CN104764784A - 基于核酸适配体检测汞离子的生物传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于核酸适配体检测汞离子的生物传感器，在电极上依次修饰有HAP2层、HAP1和Probe1层；同时提供了其制备方法，本发明提供的生物传感器性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中汞离子的检测和生物传感器产业化的实际应用。

Description

基于核酸适配体检测汞离子的生物传感器及其制备方法

技术领域    

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于核酸适配体检测汞离子的生物传感器，还涉及其制备方法。

背景技术   

汞及其化合物对人体健康存在多种伤害，若存在于天然水体中，则会对大范围的人群造成威胁。它能够在生物体内积累，通过食物链转移到人体内。人体内累积的微量汞无法通过自身代谢进行排泄，将直接导致心脏、肝甲状腺疾病，引起神经系统紊乱，慢性汞中毒，甚至引发恶性肿瘤的形成。

溶解态的Hg²⁺往往具有较高的化学活性，是排入天然水体中汞污染物的主要存在形式，其化合物具有较高的水溶性，也是各种汞形态转化的枢纽。因此，汞离子的分析测定是人们十分关注的课题。目前，常用的汞化合物检测方法包括分光光度法、原子发射光谱法、原子吸收光谱法、氢化物发生-原子荧光光谱法等，这些方法往往存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂、检测费用昂贵等问题，已经难以适应汞离子检测的方便、快捷、灵敏度等方面的要求。

因此，目前急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的检测方法来检测食品中汞离子的残留。

发明内容   

为了解决以上现有技术中检测汞离子的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于核酸适配体检测汞离子的生物传感器。

本发明还提供了基于核酸适配体检测汞离子的生物传感器的制备方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

本发明中一共用到了3条DNA链，其序列分别是：

Probe1: 5’-GTTTGTTTGTTGGCCCGG-3’（SEQ ID NO：1）

HAP1: 5’-GTTTGTTTGTTGGCCCGTTCAAACAAACTTCTTTCTTTC-3’（ SEQ ID NO：2）

HAP2: 5’-SH-GTTTGCCAACATACAAAC-MB-3’（ SEQ ID NO：3）

其中Probe1与HAP1中画横线部分的T之间可特异性结合汞离子，从而形成“T-Hg²⁺-T”。

HAP2的5’端修饰有巯基（-SH），可以与金电极形成稳定的Au-S键，从而将HAP2固定在电极表面；3’端修饰有亚甲基蓝，它可以在一定的电位下发生氧化还原反应，我们就是通过检测该氧化还原信号来达到定量的检测目标物的目的。

本发明中只用到了一种酶：核酸外切酶Ⅲ，只对DNA双链3’端的平末端和凹末端起作用，对凸末端和单链没有作用。

本发明中汞离子的检测是在电极上实现的，通过两步循环的方式来实现信号的减小，从而实现汞离子的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

均相中发生的反应主要有：在有目标物存在的情况下,HAP1与Probe1中T之间会由目标物连接形成“T-Hg²⁺-T”结构，从而将Probe1与HAP1固定到一起。此时在核酸外切酶Ⅲ的作用下，将链切割开，并释放游离态的目标物与和Probe1完全相同的Probe1’，从而实现第一次循环放大，即目标物诱导的Probe1循环放大。在第二步循环中，利用了第一步产生的Probe1’及剩余的Probe1，因为该链与修饰到电极上的已打开发夹结构的HAP2碱基互补配对，在核酸外切酶Ⅲ的再次切割下，HAP2上MB成为游离态，致使检测到的电化学信号越来越微弱。由于本发明在进行过程中可不断产生Probe1’,在核酸外切酶Ⅲ的作用下，从而继续新一轮的循环，即第二步循环减小。

在均相反应中，两步放大的反应条件均为37℃，反应时间是2h。

一种基于核酸适配体检测汞离子的生物传感器，在电极上依次修饰有HAP2层、HAP1和Probe1层；

所述的生物传感器， HAP2层的厚度大为15±2nm、HAP1和Probe1层的厚度为10±2nm。

所述的生物传感器， HAP1和Probe1层中HAP1（摩尔）、Probe1（摩尔）、核酸外切酶Ⅲ（活性）的摩尔与活性的比为1：1：250。

所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）对电极进行预处理；

（2）将HAP2层修饰到电极表面；

（3）将HAP1和Probe1层修饰到电极表面。

所述的制备方法，优选将HAP2层修饰到电极表面的操作步骤如下：将1.0μM的HAP2滴加10μL到经过预处理的电极表面，在25℃下孵育2h。

所述的制备方法，优选将HAP1和Probe1层修饰到电极表面的操作步骤如下：

（1）将灭菌水，1X的buffer缓冲液、HAP1、Probe1、核酸外切酶Ⅲ和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；

