CN107703296B - 一种用于磺胺类药物多残留检的超灵敏电化学免疫传感器 - Google Patents

一种用于磺胺类药物多残留检的超灵敏电化学免疫传感器 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种电化学免疫传感器在磺胺类药物多残留检测方面的应用。所述的应用为：首先通过原位电化学聚合法在玻碳电极表面修饰聚磺胺嘧啶，然后基于磺胺嘧啶抗体与磺胺类药物的交叉免疫反应，实现对包括磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺醋酰和磺胺胍在内的四种磺胺类药物的检测，检测限在0.06～0.15 ng/mL之间，线性范围在0.1～1500 ng/mL或0.3～500 ng/mL之间。

Description

一种用于磺胺类药物多残留检的超灵敏电化学免疫传感器
技术领域
本发明属于食品安全检测和分析化学技术领域，具体涉及一种通过原位电化学聚合法修饰的电化学免疫传感器在磺胺类药物多残留检测方面的应用。
背景技术
磺胺类药物是含有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，因具有抗菌谱广、价格低廉、性质稳定等诸多优点，已作为抗生素使用超过70 年时间。磺胺类药物具有致过敏、抑制体内酶活性、引起肠内菌群失调等副作用，人类若大量摄入，往往具有很大的风险性。我国及欧美等国均规定动物性食品中总磺胺的最高残留限量（maximum residue limit，MRL）为0.1 mg/kg。目前磺胺类药物的分析技术手段主要包括高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）、HPLC-其他检测器法、电泳分析法和免疫分析法等，其中HPLC-MS/MS法和HPLC-其他检测器法共占据了60%左右。
色谱法虽然占据磺胺类药物分析的主流，但其检测成本高、操作复杂、需要专业技术人员操作，在条件较差的基层检测部门和单位难以配备，因此，成本低廉、操作简便的快速检测技术仍具有重要的实际应用价值。
电化学传感器因操作简便、检测时间短、成本低等优点已在多种有害物的分析中得到大量应用，但通过原位电化学聚合法修饰聚磺胺的磺胺多残留电化学免疫传感器尚未见报道。董文举等（分析试验室，2009，第28卷第 3期，40-43）制备了聚磺胺嘧啶修饰电极，并用其检测对乙酰氨基酚；何保山等（食品科技，2015，第40卷第 8期，322-324）利用磺胺能在电极表面发生氧化反应的原理，建立了一种磺胺直接电化学检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种电化学传感器在磺胺类药物多残留检测方面的应用，所述电化学传感器包括基底玻碳电极，和通过原位电化学聚合法修饰到玻碳电极表面的聚磺胺嘧啶层。
本发明所述的电化学免疫传感器通过与待测物中含有的磺胺类药物竞争结合磺胺嘧啶抗体，从而导致传感器电阻发生改变实现对磺胺类药物的检测。
本发明所述的磺胺类药物包括磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺醋酰和磺胺胍（结构式见式1）。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式1 四种磺胺类药物的结构式
本发明采取的技术方案为：
（1）电化学免疫传感器的制备：将清洗干净的玻碳电极置于含2 μmol/L磺胺嘧啶的磷酸缓冲溶液（PBS，0.067mol/L，pH=8.0）中，循环扫描10周（扫速为100 mV/S，电位范围为-1.0～2.0 V），再置于含100 μmol/L磺胺嘧啶和0.1mol/L NaCl的PBS（0.067mol/L，pH=8.0）溶液中循环扫描电极至稳定（扫速为100 mV/S，电位范围为-1.0～1.0 V），淋洗后晾干即得到聚磺胺嘧啶修饰的PSD-GCE电化学免疫传感器（参考董文举等，分析试验室，2009，第28卷第 3期，40-43）。
