CN108051492B - 一种基于可控自组装镊子结构电化学检测单链目标dna的方法 - Google Patents

一种基于可控自组装镊子结构电化学检测单链目标dna的方法 Download PDF

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Abstract

一种基于可控自组装镊子结构电化学检测单链目标DNA的方法，属于分析化学、医药分析技术领域。本发明设计了三个特殊的核酸序列（A1/A2/A3）和一个发卡结构。其中A1的5’端和A2的3’端分别修饰有巯基，A1及A2的部分序列分别与A3中间的序列通过碱基互补配对可以形成一个打开状态的镊子结构。在有血红素存在时，G‑四链体与血红素结合形成具有很强电化学信号的复合物。通过差分脉冲伏安法（DPV）扫描得到的电化学信号与电极表面的G‑四链体‑血红素复合物、以及体系中加入的目标DNA浓度存在对应关系，从而实现对目标DNA的检测。利用该方法成功实现了在血清样品中对K‑ras基因片段的检测，取得了理想的效果。本发明方法具有灵敏度高、特异性强的优点。

Description

一种基于可控自组装镊子结构电化学检测单链目标DNA的 方法
技术领域
本发明涉及一种基于可控自组装镊子结构电化学检测单链目标DNA的方法，属于分析化学、医药分析技术领域。
背景技术
对特定的基因序列进行检测在临床诊断、疾病的预防和治疗等方面有十分重要的意义。传统的DNA检测方法存在一定的缺点，如操作繁琐、可能导致放射性污染、需要昂贵的检测仪器、灵敏度不高等。电化学DNA生物传感器检测技术与传统的基因检测技术相比，具有操作简单、响应速度快、灵敏度高、环境友好、可便携化高、不污染破坏检测样品等优势，因而使得电化学DNA生物传感器逐渐成为DNA序列检测方面的有效手段。
研制电化学DNA生物传感器，开发出灵敏度高、特异性强、检测限低的特定基因序列的检测方法在医学检测、食品工业、环境监测等诸多领域具有重要意义和广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处，将生物传感技术与DNA自组装结构及信号放大技术相结合，用G-四链体-血红素复合物进行信号放大，建立一种灵敏度高、特异性强的基于可控自组装镊子结构电化学检测单链目标DNA的方法。
本发明的技术方案，一种基于可控自组装镊子结构电化学检测单链目标DNA的方法，步骤如下：将镊子结构固定到金电极上；将不同浓度的目标DNA、发卡结构和固定在电极表面的镊子结构混合杂交反应，此时，目标DNA的一部分和发卡结构发生杂交反应形成双链，在核酸外切酶Ⅲ的帮助下切掉结合的序列，剩下的单链可以与打开状态的镊子结构中A1和A2的另一部分序列互补结合从而拉近A3的两端序列形成闭合状态的镊子，并形成G-四链体结构；在血红素存在时形成G-四链体-血红素复合物，采用差分脉冲伏安法DPV检测响应电流值；
所述发卡结构由两部分组成：5’端序列能和镊子结构中A1和A2的部分序列互补，3’端能与目标DNA序列互补。
一种基于可控自组装镊子结构电化学检测单链目标DNA的方法，具体步骤如下：
（1）金电极的预处理：将金电极在氧化铝粉末上打磨；后依次在超纯水、乙醇、超纯水中超声清洗2-3 min；清洗结束后将金电极插入到0.5M H2SO4溶液中循环伏安法扫描活化，扫描范围从-0.4 V至+1.5 V，扫描速度100mV/s，直到获得稳定的循环伏安曲线为止；将金电极用超纯水冲洗并用氮气吹干；
（2）镊子结构的固定：将合成好的A1、A2、A3序列用10mM PBS缓冲液溶解，-20℃冰箱中保藏；将三条序列用PBS缓冲液稀释；将体系为100μL、浓度各为0.8μM的三条序列的溶液放在95℃恒温金属浴中加热5min，然后室温下反应2h；之后倒扣到金电极上，反应6h，使镊子结构在金电极表面上形成自组装单分子层；用2mM巯基己醇封闭电极4h；用清洗缓冲液淋洗电极，氮气吹干待用；
10mM PBS缓冲液中含有1mM Mg2+、1M NaCl，其pH为7.4；
（3）镊子结构、目标DNA以及发卡结构之间的杂交反应：将修饰有镊子结构的电极浸没到100μL的反应体系中，室温反应2h；
所述反应体系为：0.6μM发卡结构、不同浓度的目标DNA、60U的核酸外切酶III，及10mM PBS缓冲液；
（4）G-四链体-血红素复合物的形成：将200μL的G-四链体形成液倒扣在如步骤（3）所述反应后的电极上，室温下30min；向G-四链体形成液中加入2μL 20 mM血红素混匀；将反应液继续倒扣到电极上，室温下1h；用清洗缓冲液冲洗电极，用于电化学检测；
G-四链体形成液为：10 mmol•L-1 HEPES, 50 mmol•L-1 KCl, pH8.0
（5）电化学检测：采用三电极系统，上述金电极作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极；检测所用电解液为含20mM KCl的pH 7.4、20 mM HEPES缓冲液；先通入氮气至少30 min；
检测方法为差分脉冲伏安法DPV，扫描范围-0.6～-0.15 V，振幅50 mV；取不同浓度的目标DNA，以步骤（1）-（5）同样操作后对其进行检测，绘制峰电流和目标DNA浓度的关系曲线。
