CN107828642A - 核酸检测用生物传感器识别元件及利用其构建的生物传感器检测核酸的方法 - Google Patents

核酸检测用生物传感器识别元件及利用其构建的生物传感器检测核酸的方法 Download PDF

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Abstract

核酸检测用生物传感器识别元件及利用其构建的生物传感器检测核酸的方法，它涉及一种生物传感器识别元件及一种检测核酸的方法。本发明生物传感器识别元件以高纯碳化硅作为衬底，衬底上具有单分子层石墨烯结构。检测核酸的方法：A1、设计探针；A2、形成DNA双链；A3、探针固定；A4、测定核酸的浓度和突变情况。本发明方法通过对石墨烯表面的功能化处理，将探针分子共价连接在石墨烯表面，无需进行标记就可以实现对DNA的检测；并且，高品质的石墨烯识别元件对核酸的检测的灵敏度较高，制备和操作简单、稳定性好、响应速度快。

Description

核酸检测用生物传感器识别元件及利用其构建的生物传感器 检测核酸的方法
技术领域
本发明涉及一种生物传感器识别元件及一种检测核酸的方法。
背景技术
遗传检测在生物医学和农畜牧生产中具有重要的应用价值，被广泛应用于肿瘤的精准医疗、遗传疾病基因诊断和动物遗传育种中。现有的基因芯片和二代测序遗传检测方法存在价格昂贵、检测周期长、灵敏度低等问题，无法完全满足遗传检测的需求。基于碳纳米材料的核酸生物传感器具有无需标记，检测平台简单等优势，有极大的潜力，未来将成为解决肿瘤精准医疗动态等遗传检测问题的重要手段。
荧光法石墨烯碳纳米材料核酸传感器对microRNA的检出限可以达到2.1fM和3.0fM，但是需要对探针进行荧光标记，限制了这一方法的应用。电化学法是近年来的研究热点，国内外多家课题组利用不同的碳纳米材料构建了电化学核酸传感器，均获得了极低的检出限。其中伊朗科学家以还原氧化石墨烯纳米墙为材料构建的电化学核酸传感器在检测DNA浓度和核酸单碱基多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)时，检出限分别达到了9.4zM和20zM(5和10个DNA分子/mL溶液)。证实碳纳米材料和电化学法在核酸检测中具有灵敏度的优势。
发明内容
本发明要解决现有基因芯片和二代测序遗传检测方法价格昂贵、检测周期长、灵敏度低等问题，而提供的一种核酸检测用生物传感器识别元件及利用其构建的生物传感器检测核酸的方法。
本发明核酸检测用生物传感器识别元件以高纯碳化硅作为衬底，衬底上具有单分子层石墨烯结构。
上述核酸检测用生物传感器识别元件的制备按以下步骤制备：
步骤011、制备高纯SiC源料；
步骤012、制备无微管SiC晶体；
步骤013、切割制备4H晶型SiC衬底；
步骤014、氢气刻蚀去除表面划痕；
步骤015、在氢气刻蚀处理的SiC衬底表面制备单层石墨烯，即获得生物传感器识别元件。
本发明核酸检测用生物传感器识别元件能可以直接换现有生物传感器上的识别元件构建生物传感器。
采用上述核酸检测用生物传感器识别元件构建的生物传感器检测核酸的方法：
步骤A1、根据待检核酸设计探针，探针序列为待检核酸的反向互补DNA序列并在5’端加一个C、A或G碱基，然后对探针序列5’端碱基进行氨基修饰；
步骤A2、将探针核酸和扩增后的待检核酸分别溶解于PBS中，之后取等摩尔数混合，将混合液加热后置于室温缓慢冷却，退火形成DNA双链；
步骤A3、生物传感器识别元件功能化处理、探针固定以及生物传感器识别元件表面的封闭；
步骤A4、控制生物传感器识别元件表面温度，令生物传感器识别元件表面的探针与待检核酸形成双链，或者使形成的核酸双链发生解离，并测定生物传感器在此过程中的电流信号变化；再利用R语言分析获得的数据，并确定待检核酸的浓度和突变情况。
其中，A31、生物传感器识别元件功能化处理：通过重氮反应功能化生物传感器识别元件表面；
A32、将步骤A2形成的DNA双链共价偶联在识别元件表面。
