CN102288656A - 一种检测卵巢skov-3癌细胞的三明治型电化学传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学和化学传感器技术领域,公开了一种用于诊断卵巢癌SKOV-3细胞的电化学传感器。涉及基于石墨烯和DNA标记抗体的三明治型免疫传感器的制法和医学诊断应用。利用石墨烯/抗体/抗原/DNA标记抗体/互补DNA的修饰玻碳电极,基于鸟嘌呤碱基和腺嘌呤碱基的催化氧化反应间接测定抗原(人类卵巢癌)。此传感器不仅利用了石墨烯的电子高传导性,而且降低了抗体标记物的高成本。在此基础上制备的免疫传感器还能用于其它种类细胞的检测,用途广泛。该传感器灵敏度高、制备简单,可用于任意种类癌细胞的检测,在医学诊断中有着良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及材料领域、医疗诊断和传感技术领域,具体为一种测定卵巢癌SKOV-3细胞的电化学传感器。
背景技术
恶性肿瘤是人类健康的巨大威胁,卵巢癌则是发生于卵巢组织的恶性肿瘤。由此可见检测卵巢癌细胞的水平有十分重要的意义。电分析化学由于具有灵敏度高、选择性好、响应时间短、所需仪器设备价格低廉等优点而广泛用于生命物质的电化学检测。以往的一些肿瘤检测以免疫方法为主,成本高、操作步骤复杂,易产生假阴性结果是该方法的致命缺点。因此开发出高灵敏度(用于体内痕量SKOV-3癌细胞的检测)、高选择性(防止体内共存物质的干扰)、价钱低廉、制备简单测定SKOV-3方法引起了人们的研究兴趣。
石墨烯,作为碳的一种新的形态,是sp2杂化碳原子组成的单层材料,是碳的二维结构。由于其具有优良的导电性和电催化性能,因此可以作为制备电化学传感器和生物传感器的一种理想材料。它具有碳纳米管的大部分优越性能,而且不像碳纳米管那样负载金属杂质。由于石墨烯的生物兼容性,将其应用于化学/生物传感器有着非常好的发展前景。
目标放大检测蛋白质的方法促进了医学的诊断和蛋白质组学的发展。DNA标记通过共价或链亲合素-生物素的方法连接到抗体上,利用多聚酶链反应放大后,用DNA检测的方法来识别目标待测物。至今为止,在所有的免疫多聚酶链反应方法中,目标分析物的检测均涉及在抗体表面对目标分析物的固定和对DNA标记物的检测。而相比于免疫多聚酶链反应,很少有报道关于DNA标记抗体检测癌细胞的免疫传感器。
在此,我们设计制备了一种新型的电化学检测卵巢癌SKOV-3细胞的免疫传感器,这种传感器集中了石墨烯生物传感器和DNA标记物的优点。通过这种方法,避免了抗体标记的需要。在杂交目标DNA之后,柔红霉素活化了示差脉冲伏安信号,能测出鸟嘌呤氧化还原所产生的电流,借此实现人类卵巢癌SKOV-3细胞的检测。在此基础上,只要改变抗体种类,即可检测出对该抗体有特异性吸附的肿瘤细胞。这种方法在临床应用上有着很大的潜力和光明前景。
发明内容
本发明提供一种高灵敏度、高选择性测定卵巢癌SKOV-3细胞的电化学传感器。
本发明还将上述传感器用于测定卵巢癌SKOV-3细胞。
一种检测卵巢癌SKOV-3细胞的电化学传感器,其制备方法包括如下步骤:
(1)制备用石墨烯修饰电极:电极清洗打磨后,在电极表面滴加氧化态的石墨烯溶液,干燥,得到石墨烯修饰的电极;
氧化态的石墨烯溶液浓度优选为0.5~4mg/ml;电极为玻碳电极;
(2)石墨烯修饰的电极用偶联剂混合溶液活化后,在抗体1溶液中放置20分钟~2小时,使抗体1共价连接到石墨烯修饰的电极表面;所述抗体1为anti-HER2抗体(卵巢癌SKOV-3表面相应抗原的抗体);
偶联剂混合液为含有200~800mmol/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和80~200mmol/L N-羟基硫代琥珀酰亚的溶液;抗体1溶液浓度为2~50μg/mL;
