CN201514410U - 食源性土霉素残留快速半定量检测试纸条及试纸卡 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开一种用于食源性土霉素快速半定量检测的试纸条和试纸卡。试纸条含有支撑板、样品区、金标结合物、检测区、对照区、反应膜、吸水区及保护膜。检测区包括由金标土霉素单克隆抗体及第二种属动物蛋白的混合物，检测用土霉素印制而成的3条隐性直线，或金标记检测用土霉素人工抗原与第二种属动物蛋白的混合物，土霉素单克隆抗体印制而成的3条隐性直线，对照区是由抗第二种属动物蛋白IgG抗体印制而成的1条隐性直线。将不带有保护膜的试纸芯外加特制的透明塑料卡包被，制成检测用试纸卡。本试纸条及试纸卡适用于食品安全检测部门、研究部门、蜂场、个人用于检测蜂蜜、牛奶、肉组织、饲料、血清样品中的土霉素残留，具有快速、特异性强、方便等特点。

Description

食源性土霉素残留快速半定量检测试纸条及试纸卡

技术领域：

本发明涉及一种新型检测试纸条及试纸卡，特别是一种用于食品中土霉素(Oxytetracyline，OTC)残留检测的试纸条及试纸卡。

技术背景：

土霉素是四环素族抗生素中的一种。常用其盐酸盐，为淡黄色的结晶或无定形粉末，无臭，在日光下颜色变暗，在碱性溶液中晚破坏失效，在乙醇中微溶，在NaOH及稀HCl中易溶。

土霉素对大多数革兰氏阳性和阴性球菌与杆菌，对立克次体、支原体、衣原体螺旋体和某些原虫都有抑制作用，其抗菌机制主要为与菌核蛋白体30S亚基在A位特异性结合，阻止aa-tRNA在该位置上的联结，从而阻止肽链延伸和细菌蛋白合成，其次还可引起细胞膜通透性改变，使胞内的核苷酸和其它重要成分外漏，从而抑制DNA复制，但是目前细菌对其耐药性较重，耐药率较高，而且OTC与四环素族其它的抗生素间也存在着一定的交叉耐药性。

OTC在体内的残留较重。一般来说，OTC易吸收，但不完全，2h-4h达到血药峰浓度。土霉素在不同动物体内达到峰浓度的时间不同，如在牛中需要4-8小时达到峰浓度，吸收后广泛分布于肝、肾等组织和体液中，易渗入胸水、腹水、胎畜循环及乳汁中，也可以在肝脏胆汁中浓缩，排入肠内，部分再被吸收，形成肚肠循环。主要以原形药从尿中排出。猪内40mg/kg/天，连服5天，休药4天可食组织中残留量为0.04mg/kg。蛋鸡服7日，蛋清浓度迅速达到高峰，但是蛋黄浓度持续时间长，休药13天后，蛋清和蛋黄中均可检测到残留量。绵羊肌肉注射后14天，组织中残留量才能低于0.1mg/kg，奶牛肌肉注射5mg/kg后4天，牛奶中的残留量在370μg/kg-10μg/kg间。

由于OTC是一种广谱的抗菌药，加之其价格低廉，因此作为动物生产中的饲料添加剂用于控制动物性疾病，促进动物的生长发育，被广泛应用于畜牧饲养场、蜂场、鸡场等。但是由于其滥用，已经引起了食源性OTC的残留，对人体的健康造成了较大的危害，因此国家食品安全部门、农业部门对动物性食品中，包括肉、蛋奶、蜂蜜等食品中残留限量均进行了严格的限制，明确了在肉制品中OTC的检测量不得超过0.1mg/kg，，在蜂蜜中不得检出。

目前测定OTC的方法主要是酶联免疫法(ELISA)和高效液相色谱法(HPLC)，ELISA法检测用的试剂目前主要依赖进口，检测成本很高，HPLC法要求有高端的液相色谱仪和专门的技术人员，样品的通量较小，需要样品的前处理时间长，因此用HPLC法进行检测成本高，时间长，通量小，不适合于生产单位检测。虽然也有利用OTC检测用试纸条的方法进行残留检测的相关报道，但是，其不能定量，假阳性和假阴性率较高，准确率得不到保证，应用效果不理想。