石墨烯(Graphene)是由单层碳原子紧密堆积成二维蜂窝状晶格结构的一种碳质新材料，是构建其它维度碳质新材料(如零维富勒烯、一维碳纳米管、三维石墨)的基本单元。作为一种新型的二维碳纳米材料，石墨烯以其独特而优异的电学、热学、力学等方面的性能，以及其超大表面积和独特的sp2键杂化结构使之成为构建生物传感器的优质候选材料。本发明以碳化硅为衬底，在其上生长石墨烯制成识别元件，并构筑生物传感器；设计合成DNA探针，将其固定于传感器识别元件表面，通过检测程序升降温过程中核酸双链形成与解离所引起的传感器电流变化来确定待检核酸浓度和突变情况，具有灵敏度高、准确高等优点。
本发明方法通过对石墨烯表面的功能化处理，将探针分子共价连接在石墨烯表面，无需进行标记就可以实现对DNA的检测；并且，高品质的石墨烯识别元件对核酸的检测的灵敏度较高，制备和操作简单、稳定性好、响应速度快。
附图说明
图1是具体实施方式三所制备的核酸检测用生物传感器识别元件表面石墨烯的AFM形貌图。
图2是具体实施方式三所制备的核酸检测用生物传感器识别元件表面石墨烯的拉曼衍射图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式核酸检测用生物传感器识别元件以高纯碳化硅作为衬底，衬底上具有单分子层石墨烯结构。
采用本发明制备的核酸检测用生物传感器识别元件构建核酸检测用生物传感器。本发明构建的核酸检测用生物传感器超敏感，检出限为100fM。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点在于：衬底为无微管、4H晶型SiC晶体。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
本实施方式核酸检测用生物传感器识别元件按以下步骤获得：
步骤011、制备高纯SiC源料；
步骤012、制备无微管SiC晶体；
步骤013、切割制备4H晶型SiC衬底；
步骤014、氢气刻蚀去除表面划痕；
步骤015、在氢气刻蚀处理的SiC衬底表面制备单层石墨烯，即获得生物传感器识别元件。
具体实施方式三：本实施方式核酸检测用生物传感器识别元件按以下步骤获得：
步骤011、高纯碳和高纯硅颗粒放入坩埚中1920℃、真空加热合成高纯SiC源料；
步骤012、将高纯SiC源料放入高频感应加热炉中调控生长系统内温场均匀分布，高纯SiC源料在温度为2200℃、精确度为1℃，炉腔内氩气压力为3000Pa、炉体加热功率为5000W，频率为10000Hz条件下晶体生长15个小时，获得SiC晶体；
步骤013、沿SiC晶体c轴切割并化学机械抛光处理，获得4H晶型SiC衬底；
步骤014、SiC衬底氢气刻蚀去除表面划痕；
步骤015、在氢气刻蚀处理的SiC衬底表面制备单层石墨烯。
本实施方式步骤011制备的高纯SiC源料中SiC的纯度高达99.99999％。
本实施方式步骤012生长出的SiC晶体质量高、无微管。
本实施方式步骤013沿SiC晶体c轴切割可将表面磨损降为最低沿晶体c轴切割(可将表面磨损降为最低)，并进行化学机械抛光处理。采用氢刻蚀工艺，去除表面衬底划痕。
本实施方式步骤014氢气刻蚀在SiC衬底表面形成均匀有序、高度约为纳米量级的台阶状结构。
本实施方式步骤015中将氢气刻蚀处理的SiC衬底放于高温反应炉内，在反应温度为1650℃、压力为5mbar、Ar气体流速控制为2L/min条件下加热生长时间为2小时，在SiC衬底表面生成单层石墨烯。石墨烯的表征如图1和图2所示，通过AFM显微镜获得的石墨烯表面形貌(图1)可以看出，本实施方式制得的石墨烯表面平整，缺陷度较少，具有完整的二维结构。石墨烯2D拉曼衍射的峰值在2720cm-1附近，而G峰在1600cm-1附近，G峰和2D峰的位置证明在SiC衬底上有石墨烯的存在，以G峰和2D峰的比值IG/I2D来判断石墨烯的厚度，根据图2计算出IG/I2D的值约为0.24，表明石墨烯为单层。
具体实施方式四：本实施方式核酸检测用生物传感器识别元件构建的生物传感器检测核酸的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
步骤A1、根据待检核酸设计探针(P)，探针序列为待检核酸的反向互补DNA序列并在5’端加一个C、A或G碱基，然后对探针序列5’端碱基进行氨基修饰；
步骤A2、将探针核酸和扩增后的待检核酸(T)分别溶解于PBS中，之后取等摩尔数混合，将混合液加热后置于室温缓慢冷却，退火形成DNA双链；
