CN103163193B - 同时检测三种瘦肉精的电化学传感器的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于纳米功能材料、食品安全分析和生物传感技术领域,其提供了同时检测三种瘦肉精的电化学传感器的制备方法及应用。所述传感器集成三个工作电极,可同时检测莱克多巴胺、沙丁胺醇及克伦特罗三种常见的瘦肉精,提高了检测效率和准确性。其制作方案是:在多通道丝网印刷电极的三个工作电极的表面,依次滴涂石墨烯溶液、EDC/NHS溶液、三种瘦肉精抗原溶液和牛血清白蛋白溶液,通过竞争法将混合有待测样品的银钯纳米粒子标记的三种瘦肉精的抗体标记物溶液滴加到电极表面,实现0.01~1000ppb范围内的莱克多巴胺、沙丁胺醇和克伦特罗三种瘦肉精的同时检测。

Description

同时检测三种瘦肉精的电化学传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明属于纳米功能材料、食品安全分析与生物传感技术领域,具体涉及一种同时检测三种瘦肉精的电化学传感器的制备方法及应用。
背景技术
瘦肉精是一类动物用药,任何能够促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的物质都可以叫做“瘦肉精”。莱克多巴胺、沙丁胺醇及克伦特罗是三种常见的瘦肉精。
此类药物主要是肾上腺类β激动剂,因为能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长,所以统称“瘦肉精”。瘦肉精能让猪的瘦肉率提高,带来更多经济价值,但它有很危险的副作用。
当用瘦肉精饲养家畜时,即有显著的营养“再分配效应”——促进动物体蛋白质沉积、促进脂肪分解抑制脂肪沉积,能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率,因此曾被用作牛、羊、禽、猪等畜禽的促生长剂、饲料添加剂。将瘦肉精添加于饲料中,可以增加动物的瘦肉量、减少饲料使用、使肉品提早上市、降低成本。
瘦肉精能起到“瘦肉”作用,却对人体健康危害过大,因而造成安全隐患。1ppm的克伦特罗添加于猪饲料中用于促生长,人食用猪肝或猪肺足够引起中毒。
其主要危害是:出现肌肉振颤、心慌、战栗、头疼、恶心、呕吐等症状,特别是对高血压、心脏病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大,严重的可导致死亡。2001年12月27日、2002年2月9日、2002年4月9日,农业部分别下发文件禁止食品动物禁止使用β激动剂类药物作为饲料添加剂(农业部176号、193号公告、1519号条例)。
目前国内检测瘦肉精的检测方法主要有气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)和液相色谱—质谱/质谱法(HPLC-MS/MS)。
但由于其仪器价格昂贵,操作复杂,检测周期长,所需试剂繁多等缺点已不能满足现代检测要求。因此,寻找一种简单、快速、灵敏的检测方法具有非常重要的意义。
本发明采用丝网印刷电极,价格低廉,结合电化学技术,使之具有较高的灵敏度;结合免疫技术,提高了传感器的选择性,仅需简单的样品处理,节省了检测时间,降低了检测成本,是一种快速、廉价且灵敏度高的检测方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种同时检测三种瘦肉精的电化学传感器的制备方法。
本发明的目的之二是提供所制备的电化学传感器用于同时检测三种瘦肉精。
本发明的技术方案如下:
1. 一种同时检测三种瘦肉精的电化学传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)银钯纳米粒子水溶液的制备
将质量比为(0.6 ~1.9)∶1的硝酸银和六氯钯酸钾固体加入到10~20 mL含有体积浓度为5%的曲拉通X-100水溶液中,室温下搅拌10~30 min,然后加热到65~70℃保持3.5~5 h,用水和乙醇清洗,离心分离,真空干燥,得到银钯纳米粒子,银与钯的质量比为(1.5 ~ 4.5)∶1,配成银钯纳米粒子水溶液的浓度为1~2 mg/mL。
