CN101858918A - 基于微间隙阵列电极的电化学免疫传感器及其检测动物源食品中莱克多巴胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于微间隙阵列电极的电化学免疫定量传感器及用于检测食品中莱克多巴胺的方法。传感器有：叉指式双电极组成的微间隙阵列电极，其正电极和负电极的梳形齿宽均为1μm-100μm，电极间隙1μm-100μm，微间隙阵列电极表面固定有莱克多巴胺-BSA偶联物；碱性磷酸酯酶标记的莱克多巴胺单克隆抗体，它在检测时加到微间隙阵列电极上，同被检测样品中的莱克多巴胺及所述电极上的莱克多巴胺-BSA偶联物发生竞争免疫反应。该传感器特异性强，能够实现定量检测，4-40℃都可使用，10min以后便可观察结果，适合于单位或个人对动物源性食品样品中的莱克多巴胺进行快速检测。

Description

基于微间隙阵列电极的电化学免疫传感器及其检测动物源食品中莱克多巴胺的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于微间隙阵列电极的电化学免疫传感器及其利用该传感器检测动物源食品中莱克多巴胺的方法。

背景技术

动物性产品中常见的残留药物大致分为抗生素类、驱肠虫药类、生长促进剂类、抗原虫药类、灭锥虫药类、镇静剂类和肝肾上腺素能受体阻断剂及其它化学物质等，其中违禁药物包括如：抗生素(环丙沙星、恩诺沙星等)、二苯乙烯类及其衍生物(已烯雌酚、双烯雌酚等)、β-兴奋剂(来克多巴胺、克仑特罗等)、镇静剂(氯丙嗪、安定等)、皮质激素类(地塞咪松等)、甲状腺抑制剂(丙硫氧嘧啶等)和性激素与同化激素(睾酮、雌二醇、孕酮等)等。近二十年来，我国动物药品行业进人了全面发展的时期，随着各种新型兽药在畜、禽中的应用显著增加，由此导致的畜禽肉及其加工食品中兽药残留的问题日益突出，严重危害了人类健康，因此，进行兽药残留检测技术的研究，发展可靠、灵敏、快速和实用的残留分析技术已迫在眉睫。

现有兽药残留分析技术大多采用化学分析法、比色法、生物测定法、高效薄层色谱法(HPTLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、超临界液体色谱法(SFC)、毛细管区域电泳法(CZE)及联用技术等，检测限一般为μg/kg级，LC-MS能对ng级的抗生素残留进行检测与结构确证。我国现有检测方法标准有SN0208-1993、SN0498-1995、NY5029-2001等，而上述方法都需要严格的样本前处理步骤，精细的微量操作手段，高灵敏的痕量检测技术，难度大，仪器化程序分析成本高，分析时间长。近年来颇受关注的免疫分析技术在抗生素的残留分析方面已有初步的应用，其方法的建立包括待测物选择半抗原及人工抗原的合成，抗体制备和测定方法建立几个方面。如采用免疫法(IA)分析青霉素、链霉素、四环素、氯霉素、磺胺类等抗生素；生物传感器技术对牛奶中的抗生素进行检测；免疫亲合色谱与高效液相色谱联用(IAC-HPLC)方式或免疫亲合色谱与气相色谱联用(IAC-GC)方式对氯霉素、阿维菌素、依维菌素残留进行分析。这些分析技术在灵敏性、选择性和实用性方面基本能满足目前抗生素残留的分析要求(Kd＝10-6～10-12M)，但检测速度慢，不能满足现场和实验室快速定量检测要求。目前，国际上在兽药残留分析方面主要呈现两大趋势：一是残留指标限量值的逐步降低；二是检测技术趋向于高技术化、系列化、速测化、便携化。为了与国际接轨，我们必须不断开发和完善检测技术，发展简单、快速、准确、灵敏和便携化的兽药筛选性多残留分析技术。