步骤A3、生物传感器识别元件功能化处理、探针固定以及生物传感器识别元件表面的封闭；
步骤A4、控制生物传感器识别元件表面温度，令生物传感器识别元件表面的探针与待检核酸形成双链，或者使形成的核酸双链发生解离，并测定生物传感器在此过程中的电流信号变化；再利用R语言分析获得的数据，并确定待检核酸的浓度和突变情况。
其中，步骤A31、生物传感器识别元件功能化处理：通过重氮反应功能化生物传感器识别元件表面；
步骤A32、将步骤A2形成的DNA双链共价偶联在识别元件表面。
本实施方式步骤A2形成DNA双链(P|T)能够保护探针内部的氨基在固定过程中与生物传感器识别元件上的石墨稀不发生酰胺化反应。
本实施方式步骤A32通过EDC与NHS反应使探针上的自由氨基与识别元件表面的羧基发生酰胺反应，从而将探针的双链DNA(P|S)共价偶联在生物传感器识别元件表面。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四的不同点在于：步骤A31、将亚硝酸钠和对氨基苯甲酸混合后溶解于盐酸中，然后用反应生成的重氮盐溶液对石墨烯表面进行循环伏安扫描修饰，使重氮盐与识别元件表面的石墨烯形成碳碳共价双键。其它步骤及参数与具体实施方式四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式四或五的不同点在于：步骤A3中用含有自由氨基的分子对生物传感器识别元件表面进行封闭。其它步骤及参数与具体实施方式四或五相同。
本实施方式含有自由氨基的分子与生物传感器识别元件表面的羧基发生反应，从而实现封闭。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六的不同点在于：含有自由氨基的分子为乙醇胺、2-氨基嘧啶或BSA。其它步骤及参数与具体实施方式六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式四至七之一的不同点在于：步骤A31中盐酸的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L，对氨基苯甲酸溶解后浓度为1mmol/L～200mmol/L，亚硝酸钠溶解后浓度为1mmol/L～200mmol/L；以生物传感器识别元件为工作电极、铂电极为对电极、甘汞电极为参照电极，用电化学工作站施加100mV/s的电流从+0.3V至-0.6V进行3个循环的伏安扫描。其它步骤及参数与具体实施方式四至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式四至八之一的不同点在于：步骤A32、将生物传感器识别元件放入由1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺组成的缓冲液A中孵育1个小时，然后用吗啉乙磺酸(MES)缓冲液清洗3次，每次10分钟；再将生物传感器识别元件置于相对湿度为80％的环境中，取2～50μL浓度为0.1μmol/L～20μmol/L、步骤A2形成的DNA双链加在生物传感器识别元件表面，室温孵育2个小时，之后再将生物传感器识别元件放入PBS溶液中清洗3次，每次10分钟；而后将生物传感器识别元件置于50～200μl、浓度为20mmol/L～500mmol/L的乙醇胺、BSA或2-氨基嘧啶溶液中，室温孵育30分钟，封闭识别元件表面未与DNA反应的羧基，再将识别元件用50mmol/L的NaCl溶液清洗3次、10min/次，去除表面残留的乙醇胺、BSA或2-氨基嘧啶溶液；然后将识别元件置于包含1～100mmol/L Tris和1～500mmol/L NaCl的TS溶液中，加热到95℃、并每5分钟更换TS溶液一次、共三次，以去除探针的互补链；冷却至室温，备用。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式四至九之一的不同点在于：步骤A4中测定生物传感器识别元件在空白对照组和待检核酸溶液中的电阻变化；取检测组数据的时间点和电阻值，根据检测组数据的时间值，利用R语言中smooth.spline函数，求出相应时间点空白对照组数据组中的电阻值；根据检测数据，绘制时间电阻百分比变化曲线，用R语言qpcR程序包中的meltcurve函数绘制溶解曲线。其它步骤及参数与具体实施方式四至九之一相同。