以K-ras基因片段作为目标DNA，其序列为：
5’- TCGTCAAGGC ACTCTTGCCT ACGCCACCAG CTCCAACTAC CACAAG -3’ ；
设计发卡结构序列为：
5’- TCACTCCTTC TAGCTACGTC AAGGCACTCT TGCCTACGCC ACCAGCTCCA ACTTGTGGTAGTTGGAGCTG GTGGCGTAGG CAAGAGTGCC TTGACGA -3’；
设计A1序列为：
5’-HS-CCGACCGCAG GATCCTATAA CTTGACGTAG CTAGAAGGAG-3’；
设计A2序列为：
5’-GCTGGTGGCG TAGGCAAGAT ACATTTTACG CCTGGTGCC-SH -3’；
设计A3序列为：
5’-GGGTTGGGTT TTTATAGGAT CCTGCGGTCG GAGGCACCAG GCGTAAAATG TATTTGGGTAGGG -3’。
本发明的有益效果：本发明构建了一种灵敏度高、特异性强的电化学DNA生物传感器，实现了对特定单链目标DNA的高灵敏检测；将电化学检测跟信号放大技术联合起来，提高检测灵敏度。
附图说明
图1 基于G-四链体-血红素复合物的电化学检测特定单链DNA原理图。
图2不同浓度的目标DNA存在下的DPV曲线图。
图3 DPV峰电流值与目标DNA浓度关系标准曲线图。
图4 目标DNA和不同碱基错配DNA存在时峰电流变化直方图。
图5不同浓度的目标DNA在实际样品检测中的DPV曲线图。
图6在实际样品检测中DPV峰电流值与目标DNA浓度关系标准曲线图。
具体实施方式
以下实施例中的核酸外切酶Ⅲ购自宝生物工程（大连）有限公司。
实施例1 用基于可控自组装镊子结构电化学检测K-ras基因片段
K-ras原癌基因可以作为分子开关来调节细胞生长，K-ras基因第12密码子突变会扰乱细胞生长并导致癌症，如胰腺癌的恶性肿瘤。统计表明，癌症患者体内K-ras基因发生病变的概率在80%-100%之间。因此，它可以作为胰腺癌早期诊断的生物标志物。
以K-ras基因片段作为目标DNA，检测步骤同上所述。
目标DNA序列为：5’- TCGTCAAGGC ACTCTTGCCT ACGCCACCAG CTCCAACTAC CACAAG-3’。
设计镊子结构序列为：
A1序列为：
5’- HS-CCGACCGCAG GATCCTATAA CTTGACGTAG CTAGAAGGAG-3’；
A2序列为：
5’- GCTGGTGGCG TAGGCAAGAT ACATTTTACG CCTGGTGCC-SH -3’；
A3序列为：
5’- GGGTTGGGTT TTTATAGGAT CCTGCGGTCG GAGGCACCAG GCGTAAAATG TATTTGGGTAGGG -3’；
A1序列的5’端修饰的巯基和A2序列的3’端的巯基用以自组装至金电极表面上。
设计发卡结构序列为：
5’- TCACTCCTTC TAGCTACGTC AAGGCACTCT TGCCTACGCC ACCAGCTCCA ACTTGTGGTAGTTGGAGCTG GTGGCGTAGG CAAGAGTGCC TTGACGA -3’；
（1）金电极的预处理：将金电极在氧化铝粉末上打磨；后依次在超纯水、乙醇、超纯水中超声清洗2-3 min；清洗结束后将金电极插入到0.5 M H2SO4溶液中循环伏安法扫描活化，扫描范围从-0.4 V至+1.5 V，扫描速度100 mV/s，直到获得稳定的循环伏安曲线为止；将电极用超纯水冲洗并用氮气吹干；
（2）镊子结构的固定：将合成好的A1、A2、A3序列用10 mM PBS缓冲液溶解，-20℃冰箱中保藏；将三条序列用PBS缓冲液稀释；将体系为100 μL、浓度各为0.8 μM的三条序列的溶液放在95℃恒温金属浴中加热5 min，然后室温下反应2 h。之后倒扣到金电极上，反应6h，使镊子结构在金电极表面上形成自组装单分子层；用2 mM 巯基己醇封闭电极4 h；用清洗缓冲液淋洗电极，氮气吹干待用；
10 mM PBS缓冲液中含有1 mM Mg2+、1 M NaCl，其pH为7.4；
（3）镊子结构、目标DNA以及发卡结构之间的杂交反应；将修饰有镊子结构的电极浸没到100 μL的反应体系中，室温反应2 h；
所述反应体系为：0.6 μM 发卡结构、不同浓度的目标DNA、60 U的核酸外切酶III，及10 mM PBS缓冲液；
（4）G-四链体-血红素复合物的形成：将200 μL的G-四链体形成液倒扣在如（3）所述反应后的电极上，室温下30 min；向G-四链体形成液中加入2 μL 20 mM 血红素混匀；将反应液继续倒扣到电极上，室温下1 h；用清洗缓冲液冲洗电极，用于电化学检测；
G-四链体形成液为：10 mmol•L-1 HEPES, 50 mmol•L-1 KCl, pH8.0
（5）电化学检测：采用三电极系统，上述金电极作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极；检测所用电解液为含20 mM KCl的pH 7.4，20 mM HEPES缓冲液；先通入氮气30 min；
