将羊抗鼠IgG多克隆抗体配制成0.2～1.0mg/ml的包被工作液B，于硝酸纤维素膜下边缘13mm处用点膜机点膜头连续横向包被于硝酸纤维素膜上；再于30～40℃条件下干燥30～120分钟，再密封干燥保存；

E、分型检测试纸所述单克隆抗体标记方法：分别量取市售浓度为0.01%纳米胶体金溶液100ml，放置于两个玻璃容器内，调节胶体金的溶液的PH值为5.8～6.8之间，在搅拌的情况下分别缓慢加入2ml 的 0.5mg/ml盐酸克伦特罗单克隆抗体和莱克多巴胺单克隆抗体溶液；继续搅拌45～120分钟，加入10%牛血清白蛋白至溶液终浓度为1%，继续搅拌30分钟后离心，离心为12000r/min，30分钟，弃上清，收集沉淀，加入25ml 金标洗涤保存液于12000 r/min离心30分钟，弃上清，再次收集沉淀，沉淀重悬于5ml金标洗涤保存液中待用；分别以少量胶体金工作液稀释胶体金后得一组梯度浓度的胶体金液，于OD540时测定一组值2～9的胶体金溶液，进行喷金干燥试验，再与已经包被膜匹配试验，优选工作参数后进行胶体金的喷制干燥；金标洗涤保存液为1.0g 聚乙二醇－20000，0.2g 叠氮钠，0.1235g硼酸，加水定容至1000ml后0.22um 滤膜过滤后备用；胶体金工作液为1g 牛血清白蛋白， 20g 蔗糖、5克海藻糖，0. 05-0.2g叠氮钠、0.29g 十二水磷酸氢二钠，0.02g磷酸二氢钠，0.025%Berol-08，加水定溶至100ml后0.22 um 滤膜过滤后备用；

F、胶体金垫的制备：用点喷方式将纳米金标记的盐酸克伦特罗单克隆抗体及莱克多巴胺单克隆抗体溶液喷涂于胶体金垫上，金标垫上标记的胶体金OD540浓度值为2～9，喷量为1.5～9ul/cm；置于30～40℃条件下干燥60～120分钟，再密封干燥保存；

G、分型检测试纸上样垫工作液为1～2g 牛血清白蛋白，0.1～0.2ml 曲拉通X－100，0.3～0.5g聚乙烯吡咯烷酮，2～5g 蔗糖、0. 05-0.2g叠氮钠、0.8～1.5g氯化钠，0.29g 十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，0.02g磷酸二氢钠，加水定溶至100ml；

H、上样垫的制备：将亲水性材料（如玻纤）浸入上样垫工作液中浸泡后取出，于30～40℃条件下除湿干燥60～240分钟，干燥后的样品垫应密封干燥保存。