发明内容：

1、本设计的目的：研制出简便、快速、灵敏的土霉素半定量检测试纸条和试纸卡。

结合附图对本设计进行说明：

图1代表土霉素半定量快速检测试纸侧面观；图2代表土霉素半定量快速检测试纸正面观；图3代表土霉素半定量快速检测试纸卡侧面观；图4代表土霉素半定量快速检测试纸卡正面观。

附图1，2，3中标号1为进样区，2为胶体金标记OTC单克隆抗体与第二种属动物蛋白的混合物，或为检测用OTC抗原与与第二种属动物蛋白的混合物，3为延长部分；4为3条由检测用OTC抗原印制而成的隐性线作为检测线，或为3条由OTC单克隆抗体印制而成的检测线，5为第二种属动物抗鼠IgG抗体印制而成的一条隐性线作为对照线，6为吸水区，7为支撑板，8为固着在支撑板上的反应膜，9为保护膜。它们依下列次序粘着于反应膜上，进样区，金标记OTC单克隆抗体与第二种属动物蛋白的混合物，3条由检测用OTC抗原印制而成的隐性线，1条第二种属动物蛋白抗鼠IgG抗体印制而成的隐性线，吸水区。附图中10为检测试纸卡上盖；11为检测试纸卡底座；附图4中标号12为检测试纸卡加样孔。

胶体金标记部分为玻璃纤维或醋酸纤维，其上标记的物质为第二种属动物蛋白与土霉素单克隆抗体，或第二种属动物蛋白与检测用土霉素人工抗原的混合物，混合物混合的方法为：第二种属动物蛋白与土霉素单克隆抗体或检测用人工抗原的混合比例，以标准的土霉素样品为标准，当阴性样品检测时，对照线和检测线刚好出现肉眼可见的红色为准。检测反应部分上包被有土霉素检测用抗原3条作为检测线，或土霉素单克隆抗体3条作为检测线，同时还包被有第二种属动物蛋白IgG抗体1条作为对照线。当胶体金标记部分为第二种属动物蛋白和土霉素单抗混合物时，在胶体金标记部分和检测反应部分之间加长。

其中检测用抗原是指土霉素与牛血清白蛋白或卵白蛋白结合的偶联物，在用胶体金标记抗原时，此混合物作为标记的对象，或在胶体金标记抗体时，此混合物作为检测线上的包被物质，第二种属动物蛋白指非抗体来源属动物蛋白。

2、本设计所涉及的各部分的处理及功能：

支撑板：起支撑作用，其上粘合有反应膜，其下有防水涂层，其作用主要是起固定反应膜等，可由硬质塑料、硬纸板、薄树脂等韧性材料制成。

进样区：主要是由吸水能力较强的滤纸、或玻璃纤维纸制成。将上述材料与中性(pH7.0)的磷酸缓冲液中浸泡10分钟以上，高温烘干，或防尘风干。

胶体金标记部分的制备：包括胶体金溶胶的制备，胶体金标记土霉素抗体或土霉素人工抗原，胶体金标记部分处理。

胶体金溶胶的制备：将氯金酸配制成1％的溶液(A)，取A溶液1mL，再配成0.01％的溶液(B)，加热至沸腾，再向B中加入1％的柠檬酸钠水溶液5mL，继续加热至出现透明的橙红色为止，获得直径约为15nm的胶体金溶胶(C)。用0.1mol/L的K₂CO₃调pH值至8.5-9.5，4℃保存备用。

胶体金标记土霉素抗体：将土霉素单抗及第二种属动物蛋白分别用PBS稀释到4mg/Kg，每100mL C溶液中加入3mL土霉素单抗，1.5mL第二种属动物蛋白，振荡5分钟，加入20％的PEG 10000至终浓度为0.05％，4℃8000-10000g离心20分钟，去上清，用PBS(0.01mol/L，pH 7.0-7.5)复溶，以8000-10000g离心，15分钟，除去上清，将沉淀用PBS(0.01mol/L，pH 7.0-7.5)稀释2000倍，产物即为金标土霉素素抗体(D)。