免疫传感器是利用抗原抗体特异免疫反应与高灵敏传感器件相结合构成的一种生物传感器件，它具有制备简便、特异性好、操作快速、灵敏的特点，一些具有半抗原性(多数兽用化学药物具有此性能)的小分子物质均可设计研制成免疫传感器，因此将免疫传感技术用于农产品中兽药残留物的检测是当前一个新的发展方向。目前，国内外有关兽药残留物的免疫分析已有一些文献报告，但大多采用酶联免疫分析(ELISA)法测定，虽采用单克隆抗体免疫分析技术的特异性较好，但灵敏度仍受一定限制。而有关免疫传感技术的报导甚少，Caldow M等和Gustavsson E等发展了一种SPR免疫传感器，分别用于蜂蜜中泰乐菌素和β-内酰胺类抗生素的检测；此外，Knecht等报导了一种自动微阵列免疫传感系统用于同时检测牛奶中的抗生素等。国内湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室已在半抗原设计、抗原的合成和抗体的制备、纯化及免疫传感器制备方面开展了相关工作并积累了一定的经验，但这些工作离实际应用仍有相当距离，因此，开展农产品中兽药残留物高通量快速分析检测是一种十分有意义的工作。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出一种基于微间隙阵列电极的电化学免疫传感器及其利用该传感器检测动物源食品中莱克多巴胺的方法，可实现对动物源中莱克多巴胺的快速、高效的检测。

本发明的技术方案之一是，所述基于微间隙阵列电极的电化学免疫传感器包括：

a.由叉指式双电极组成微间隙阵列电极，且正电极和负电极的梳形齿宽D₁均为1μm-100μm，电极间隙D₂为1μm-100μm；微间隙阵列电极表面固定有30μL的莱克多巴胺-BSA偶联物，该莱克多巴胺-BSA偶联物浓度为100μg/mL；

b.碱性磷酸酯酶标记的莱克多巴胺单克隆抗体；它在检测时加到微间隙阵列电极上，同被检测样品中的莱克多巴胺及所述电极上的莱克多巴胺-BSA偶联物发生竞争免疫反应。

本发明的技术方案之二是，利用基于微间隙电极阵列的电化学免疫传感器对动物源性食品样品中莱克多巴胺的检测方法为：

取浓度分别为0.10ng/mL、1.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、100.0ng/mL、200.0ng/mL的莱克多巴胺标准样品溶液各100μL，将所述每一种浓度的莱克多巴胺标准样品溶液分别与1μL碱性磷酸酯酶标记的莱克多巴胺单克隆抗体溶液室温下混合反应2min～3min；然后将各混合物分别滴加到对应的电化学免疫定量传感器的电极表面，室温下静置反应5min-8min，将传感器工作电极的正极与CHI 760A型电化学工作站的工作电极连接，工作站对电极与参比电极复合，再与传感器工作电极的负极连接，采用线性扫描伏安法在0～50mV电位范围检测，记录传感器电流随电位变化的响应曲线，并计算其电导值；根据不同浓度的莱克多巴胺标准样品溶液的电导值获得工作曲线；再根据样品的电导值与工作曲线求得对应的样品的莱克多巴胺的浓度。

以下对本发明做出进一步说明。

本发明中，所述碱性磷酸酯酶标记的莱克多巴胺单克隆抗体溶液可采用以下方法制备：

取2.5mg/mL的莱克多巴胺单克隆抗体1mL，加入碱性磷酸酯酶5mg，再加入质量分数为2.5％的戊二醛20μL，室温静放置2小时；然后用0.01mol/LPBS于4℃透析过夜，换液3次；再移入0.05mol/L Tris-HCl缓冲液中，于4℃透析过夜，换液3次；取出，用含质量分数为1.0％BSA和质量分数为0.02％NaN₃的Tris-HCl缓冲液稀释至4mL，即为酶标记抗体溶液原液；最后加入1mL-2mL纯甘油，4℃保存。