（2）磺胺类药物标准溶液的配制：配制一组包括空白标样在内的含不同浓度的磺胺类药物和10 μg/mL磺胺嘧啶抗体的磷酸缓冲溶液，作为标准溶液。
（3）多种磺胺类药物的检测：将步骤（1）所述的电化学免疫传感器分别浸入一系列总体积均为50 μL的磺胺类药物标准溶液中，孵育后用磷酸缓冲溶液冲洗，在K3[Fe(CN)6]溶液中进行差分脉冲伏安（DPV）扫描。以孵育前后DPV响应电流变化值ΔI对标准溶液中磺胺类药物浓度对数值lgC作图，得ΔI-lgC工作曲线，采用线性回归法获得ΔI-lgC线性回归方程。将待测样品按步骤（2）配制成磷酸缓冲溶液，经过孵育和DPV扫描，获得ΔIx，代入ΔI-lgC线性回归方程，即可得出待测样品中磺胺类药物的浓度。
所述磺胺类药物包括磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺醋酰和磺胺胍。
有益效果
本发明提供的一种电化学免疫传感器在磺胺类药物多残留检测方面的应用，基于磺胺嘧啶抗体对磺胺类药物的交叉免疫反应，能实现对包括磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺醋酰和磺胺胍四种磺胺类药物的检测。所述的传感器快速、高效、灵敏度高，并且所述的方法具有较低的检出限（0.06～0.15 ng/ml）和较宽的线性范围（0.1～01500 ng/mL或0.3～0500 ng/mL）。
本发明提供的一种电化学免疫传感器在磺胺类药物多残留检测方面的应用，样品前处理简单、检测操作简便、灵敏度高，实用价值较强，市场潜力较大。
附图说明
图1为电化学免疫传感器对磺胺嘧啶进行检测的DPV曲线图。
图2为响应电流的变化值ΔI与磺胺嘧啶浓度对数值lgC的工作曲线图。
图3为电化学免疫传感器对磺胺二甲基嘧啶进行检测的DPV曲线图。
图4为响应电流的变化值ΔI与磺胺二甲基嘧啶浓度对数值lgC的工作曲线图。
图5为电化学免疫传感器对磺胺醋酰进行检测的DPV曲线图。
图6为响应电流的变化值ΔI与磺胺醋酰浓度对数值lgC的工作曲线图。
图7为电化学免疫传感器对磺胺胍进行检测的DPV曲线图。
图8为响应电流的变化值ΔI与磺胺胍浓度对数值lgC的工作曲线图。
具体实施方式
实施例1 电化学免疫传感器的制备
将清洗干净的玻碳电极置于含2 μmol/L磺胺嘧啶的磷酸缓冲溶液（PBS，0.067mol/L，pH=8.0）中，循环扫描10周（扫速为100 mV/S，电位范围为-1.0～2.0 V），再置于含100 μmol/L磺胺嘧啶和0.1mol/L NaCl的PBS（0.067mol/L，pH=8.0）溶液中循环扫描电极至稳定（扫速为100 mV/S，电位范围为-1.0～1.0 V），淋洗后晾干即得到聚磺胺嘧啶修饰的PSD-GCE电化学免疫传感器。
实施例2 对磺胺嘧啶（SD）的检测
以与实施例1完全相同方法制备PSD-GCE电化学免疫传感器，将其浸入总体积为50µL的含有浓度为10 μg/mL的磺胺嘧啶抗体和一系列不同浓度的磺胺嘧啶的标准溶液中，37℃孵育30分钟，用磷酸缓冲溶液冲洗干净后置于含有2 mmol/L的K3[Fe(CN)6]的KCl溶液（0.1 mol/L）中进行差分脉冲伏安（DPV）扫描，DPV曲线图如图1所示，图中曲线从上到下浓度依次为3000 ng/mL、1000 ng/mL、300 ng/mL、100 ng/mL、30 ng/mL、10 ng/mL 、3 ng/mL、1 ng/mL、0.3 ng/mL 和0.1 ng/mL。将传感器未经孵育直接在KCl溶液中所测得的响应电流值记为I0，与含有一定浓度磺胺嘧啶的标准溶液孵育后所测得的响应电流值记为Ix，响应电流的变化值△I等于Ix与I0的差值；将所述△I与磺胺嘧啶的浓度对数值lgC（ng/mL）绘制成△I-lgC工作曲线。