胶体金标记土霉素抗原：将土霉素检测用抗原及第二种属动物蛋白分别用PBS(0.01mol/L，pH 7.0-8.4)稀释到4mg/Kg，每100mL C溶液中加入3mL土霉素检测用抗原，1.5mL第二种属动物蛋白，振荡5分钟，加入20％的PEG 10000至终浓度为0.05％，4℃8000-10000g离心20分钟，去上清，用PBS(0.01mol/L，pH 7.0-7.5)复溶，以8000-10000g离心，15分钟，除去上清，将沉淀用PBS(0.01mol/L，pH 7.0-7.5)稀释2000倍，产物即为金标土霉素检测用抗原(E)。

胶体金标记部分处理：将获得的D或E倒入大玻璃皿中，将精制玻璃纤维棉浸于其中2分钟，取出后自然干燥。

用0.8％戊二醛溶液浸泡反应膜，半小时以上，取出烘干，上边包被3条不同浓度的土霉素检测用抗原作为检测线，同时包被有1条抗第二种属动物蛋白IgG抗体的对照线，当胶体金标记为第二种属动物蛋白和土霉素单克隆抗体的混合物时，检测线包被的是土霉素检测用抗原，当胶体金标记的为第二种属动物蛋白和土霉素检测用抗原时，检测线包被的是土霉素单克隆抗体。此部分的作用是将检测结果以不同的颜色显示出来。

吸水区制备：将醋酸纤维、吸水滤纸等经室温干燥后，用作检测反应后多余反应液的吸收部分。

延长部分的制备：将玻璃纤维棉、醋酸纤维、等经室温干燥后加在胶体金标记部分与检测反应部分之间。

试纸的组装：将进样区、胶体标记区、延长区、检测反应区及吸水区依次粘于固定在支撑板上的反应膜上，再在其两端加上不干胶保护膜，即成为土霉素半定量检测试纸。

试纸卡的组装：将上述不加保护膜的试纸芯置于一种特殊的有槽底座中(11)，其上粘有部分区域带有颜色的上盖(10)，上盖有加样孔(12)，加样孔一侧有深色涂层，底座与上盖在周边用胶粘合在一起。

检测原理：

当胶体金标记部分的标记物为第二种属动物蛋白和土霉素素单克隆抗体的混合物时，如果样品中含有土霉素，进样后，样品通过试纸的虹细作用到达胶体金部分，样品中的土霉素与胶体金标记的土霉素单克隆抗体结合，形成复合物，结合物上移到达检测线，因胶体金标记的抗体只有一个土霉素结合位点，样品溶液中的土霉素与之结合后，检测线上的检测用的抗原便不能与胶体金标记的土霉素抗体结合，检测线不显色；当样品中不含有土霉素时，胶体金标记的土霉素单抗便被检测用抗原捕获，检测线显色。无论样品中是否含有土霉素，胶体金标记的第二种属动物蛋白都可以到达对照线，与对照线上包被的第二种属动物蛋白抗体结合，形成肉眼可见的颜色。如果对照线不出颜色，则说明试纸条失效。当胶体金标记物为第二种属动物蛋白与检测用土霉素抗原的混合物时，如果样品中含有土霉素，样品溶液会通过毛细作用上移，其中土霉素分子量小，移动速度快，先达到检测线，与检测线上包被的土霉素单抗结合，因土霉素单抗只有一个结合位点，且土霉素小分子与土霉素单抗结合力较检测用蛋白偶合的土霉素人工抗原与抗体的结合力强，于是检测用抗原不能与检测线上的土霉素单抗结合，检测线不显色。如果样品中不含有土霉素，则胶体金标记的土霉素人工抗原则可以达到检测线后与土霉素单抗结合，检测线显色。无论样品中是否含有土霉素，胶体金标记的第二种属动物蛋白都可以到达对照线，与对照线上包被的第二种属动物蛋白抗体结合，形成肉眼可见的颜色。如果对照线不出颜色，则说明试纸条失效。