(2)银钯纳米粒子标记的三种瘦肉精抗体标记物溶液的制备
将0.1~1 mL瘦肉精抗体溶液加入到1~2 mL制备的银钯纳米粒子水溶液中,搅拌3~5 h后离心分离,再重新分散到1~2 mL磷酸缓冲溶液中,得到瘦肉精抗体标记物溶液;所述瘦肉精抗体选自下列之一:莱克多巴胺抗体、沙丁胺醇抗体、克伦特罗抗体;所述瘦肉精抗体溶液浓度均为5~10 μg/mL。
(3)同时检测三种瘦肉精的电化学传感器的制备
1)在多通道丝网印刷电极的3个工作电极的表面,分别滴加5~10 μL、浓度为1~2 mg/mL的石墨烯溶液,自然晾干。
2)在1)中得到的3个工作电极的表面上分别滴加5~10 μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)溶液,孵化1~3 h,然后用超纯水清洗干净。
3)在2)中得到的3个工作电极的表面上分别滴加5~10 μL三种瘦肉精抗原溶液中的一种,润湿状态下放置1~3 h;所述瘦肉精抗原选自下列之一:莱克多巴胺抗原、沙丁胺醇抗原、克伦特罗抗原;所述抗原溶液的浓度均为5~10 μg/mL。
4)在3)中得到的3个工作电极表面分别滴加5 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液,待干燥后,用超纯水清洗干净,即制得同时检测三种瘦肉精的电化学传感器。
2. 以上所述制备的一种同时检测三种瘦肉精的电化学传感器,用于三种瘦肉精的同时检测,步骤如下:
(1)将上述制备的银钯纳米粒子标记的抗体标记物溶液与对应的三种瘦肉精的标准溶液等体积混合,孵化1 ~3 h,制得三种混合溶液。
(2)在上述所得的同时检测三种瘦肉精的电化学传感器的3个工作电极表面上分别滴加5~10 μL(1)中得到的三种混合溶液,孵化1 ~ 3 h,然后用超纯水清洗干净。 
(3)将参比电极、对电极和工作电极连接在电化学工作站上,在电解槽中加入pH为5.0~9.0的磷酸盐缓冲溶液,通过线性扫描伏安法检测所述修饰好的工作电极的电流响应,根据所得电流响应与三种瘦肉精的标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线。
(4)将待测样品制成的样品溶液,代替三种瘦肉精的标准溶液,按照所述三种瘦肉精工作曲线的绘制方法进行检测。
以上所述的石墨烯溶液的制备,包括以下步骤:
将用经典Hummers法合成的氧化石墨烯加入到0.5 mg/mL的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中,超声30 min,然后加热到153℃保持1 h。经离心、洗涤、干燥,最后分散于超纯水中得到浓度为1~2 mg/mL的石墨烯溶液。
本发明具备以下优势:
(1)本发明快速、准确,仅需简单处理,可用于复杂样品中的三种瘦肉精的同时检测。
(2)本发明采用的银钯纳米粒子和石墨烯均可增强电化学信号,从而提高了本发明传感器的灵敏度。
(3)本发明印刷电极制备简单、成本低、便于携带、样品消耗少,易于微型化和集成化,应用范围广。
(4)本发明与其它的丝网印刷电极传感器相比,可以一次性同时检测复杂样品中三种瘦肉精,显著提高了检测效率,同时具有良好的准确性和精密度,检测范围为0.01~1000 ppb,检测限低于0.002 ppb。
附图说明
图1 本发明所采用的丝网印刷电极示意图。在图1中,(1)工作电极1,(2)工作电极2,(3)工作电极3,(4)参比电极,(5)辅助电极,(6)电解槽,(7)电极触点,(8)印刷电极基板。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明。
实施例1
本发明提供的石墨烯溶液的制备方法,包括以下步骤:
将用经典Hummers法合成的氧化石墨烯加入到0.5 mg/mL的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中,超声30 min,然后加热到153℃保持1 h。经离心、洗涤、干燥,最后称取1~2 mg石墨烯分散于1 mL超纯水中得到浓度为1~2 mg/mL的石墨烯溶液。
实施例2
本发明提供的银钯纳米粒子水溶液的制备方法,包括以下步骤:
将质量比为0.6∶1的硝酸银和六氯钯酸钾固体加入到10 mL含有体积浓度为5%的曲拉通X-100水溶液中,室温下搅拌10 min,然后加热到65℃保持3.5h,用水和乙醇清洗,离心分离,真空干燥,得到银钯纳米粒子,银与钯的质量比为1.5∶1,配成银钯纳米粒子水溶液的浓度为1 mg/mL。
实施例3
本发明提供的银钯纳米粒子水溶液的制备方法,包括以下步骤:
将质量比为1.3∶1的硝酸银和六氯钯酸钾固体加入到15 mL含有体积浓度为5%的曲拉通X-100水溶液中,室温下搅拌20 min,然后加热到68℃保持4.5 h,用水和乙醇清洗,离心分离,真空干燥,得到银钯纳米粒子,银与钯的质量比为3∶1,配成银钯纳米粒子水溶液的浓度为1.5 mg/mL。
实施例4
本发明提供的银钯纳米粒子水溶液的制备方法,包括以下步骤:
将质量比为1.9∶1的硝酸银和六氯钯酸钾固体加入到20 mL含有体积浓度为5%的曲拉通X-100水溶液中,室温下搅拌30 min,然后加热到70℃保持5 h,用水和乙醇清洗,离心分离,真空干燥,得到银钯纳米粒子,银与钯的质量比为4.5∶1,配成银钯纳米粒子水溶液的浓度为2 mg/mL。
实施例5
本发明提供的银钯纳米粒子标记的三种瘦肉精抗体标记物溶液的制备方法,包括以下步骤:
将0.1 mL、浓度为5 μg/mL三种瘦肉精抗体溶液中任意一种加入到1 mL由实施例2~4任意一种方法制备的银钯纳米粒子水溶液中,搅拌3 h后离心分离,再重新分散到1 mL磷酸缓冲溶液中,得到相应的瘦肉精抗体标记物溶液,即:莱克多巴胺抗体标记物溶液、沙丁胺醇抗体标记物溶液和克伦特罗抗体标记物溶液。
实施例6
本发明提供的银钯纳米粒子标记的三种瘦肉精抗体标记物溶液的制备方法,包括以下步骤:
将0.5 mL、浓度为7.5 μg/mL三种瘦肉精抗体溶液中任意一种加入到1.5mL由实施例2~4任意一种方法制备的银钯纳米粒子水溶液中,搅拌4h后离心分离,再重新分散到1.5 mL磷酸缓冲溶液中,得到相应的莱克多巴胺抗体标记物溶液、沙丁胺醇抗体标记物溶液和克伦特罗抗体标记物溶液。
实施例7
本发明提供的银钯纳米粒子标记的三种瘦肉精抗体标记物溶液的制备方法,包括以下步骤:
将1 mL、浓度为10 μg/mL三种瘦肉精抗体溶液中任意一种加入到2 mL由实施例2~4任意一种方法制备的银钯纳米粒子水溶液中,搅拌5h后离心分离,再重新分散到2 mL磷酸缓冲溶液中,得到相应的莱克多巴胺抗体标记物溶液、沙丁胺醇抗体标记物溶液和克伦特罗抗体标记物溶液。
实施例8
本发明提供的同时检测三种瘦肉精的电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)在多通道丝网印刷电极(图1)的3个工作电极的表面,分别滴加5 μL、浓度为1mg/mL的石墨烯溶液,自然晾干。
(2)在(1)中得到的3个工作电极的表面上分别滴加5μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液,孵化1h,然后用超纯水清洗干净。
(3)在(2)中得到的3个工作电极的表面上分别滴加5 μL三种瘦肉精抗原溶液中的一种,润湿状态下放置1h,所述抗原溶液的浓度均为5 μg/mL。
(4)在(3)中得到的3个工作电极表面分别滴加5 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液,待干燥后,用超纯水清洗干净,即制得一种同时检测三种瘦肉精的电化学传感器。
实施例9
本发明提供的同时检测三种瘦肉精的电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)在多通道丝网印刷电极(图1)的3个工作电极的表面,分别滴加8 μL、浓度为1.5mg/mL的石墨烯溶液,自然晾干。