本实施方式测定生物传感器识别元件在空白对照组(EC)中的电阻变化：取150μlTris-NaCl溶液加入500μl PCR管中，将生物传感器识别元件置于Tris-NaCl溶液中，实时记录温度(加热至待检核酸变性所需温度)和生物传感器电阻变化。
本实施方式测定生物传感器识别元件在待检核酸溶液(即检测组)中的电阻变化：将待检核酸稀释于TS溶液中，然后取150μl含待检核酸的TS溶液加入500μl PCR管中，将生物传感器识别元件置于含待检核酸的Tris-NaCl溶液中，实时记录温度和生物传感器电阻变化。
用meltcurve函数绘制的溶解曲线以电阻为横坐标、以温度为纵坐标。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式十的不同点在于：步骤A4中计算程序升降温过程中首个25℃温浴时的电阻平均值，计算空白对照组和检测组中所有时间点相对于该平均值的百分数变化；将检测组中所有时间点的电阻变化百分数减去空白对照组中对应时间点的电阻变化百分数，绘制出时间电阻百分比变化曲线。其它步骤及参数与具体实施方式十相同。
本实施方式程序升降温控制程序为25℃温浴10分钟、以0.5℃/秒的速度程序升温到核酸变性温度并温浴10分钟；之后以0.05℃/秒的速度降温至25℃，在25℃保温10分钟。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式十的不同点在于：步骤A4中计算待检样品的溶解曲线面积，根据溶解曲线面积确定样品浓度；根据溶解曲线计算待检核酸的溶解温度，再根据溶解温度的不同确定待检样品中是否含有突变。其它步骤及参数与具体实施方式十相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式十的不同点在于：步骤A4中Tris-NaCl溶液中Tris的浓度为1～100mmol/L。其它步骤及参数与具体实施方式十相同。
实施例1
用本发明方法构建生物传感器，并检测核酸：
一、制备衬底
采用PVT法制备4～6英寸高纯半绝缘SiC晶体，切割制成4H-SiC衬底，尺寸为4英寸，厚度为500μm±25μm，方向为零度偏角，Si面经过化学机械抛光处理，形成均匀有序、高度约为纳米量级的台阶状结构，表面粗糙度小于0.2nm；
二、制备识别元件
将上步骤获得的SiC衬底置于Aixtron/Epigress VP 508热壁式高温反应炉内，在反应温度为1650℃、压力为5mbar、Ar气体流速控制为2L/min条件下加热生长时间为2小时，制备外延石墨烯；
三、设计并合成待检测的DNA探针
待检核酸序列为5'-GAGCAAGAGAATCCCAGGACAGAAA-3'，设计探针(P)序列为5'-CTTTCTGTCCTGGGATTCTCTTGCTC-3'，探针反向互补链(T)序列为5'-GAGCAAGAGAATCCCAGGACAGAAA-3'；并对探针序列5’端碱基进行氨基修饰；
将P和T两种寡核苷酸溶解于PBS中，取等摩尔数混合。将混合液加热到95℃，并在室温下自然冷却，使其形成DNA双链(P|T)；
四、生物传感器识别元件功能化处理、探针固定以及生物传感器识别元件表面的封闭；
a)将亚硝酸钠和对氨基苯甲酸溶解于盐酸中，盐酸的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L，对氨基苯甲酸溶解后浓度为1mmol/L～200mmol/L，亚硝酸钠溶解后浓度为1mmol/L～200mmol/L；以生物传感器识别元件为工作电极，铂电极为对电极，甘汞电极为参比电极，利用电化学工作站施加100mV/s的+0.3至-0.6V循环伏安扫描，使重氮盐与识别元件表面石墨烯形成碳碳双键的共价连接；用超纯水清洗传感器识别元件，去除表面残余的溶液；