半定量的方法：通过调节检测线与对照线包被物浓度，调节显色深浅，将检测线显色深浅与标准物质浓度呈线性相关，即可达到半定量的目的。

3、使用方法：

3条检测线包被有0.01-30μg/mL的土霉素单克隆抗体或土霉素检测用抗原，三条检测线上包被的浓度渐减，参考线包被有浓度为0.01-30μg/mL的抗第二种动物蛋白的IgG；各条线之间间隔5mm，当3条检测线都呈现颜色时，则样品为阴性，当检测线第1，2条检测线呈色，第3条检测线不呈色时，则样品中土霉素的浓度大于A ng/mL，小于B ng/mL，当第1条检测线呈色，第2，3条线不呈色时，样品中土霉素的浓度大于B ng/mL，小于C ng/mL，当3条线都不呈色时，样品中土霉素的含量大于C ng/mL。其中A、B、C为设定的检测限，可以是大于或等于0.1ng/mL的某一浓度，三种浓度为：A＜B＜C。对照线一直呈色，如不显色，表明试纸失效。

4、本设计的优点：

特异性强。本设计采用了土霉素单克隆抗体用来检测食源性土霉素素残留。由于单克隆抗体的特异性极高，所以本发明的试纸及试纸卡能够极特异地检测，与四环素、金霉素、利它霉素、泰乐菌素、呋喃唑酮等生产中常用抗生素无交叉反应，无假阳性。

灵敏度高。本试纸检测下限可达到1ng/mL，也可以根据检测要求，把检测浓度调到1ng/mL以上。

检测快速。本试纸可以在样液加入后2-5分钟出现结果，且颜色稳定，比一般的酶联免疫法快50倍以上。

准确性高。本设计采用了3条检测线结合1条对照线的方法进行检测，通过检测线颜色与对照线颜色深浅及检测线呈现颜色条带数，可以做到半定量。与一般的仅一条检测线的试纸条相比，准确性高。

成本低廉。本发明的检测成本较一般的酶联免疫检测成本低很多，如果大规模制备，成本将更低。

操作方便。本设计用于土霉素残留检测无需任何专门的仪器设备，不需要专业技术人员培训，只要用肉眼判读即可检测出残留情况。而且各种样品均可以进行测定。因此本设计适合范围较广，适合于卫生检测部分、食品安全检测部门、动物饲养场、食品加工厂、个人使用。

5、具体实验例：

(1)土霉素素人工抗原的合成：

具体方法一采用羰二亚胺法将OTC与BSA偶联，形成OTC-BSA。将BSA和羰二亚胺分别溶于PBS(0.01mol/L、pH7.4)中，OTC溶于甲醇中。然后将EDC溶液和OTC溶液加至BSA溶液中。室温避光搅拌反应20h以上，5000-8000g离心10-20min，取上清，用PBS(0.01mol/L、pH7.4)于4℃透析48h以上。OTC与OVA的偶联方法同上。具体方法二采用羰基二咪唑法(CD I法)将OTC和CD I在适量无水丙酮中室温避光反应，得到OTC和CDI的中间产物，再将该中间产物用PBS(0.01mol/L、pH7.4)溶解，最后加入BSA，室温避光反应20h。5000-8000r/min离心15min，取上清用PBS(0.01mol/L、pH7.4)于4℃透析48h以上。OVA与OTC的偶联方法同上。制备出的抗原进行鉴定的方法为：将OTC、BSA、OVA、偶联产物、载体蛋白与OTC的简单混合物分别加入浓硫酸，根据其显色反应的不同也可鉴定抗原偶联情况。或者将BSA、OVA、OTC、偶联产物，载体蛋白与OTC的简单混合物经适当稀释后，在250～400nm波长范围内扫描，分析扫描图谱，并对它们的特征性吸收峰的偏移情况进行对比。

