CN106596662A - 一种温度可控的电化学dna生物传感器及其制备方法 - Google Patents

一种温度可控的电化学dna生物传感器及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种温度可控的电化学DNA生物传感器及其制备方法。将与一段目标DNA序列互补的巯基化的单链DNA固定在金丝热电极表面作为捕获探针，与目标DNA互补以后，形成带有3’平端的双链结构，诱导外切酶III从双链结构的3’平端由3’端向5’端对捕获探针消解，目标DNA被释放，并与其他捕获探针进行新的杂交切酶循环，最终电极表面捕获探针数量明显减少。酶切循环过程前后电极表面捕获探针对检测液中三氯化六氨合钌的电化学吸附信号的减少程度与DNA浓度对数成线性关系，即可实现对目标DNA的检测。本发明提供的检测方法对目标DNA的检测具有检测时间短，灵敏度高，检测线低，选择性好的特点。

Description

一种温度可控的电化学DNA生物传感器及其制备方法
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种温度可控的电化学DNA生物传感器及其制备方法，应用于核酸检测领域。
背景技术
快速、准确、灵敏地对特异DNA序列的检测在基因相关疾病的预防诊断、环境监测、食品监控等领域具有十分重要的意义。通常,实际生化分析样品中仅存在痕量靶物质,因此高灵敏度和高准确性一直是分析检测方法的改进目标。针对这一需求,除了直接发展高灵敏的方法外,放大检测法能降低分析方法或传感器的设计难度以及对专业大型仪器的依赖。
根据信号放大手段的不同可分为纳米颗粒信号放大、酶或核酶信号放大及杂交链式反应信号放大等。其中,一种简单、快速的基于外切酶Ⅲ的信号放大方法被广泛运用于DNA 及生物分子的高灵敏检测。作为一种核酸工具酶，外切酶Ⅲ作用于双链核酸分子，并沿3’到5’方向逐步切去单个核苷酸。该酶对单链核酸分子及含有3’突出端的双链核酸分子没有切割活性。另从核酸酶辅助的信号放大策略的通用性来讲,没有序列依赖性的外切酶在探针设计和靶标分析方面更加简便易行,因而显示了更广的应用前景。
外切酶Ⅲ是一种对温度变化十分敏感的生物大分子，温度低于最适温度时酶的活性较差，但过高的温度极易使酶分子结构发生不可逆转的变性导致酶失活。以往报道的电流型生物传感器，大多控制实验体系的整体温度变化，所需装置复杂，操作不易。本发明在热电极表面构建生物传感器，只改变电极表面温度使酶处于最适条件而不对溶液进行整体加热，又增强了溶液对流，提高了传质速率，可缩短传感器到达稳态电流的时间，并增大电极响应信号。
发明内容
本发明的目的在于提供一种温度可控的电化学DNA生物传感器及其制备方法。本发明的传感器结构简单、制备工艺简单、检测时间短、灵敏度高、选择性好，为医学诊断等领域中特异性DNA提供了一种快速、低成本的检测方法。
为了实现本发明目的，本发明利用目标DNA与修饰在金丝热电极上的捕获探针特异性结合，再利用外切酶的切割作用释放目标DNA，实现对目标DNA进行分析检测。电化学DNA生物传感器制备方法具体包括以下步骤：
（1）设计一条捕获探针DNA链CP，所述DNA链CP与目标DNA链TP互补配对，并可以形成带有3’平端的双链结构，诱导外切酶III从双链结构的3’平端由3’端向5’端对捕获探针消解，从而释放目标DNA；CP链的5’端巯基化，使得CP通过金－硫键修饰到金丝热电极表面；其中，捕获探针DNA链CP的DNA序列为：5’-SH-(CH2)6-TTTTC TGTGC GCCGG TCTCT CCCA-3’，目标DNA链TP的DNA序列为：5’-TGGGA GAGAC CGGCG CACAG AGGAA G-3’；
（2）将金丝热电极打磨抛光成镜面，经二次蒸馏水超声清洗，干燥，得处理后的金丝热电极；
（3）将含有巯基化捕获探针DNA链CP的缓冲溶液滴加在步骤（2）中处理好的金丝热电极上，再用巯基己醇对电极表面残余位点进行封闭，得到巯基化捕获探针修饰的金丝热电极；
（4）将步骤（3）中得到的电极浸泡在含有不同浓度目标DNA链TP和外切酶缓冲液中进行杂交酶切循环，反应结束后得到电化学DNA生物传感器。
步骤（2）中，打磨采用在麂皮上用氧化铝粉末打磨；超声清洗的时间为40～60s，干燥为氮气吹干。
步骤（3）中，所述缓冲液为含有10～20mM Tris-HCl，90～110mM NaCl,9～11mM 三（2-羧乙基）膦的混合液，其pH为7.2～7.6。
步骤（3）中，CP的浓度为1～2μM；修饰温度为20～25℃；修饰时间为1.5～2.5h。
