CN101936995A

CN101936995A - β-兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺二元检测测试条及其制备方法

Info

Publication number: CN101936995A
Application number: CN2010102355819A
Authority: CN
Inventors: 杨书豪; 王玉金; 刘丽
Original assignee: HENAN ACADEMY OF SCIENCES BIOLOGICAL RESEARCH INSTITUTE Co Ltd
Current assignee: HENAN ACADEMY OF SCIENCES BIOLOGICAL RESEARCH INSTITUTE Co Ltd
Priority date: 2010-07-26
Filing date: 2010-07-26
Publication date: 2011-01-05
Anticipated expiration: 2030-07-26
Also published as: CN101936995B

Abstract

本发明涉及β-兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺二元检测测试条及其制备方法，有效解决快速、简便同时检测β-兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺的问题，方法是，基材PVC板上面自前向后依次设置有引水玻璃纤维、载体玻璃纤维、硝酸纤维膜和吸水棉浆板，引水玻璃纤维、载体玻璃纤维和吸水棉浆板上面覆盖有覆膜，测试条前部载体玻璃纤维上吸附有抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物；中部硝酸纤维膜上自后而前分布有一条包被有兔抗鼠多抗的质控线，二条分别包被有盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物的检测线，本发明可有效用于同时检测盐酸克伦特罗、莱克多巴胺，方便、快捷，结果准确。

Description

β-兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺二元检测测试条及其制备方法

一、技术领域

本发明涉及β-兴奋剂检测技术领域，特别是一种β-兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺二元检测测试条及其制备方法。

二、背景技术

β-兴奋剂是一类拟肾上腺素，因其能使动物和人体组织中的β受体兴奋(激动)从而调节体内不同组织的机能而得名，其化学成分为苯乙醇胺衍生物，该类药物具有促进畜禽脂肪分解、增加肌肉生长作用，作为营养重分配剂，以提高瘦肉率，减少脂肪沉积和促进动物生长，被一些畜牧养殖者作为养殖促进剂非法使用。在养殖业中最常用的是盐酸克仑特罗(Clenbuterol)、沙丁胺醇(Salbutamol)和莱克多巴胺(ractopamine)，在家畜饲料中使用β-兴奋剂而造成消费者食物中毒事件时有发生。β-兴奋剂作为促进动物生长、提高瘦肉率的饲料添加剂，但长期使用会使该类药物在动物食品中蓄积，人食用了饲喂含β-兴奋剂作为添加剂饲料的畜产品后，就会出现中毒症状，通常会出现肌肉震颤、心悸、精神紧张、头疼、肌肉疼痛、晕眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状，甚至死亡。因此，世界许多国家禁止在饲料中使用盐酸克伦特罗等β-兴奋剂来增加动物的瘦肉率。我国政府已明令禁止在畜牧生产中使用盐酸克伦特罗等β-兴奋剂。

目前，现有技术对于盐酸克仑特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的检测主要依赖化学仪器分析、酶免疫检测试剂盒及单独检测盐酸克仑特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺的检测测试条。监管部门并不知道养殖户使用了何种β兴奋剂，检测存在一定的盲目性，常常造成漏检。因此，市场迫切需要有一种试剂能同时检测常见的β兴奋剂，以方便日常监管工作。

三、发明内容

针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种β-兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺二元检测测试条及其制备方法，可有效解决快速、简便地同时检测出β-兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺的问题，其解决的技术方案是，该测试条包括基材PVC板和覆膜，基材PVC板上面自前向后依次设置有引水玻璃纤维、载体玻璃纤维、硝酸纤维膜和吸水棉浆板，引水玻璃纤维、载体玻璃纤维和吸水棉浆板上面覆盖有由前部覆盖膜和后部覆盖膜组成的覆膜，测试条前部载体玻璃纤维上吸附有抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物；中部硝酸纤维膜上自后而前分布有一条包被有兔抗鼠多抗(为公知市售产品，如郑州兰森生物技术有限公司的产品)的质控线，二条分别包被有盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物的检测线(所说的前、后是指以引水方向向吸水方向而言，引水玻璃纤维为前，吸水棉浆板为后)，硝酸纤维膜两端分别与载体玻璃纤维后端面和吸水棉浆板前端面紧密接触，载体玻璃纤维前端面和引水玻璃纤维后端面紧密接触；