本发明的工作电极为微间隙阵列电极，可由常规光刻印刷法制作，正负电极均为两个梳形金电极，正负电极的梳形齿数5-20个，彼此交叉组成微间隙阵列金电极，梳齿宽为1μm-100μm，间隙为1μm-100μm；再对基片进行硅烷化处理，步骤包括：1)将金电极基片用无水乙醇清洗三次，每次1min-2min；2)将金电极浸入1M的NaOH溶液中25min-35min，然后用超纯水清洗该电极三次，每次1min-2min，吹干；3)将经步骤2)处理后的金电极浸入含氨丙基三甲氧基硅烷5％(V/V)的乙醇溶液中，室温下静置23小时-25小时；再用超纯水清洗三次后吹干，即得工作电极。

本发明所述基于微间隙电极阵列的莱克多巴胺电化学免疫定量传感器的制备，可采用以下步骤：

1)按照上述制得的工作电极浸入质量分数为2.5％的戊二醛水溶液中，室温下静置1小时；

2)取出，用超纯水清洗三次；在上述电极上滴加30μL莱克多巴胺与牛血清白蛋白或酪蛋白交联物溶液，室温下静置反应1小时；所述交联物浓度为100μg/mL，是溶于0.01mol/L、pH7.4磷酸缓冲溶液而得；

3)用超纯水清洗三次，吹干，所得的工作电极保存于4℃备用；

4)将上述工作电极浸泡在银沉积溶液中1min-2min，再经室温干燥，即得所述电化学传感器，所述的银沉积溶液为将1mM抗坏血酸磷酸酯，2mMAgNO₃的0.1M甘氨酸-NaOH缓冲溶液而得，溶液pH＝9.0。

本发明基于微间隙电极阵列的电化学免疫传感器的莱克多巴胺的检测方法中，分别取一系列浓度0.10ng/mL、1.0ng/mL、，10.0ng/mL、20.0ng/mL、100.0ng/mL、200.0ng/mL的莱克多巴胺标准样品溶液100μL与1μL碱性磷酸酯酶标记的莱克多巴胺单克隆抗体溶液室温下混合反应2～3min，然后将各混合物分别滴加到对应的电化学免疫定量传感器的电极表面，室温下静置反应5min-8min；未反应的碱性磷酸酯酶标记抗体则与工作电极表面的已经固定了的莱克多巴胺牛血清白蛋白或酪蛋白交联物反应形成偶联物-单抗复合物；偶联物-单抗复合物中的碱性磷酸酶催化工作电极表面的抗坏血酸磷酸酯水解产生抗坏血酸，银离子在抗坏血酸的作用下被还原成银单质并沉积在工作电极上，从而增大了微间隙阵列电极的电导；将传感器工作电极的正极与CHI 760A型电化学工作站的工作电极连接，工作站对电极与参比电极复合，再与传感器工作电极的负极连接，采用线性扫描伏安法在0～50mV电位范围检测，记录传感器电流随电位变化的响应曲线，并计算其电导值；根据不同浓度的莱克多巴胺标准样品溶液的电导值，获得工作曲线；再根据样品的电导值与工作曲线，求得对应样品的莱克多巴胺的浓度。

本发明的有益效果为：

(1)电化学免疫定量传感器制备简单，成本低廉，可大批量低成本生产；

(2)操作步骤简单，检测时间在30分钟内，检测所需要的仪器可用自行研制的电阻量测装置；

(3)本免疫传感器灵敏度高，可实现浓度为1ng/mL的动物源中莱克多巴胺的检测，达到我国食品中莱克多巴胺的限量标准，且背景干扰小，可以对食品中莱克多巴胺进行快速筛查和检测；

(4)解决了快速检测卡只能定性或者半定量的问题，克服了光学定性检测卡、薄层层析检测卡重现性差的难题，实现真正意义上的定量检测，数据真实可靠，整个仪器可便携，低成本；在国内外首次将该技术应用于食品、环境等领域的检测，特别适用于食品安全检测机构和监管部门的现场检测；

(5)检测温度适宜范围宽，在4℃-40℃都可使用，结果正常。

本发明适合于卫生、质监、海关、家畜养殖场、食品企业等单位或个人对动物源性食品样品中的莱克多巴胺进行快速检测，可望成为食品样品中的莱克多巴胺现场筛查提供有效的技术手段。