检测方法为差分脉冲伏安法（DPV），扫描范围-0.6～-0.15 V，振幅50 mV；取不同浓度的目标DNA，以步骤（1）-（5）同样操作后对其进行检测，绘制峰电流和目标DNA浓度的关系曲线。
经镊子结构固定至电极、发卡结构与目标DNA之间的杂交及G-四链体-血红素复合物形成后所得到电极为工作电极，用差分脉冲伏安法(DPV)进行检测；取一系列不同浓度的目标DNA，以步骤（1）-（5）同样的操作和试剂进行反应后，测定目标DNA在不同浓度条件下的DPV曲线图，分析DPV曲线中峰电流值与目标DNA浓度之间的关系，绘制线性拟合曲线（图2）。随着目标DNA浓度的增加，氧化峰电流信号也随之增强，在目标DNA浓度在10fM到1nM范围内，响应电流与目标DNA浓度的对数呈线性相关，拟合曲线方程y=2.29471+0.41462logC (C是目标DNA的浓度/pM，y是峰电流值/μA)，线性相关系数0.99472。目标DNA检测限达到2.5fM。
实施例2. 电化学DNA生物传感器的特异性分析
以上述K-ras基因片段为例，用发生单碱基错配和三碱基错配的DNA取代原目标DNA参与杂交反应，具体步骤同实施例1。
目标DNA序列为：
5’- TCGTCAAGGC ACTCTTGCCT ACGCCACCAG CTCCAACTAC CACAAG -3’
单碱基错配序列为：
5’- TCGTCAAGGC ACTCTTGCCT ACGCCACCAG CTCCAACTAC CCCAAG -3’
三碱基错配序列为：
5’- TCGTCAAGGC ACTCTTGCCT ACGCCACCAG CTCCAACTAC ACAAAG -3’
比较目标DNA、单碱基错配DNA、三碱基错配DNA三种不同DNA存在下的信号响应。如图4，相比较于完全配对的目标DNA产生的信号增加(a)，单碱基(b)和三碱基错配(c)产生的信号强度要低得多，从而验证了构建的电化学DNA生物传感器能很好地辨别目标DNA和突变序列。
实施例3.电化学DNA生物传感器检测血清样品中的K-ras基因片段
在实际样品人血清中对一系列浓度的目标DNA进行检测，具体步骤同实施例1。
取一系列不同浓度的目标DNA，以步骤（1）-（5）同样的操作和试剂进行反应后，测定目标DNA在不同浓度条件下的DPV曲线图，分析DPV曲线中峰电流值与目标DNA浓度之间的关系，绘制线性拟合曲线（图6）。随着目标DNA浓度的增加，氧化峰电流信号也随之增强，在目标DNA浓度在10 fM到1 nM范围内，响应电流与目标DNA浓度的对数呈线性相关，拟合曲线方程y=1.71005+0.2399logC (C是目标DNA的浓度/pM，y是峰电流值/μA)，线性相关系数0.9935。目标DNA检测限达到5.1 fM。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种基于可控自组装镊子结构电化学检测单链目标DNA的方法
<130> 201712031104
<141> 2017-12-21
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 目标DNA(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
tcgtcaaggc actcttgcct acgccaccag ctccaactac cacaag 46
<210> 2
<211> 97
<212> DNA
<213> 发卡结构(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
tcactccttc tagctacgtc aaggcactct tgcctacgcc accagctcca acttgtggta 60
gttggagctg gtggcgtagg caagagtgcc ttgacga 97
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> A1序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
ccgaccgcag gatcctataa cttgacgtag ctagaaggag 40
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> A2序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
gctggtggcg taggcaagat acattttacg cctggtgcc 39
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> A3序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
gggttgggtt tttataggat cctgcggtcg gaggcaccag gcgtaaaatg tatttgggta 60
ggg 63