（2）将孵育好的混合溶液滴加到修饰好HAP2层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗。

所述的制备方法，优选对电极进行预处理操作为电极在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。

所述的制备方法，优选所述电极为金电极。

该发明的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将HAP2固定到电极表面。将反应后的均相溶液修饰到电极表面，然后37℃孵育2h使均相中的Probe1及Probe1’与电极表面的HAP2完成杂交反应，并由核酸外切酶Ⅲ完成对他们的切割。然后用三电极工作体系检测MB的氧化还原峰。以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06 S，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测待测目标物。

本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，核酸外切酶Ⅲ在特异性位点对核酸链的切割作用以及亚甲基蓝的氧化还原特性构建了适体生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补汞离子现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。

本发明的有益效果：

1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用汞离子的适体作为识别物质实现了对目标物汞离子的高特异性检测；

2、利用核酸外切酶Ⅲ的切割作用，实现了目标物的循环利用，起到了信号减小的作用；

3、利用核酸外切酶Ⅲ对特异性序列的识别和切割作用，实现了信号的两步循环变动，实现了对目标物的高敏检测，提高了检测的灵敏度；

4、该传感器的反应条件温和，反应速度快；

5、由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用；

6、检测原理的主要过程均是在电极上实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；

7、制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中汞离子的检测和生物传感器产业化的实际应用；

8、制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

 附图说明

图1为该实验的原理图；

图2为实施例1传感器检测汞离子的工作曲线；

图3为生物传感器的结构示意图。

其中，1为金电极；2为HAP2层、3为HAP1和Probe1层。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

如附图3所示，本发明提供的生物传感器包括金电极1； HAP2层2和 HAP1和Probe1层3。

本发明的具体制备方法如下：

a、金电极首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水反复冲洗；

b、将10μL的HAP2（1.0μM）滴加到电极表面，在室温下孵育2h。通过Au-S键将巯基链固定到电极表面；

至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：

a、将灭菌水，1X的缓冲液（buffer），HAP1（1.0μM），Probe1（1.0μM），核酸外切酶Ⅲ（1μL）和1μL不同浓度的目标物（10pM，50pM，100pM，500pM，1000pM，5000pM，10000pM，50000pM，100000pM）加入到预先准备好的灭菌的离心管中。震荡30s，然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育2h；

b、将a步反应后的溶液（10μL）滴加到预先修饰好HAP2的电极上。然后将电极继续放在37 ℃的恒温箱中孵育2h；

c、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。

以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5 V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06 s，采用差分脉冲伏安技术读取MB电信号的变化，检测目标物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。原理图如图1所示，不同浓度的工作曲线如图2所示，从工作曲线中可以看出，当浓度在10pM时，工作曲线依然符合线性关系。

Claims (6)

1.    一种基于核酸适配体检测汞离子的生物传感器，其特征在于，在金电极上依次修饰有HAP2层、HAP1和Probe1层。

2.     根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，HAP2层的厚度为15±2nm、HAP1和Probe1层的厚度为10±2nm。

3.一种权利要求1或2所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对金电极进行预处理；

（2）将HAP2层修饰到电极表面；

（3）将HAP1和Probe1层修饰到电极表面；

所述Probe1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述 HAP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述 HAP2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）将HAP2层修饰到电极表面的操作步骤如下：将1.0μM的HAP2滴加10μL到经过预处理的电极表面，在25℃下孵育2h。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）将HAP1和Probe1层修饰到电极表面的操作步骤如下：

（1）将灭菌水，1X的buffer缓冲液、HAP1、Probe1、核酸外切酶Ⅲ和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；

（2）将孵育好的混合溶液滴加到修饰好HAP2层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗；

HAP1和Probe1层中HAP1、Probe1、核酸外切酶Ⅲ的摩尔与活性的比为1：1：250，其中，HAP1 和Probe1的单位为摩尔，核酸外切酶Ⅲ的单位为活性单位。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）对电极进行预处理操作为电极在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。