附图说明

图1是微间隙阵列电极的一种实施例放大图样(黑色区域为金膜，白色区域为裸露的基片)；D₁为正电极或负电极的梳形齿宽，D₂为电极间隙；

图2为微型化后的反应装置示意图；图中，圆柱形筒体为反应槽示意图，该反应槽以外的构件为置于反应槽底部的微间隙阵列电极(其中两黒色色块为正、负电极)。

具体实施方式

利用本传感器对样品中莱克多巴胺的检测：

样品的前处理：

(1)饲料：样品粉碎后过20目筛，得试样。取2g试样于50ml离心管中，加入10ml水，混匀，置于超声波水浴中超声30min(其间每10min取出混匀1次)，超声提取后冷却至室温，于2500rpm离心5min，取上清液进行测试。

(2)尿液：用尿液直接进行测试，如有浑浊请先离心取上清。尿液标准必须收集在洁净、干燥不含有任何防腐剂的塑料尿杯或玻璃容器内。若不能及时检测送检，尿样标准在2-8℃冷藏可以保存48小时。长期保存需冷冻于-20℃，忌反复冻融。

(3)肉：装入大约4克碎的猪肉样本(肉泥)于离心管中，盖紧管盖。将装样品的离心管在微沸的水浴锅中水浴10分钟；吸取3滴以上(约100ul)煮出的溶液到1.5ml的离心管中。如有明显黄色浑浊请离心，使用上清液作为待测样品溶液。

分别取上述提取样品100μL与1μL碱性磷酸酶标记的莱克多巴胺单克隆抗体混合，室温下反应2～3min，滴到固定有30μL 100μg/mL莱克多巴胺-BSA抗原的电化学免疫定量传感器的电极表面，室温下静置反应8-12min，再从该电极获取与莱克多巴胺抗原浓度相关的电导信号，记录变化值。根据工作曲线计算得到莱克多巴胺浓度。五次测定并根据工作曲线计算得到对应的样品中莱克多巴胺浓度平均值为24.2±1.2ng/mL。与五次色谱法结果22.3±2.0ng/mL吻合。结果表明，本传感器可以对莱克多巴胺进行快速检测。

Claims (2)

1.一种基于微间隙阵列电极的电化学免疫传感器，其特征是，它包括：

a.由叉指式双电极组成微间隙阵列电极，且正电极和负电极的梳形齿宽均为1μm-100μm，电极间隙1μm-100μm；微间隙阵列电极表面固定有30μL的莱克多巴胺-BSA偶联物，该莱克多巴胺-BSA偶联物浓度为100μg/mL；

b.碱性磷酸酯酶标记的莱克多巴胺单克隆抗体；它在检测时加到微间隙阵列电极上，同被检测样品中的莱克多巴胺及所述电极上的莱克多巴胺-BSA偶联物发生竞争免疫反应。

2.一种基于权利要求1所述微间隙电极阵列的电化学免疫传感器的莱克多巴胺的检测方法，其特征是，该方法为：

取浓度分别为0.10ng/mL、1.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL、100.0ng/mL、200.0ng/mL的莱克多巴胺标准样品溶液各100μL，将所述每一种浓度的莱克多巴胺标准样品溶液分别与1μL碱性磷酸酯酶标记的莱克多巴胺单克隆抗体溶液室温下混合反应2min～3min；然后将各混合物分别滴加到对应的电化学免疫定量传感器的电极表面，室温下静置反应5min-8min，将传感器工作电极的正极与CHI 760A型电化学工作站的工作电极连接，工作站对电极与参比电极复合，再与传感器工作电极的负极连接，采用线性扫描伏安法在0～50mV电位范围检测，记录传感器电流随电位变化的响应曲线，并计算其电导值；根据不同浓度的莱克多巴胺标准样品溶液的电导值获得工作曲线；再根据样品的电导值与工作曲线求得对应的样品的莱克多巴胺的浓度。

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