Claims (1)

1.一种基于可控自组装镊子结构电化学检测单链目标DNA的方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）金电极的预处理：将金电极在氧化铝粉末上打磨；后依次在超纯水、乙醇、超纯水中超声清洗2-3 min；清洗结束后将金电极插入到0.5M H2SO4溶液中循环伏安法扫描活化，扫描范围从-0.4 V至+1.5 V，扫描速度100mV/s，直到获得稳定的循环伏安曲线为止；将金电极用超纯水冲洗并用氮气吹干；
（2）镊子结构的固定：将合成好的A1、A2、A3序列用10mM PBS缓冲液溶解，-20℃冰箱中保藏；将三条序列用PBS缓冲液稀释；将体系为100μL、浓度各为0.8μM的三条序列的溶液放在95℃恒温金属浴中加热5min，然后室温下反应2h；之后倒扣到金电极上，反应6h，使镊子结构在金电极表面上形成自组装单分子层；用2mM巯基己醇封闭电极4h；用清洗缓冲液淋洗电极，氮气吹干待用；
设计A1序列为：
5’-HS-CCGACCGCAG GATCCTATAA CTTGACGTAG CTAGAAGGAG-3’；
设计A2序列为：
5’-GCTGGTGGCG TAGGCAAGAT ACATTTTACG CCTGGTGCC-SH -3’；
设计A3序列为：
5’-GGGTTGGGTT TTTATAGGAT CCTGCGGTCG GAGGCACCAG GCGTAAAATG TATTTGGGTA GGG-3’；
10mM PBS缓冲液中含有1mM Mg2+、1M NaCl，其pH为7.4；
（3）镊子结构、目标DNA以及发卡结构之间的杂交反应：将修饰有镊子结构的电极浸没到100μL的反应体系中，室温反应2h；
所述反应体系为：0.6μM发卡结构、不同浓度的目标DNA、60U的核酸外切酶III，及10mMPBS缓冲液；
以K-ras基因片段作为目标DNA，其序列为：
5’- TCGTCAAGGC ACTCTTGCCT ACGCCACCAG CTCCAACTAC CACAAG -3’ ；
设计发卡结构序列为：
5’- TCACTCCTTC TAGCTACGTC AAGGCACTCT TGCCTACGCC ACCAGCTCCA ACTTGTGGTAGTTGGAGCTG GTGGCGTAGG CAAGAGTGCC TTGACGA -3’；
（4）G-四链体-血红素复合物的形成：将200μL的G-四链体形成液倒扣在如步骤（3）所述反应后的电极上，室温下反应30min；向G-四链体形成液中加入2μL 20 mM血红素混匀；将反应液继续倒扣到电极上，室温下反应1h；用清洗缓冲液冲洗电极，用于电化学检测；
所述G-四链体形成液为：10mmol·L-1 HEPES，50 mmol·L-1 KCl，pH8.0；
（5）电化学检测：采用三电极系统，上述金电极作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极；检测所用电解液为含20mM KCl的pH 7.4、20 mM HEPES缓冲液；先通入氮气30 min；
检测方法为差分脉冲伏安法DPV，扫描范围-0.6～-0.15 V，振幅50 mV；取不同浓度的目标DNA，以步骤（1）-（5）同样操作后对其进行检测，绘制峰电流和目标DNA浓度的关系曲线。
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