步骤（3）中，巯基己醇浓度为0.1～4mM，电极浸入时间为1h。
步骤（4）中，所述缓冲液为含有10～20mM Tris-HCl，400～600mM NaCl，9～11mMMgCl2的混合液，其pH为7.2～7.6。
步骤（4）中，外切酶浓度为1～5μ/μL，杂交酶切循环反应温度0～40℃，反应时间为0.25～2h。
步骤（4）中，通过外加直流电流调控金丝热电极温度，来控制杂交酶切循环反应过程温度。
本发明还提供了一种上述传感器在检测目标DNA中的应用，检测步骤如下：
（1）将巯基化捕获探针修饰的金丝热电极在三氯化六氨合钌检测液中浸泡，然后与银氯化银参与电极和铂丝对比电极构成三电极系统，进行SWV检测，得到钌的峰电流I0(RuHex)；
（2）将最终得到的电化学生物传感器用SWV在三氯化六氨合钌检测液中检测，将得到的钌的峰电流与得到的I0(RuHex)做差取绝对值得：|ΔIRuHex|=|IRuHex-I0(RuHex)|；以|ΔIRuHex|对TP浓度对数做线性回归方程，得工作曲线；
步骤（1）中，三氯化六氨合钌检测液pH为7.4的含有10mM Tris-HCl，5mM RuHex的混合液；所述浸泡时间为5～6分钟。
本发明相对于现有技术具有如下有益效果：
（1）本发明通过采用一段与目标DNA互补的巯基化DNA作为捕获探针，提高了DNA电化学生物传感器的选择性及其在复杂临床样品中的实用性；
（2）本发明将外切酶目标循环信号放大技术应用到目标DNA的检测中来，在实现高灵敏地对目标DNA进行检测（检测线达到26aM）的同时还具有操作简便，低成本，检测快速等优点。
（3）本发明在金丝热电极表面构建生物传感器，只改变电极表面温度使外切酶处于最适条件而不对溶液进行整体加热，增强了溶液对流，提高了传质速率，增强了外切酶活性，促进了酶切反应的进行，并增大电极响应信号，提高检测灵敏度。
附图说明
图1为本发明电化学DNA生物传感器的制备过程示意图。
图2为温度对捕获探针CP修饰的金丝热电极的稳定性影响图。
图3为实验优化条件图，杂交酶切循环过程电极温度。
图4为本发明电化学DNA生物传感器对不同浓度的目标DNA的电化学响应。
图5为本发明电化学DNA生物传感器对不同DNA的电化学响应。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。
实施例1
一种温度可控的基于外切酶目标循环信号放大的电化学DNA生物传感器的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
（1）设计一条捕获探针DNA链CP，所述DNA链CP与目标DNA链TP互补配对，并可以形成带有3’平端的双链结构，诱导外切酶III从双链结构的3’平端由3’端向5’端对捕获探针消解，从而释放目标DNA；CP链的5’端巯基化，使得CP通过金－硫键修饰到金丝热电极表面；其中，捕获探针CP的DNA序列为：5’-SH-(CH2)6 -TTTTC TGTGC GCCGG TCTCT CCCA-3’，目标DNA链TP的DNA序列为：5’-TGGGA GAGAC CGGCG CACAG AGGAAG-3’；
（2）金丝热电极在麂皮上用0.05mm Al2O3打磨成镜面，用二次蒸馏水超声清洗40～60s；之后再0.5M硫酸溶液中循环伏安，扫速0.1V/s至稳定后二次水冲洗干净，氮气吹干；
（3）将浓度为1mM的在捕获探针CP在pH为7.4的含有10mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mM三（2-羧乙基）膦的缓冲液中处理2小时打开二硫键；后将3mL其溶液滴加在步骤（2）中处理好的金丝热电极上，在25℃下修饰时间2h；再用浓度为2mM巯基己醇对电极表面残余位点进行封闭，封闭时间为1h，得到巯基化捕获探针CP修饰的金丝热电极；
（4）将一定浓度目标DNA链TP和2μ/μl外切酶混合在pH为7.4的含有10mM Tris-HCl、100mM NaCl、10mM MgCl2的缓冲液中，将步骤（3）中得到的电极浸泡在此缓冲液中进行杂交酶切循环，在25℃下反应0.5h，反应温度是通过外加直流电流调控金丝热电极温度来控制，反应结束后得到电化学DNA生物传感器。
实施例2
为温度对捕获探针CP修饰的金丝热电极的稳定性影响考察，如图2所示，具体步骤如下：
（1）将实施例1步骤（3）中得到的巯基化捕获探针修饰的金丝热电极在pH为7.4的含有10mM Tris-HCl、5mM三氯化六氨合钌的检测液中浸泡，然后与银氯化银参与电极和铂丝对比电极构成三电极系统，进行SWV检测，得到钌的初始SWV曲线；
