CN105203612A - 一种基于金属有机骨架材料的生物传感器及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于金属有机骨架材料和壳聚糖的酪氨酸酶电化学生物传感器及其制备方法和应用，首先将酪氨酸酶固载在以铜离子为金属中心的金属有机骨架材料(CuMOF)表面上，再与壳聚糖(Chi)混合后生成CuMOF-Tyr-Chi复合材料固定在玻碳电极表面制得酪氨酸酶电化学生物传感器。本发明的优点是：1.对双酚类化合物灵敏度高；2.检测限低；3.选择性好；4.本发明的生物传感器制备过程简单，无需复杂的样品前处理过程，对目标化合物响应迅速，易于微型化。

Description

一种基于金属有机骨架材料的生物传感器及其应用

技术领域

本发明属于生物传感器，涉及一种基于金属有机骨架材料-壳聚糖复合材料的酪氨酸酶电化学生物传感器用于检测双酚类化合物的方法。

背景技术

双酚A，即2,2-二(4-羟基苯基)丙烷(简称BPA)，是一种近年来受到广泛关注的内分泌干扰物。双酚A与人体雌激素受体相互作用，产生雌激素效应，对人体健康造成危害。此外，有实验证明双酚A对人体中枢神经系统、免疫系统和生殖系统也有一定的毒性。双酚A是世界上使用最广泛的工业原料之一，主要用来生产聚碳酸酯和环氧树脂。这些塑料制品常常被用来生产婴幼儿奶瓶，餐具，饮水杯和饮料罐体内侧涂层。加拿大、美国和中国等国家相继出台法律法规禁止双酚A应用于婴幼儿奶瓶和奶粉包装材料的生产。因为这些法律法规的限制，近年来其他双酚类化合物(包括双酚F、双酚E、双酚B和双酚Z)开始成为双酚A的替代物用于工业生产中。

由于双酚类化合物在工业中的大量使用及其对人体潜在的毒性，有必要发展一种快速、便捷、灵敏、价格低廉的检测方法用于双酚类化合物的检测。目前常用的双酚类化合物分析检测方法主要为色谱法和色谱-质谱联用法。这些方法存在着所使用的仪器价格昂贵，检测操作繁琐，需要专业的科研人员进行操作，样品的前处理费时等缺点。电化学生物传感器这一新兴的分析手段能够弥补上述缺点，已经成为一种重要的分析手段。

酶的固定对生物传感器的性能起着至关重要的作用。关于酶固定材料的研究越来越受到关注。金属有机骨架材料(MOFs)是一种新兴的由含氧、氮等有机配体与金属离子自组装而成的配位聚合物。由于其具有比表面积大、孔隙率大、孔道可调和热稳定性好等特点，已经成为近年来材料领域的研究热点，并且在气体存储、分离、催化、清洁能源、生物医学和化学传感等领域广泛应用。

迄今为止，国内外上还没有基于有机金属骨架材料-壳聚糖复合材料制备的酪氨酸酶电化学生物传感器用于检测双酚类化合物的先例。所以针对双酚类化合物的检测，发明一种响应时间短、检测限低、灵敏度高的生物传感器是一个迫切需要解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于有机金属骨架材料-壳聚糖修饰玻碳电极的酪氨酸酶电化学生物传感器，这种传感器具有高灵敏度、低检测限、高选择性、检测快速和制备方法简单等优点，能够用于检测双酚类化合物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

构建基于有机金属骨架材料-壳聚糖修饰玻碳电极的酪氨酸酶电化学生物传感器，并利用该传感器通过电化学检测信号前后的变化对双酚类化合物进行测定。

酪氨酸酶电化学生物传感器的制备与样品的检测过程具体步骤如下：

(1)将有机金属骨架材料与酪氨酸酶磷酸盐缓冲溶液混合，在室温下震荡0.5小时。

(2)将具有成膜能力的壳聚糖加入到有机金属骨架材料和酶分子形成的复合材料溶液中混匀，取4μL上述含有有机金属骨架材料-酪氨酸酶-壳聚糖(CuMOF-Tyr-Chi)复合物溶液滴加到已经进行过抛光处理的玻碳电极表面，在室温下静置晾干。