本发明的测试条的制备方法是，由以下步骤实现：首先分别制备胶体金标记单克隆抗体、胶体金溶液、胶体金标记物、固化金标物、包被膜，再将上述制备好的包被膜、固化金标物、引水玻璃纤维、吸水棉浆板固定粘结于基材PVC板上，覆盖上覆膜，切割成长条即可。

本发明可有效用于同时检测盐酸克伦特罗、莱克多巴胺，方法简单，方便、快捷，结果准确。

四、附图说明

附图为本发明测试条立体结构图(覆膜掀起)。

五、具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式作详细说明。

由附图给出，本发明二元检测测试条其结构是，包括基材PVC板和覆膜，基材PVC板1上面自前向后依次设置有引水玻璃纤维3、载体玻璃纤维4、硝酸纤维膜2和吸水棉浆板5，引水玻璃纤维3、载体玻璃纤维4和吸水棉浆板5上面覆盖有由前部覆盖膜7和后部覆盖膜6组成的覆膜，测试条前部载体玻璃纤维上吸附有抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物；中部硝酸纤维膜上自后向前分布有一条包被有兔抗鼠多抗的质控线，二条分别包被有盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物的检测线(所说的前、后是指以引水方向向吸水方向而言，引水玻璃纤维为前，吸水棉浆板为后)，硝酸纤维膜两端分别与载体玻璃纤维后端面和吸水棉浆板前端面紧密接触，载体玻璃纤维前端面和引水玻璃纤维后端面紧密接触。

为了保证使用效果，所说的覆膜为不干胶膜。

本发明二元检测测试条的制备方法是，由以下步骤实现：首先分别制备胶体金标记单克隆抗体、胶体金溶液、胶体金标记物、固化金标物、包被膜，再将上述制备好的包被膜、固化金标物、引水玻璃纤维、吸水棉浆板固定粘结于基材PVC板上，覆盖上覆膜，切割成长条即可；具体是：

1.胶体金标记单克隆抗体的制备：取1份含有抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物或莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水与2份60mM醋酸缓冲液混合，室温(18-25℃)搅拌下逐滴加入辛酸33μl/ml小鼠腹水(即辛酸加入量为每1ml小鼠腹水中加入33μl的辛酸)，混匀后，室温(18-25℃)放置30分钟，15000转/分、4℃离心20分钟，用玻璃棉过滤上清液，弃沉淀，过滤后的上清液用NaOH调PH值至7.2，再加入硫酸铵，硫酸铵加入量为每1ml PH值7.2的上清液中加入硫酸铵0.277g(硫酸铵0.277g/ml PH值7.2上清液)，快速使硫酸铵溶解，室温(18-25℃)搅拌30分钟，15000转/分4℃离心20分钟，弃上清液，沉淀物用原小鼠腹水1/2体积的0.01M PBS pH 7.2溶液溶解，再放入0.01M PBS pH 7.2溶液中浸没，4℃透析48小时，用紫外分光光度计测定蛋白含量，即制备成胶体金标记用的抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体、抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体；所说的小鼠腹水，其制备方法是，将液体石蜡注射7周龄Balb/c小鼠腹腔内，注射量为500μl/只，10天后，将分泌抗莱克多巴胺蛋白质偶联物或抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，注射杂交瘤细胞的数量为2×10⁶/只鼠，10天后用无菌注射器注射于小鼠腹腔采集腹水，即为抗莱克多巴胺蛋白质偶联物或抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水；

2、制备胶体金溶液：在烧杯中加入1000ml蒸馏水，100℃煮沸约5分钟，再加入质量浓度为1％的氯金酸溶液10ml和质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液15～20ml，搅拌至溶液呈深红色，冷至室温(18-25℃)，用碳酸钾(K₂CO₃)调PH值至待标记单克隆抗体的等电点或略偏碱，即为待标记的胶体金溶液；