b)配制浓度为10～1000mmol/L的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和2～200mmol/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的吗啉乙磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid,MES)缓冲液(pH3.0～8.0)。将传感器识别元件置于缓冲液中孵育1小时，将传感器识别元件在50～500μl的MES缓冲液中清洗3次，每次10分钟。清洗完成后将传感器识别元件置于潮湿的小室中，取2～50μl 0.1～20μM的P|S DNA加在传感器识别元件表面，室温孵育2个小时。孵育完成后将传感器识别元件在300μl的PBS溶液中清洗3次，每次10分钟。
c)配制20～500mM的2-氨基嘧啶溶液，将传感器识别元件置于2-氨基嘧啶溶液中，室温孵育30分钟，封闭传感器表面未与DNA反应的羧基。将传感器识别元件用50mM NaCl溶液清洗3遍，10min/次，去除表面残留的2-氨基嘧啶溶液。
d)将传感器识别元件置于包含1～100mM Tris和1～500mM NaCl的溶液(TS)中，加热到95℃，每5分钟更换TS一次，共三次，以去除探针的互补链；冷却至室温后，待用。
五、程序控制传感器识别元件表面的温度，从而使传感器识别元件表面的探针与待检核酸形成双链或使形成的双链发生解离，测定传感器识别元件在这一过程中电流信号的变化
a)测定传感器识别元件在空白对照组(EC)中的电流变化。取150μl TS溶液加入500μl PCR管中，将传感器识别元件置于其中。将传感器识别元件连接在吉时利2700系列数据采集系统(Keithley 2700Multimeter/Data Acquisition System)上。用PCR仪将TS溶液和传感器识别元件按程序控温：25℃温浴10分钟；以0.5℃/秒的速度程序升温到95℃；在95℃温浴10分钟；以0.05℃/秒的速度降温至25℃；在25℃保温10分钟。实时记录温度和传感器电阻变化。
b)测定传感器识别元件在待检核酸溶液中的电阻变化。将待检核酸稀释于TS溶液中，取150μl。按上述步骤中程序控温并实时记录温度和传感器电阻变化，为实验组数据。
六、利用R语言分析数据，并确定待检核酸的浓度和突变情况
a)取实验组数据的时间点和电阻值，根据实验组数据的时间值，利用R语言中smooth.spline函数，求出相应时间点中EC数据组中的电阻值。计算程序升降温过中首个25℃温浴时的电阻值平均值，计算EC和实验组中所有时间点相对于该平均值的百分数变化。
b)将实验数据组中每个时间点的百分数变化减去EC数据组中相应时间点的百分比变化。绘制时间、温度、电阻百分比变化曲线。
c)用R语言qpcR程序包中的meltcurve函数绘制溶解曲线。具体的讲，该函数将计算电阻和温度的一阶导数值(dR和dT)，并以dT为横坐标，dR为纵坐标绘制溶解曲线。
d)计算待检样品的溶解曲线面积。根据溶解曲线面积确定样品浓度。根据溶解曲线计算待检核酸的溶解温度，根据溶解温度的不同确定样品中是否含有突变。
本实施例中分成3个实验组，第1实验组中待检核酸序列为5'-GAGCAAGAGAATCCCAGGACAGAAA-3'，不含突变序列，浓度为100nM。第2实验组中待检核酸序列与第1实验组相同，不含突变序列，浓度为1μM。第3实验组中待检核酸中包含突变序列，序列中仅有一处碱基与第1实验组不同，突变核酸序列为5'-GAGCAAGAGAATCCCAGGACAGGAA-3'，核酸总浓度为100nM，其中含突变序列含量为5％。经过本实施例检测，结果是第1实验组不含突变序列，浓度为100nM；第2实验组不含突变序列，浓度为1μM；第3实验组溶解曲线与第1和第2实验组不同，测定序列中含突变序列，浓度为100nM。本实施例实验结果均与实验样品吻合，说明本发明检测准确性高、稳定可靠。

Claims (10)

1.核酸检测用生物传感器识别元件，其特征在于该生物传感器识别元件以高纯碳化硅作为衬底，衬底上具有单分子层石墨烯结构。
2.根据权利要求1所述的核酸检测用生物传感器识别元件，其特征在于衬底为无微管、4H晶型SiC晶体。
3.权利要求1所述核酸检测用生物传感器识别元件的制备方法，其特征在于按以下步骤获得：
步骤011、制备高纯SiC源料；
步骤012、制备无微管SiC晶体；
步骤013、切割制备4H晶型SiC衬底；
步骤014、氢气刻蚀去除表面划痕；
步骤015、在氢气刻蚀处理的SiC衬底表面制备单层石墨烯，即获得生物传感器识别元件。