（2）将进行过初始检测的巯基化捕获探针修饰的金丝热电极在温度分别为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，pH为7.4的含有10mM Tris-HCl缓冲液中浸泡1h，浸泡结束后用SWV在三氯化六氨合钌检测液中检测，将得到的钌的最终峰电流。如图2所示，比较浸泡前后SWV曲线，可以看出当浸泡温度超过40℃后，巯基化捕获探针修饰的金丝热电极稳定性下降，说明本发明可研究的温度范围在40℃以下。
实施例3
为优化实验温度。
只改变实施例1步骤（4）中的反应温度从0～40℃，依次分别进行实验，其他反应条件同时实施例1；将实施例1步骤（3）中得到的巯基化捕获探针CP修饰的金丝热电极在三氯化六氨合钌检测液中进行SWV检测，得到钌的峰电流I0(RuHex)；将实施例1步骤（4）中最终得到的电化学生物传感器用SWV在三氯化六氨合钌检测液中检测，将得到的钌的峰电流与得到的I0(RuHex)做差取绝对值得：|ΔIRuHex|=|IRuHex-I0(RuHex)|；以|ΔIRuHex|对温度作图，如图3所示，可以看出随温度升高|ΔIRuHex|变大，说明温度升高可以增加ExoIII的活性，促使酶切反应更快的进行。
实施例4
为本发明电化学DNA生物传感器对不同浓度的目标DNA的电化学响应特性。
采用本发明所述的电化学DNA生物传感器，以巯基化的单链DNA（序列：5’-SH-(CH2)6 -TTTTC TGTGC GCCGG TCTCT CCCA-3’）作为捕获探针，以完全互补的DNA片段（序列：5’-TGGGA GAGAC CGGCG CACAG AGGAA G-3’）作为目标DNA。所有操作步骤均如同上述实施例1，其中，通过改变目标DNA的浓度（0、100aM、1fM、10fM、100fM、1 pM、10 pM、100 pM、1 nM、10 nM），检测本发明电化学DNA生物传感器的电化学响应特性。
其检测过程为：将实施例1步骤（3）中得到的巯基化捕获探针CP修饰的金丝热电极在三氯化六氨合钌检测液进行SWV检测，得到钌的峰电流I0(RuHex)；将实施例1步骤（4）中最终得到的电化学生物传感器用SWV在三氯化六氨合钌检测液中检测，将得到的钌的峰电流与得到的I0(RuHex)做差取绝对值得：|ΔIRuHex|=|IRuHex-I0(RuHex)|；以|ΔIRuHex|对TP浓度对数做线性回归方程，得工作曲线。
其检测结果如图4所示，在杂交酶切循环过程在25℃下进行时，|ΔIRuHex|与目标TP浓度在10fM～10 nM呈线性，检测限为2.7fM；当在杂交酶切循环过程在40℃下进行时，|ΔIRuHex|与目标TP浓度在100aM～10 nM范围内呈线性关系，检测限为26aM，相比于25℃时，其检测限降低了2个数量级，表明升高温度，酶切活性性增强，实现了对目标DNA高灵敏的检测。
实施例5
为本发明电化学DNA生物传感器对不同DNA的电化学响应。
采用本发明所述方法，以巯基化的单链DNA（序列：5’-SH-(CH2)6 -TTTTC TGTGCGCCGG TCTCT CCCA-3’）作为捕获探针，与相同浓度的目标DNA（序列：5’-TGGGA GAGACCGGCG CACAG AGGAA G-3’）、单碱基错配DNA（序列：5’-AGGGA GAGAC CGGCG CACAG AGGAAG-3’）、三碱基错配DNA（序列：5’-ACCGA GAGAC CGGCG CACAG AGGAA G-3’）和对照DNA（序列：5’-ACCCT CAGAC CGGCG CACAG AGGAA G-3’）进行杂交反应。所有操作步骤均如同上述实施例1，其中，所有DNA序列浓度均为10nM,检测本发明电化学DNA生物传感器对不同DNA的电化学响应。其检测结果如图5所示，从图中可以看出，本发明电化学DNA生物传感器对于不同序列DNA具有不同强度的电化学响应，因而具有很好选择，可用于单核苷酸多态性分析。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种温度可控的电化学DNA生物传感器及其制备方法
<130> 5
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttttctgtgc gccggtctct ccca 24
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgggagagac cggcgcacag aggaag 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