(2)土霉素单克隆抗体制备：

对6周龄的SPF雌性BALB/c小鼠进行皮下多点注射，免疫剂量为60μg蛋白/只。初次免疫时，抗原和等量的弗氏完全佐剂混合均匀，以后各次均和等量的不完全佐剂混合。初次免疫与再次免疫时间间隔2周，以后每次免疫之间间隔2周，每次免疫量均为30ug蛋白/只，共免疫4次。免疫4次后小鼠眼眶取血，测血清效价。测定方法为：BSA和OVA偶联土霉素2ug/ml，4℃包被过夜，37℃封闭2h；多抗血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照(blank)为PBS，阴性对照(negative)为阴性血清200倍稀释。效价测定结果表明，免疫的4只鼠中的第4号OTC-BSA与OTC-OVA效价达10⁶以上，所以腹腔冲击免疫4#鼠，免疫量为50ug蛋白。冲击后可以进行细胞融合，具体步骤为：将状态良好的sp2/0细胞轻柔的从培养瓶壁上吹打下来，吸入到50ml离心管中。小鼠摘眼球取血，然后拉颈处死，放入75％的酒精中浸泡5min。在平皿中倒入少量无血清的IMDM，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上。用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装sp2/0的离心管中，离心1500rad/min，5min。用剪刀和镊子取下小鼠的胸腺，碾碎。将碾好的胸腺细胞到15ml离心管中，再加入1ml的HAT，放在孵箱中备用。将离心好的细胞，倒掉上清，用无血清的IMDM将细胞小心轻柔地吹匀，离心(1500rad/min，5min)。将离心好的细胞上清尽量倒掉。拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入37℃温水中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG，加完后，在温水中静置1min。然后2min内缓慢加入2ml的无血清的IMDM，接着2min内缓慢加入8ml无血清的IMDM。离心1000rad/min，5min。倒掉上清，加入10ml的血清，小心的将细胞吹匀，倒入前面准备好的胸腺细胞。再加入25ml灭过菌的半固体培养基，充分混匀。然后均匀倒入30个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入湿盒中，然后放入孵箱中培养。挑5×93个细胞单克隆，培养于5块96孔细胞培养板(事先用胸腺细胞铺板，100ul/孔)。第3天对5块96孔细胞培养板，全部换液。第6天用免疫蛋白BSA偶联土霉素包板，对挑选的克隆采用ELISA方法，做第二次筛选，得到9株阳性杂交瘤细胞株。具体步骤为：首先用包被液稀释抗原(huhep)，终浓度为2ug/ml，100ul/孔，4℃，过夜；后用洗液洗涤2次。加入一抗(细胞培养上清)、阴性对照(SP2/0培养上清)、空白对照(PBS)、阳性对照(阳性血清PBS 200倍稀释)，均为100ul/孔，37℃孵箱，温育1h后用洗液洗涤3次。加入PBS稀释20000倍的二抗，100ul/孔，37℃孵箱温育1h，取出后用洗液洗涤3次。最后是显色，采用显色液100ul/孔，显色时间为5min左右。每孔加入50ul终止液终止。在双波长(450，603)条件下测吸光值，记录保存数据。

每只小鼠腹腔注射灭菌的液体石蜡0.5mL，1周后同法每只小鼠注射1×10⁶个杂交瘤细胞，10d后抽取腹水，离心去除油脂和沉淀，获得单克隆抗体。用间接EL ISA法检测腹水效价，确定合适的抗原包被浓度和腹水稀释倍数。将腹水做适当稀释后，分别与0、0.1、1、10、100、1000mg/L等不同浓度的OTC标准品按等体积加入酶标板中反应，绘制标准曲线测定其亲和力、灵敏度与检测限。以OTC的结构类似物盐酸土霉素(OTC-HCl)、盐酸金霉素(CTC-HCl)、盐酸四环素(TC-HCl)与其做竞争EL ISA，检测其交叉反应。所用竞争物的浓度同上。获得的稳定性及特异性较高的腹水经层析纯化后即为OTC单克隆抗体。