工作曲线图如图2所示，采用线性回归法得到其△I-lgC线性回归方程为ΔI（μA）= 26.2003-4.0392 lgC（ng/mL），磺胺嘧啶的浓度在0.1～03000 ng/mL范围内ΔI与lgC成正比，线性相关系数为0.9909。以空白标样测定值标准偏差的3倍（3σ）作为样品检测限，重复10次实验得出，以上述方法检测磺胺嘧啶的样品检测限为0.06 ng/mL。将待测样品在上述条件下进行孵育和扫描得出响应电流I；根据响应电流的变化值△I和△I-lgC线性回归方程，可计算出待测样品中磺胺嘧啶的浓度C。
实施例3 对磺胺二甲基嘧啶（SM2）的检测
以与实施例1完全相同方法制备PSD-GCE电化学免疫传感器，将其浸入总体积为50µL的含有浓度为10 μg/mL的磺胺嘧啶抗体和一系列不同浓度的磺胺二甲基嘧啶的标准溶液中，37 ℃孵育30分钟，用磷酸缓冲溶液冲洗干净后置于含有2 mmol/L的K3[Fe(CN)6]的KCl溶液（0.1 mol/L）中进行差分脉冲伏安（DPV）扫描，DPV曲线图如图3所示，图中曲线从上到下浓度依次为400 ng/mL、100 ng/mL、25 ng/mL、15 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1 ng/mL、0.5 ng/mL和0.2ng/mL。将传感器未经孵育直接在KCl溶液中所测得的响应电流值记为I0，与含有一定浓度磺胺二甲基嘧啶的标准溶液孵育后所测得的响应电流值记为Ix，响应电流的变化值△I等于Ix与I0的差值；将所述△I与磺胺二甲基嘧啶的浓度对数值lgC（ng/mL）绘制成△I-lgC工作曲线。工作曲线图如图4所示，采用线性回归法得到其△I-lgC线性回归方程为ΔI（μA）= 29.1314-6.3213lgC（ng/mL），磺胺二甲基嘧啶的浓度在0.2～0400 ng/mL范围内ΔI与lgC成正比，线性相关系数为0.9903。以空白标样测定值标准偏差的3倍（3σ）作为样品检测限，重复10次实验得出，以上述方法检测己烯雌酚的样品检测限为0.1 ng/mL。将待测样品在上述条件下进行孵育和扫描得出响应电流I；根据响应电流的变化值△I和△I-lgC线性回归方程，可计算出待测样品中磺胺二甲基嘧啶的浓度C。
实施例4 对磺胺醋酰（SA）的检测
以与实施例1完全相同方法制备PSD-GCE电化学免疫传感器，将其浸入总体积为50µL的含有浓度为10 μg/mL的磺胺嘧啶抗体和一系列不同浓度的磺胺醋酰的标准溶液中，37℃孵育30分钟，用磷酸缓冲溶液冲洗干净后置于含有2 mmol/L的K3[Fe(CN)6]的KCl溶液（0.1 mol/L）中进行差分脉冲伏安（DPV）扫描，DPV曲线图如图5所示，图中曲线从上到下浓度依次为1500 ng/mL、500 ng/mL、150 ng/mL、50 ng/mL 、15 ng/mL、5 ng/mL、1.5 ng/mL、0.5 ng/mL、0.15 ng/mL和0.1 ng/mL。将传感器未经孵育直接在KCl溶液中所测得的响应电流值记为I0，与含有一定浓度磺胺醋酰的标准溶液孵育后所测得的响应电流值记为Ix，响应电流的变化值△I等于Ix与I0的差值；将所述△I与磺胺醋酰的浓度对数值lgC（ng/mL）绘制成△I-lgC工作曲线。工作曲线图如图6所示，采用线性回归法得到其△I-lgC线性回归方程为ΔI（μA）= 28.7757-4.0884 lgC（ng/mL），磺胺醋酰的浓度在0.1～01500 ng/mL范围内ΔI与lgC成正比，线性相关系数为0.9962。以空白标样测定值标准偏差的3倍（3σ）作为样品检测限，重复10次实验得出，以上述方法检测磺胺醋酰的样品检测限为0.09 ng/mL。将待测样品在上述条件下进行孵育和扫描得出响应电流I；根据响应电流的变化值△I和△I-lgC线性回归方程，可计算出待测样品中磺胺醋酰的浓度C。