3、胶体金标记物的制备：取100ml步骤2中调好PH的胶体金溶液，加入抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体1～10μg/ml胶体金溶液，搅拌2分钟，加入质量浓度为10％的牛血清白蛋白(BSA)15μl/ml胶体金溶液终止反应，离心50分钟，得沉淀物，取沉淀物用PH为7.4的0.01M PBS稀释至步骤2的原胶体金溶液体积的30％，制备成抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物；

4、固化金标物的制备：用载体玻璃纤维吸取抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物，干燥，制备成抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体固化金标物；

5、包被膜制备：取兔抗鼠多抗、盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物，分别包被于硝酸纤维膜上，制备成包被膜；兔抗鼠多抗包被浓度为0.5～5mg/ml，盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物包被浓度为0.05～2mg/ml；

6、测试条装备：取基材PVC板1，将引水玻璃纤维3、固化金标物的载体玻璃纤维4、构成包被膜的硝酸纤维膜2、吸水棉浆板5自前向后依次粘贴于基材PVC板1上，覆盖上由前部覆盖膜7和后部覆盖膜6组成的覆膜，切割成长条即可(如附图所示)。

本发明在具体实施中，还可由以下实施例给出：

实施例1：β-兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺二元检测测试条，包括基材PVC板1、粘附于基材中部的硝酸纤维膜2、粘附于基材前部(本实施例中前、后部以测试条使用时标本样品泳动方向为准，引水端为前，吸水端为后，即引水玻璃纤维为前，吸水棉浆板为后)的引水玻璃纤维3及载体玻璃纤维4、粘附于基材上部的吸水棉浆板5、上部覆膜6及下部覆膜7，引水玻璃纤维3后端面和载体玻璃纤维4前端面紧密相接，硝酸纤维膜2两端面分别和载体玻璃纤维4的后端面及吸水棉浆板5前端面紧密接触，下部载体玻璃纤维4为抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体和抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体固化金标物，胶体金溶液制备中质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液量为17ml，胶体金标记抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体浓度为5μg/ml；中部硝酸纤维膜2上包被有一条质控线和两条测试线，质控线包被有兔抗鼠多抗，测试线包被有盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物，兔抗鼠多抗包被浓度为1mg/ml，盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物包被浓度为0.2mg/ml。

实施例2：本实施例中，胶体金溶液制备中，质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液量为15ml，胶体金标记抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体浓度为4μg/ml；兔抗鼠多抗包被浓度为0.9mg/ml，盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物包被浓度为0.1mg/ml。其它同实施例1。

实施例3：本实施例中，胶体金溶液制备中，质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液量为19ml，胶体金标记抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体浓度为8μg/ml；兔抗鼠多抗包被浓度为2mg/ml，盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物包被浓度为0.5mg/ml。其它同实施例1。

本发明测试条在使用时，将引水玻璃纤维膜一端竖向插入标本样品中，或将标本样品滴至测试条下部引水玻璃纤维上。样品在毛细作用下，沿测试条向吸水棉浆板方向泳动，如果标本样品中含有β-兴奋剂盐酸克伦特罗和莱克多巴胺或一种，它们与相应标记抗体(胶体金标记单克隆抗体)反应形成标记抗体一抗原复合物。当标本样品泳动至包被有盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物检测带时则不发生反应，而与质控线反应，结果仅出现一条红线(质控线)或两条红线；如果标本样品中无β-兴奋剂盐酸克伦特罗和莱克多巴胺，标记抗体(抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体)分别与包被膜上盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物以及质控线结合形成红色线条带，结果出现n+1条红线；如质控线不出现红线，则表明测试条已失效。因此，利用本测试条，只需一次加样，5-10分钟即可对二种β-兴奋剂进行检测。该方法简单、方便、快捷、结果准确。

本发明经试验，利用本测试条同时测试β-兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺，只需一次加样，5-10分钟即可对β-兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺进行测试，经158次试用，除1例不明确外，其余157例均达到了满意效果，准确率达99％以上，因此，本发明具有方法简单，方便快捷，结果准确之特点，是β-兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺检测上的创新。