(3)样液吸收部分处理：将滤纸或玻璃纤维棉浸于PBS中2分钟以上，然后烘干。

(4)胶体金标记部分的制备：包括胶体金溶胶的制备，胶体金标记土霉素抗体或土霉素人工抗原，胶体金标记部分处理。

(5)胶体金溶胶的制备：将氯金酸配制成1％的溶液(A)，取A溶液1mL，再配成0.01％的溶液(B)，加热至沸腾，再向B中加入1％的柠檬酸钠水溶液5mL，继续加热至出现透明的橙红色为止，获得直径约为15nm的胶体金溶胶(C)。用0.1mol/L的K₂CO₃调pH值至8.5-9.5，4℃保存备用。

(6)胶体金标记土霉素抗体：将土霉素单抗及第二种属动物蛋白分别用PBS稀释到4mg/Kg，每100mL C溶液中加入3mL土霉素单抗，1.5mL第二种属动物蛋白，振荡5分钟，加入20％的PEG 10000至终浓度为0.05％，4℃8000-10000g离心20分钟，去上清，用PBS(0.01mol/L，pH 7.0-7.5)复溶，以8000-10000g离心，15分钟，除去上清，将沉淀用PBS(0.01mol/L，pH 7.0-7.5)稀释2000倍，产物即为金标土霉素素抗体(D)。

(7)胶体金标记土霉素抗原：将土霉素检测用抗原及第二种属动物蛋白分别用PBS(0.01mol/L，pH 7.0-8.4)稀释到4mg/Kg，每100mL C溶液中加入3mL土霉素检测用抗原，1.5mL第二种属动物蛋白，振荡5分钟，加入20％的PEG 10000至终浓度为0.05％，4℃8000-10000g离心20分钟，去上清，用PBS(0.01mol/L，pH 7.0-7.5)复溶，以8000-10000g离心，15分钟，除去上清，将沉淀用PBS(0.01mol/L，pH 7.0-7.5)稀释2000倍，产物即为金标土霉素检测用抗原(E)。

(8)胶体金标记部分处理：将获得的D或E倒入大玻璃皿中，将精制玻璃纤维棉浸于其中2分钟，取出后自然干燥。

(9)检测反应部分处理：用0.8％戊二醛溶液浸泡反应膜，半小时以上，取出烘干，上边包被3条不同浓度的土霉素检测用抗原作为检测线，同时包被有1条抗第二种属动物蛋白IgG抗体的对照线。此部分的作用是将检测结果以不同的颜色显示出来。

(10)试纸组装：将进样区、胶体标记区、延长区、检测反应区及吸水区依次粘于固定在支撑板上的反应膜上，再在其两端加上不干胶保护膜，即成为土霉素半定量检测试纸。

(11)试纸卡的组装：将上述不加保护膜的试纸芯置于一种特殊的有槽底座中，其上粘有部分区域带有颜色的上盖，上盖有加样孔，加样孔一侧有深色涂层，底座与上盖在周边用胶粘合在一起。

(12)检测试纸的制备要求：

物理要求：外观平整，材料粘合牢固。以生理盐水为样品液，吸样后1min观察，样液移行速度5mm/min以上。

阴性参考品符合率：用PBS(0.01mol/L，pH 7.0-7.5)配制浓度为50ng/ml的四环素溶液进行10次平行检测，反应时间在5min时观察结果，应为阴性；用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)配制浓度为100ng/ml的金霉素溶液进行10次平行检测，反应时间在5min时观察结果，应为阴性。

阳性参考品符合率：用PBS(0.01mol/L，pH 7.0-7.5)配制浓度为10、50、100ng/ml的OTC标准溶液，分别进行10次平行检测，反应时间在5min时观察结果，无阴性结果出现。