再将连接了抗体1的电极在卵巢癌SKOV-3细胞悬浮液中浸0.5~3小时;使抗原卵巢癌SKOV-3细胞与抗体1连接;
(3)通过特异性吸附将探针DNA寡核苷酸-anti-HER2生物结合体吸附到步骤(2)处理后的电极表面;再杂交互补DNA,得到杂交后的修饰电极;
所述探针DNA寡核苷酸-anti-HER2生物结合体的制备包括以下步骤:将anti-HER2抗体加入到含有探针DNA寡核苷酸和偶联剂的磷酸缓冲液中,反应2~5小时;偶联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐浓度为,N-羟基硫代琥珀酰亚胺浓度为;磷酸缓冲液的pH值为7~7.5;
(4)将步骤(3)杂交后的修饰电极在电化学指示剂溶液中浸泡2~10分钟后清洗;电化学指示剂为柔红霉素,浓度为5×10-6~5×10-5mol/L。
用电化学检测方法检测电极表面上吸附的电化学指示剂的电量,通过计算杂交前后电极表面电化学数值变化指示杂交反应的发生。
步骤(1)中,氧化态的石墨烯制备方法为:将石墨烯在硝酸和盐酸的混合液中,50~80℃条件下超声2~6小时,洗涤至中性。
用上述传感器检测卵巢癌SKOV-3细胞的方法为,以这种电化学传感器作为工作电极,用电化学方法检测所产生的电流,电解液为pH7~7.5的磷酸缓冲液。可采用循环伏安法、阻抗法或脉冲伏安法。
本发明所说的ssDNA(探针DNA寡核苷酸)-anti-HER2生物结合体是利用带有磷酸基功能团的探针DNA,与带有氨基的抗体(Ab1)在中间物的作用下能相互结合的特性,可通过将5’端带有磷酸基修饰的探针DNA与抗体溶液混合后制得该复合物。
本发明中探针DNA的磷酸基修饰可采用现有技术或商业途径获得。
通过上述方法,利用抗原抗体特异性吸附、羧基氨基和磷酸基氨基共价结合的相互作用,在电极(尤其是玻碳电极)表面依次逐层修饰石墨烯修饰层、抗体1(anti-HER2抗体)、抗原(人类卵巢癌SKOV-3细胞)层、探针DNA寡核苷酸-anti-HER2(ssDNA-anti-HER2)生物结合体,以此达到探针DNA固定在玻碳电极表面的目的。再捕获互补DNA,杂交与探针DNA互补的DNA,杂交后的双链DNA作为电化学指示剂载体。通过这种“三明治型”的杂交方法,在电化学指示剂(柔红霉素)的作用下,用电化学信号间接检测卵巢癌SKOV-3细胞的存在。
其中ssDNA-anti-HER2生物结合体避免了抗体标记的高成本费用,且在常温下DNA非常稳定,不易失活。由于石墨烯较好的导电性,此传感器在卵巢癌SKOV-3细胞浓度较低时也有明显信号,检测限可达到2.9cells/mL。此方法测定的SKOV-3癌细胞含量浓度范围在6cells/mL-1~6000cells/mL-1,有良好的线性关系,检测限在2.9cells/mL-1。
附图说明
图1:玻碳电极上每修饰一层修饰物后,通过电化学方法测得的循环伏安图。(a)裸玻碳电极;(b)石墨烯/裸玻碳电极;(c)抗体1/石墨烯/裸玻碳电极;(d)SKOV-3细胞/抗体1/石墨烯/裸玻碳电极;(e)ssDNA-抗体2/SKOV-3细胞/抗体1/石墨烯/裸玻碳电极。
图2:采用本发明的传感器检测不同浓度的卵巢癌SKOV-3细胞,此方法测定的SKOV-3癌细胞含量浓度范围在6cells/mL-1~6000cells/mL-1,有良好的线性关系,检测限在2.9cells/mL-1。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明,但本发明并不受其限制。
实施例1
如图1所示A、B步骤,制备本发明的免疫电化学传感器。
(1)ssDNA-anti-HER2生物结合体(探针DNA寡核苷酸-anti-HER2生物结合体)的制备