实施例5 对磺胺胍（SG）的检测
以与实施例1完全相同方法制备PSD-GCE电化学免疫传感器，将其浸入总体积为50µL的含有浓度为10 μg/mL的磺胺嘧啶抗体和一系列不同浓度的磺胺胍的标准溶液中，37℃孵育30分钟，用磷酸缓冲溶液冲洗干净后置于含有2 mmol/L的K3[Fe(CN)6]的KCl溶液（0.1 mol/L）中进行差分脉冲伏安（DPV）扫描，DPV曲线图如图7所示，图中曲线从上到下浓度依次为500 ng/mL、150 ng/mL、50 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1ng/mL、0.5 ng/mL和0.3 ng/mL。将传感器未经孵育直接在KCl溶液中所测得的响应电流值记为I0，与含有一定浓度磺胺胍的标准溶液孵育后所测得的响应电流值记为Ix，响应电流的变化值△I等于Ix与I0的差值；将所述△I与磺胺胍的浓度对数值lgC（ng/mL）绘制成△I-lgC工作曲线。工作曲线图如图8所示，采用线性回归法得到其△I-lgC线性回归方程为ΔI（μA）= 30.1762-7.0183 lgC（ng/mL），磺胺胍的浓度在0.3～0500 ng/mL范围内ΔI与lgC成正比，线性相关系数为0.9910。以空白标样测定值标准偏差的3倍（3σ）作为样品检测限，重复10次实验得出，以上述方法检测磺胺胍的样品检测限为0.15 ng/mL。将待测样品在上述条件下进行孵育和扫描得出响应电流I；根据响应电流的变化值△I和△I-lgC线性回归方程，可计算出待测样品中磺胺胍的浓度C。
实施例6 猪肝中加标磺胺嘧啶的测定
1）猪肝样品的处理：称取绞碎的猪肝组织（5±0.0050 g），加入磺胺嘧啶标准溶液和乙酸乙酯（20 mL）匀质2 min， 4000 r/min离心10 min，取上清液，用乙酸乙酯（20 mL）重复提取一次合并上清液。加入盐酸（4 mL，浓度为0.1 mol/L）后于40 ℃下旋转蒸发浓缩至干，依次用盐酸（2 mL，浓度为0.1 mol/L）、正己烷（3mL）溶解残渣，合并溶解液。在4000 r/min下离心5 min后弃去上层液体，用正己烷（3mL）洗涤烧瓶重复萃取一次合并下层液，40℃氮气吹干。加入磷酸缓冲溶液（1 mL，pH=7.4），充分震荡使浓缩物溶解后待测。
2）猪肝样品中加标磺胺嘧啶的测定：分别取不同体积的猪肝提取液样品，加入到磷酸缓冲溶液中配制成一系列含有不同浓度磺胺嘧啶和10 μg/mL的磺胺嘧啶抗体且总体积均为50 µL的孵育液。以与实施例1完全相同方法制备PSD-GCE电化学免疫传感器，将其浸入上述孵育液中，采用与实施例2相同的方法进行孵育、DPV扫描和数据处理，计算出磺胺嘧啶的浓度C，检测回收率结果如表1。
表1为加标猪肝中的磺胺嘧啶浓度的回收率结果
磺胺嘧啶添加量 (ng/mL) 磺胺嘧啶测定量 (ng/mL) 回收率（%） 平均回收率（%）±RSD（%）
100.0 112.2、101.4、89.1 112.2、101.4、89.1 100.9±11.55
10.0 8.04、9.02、97.7 80.4、90.2、97.7 89.43±8.67
1.0 1.049、1.130、0.986 104.9、113.0、98.6 105.5±7.22
实施例7 猪肉中加标磺胺二甲基嘧啶的测定
1）猪肉样品的处理：称取绞碎的猪肉组织（5±0.0050 g），加入磺胺二甲基嘧啶标准溶液和乙酸乙酯（20 mL）匀质2 min， 4000 r/min离心10 min，取上清液，用乙酸乙酯（20mL）重复提取一次合并上清液。加入盐酸（4 mL，浓度为0.1 mol/L）后于40 ℃下旋转蒸发浓缩至干，依次用盐酸（2 mL，浓度为0.1 mol/L）、正己烷（3mL）溶解残渣，合并溶解液。在4000r/min下离心5 min后弃去上层液体，用正己烷（3mL）洗涤烧瓶重复萃取一次合并下层液，40℃氮气吹干。加入磷酸缓冲溶液（1 mL，pH=7.4），充分震荡使浓缩物溶解后待测。