最低检测限：用PBS(0.01mol/L，pH 7.0-7.5)配制浓度为0、0.5、1、2、5、10ng/ml的OTC标准溶液，分别进行10次平行检测，反应时间在5min时观察结果，最低检出量不高于1ng/ml。

再现性：用PBS(0.01mol/L，pH 7.0-7.5)配制浓度为10ng/ml的OTC标准溶液，分别进行10次平行检测，反应时间在5min时观察结果，反应结果应一致，显色度均一。

稳定性：将完好的成品放于37℃恒温箱中10天后取出检测，所有指标达到上述要求。

(13)试纸使用：

样品制备

蜂蜜：取1g样品加入10ml稀释液，每间隔2分钟用力震荡；10分钟后摇匀静置1min取上清100μl，用稀释液做10倍的稀释后用试纸检测。

牛奶：取1g样品加入10ml稀释液，每间隔2分钟用力震荡；10分钟后摇匀静置1min取上清100μl，用稀释液做10倍的稀释后用试纸检测。

饲料：取1g样品加入10ml稀释液，每间隔2分钟用力震荡；10分钟后摇匀静置1min取上清100μl，用稀释液做10倍的稀释后用试纸检测。

尿液：用尿液直接测定，也可以离心后取上清液测定。

血清：抽取动物血液，离心后取透明上清测定，或者用蒸馏水稀释一倍后再进行测定。

检测实例：

将试纸箭头浸泡在待测样品中，浸入30秒时取出放平，20分钟读取结果。采用3条检测线包被有0.01-30μg/mL的土霉素单克隆抗体或土霉素检测用抗原，三条检测线上包被的浓度渐减，对照线包被有浓度为0.01-30μg/mL的抗第二种动物蛋白的IgG；各条线之间间隔5mm，当3条检测线都呈现颜色时，则样品为阴性，当检测线第1，2条检测线呈色，第3条检测线不呈色时，则样品中土霉素的浓度大于A ng/mL，小于B ng/mL，当第1条检测线呈色，第2，3条线不呈色时，样品中土霉素的浓度大于B ng/mL，小于C ng/mL，当3条线都不呈色时，样品中土霉素的含量大于C ng/mL。其中A、B、C为设定的检测限，可以是大于或等于0.1ng/mL的某一浓度，三种浓度为：A＜B＜C。对照线一直呈色，如不显色，表明试纸失效。

使用试纸卡检测方法与试纸条相同，此处略。

Claims (8)

1.食源性土霉素残留快速半定量检测试纸含有支撑板、进样区、反应区及吸水区，进样区、反应区及吸水区按顺序粘贴于支撑板上，各区间有2-5mm的间隔，其特征在于：反应区包括反应膜、胶体金标记部分、检测用抗原及第二种属动物蛋白，胶体金标记部分标记的物质土霉素的单克隆抗体，或土霉素检测用抗原，检测反应部分为包被有第二种属动物蛋白及土霉素用抗原混合物印制成的3条线作为检测线，或包被有第二种属动物蛋白及土霉素单克隆抗体混合物印制成的3条线作为检测线，同时包被有抗鼠IgG条带作为对照线。

2.根据权利要求1所说的试纸，其特征在于：土霉素检测用抗原为土霉素与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)形成的偶合物。

3.根据权利要求1所说的试纸，其特征在于：第二种属动物蛋白为非抗体来源属动物的蛋白。

4.根据权利要求1所说的试纸，其特征在于所说的支撑板为薄树脂、或硬纸板、塑料卡等。

5.根据权利要求1所说的试纸，其特征在于反应膜是硝酸纤维素膜、或醋酸纤维素膜、玻璃纤维棉。

6.根据权利要求1所说的试纸，其特征在于吸水区由吸水能力较强的滤纸或滤油纸制成。

7.根据权利要求1所说的试纸，其特征在于保护膜为不干胶膜。

8.根据权利要求1所说的试纸卡，其特征在于由底座及部分带有颜色的上盖组成，底座有槽可放试纸芯，上盖有加样孔，加样孔一侧有深色涂层，底座与上盖在周边用胶粘合在一起。

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