(2)在(1)中得到的3个工作电极的表面上分别滴加8 μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液,孵化2 h,然后用超纯水清洗干净。
(3)在(2)中得到的3个工作电极的表面上分别滴加8 μL三种瘦肉精抗原溶液中的一种,润湿状态下放置2 h,所述抗原溶液的浓度均为8μg/mL。
(4)在(3)中得到的3个工作电极表面分别滴加5 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液,待干燥后,用超纯水清洗干净,即制得一种同时检测三种瘦肉精的电化学传感器。
实施例10
本发明提供的同时检测三种瘦肉精的电化学传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)在多通道丝网印刷电极(图1)的3个工作电极的表面,分别滴加10 μL、浓度为2 mg/mL的石墨烯溶液,自然晾干。
(2)在(1)中得到的3个工作电极的表面上分别滴加10 μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液,孵化3 h,然后用超纯水清洗干净。
(3)在(2)中得到的3个工作电极的表面上分别滴加10 μL三种瘦肉精抗原溶液中的一种,润湿状态下放置3 h,所述抗原溶液的浓度均为10 μg/mL。
(4)在(3)中得到的3个工作电极表面分别滴加5 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液,待干燥后,用超纯水清洗干净,即制得一种同时检测三种瘦肉精的电化学传感器。
实施例11
本发明提供的同时检测三种瘦肉精的电化学传感器,用于三种瘦肉精的同时检测,步骤如下:
(1)将实施例5~7中任意一种方法制备的银钯纳米粒子标记的抗体标记物溶液与对应的三种瘦肉精的标准溶液等体积混合,孵化2 h,制得三种混合溶液。
(2)在实施例8~10中任意一种方法制备的同时检测三种瘦肉精的电化学传感器的3个工作电极表面,分别滴加8 μL(1)中得到的混合溶液,孵化2h,然后用超纯水清洗干净。
(3)将参比电极、对电极和工作电极连接在电化学工作站上,在电解槽中加入pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液,通过线性扫描伏安法检测所述修饰好的工作电极的电流响应,根据所得电流响应与三种瘦肉精的标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线。
(4)将待测样品制成的样品溶液,代替三种瘦肉精的标准溶液,按照所述三种瘦肉精工作曲线的绘制方法进行检测。
实施例12
本发明采用一种同时检测三种瘦肉精的电化学传感器,用于三种瘦肉精的同时检测,步骤如下:
(1)将实施例5~7中任意一种方法制备的银钯纳米粒子标记的抗体标记物溶液与对应的三种瘦肉精的标准溶液等体积混合,孵化1 h,制得三种混合溶液。
(2)在实施例8~10中任意一种方法制备的同时检测三种瘦肉精的电化学传感器的3个工作电极表面,分别滴加5 μL(1)中得到的混合溶液,孵化1h,然后用超纯水清洗干净。
(3)将参比电极、对电极和工作电极连接在电化学工作站上,在电解槽中加入pH为5.0的磷酸盐缓冲溶液,通过线性扫描伏安法检测所述修饰好的工作电极的电流响应,根据所得电流响应与三种瘦肉精的标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线。
(4)将待测样品制成的样品溶液,代替三种瘦肉精的标准溶液,按照所述三种瘦肉精工作曲线的绘制方法进行检测。
实施例13
本发明采用一种同时检测三种瘦肉精的电化学传感器,用于三种瘦肉精的同时检测,步骤如下:
(1)将实施例5~7中任意一种方法制备的银钯纳米粒子标记的抗体标记物溶液与对应的三种瘦肉精的标准溶液等体积混合,孵化3 h,制得三种混合溶液。