(3)将一定浓度的待检测双酚类化合物水溶液滴加到缓冲溶液中，利用电化学工作站进行电化学扫描并记录响应信号。

一种生物传感器，是基于金属有机骨架材料和壳聚糖的酪氨酸酶电化学生物传感器，其采用如下过程制备获得，

(a)将金属有机骨架材料与酪氨酸酶磷酸盐缓冲溶液混合，在室温下震荡0.5小时或0.5小时以上；

(b)将壳聚糖加入到金属有机骨架材料和酶分子形成的复合材料溶液中充分混匀；

所述含有金属有机骨架材料-酪氨酸酶-壳聚糖(CuMOF-Tyr-Chi)复合物溶液中：金属有机骨架材料浓度为0.3～0.7mgmL^-1；酪氨酸酶浓度为1.0～4.0mgmL^-1；壳聚糖浓度为1.0～2.0mgmL^-1；

取4～10μL上述含有金属有机骨架材料-酪氨酸酶-壳聚糖(CuMOF-Tyr-Chi)复合物溶液滴加到已经进行过抛光处理的玻碳电极表面，在室温下静置晾干，得到酪氨酸酶电化学生物传感器。

所述的金属有机骨架材料采用溶剂热方法合成，其具体制备过程为，

(a)将0.493g三水硝酸铜，0.453g对苯二甲酸和0.32g三乙烯二胺溶于100mLN,N-二甲基甲酰胺(其中三水硝酸铜、对苯二甲酸、三乙烯二胺和N,N-二甲基甲酰胺的量可以等比例的增大或者减小)中超声混匀后，将上述溶液移入带聚四氟乙烯衬套的不锈钢反应釜中，密封后置于烘箱中加热，温度为100～140℃，反应时间为24～48小时，反应结束后将反应釜从烘箱中取出，自然降温到室温；

(b)将步骤(a)得到的产物收集和过滤，固体物质用N,N-二甲基甲酰胺洗涤，置于真空干燥箱中烘干待用，烘干温度为80～120℃。

所述的金属有机骨架材料中三水硝酸铜可用六水硝酸锌、六水硝酸镍或六水硝酸钴替代，它们的用量分别为六水硝酸锌0.608g、六水硝酸镍0.594g和六水硝酸钴0.594g。

所述磷酸盐缓冲溶液的组成为K₂HPO₄和KH₂PO₄等摩尔浓度(50mmol/L)混合水溶液，并将pH调至7.0。

所述的壳聚糖是从蟹壳和/或虾壳中所获得的直链高分子聚合物；其壳聚糖脱乙酰度为75％～85％。

玻碳电极表面的抛光处理过程为：依次用粒径分别为1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末将玻碳电极表面抛光，然后依次分别在无水乙醇和去离子水中反复超声清洗，之后用氮气将电极表面吹干待用。

所述传感器的应用用于检测双酚类化合物，也可以说是一种基于金属有机骨架材料-壳聚糖复合材料的酪氨酸酶电化学生物传感器检测双酚类化合物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将所述的酪氨酸酶电化学生物传感器放入空白检测溶液中，在工作电压下将已知浓度(0.1～1mmol/L)的双酚类化合物中的一种或二种以上作为目标分析物连续加入到上述检测溶液中，同时进行电化学扫描并记录响应的电流-时间曲线；

进一步，由于电流-时间曲线中固定时间点上检测溶液中的双酚类化合物浓度可知，通过电流-时间曲线中的电流强度I和目标物浓度C组成校正曲线；

(2)在工作电压下将分析水体样品加入到检测溶液中，同时进行电化学扫描并记录响应的电流强度；通过电流-时间曲线中的电流强度I和目标物浓度C组成的校正曲线来计算分析样品中双酚类化合物的浓度含量。

所述的目标分析物包括双酚A、双酚F、双酚E、双酚B以及双酚Z等双酚类化合物中的一种或二种以上；

所述电化学扫描的工作电压范围为-0.05～-0.15V，其为恒电势扫描；通过本发明酪氨酸酶电化学生物传感器检测的电流强度与目标物浓度关系而得到的标准曲线，来确定样品中是否含有双酚类化合物并同时确定双酚类化合物的浓度。