首先将0.5μg/μL anti-HER2抗体加入到含有2.12×10-6mol/L探针DNA寡核苷酸(ssDNA)、0.1mol/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸(EDC)和0.1mol/L N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHSS)的10mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.3)中,在室温下振荡反应3个小时。用高效液相色谱仪来提纯该复合物。流动相是标准磷酸缓冲溶液(0.2mol/L,pH 7.3),流速为1ml/min,首先出峰的物质就是ssDNA-anti-HER2生物结合体。最后,再用分光光度计来定性检测流出高效液相的ssDNA-anti-HER2生物结合体。
(2)电极预处理及组装
通过化学法合成的石墨烯在体积比为3∶1的硝酸/硫酸混合液(硝酸和硫酸浓度分别为22.33mol/L和17.66mol/L)中,70℃超声4个小时,过滤或离心、洗涤重复几次直至溶液的pH为中性后,放入真空干燥箱中干燥。干燥后的氧化态石墨烯分散在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,浓度为2mg/mL,待用。
玻碳电极在麂皮上分别用1.0μm,0.3μm和0.05μm α-氧化铝粉末悬液打磨后,再分别在乙醇和超纯水中超声清洗,氮气吹干后,在电极上滴加6μl的氧化石墨烯溶液,放置在干燥器中待干。
干燥后的石墨烯修饰玻碳电极先在400mmol/L EDC和100mmol/L NHSS的溶液中活化半小时,再浸置在6μg/mL的抗体1溶液中1小时(37℃),通过EDC/NHSS的作用使抗体1(anti-HER2抗体,简写为Ab1)共价连接到修饰电极表面。然后,将该修饰电极于37℃浸置在含有20μL 2%牛血清蛋白和0.05%吐温-20的磷酸缓冲溶液中。1小时后,用含有0.05%吐温-20的磷酸缓冲溶液冲洗3分钟。
然后将此电极浸置在含不同浓度的SKOV-3癌细胞悬浮液中(浓度分别为6、60、600、6000cells/ml)该悬浮液含有2%牛血清蛋白和0.05%吐温-20),1小时后,用含有0.05%吐温-20的磷酸缓冲溶液冲洗3分钟。
待抗体抗原连接好后,将该修饰电极浸置在含有2%牛血清蛋白和0.05%吐温-20的2.25×10-6mol/L的ssDNA-anti-HER2生物结合体磷酸缓冲溶液中,1小时后,用含有0.05%吐温-20的磷酸缓冲溶液冲洗3分钟。通过特异性吸附使ssDNA-anti-HER2生物结合体吸附到SKOV-3的细胞表面。
最后通过杂交反应杂交上互补DNA,该修饰电极的杂交反应是在40℃含有2.25×10-8mol/L目标DNA的磷酸缓冲溶液中进行的,30分钟后,用含有0.05%吐温-20的磷酸缓冲溶液冲洗去除未杂交的目标DNA。
将上述所得的杂交后的三明治型电极浸置于10-5mol/L电化学指示剂(柔红霉素溶液)中,5分钟后拿出,用磷酸缓冲溶液洗净,置入pH为7.3的0.1mol/L磷酸缓冲液,得到电化学传感器。
(3)SKOV-3癌细胞的电化学检测
使用时,将所制备的电化学传感器置入电解液(0.1mol/L磷酸缓冲液)中作为工作电极,Ag/AgCl作为参比电极,铂丝电极作为辅助电极,采用示差脉冲伏安法检测该修饰电极产生的电流。通过杂交反应,互补DNA连接到电极上,同时吸附柔红霉素到电极表面,杂交后的电流值远远大于未经互补DNA杂交的电极所产生的电流信号。
如图1所示,玻碳电极上每修饰一层修饰物后,通过电化学方法测得的循环伏安图均有变化。图1中,(a)裸玻碳电极;(b)石墨烯/裸玻碳电极;(c)抗体1/石墨烯/裸玻碳电极;(d)SKOV-3细胞/抗体1/石墨烯/裸玻碳电极;(e)ssDNA-抗体2/SKOV-3细胞/抗体1/石墨烯/裸玻碳电极。