(2)在实施例8~10中任意一种方法制备的同时检测三种瘦肉精的电化学传感器的3个工作电极表面,分别滴加10 μL(1)中得到的混合溶液,孵化3h,然后用超纯水清洗干净。
(3)将参比电极、对电极和工作电极连接在电化学工作站上,在电解槽中加入pH为9.0的磷酸盐缓冲溶液,通过线性扫描伏安法检测所述修饰好的工作电极的电流响应,根据所得电流响应与三种瘦肉精的标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线;用于莱克多巴胺、沙丁胺醇和克伦特罗三种瘦肉精的检测范围均为0.01~1000 ppb,检测限均低于0.002 ppb。
(4)将待测样品制成的样品溶液,代替三种瘦肉精的标准溶液,按照所述三种瘦肉精工作曲线的绘制方法进行检测。
实施例14
由实施例1~13任意一种方法制成的电化学传感器,用于3种猪肉样品中三种瘦肉精的同时检测,均未检出三种瘦肉精;采用加标回收法,每种样品平行检测7次,其相对标准偏差均低于5%,回收率为97.6%~102%,表明该方法的精密度和准确度均令人满意,同时说明该产品为合格产品。

Claims (3)

1.一种应用电化学传感器同时检测三种瘦肉精的方法,所述电化学传感器通过以下方法制备: 
1)在多通道丝网印刷电极的3个工作电极的表面,分别滴加5~10 μL、浓度为1~2 mg/mL的石墨烯溶液,自然晾干;
2)在1)中得到的3个工作电极的表面上分别滴加5~10 μL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液,孵化1~3 h,然后用超纯水清洗干净;
3)在2)中得到的3个工作电极的表面上分别滴加5~10 μL三种瘦肉精抗原溶液中的一种,润湿状态下放置1~3 h;
4)在3)中得到的3个工作电极表面分别滴加5 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液,待干燥后,用超纯水清洗干净,即制得一种同时检测三种瘦肉精的电化学传感器;
其特征在于,检测包括以下步骤:
(1)银钯纳米粒子水溶液的制备
将质量比为(0.6 ~1.9)∶1的硝酸银和六氯钯酸钾固体加入到10~20 mL含有体积浓度为5%的曲拉通X-100水溶液中,室温下搅拌10~30 min,然后加热到65~70℃保持3.5~5 h,用水和乙醇清洗,离心分离,真空干燥,得到银钯纳米粒子,银与钯的质量比为(1.5 ~ 4.5)∶1,配成银钯纳米粒子水溶液的浓度为1~2 mg/mL;
(2)银钯纳米粒子标记的三种瘦肉精抗体标记物溶液的制备
将0.1~1 mL瘦肉精抗体溶液加入到1~2 mL制备的银钯纳米粒子水溶液中,搅拌3~5 h后离心分离,再重新分散到1~2 mL磷酸缓冲溶液中,得到瘦肉精抗体标记物溶液;所述瘦肉精抗体选自下列之一:莱克多巴胺抗体、沙丁胺醇抗体、克伦特罗抗体;
(3)将银钯纳米粒子标记的抗体标记物溶液与对应的三种瘦肉精的标准溶液等体积混合,孵化1 ~3 h,制得三种混合溶液;
(4)在同时检测三种瘦肉精的电化学传感器的3个工作电极表面上分别滴加5~10 μL(1)中所述的三种混合溶液,孵化1 ~ 3 h,然后用超纯水清洗干净; 
(5)将参比电极、对电极和工作电极连接在电化学工作站上,在电解槽中加入pH为5.0~9.0的磷酸盐缓冲溶液,通过线性扫描伏安法检测所述修饰好的工作电极的电流响应,根据所得电流响应与三种瘦肉精的标准溶液浓度之间的关系,绘制工作曲线;
(6)将待测样品制成的样品溶液,代替三种瘦肉精的标准溶液,按照所述三种瘦肉精工作曲线的绘制方法进行检测。
2.如权利要求1所述的应用电化学传感器同时检测三种瘦肉精的方法,其中,(2)中所述瘦肉精抗体溶液的浓度为5~10 μg/mL。
3.如权利要求1所述的应用电化学传感器同时检测三种瘦肉精的方法,其中,3)中所述瘦肉精抗原溶液的浓度为5~10 μg/mL。
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