agggagagac cggcgcacag aggaag 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
accgagagac cggcgcacag aggaag 26
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
accctcagac cggcgcacag aggaag 26

Claims (10)

1.一种温度可控的电化学DNA生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）设计一条捕获探针DNA链CP，所述DNA链CP与目标DNA链TP互补配对；CP链的5’端巯基化；捕获探针DNA链CP的DNA序列为：5’-SH-(CH2)6–TTTTC TGTGC GCCGG TCTCT CCCA-3’，目标DNA链TP的序列为：5’-TGGGA GAGAC CGGCG CACAG AGGAA G-3’；
（2）将金丝热电极打磨抛光成镜面，经二次蒸馏水超声清洗，干燥，得处理后的金丝热电极；
（3）将含有巯基化捕获探针DNA链CP的缓冲溶液滴加在步骤（2）中处理好的金丝热电极上，再用巯基己醇对电极表面残余位点进行封闭，得到巯基化捕获探针CP修饰的金丝热电极；
（4）步骤（3）中得到的电极浸泡在含有不同浓度目标DNA链TP和核酸外切酶Ⅲ缓冲液中进行杂交酶切循环，反应结束后得到电化学DNA生物传感器。
2.根据权利要求1所述的一种温度可控的电化学DNA生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，打磨采用在麂皮上用氧化铝粉末打磨；超声清洗的时间为20～60s，干燥为氮气吹干。
3.根据权利要求1所述的一种温度可控的电化学DNA生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述缓冲液为含有10～20mM Tris-HCl，90～110mM NaCl,9～11mM 三（2-羧乙基）膦的混合液，其pH为7.2～7.6。
4.根据权利要求1所述的一种温度可控的电化学DNA生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，CP的浓度为1～2μM；修饰温度为20～25℃；修饰时间为1.5～2.5h；巯基己醇浓度为0.1～4mM。
5.根据权利要求1所述的一种温度可控的电化学DNA生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述缓冲液为含有10～20mM Tris-HCl，400～600mM NaCl,9～11mM MgCl2的混合液，其pH为7.2～7.6。
6.如权利要求1所述的一种温度可控的基于外切酶Ⅲ目标循环信号放大的电化学DNA生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，核酸外切酶Ⅲ浓度为1～5μ/μL，杂交酶切循环反应温度为0～40℃，反应时间为0.25～2h。
7.根据权利要求1所述的一种温度可控的电化学DNA生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，通过外加直流电流调控金丝热电极温度，来控制杂交酶切循环反应过程温度。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法制备获得的一种温度可控的基于外切酶Ⅲ目标循环信号放大的电化学DNA生物传感器。
9.如权利要求8所述的电化学生物传感器在检测目标DNA中的应用。
10.根据权利要求9所述的电化学生物传感器在检测目标DNA中的应用，其特征在于，检测步骤如下：
（1）将得到的巯基化捕获探针修饰的金丝热电极在三氯化六氨合钌检测液中浸泡，然后与银氯化银参与电极和铂丝对比电极构成三电极系统，进行SWV检测，得到钌的峰电流I0(RuHex)；三氯化六氨合钌检测液pH为7.4的含有10mM Tris-HCl，5μM RuHex的混合液；所述浸泡时间为5～6分钟；
（2）将所述的电化学生物传感器用SWV在三氯化六氨合钌检测液中检测，将得到的钌的峰电流与步骤（2）得到的I0(RuHex)做差取绝对值得：|ΔIRuHex|=|IRuHex-I0(RuHex)|；以|ΔIRuHex|对TP浓度对数做线性回归方程，得工作曲线。
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