2）猪肉样品中加标磺胺二甲基嘧啶的测定：分别取不同体积的猪肉提取液样品，加入到磷酸缓冲溶液中配制成一系列含有不同浓度磺胺二甲基嘧啶和10 μg/mL的磺胺嘧啶抗体且总体积均为50 µL的孵育液。以与实施例1完全相同方法制备PSD-GCE电化学免疫传感器，将其浸入上述孵育液中，采用与实施例2相同的方法进行孵育、DPV扫描和数据处理，计算出磺胺二甲基嘧啶的浓度C，检测回收率结果如表2。
表2为加标猪肉中的磺胺二甲基嘧啶浓度的回收率结果
Figure RE-259207DEST_PATH_IMAGE005
实施例8 鸡肉中加标磺胺醋酰的测定
1）鸡肉样品的处理：称取绞碎的鸡肉组织（5±0.0050 g），加入磺胺醋酰标准溶液和乙酸乙酯（20 mL）匀质2 min， 4000 r/min离心10 min，取上清液，用乙酸乙酯（20 mL）重复提取一次合并上清液。加入盐酸（4 mL，浓度为0.1 mol/L）后于40 ℃下旋转蒸发浓缩至干，依次用盐酸（2 mL，浓度为0.1 mol/L）、正己烷（3mL）溶解残渣，合并溶解液。在4000 r/min下离心5 min后弃去上层液体，用正己烷（3mL）洗涤烧瓶重复萃取一次合并下层液，40℃氮气吹干。加入磷酸缓冲溶液（1 mL，pH=7.4），充分震荡使浓缩物溶解后待测。
2）鸡肉样品中加标磺胺醋酰的测定：分别取不同体积的鸡肉提取液样品，加入到磷酸缓冲溶液中配制成一系列含有不同浓度磺胺醋酰和10 μg/mL的磺胺嘧啶抗体且总体积均为50 µL的孵育液。以与实施例1完全相同方法制备PSD-GCE电化学免疫传感器，将其浸入上述孵育液中，采用与实施例2相同的方法进行孵育、DPV扫描和数据处理，计算出磺胺醋酰的浓度C，检测回收率结果如表3。
表3为加标鸡肉中的磺胺醋酰浓度的回收率结果
Figure RE-190254DEST_PATH_IMAGE006
实施例9 鱼肉中加标磺胺胍的测定
1）鱼肉样品的处理：称取绞碎的鱼肉组织（5±0.0050 g），加入磺胺胍标准溶液，依次加入乙酸乙酯（25 mL）和无水硫酸钠（5g）并分别匀质2 min，在4000 r/min离心10min。留上清液，用乙酸乙酯（25 mL）重复提取一次残渣，合并上清液后于40 ℃下旋转蒸发浓缩至干。依次用盐酸（2mL，浓度为0.1 mol/L）、甲醇（5mL）溶解残渣，再重复溶解一次，合并溶液。用正己烷（8mL）萃取，以3000 r/min离心5min后弃去上层液，再用正己烷（8mL）重复萃取一次，合并下层液在40℃旋转蒸发至干。加入磷酸缓冲液（1 mL，pH=7.4），充分震荡使浓缩物溶解后待测。
2）鱼肉样品中加标磺胺胍的测定：分别取不同体积的鱼肉提取液样品，加入到磷酸缓冲溶液中配制成一系列含有不同浓度磺胺胍和10 μg/mL的磺胺嘧啶抗体且总体积均为50 µL的孵育液。以与实施例1完全相同方法制备PSD-GCE电化学免疫传感器，将其浸入上述孵育液中，采用与实施例2相同的方法进行孵育、DPV扫描和数据处理，计算出磺胺胍的浓度C，检测回收率结果如表4。
表4为加标鱼肉中的磺胺胍浓度的回收率结果
Figure RE-882267DEST_PATH_IMAGE008

Claims (1)

1.一种电化学免疫传感器在磺胺类药物多残留检测方面的应用，其特征在于，通过原位电化学聚合法修饰到玻碳电极表面的聚磺胺嘧啶，仍然能够被磺胺嘧啶抗体特异性识别，从而能与待测物中含有的磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺醋酰和磺胺胍竞争结合磺胺嘧啶抗体，导致传感器电流发生改变实现对上述磺胺类药物的多残留检测。
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