Claims

1.一种β-兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺二元检测测试条，包括基材PVC板和覆膜，其特征在于，基材PVC板(1)上面自前向后依次设置有引水玻璃纤维(3)、载体玻璃纤维(4)、硝酸纤维膜(2)和吸水棉浆板(5)，引水玻璃纤维(3)、载体玻璃纤维(4)和吸水棉浆板(5)上面覆盖有由前部覆盖膜(7)和后部覆盖膜(6)组成的覆膜，测试条前部载体玻璃纤维上吸附有抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物；中部硝酸纤维膜上自后而前分布有一条包被有兔抗鼠多抗的质控线，二条分别包被有盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物的检测线，硝酸纤维膜两端分别与载体玻璃纤维后端面和吸水棉浆板前端面紧密接触，载体玻璃纤维前端面和引水玻璃纤维后端面紧密接触。

2.根据权利要求1所述的β-兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺二元检测测试条，其特征在于，所说的覆膜为不干胶膜。

3.权利要求1所述的β-兴奋剂盐酸克伦特罗、莱克多巴胺二元检测测试条的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

(1)、胶体金标记单克隆抗体的制备：取1份含有抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物或莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水与2份60mM醋酸缓冲液混合，室温搅拌下逐滴加入辛酸33μ1/ml小鼠腹水，混匀后，18-25℃放置30分钟，15000转/分、4℃离心20分钟，用玻璃棉过滤上清液，弃沉淀物，过滤后的上清液用NaOH调PH值至7.2，再加入硫酸铵，硫酸铵加入量为每1mlPH值7.2的上清液中加入硫酸铵0.277g，快速使硫酸铵溶解，18-25℃搅拌30分钟，15000转/分4℃离心20分钟，弃上清液，沉淀物用原小鼠腹水1/2体积的0.01M PBS pH 7.2溶液溶解，再放入0.01M PBS pH 7.2溶液中浸没，4℃透析48小时，用紫外分光光度计测定蛋白含量，即制备成胶体金标记用的抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体、抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体；所说的小鼠腹水，其制备方法是，将液体石蜡注射7周龄Balb/c小鼠腹腔内，注射量为500μl/只，10天后，将分泌抗莱克多巴胺蛋白质偶联物或抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，注射杂交瘤细胞的数量为2×10⁶/只鼠，10天后用无菌注射器注射于小鼠腹腔采集腹水，即为抗莱克多巴胺蛋白质偶联物或抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体的小鼠腹水；

(2)、制备胶体金溶液：在烧杯中加入1000ml蒸馏水，100℃煮沸5分钟，再加入1％氯金酸溶液10ml和1％柠檬酸三钠溶液15～20ml，搅拌至溶液呈深红色，冷至18-25℃，用碳酸钾调PH值至待标记单克隆抗体的等电点或略偏碱，即为待标记的胶体金溶液；

(3)、胶体金标记物的制备：取100ml步骤2中调好PH的胶体金溶液，加入抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体1～10μg/ml胶体金溶液，搅拌2分钟，加入质量浓度为10％的牛血清白蛋白15μl/ml胶体金溶液终止反应，离心50分钟，得沉淀物，取沉淀物用PH为7.4的0.01M PBS稀释至步骤2的原胶体金溶液体积的30％，制备成抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物；

(4)、固化金标物的制备：用载体玻璃纤维吸取抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体胶体金标记物，干燥，制备成抗盐酸克伦特罗蛋白质偶联物单克隆抗体或抗莱克多巴胺蛋白质偶联物单克隆抗体固化金标物；

(5)、包被膜制备：取兔抗鼠多抗、盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物，分别包被于硝酸纤维膜上，制备成包被膜；兔抗鼠多抗包被浓度为0.5～5mg/ml，盐酸克伦特罗蛋白质偶联物、莱克多巴胺蛋白质偶联物包被浓度为0.05～2mg/ml；

(6)、测试条装备：取基材PVC板(1)，将引水玻璃纤维(3)、固化金标物的载体玻璃纤维(4)、构成包被膜的硝酸纤维膜(2)、吸水棉浆板(5)自前向后依次粘贴于基材PVC板(1)上，覆盖上由前部覆盖膜(7)和后部覆盖膜(6)组成的覆膜，切割成长条即可。