如图2所示,以前述卵巢癌SKOV-3细胞浓度分别为(a)0cells/mL、(b)6cells/mL、(c)60cells/mL、(d)600cells/mL、(e)6000cells/ml的悬浮液为标准曲线,可检测不同浓度的卵巢癌SKOV-3细胞悬浮液。
用此方法测定SKOV-3癌细胞含量浓度范围在6cells/mL~6000cells/mL,检测限可达到2.9cells/mL。检测结果如图2。
Claims (9)
1.一种检测卵巢癌SKOV-3细胞的电化学传感器的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)制备用石墨烯修饰电极:电极清洗打磨后,在电极表面滴加氧化态的石墨烯溶液,干燥,得到石墨烯修饰的电极;
(2)石墨烯修饰的电极用偶联剂混合溶液活化后,在抗体1溶液中放置20分钟~2小时,使抗体1共价连接到石墨烯修饰的电极表面;所述抗体1为anti-HER2抗体;
再将连接了抗体1的电极在卵巢癌SKOV-3细胞悬浮液中浸0.5~3小时;使抗原卵巢癌SKOV-3细胞与抗体1连接;
(3)通过特异性吸附将探针DNA寡核苷酸-anti-HER2生物结合体吸附到步骤(2)处理后的电极表面;再杂交互补DNA,得到杂交后的修饰电极;
所述探针DNA寡核苷酸-anti-HER2生物结合体的制备包括以下步骤:将anti-HER2的抗体加入到含有探针DNA寡核苷酸和偶联剂的磷酸缓冲液中,反应2~5小时;
(4)将步骤(3)杂交后的修饰电极在电化学指示剂溶液中浸泡2~10分钟后清洗。
2.权利要求1所述检测卵巢癌SKOV-3细胞的电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述氧化态的石墨烯溶液浓度为0.5~4mg/ml;氧化态的石墨烯制备方法为:将石墨烯在硝酸和盐酸的混合液中超声2~6小时,洗涤至中性。
3.权利要求1所述检测卵巢癌SKOV-3细胞的电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述的电极为玻碳电极。
4.权利要求1所述检测卵巢癌SKOV-3细胞的电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述偶联剂混合液为含有200~800mmol/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和80~200mmol/L N-羟基硫代琥珀酰亚的溶液;所述抗体1溶液浓度为2~50μg/mL。
5.权利要求1所述检测卵巢癌SKOV-3细胞的电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述的偶联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐浓度为,N-羟基硫代琥珀酰亚胺浓度为;磷酸缓冲液的pH值为7~7.5。
6.权利要求1所述检测卵巢癌SKOV-3细胞的电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(4)所述的电化学指示剂为柔红霉素,浓度为5×10-6~5×10-5mol/L。
7.一种检测卵巢癌SKOV-3细胞的电化学传感器,其特征在于,通过权利要求1~6任一项所述的方法制备。
8.一种检测卵巢癌SKOV-3细胞的方法,其特征在于,以权利要求5所述的电化学传感器作为工作电极,用电化学方法检测所产生的电流,电解液为pH7~7.5的磷酸缓冲液。
9.权利要求8所述检测卵巢癌SKOV-3细胞的电化学传感器的制备方法,其特征在于,步骤(5)所述的电化学方法为循环伏安法、阻抗法或脉冲伏安法。
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