4.采用权利要求1所述核酸检测用生物传感器识别元件构建的生物传感器检测核酸的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
步骤A1、根据待检核酸设计探针，探针序列为待检核酸的反向互补DNA序列并在5’端加一个C、A或G碱基，然后对探针序列5’端碱基进行氨基修饰；
步骤A2、将探针核酸和扩增后的待检核酸分别溶解于PBS中，之后取等摩尔数混合，将混合液加热后置于室温缓慢冷却，退火形成DNA双链；
步骤A3、生物传感器识别元件功能化处理、探针固定以及生物传感器识别元件表面的封闭；
步骤A4、控制生物传感器识别元件表面温度，令生物传感器识别元件表面的探针与待检核酸形成双链，或者使形成的核酸双链发生解离，并测定生物传感器在此过程中的电流信号变化；再利用R语言分析获得的数据，并确定待检核酸的浓度和突变情况。
其中，步骤A31、生物传感器识别元件功能化处理：通过重氮反应功能化生物传感器识别元件表面；
步骤A32、将步骤A2形成的DNA双链共价偶联在识别元件表面。
5.根据权利要求4所述的核酸检测用生物传感器识别元件构建的生物传感器检测核酸的方法，其特征在于步骤A31、将亚硝酸钠和对氨基苯甲酸混合后溶解于盐酸中，然后用反应生成的重氮盐溶液对石墨烯表面进行循环伏安扫描修饰，使重氮盐与识别元件表面的石墨烯形成碳碳共价双键。
6.根据权利要求4所述的核酸检测用生物传感器识别元件构建的生物传感器检测核酸的方法，其特征在于步骤A3中用含有自由氨基的分子对生物传感器识别元件表面进行封闭。
7.根据权利要求5所述的核酸检测用生物传感器识别元件构建的生物传感器检测核酸的方法，其特征在于步骤A31中盐酸的浓度为0.1mol/L～0.5mol/L，对氨基苯甲酸溶解后浓度为1mmol/L～200mmol/L，亚硝酸钠溶解后浓度为1mmol/L～200mmol/L；以生物传感器识别元件为工作电极、铂电极为对电极、甘汞电极为参照电极，用电化学工作站施加100mV/s的电流从+0.3V至-0.6V进行3个循环的伏安扫描。
8.根据权利要求4所述的核酸检测用生物传感器识别元件构建的生物传感器检测核酸的方法，其特征在于步骤A32、将生物传感器识别元件放入由1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺组成的缓冲液A中孵育1个小时，然后用吗啉乙磺酸(MES)缓冲液清洗3次，每次10分钟；再将生物传感器识别元件置于相对湿度为80％的环境中，取2～50μL浓度为0.1μmol/L～20μmol/L、步骤A2形成的DNA双链加在生物传感器识别元件表面，室温孵育2个小时，之后再将生物传感器识别元件放入PBS溶液中清洗3次，每次10分钟；而后将生物传感器识别元件置于50～200μl、浓度为20mmol/L～500mmol/L的乙醇胺、BSA或2-氨基嘧啶溶液中，室温孵育30分钟，封闭识别元件表面未与DNA反应的羧基，再将识别元件用50mmol/L的NaCl溶液清洗3次、10min/次，去除表面残留的乙醇胺、BSA或2-氨基嘧啶溶液；然后将识别元件置于包含1～100mmol/L Tris和1～500mmol/L NaCl的TS溶液中，加热到95℃、并每5分钟更换TS溶液一次、共三次，以去除探针的互补链；冷却至室温。
9.根据权利要求4所述的核酸检测用生物传感器识别元件构建的生物传感器检测核酸的方法，其特征在于步骤A4中测定生物传感器识别元件在空白对照组和待检核酸溶液中的电阻变化；取检测组数据的时间点和电阻值，根据检测组数据的时间值，利用R语言中smooth.spline函数，求出相应时间点空白对照组数据组中的电阻值；根据检测数据，绘制时间电阻百分比变化曲线，用R语言qpcR程序包中的meltcurve函数绘制溶解曲线。
10.根据权利要求9所述的核酸检测用生物传感器识别元件构建的生物传感器检测核酸的方法，其特征在于步骤A4中计算待检样品的溶解曲线面积，根据溶解曲线面积确定样品浓度；根据溶解曲线计算待检核酸的溶解温度，再根据溶解温度的不同确定待检样品中是否含有突变。
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