检测溶液为磷酸盐缓冲溶液，其组成为pH＝7.0的K₂HPO₄和KH₂PO₄等摩尔浓度(50mmol/L)混合水溶液，体积为8mL。

目标分析物被连续加入到上述检测溶液中，加入速度为每隔40～50s一次，加入体积为0.4～8μL；此时检测溶液的体积为8mL。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明中的有机金属骨架材料具有独特的3D结构，高比表面积能够有效增强固载其上的酪氨酸酶的生物催化活性。有机金属骨架材料中相互贯通的孔道可以促进离子和电荷的转移，从而提高生物传感器的灵敏度；(2)有机金属骨架材料通过π-π作用，对双酚类化合物产生预富集作用，增加待分析物的局部浓度，提高生物传感器的检测限；(3)本发明的酪氨酸酶电化学生物传感器对样品中双酚类化合物的检测不需要复杂的样品预处理，操作简便快速，检测反应迅速。

本发明的酪氨酸酶电化学生物传感器对双酚类化合物具有高选择性，能够快速、灵敏、准确、高效地评价环境水样中双酚类化合物的浓度水平。

附图说明

图1(A)为本发明合成的金属有机骨架材料扫描电子显微镜(SEM)图；(B)为透射电子显微镜(TEM)图。

图2为本发明方法实施例2中的不同修饰电极的电化学阻抗图谱。

图3(A)为本发明方法实施例3中的双酚A响应电流-时间关系曲线；(B)为响应电流强度与双酚A浓度的线性关系曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下是部分本发明实施例中所用的仪器和设备，其它未具体注明的实验条件，按照常规或仪器制造厂建议的条件。

电流-时间测试所用仪器为上海辰华电化学工作站CHI440，电化学阻抗测试所用仪器为瑞士万通Autolab电化学工作站PGSTAT302N，三电极体系，修饰玻碳电极作为工作电极，银/氯化银电极作为参比电极，铂电极作为辅助电极。酪氨酸酶(菌菇)购于Sigma-aldrich(China)。

所述的金属有机骨架材料采用溶剂热方法合成，其具体制备过程为，

(a)将0.493g三水硝酸铜，0.453g对苯二甲酸和0.32g三乙烯二胺溶于100mLN,N-二甲基甲酰胺中超声混匀后，将上述溶液移入带聚四氟乙烯衬套的不锈钢反应釜中，密封后置于烘箱中加热，温度为100～140℃，反应时间为24～48小时，反应结束后将反应釜从烘箱中取出，自然降温到室温；

(b)将步骤(a)得到的产物收集和过滤，固体物质用N,N-二甲基甲酰胺洗涤，置于真空干燥箱中烘干待用，烘干温度为80～120℃。

实施例1.酪氨酸酶电化学生物传感器制备

玻碳电极组装步骤：

(1)用粒径分别为1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末将玻碳电极表面抛光，然后在无水乙醇和去离子水中反复超声清洗，之后用氮气将电极表面吹干待用。放入1mmolL^-1的铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液(摩尔比1:1)中在-0.1^～+0.6V之间扫描循环伏安曲线。该曲线氧化还原峰电位差小于70mV，说明玻碳电极表面的氧化还原反应属于完全可逆反应，电极抛光情况良好，可以进行下一步实验。

(2)金属有机骨架材料-酪氨酸酶复合材料的制备。将金属有机骨架材料加入到酪氨酸酶磷酸盐缓冲溶液(50mmol/LK₂HPO₄/KH₂PO₄溶液,pH＝7.0)中，震荡0.5小时，酪氨酸酶被成功吸附到金属有机骨架材料表面，得到金属有机骨架材料-酪氨酸酶复合材料分散液。

(3)将具有生物相容性的成膜剂壳聚糖加入到上述复合材料分散液中，加入壳聚糖后形成的最终分散液的组成为金属有机骨架材料浓度为0.5mgmL^-1；酪氨酸酶浓度为2.5mgmL^-1；壳聚糖浓度为1.5mgmL^-1，取4μL最终分散液滴到玻碳电极表面，在室温下静置缓慢晾干，得到有机金属骨架材料-酪氨酸酶-壳聚糖电极(CuMOF-Tyr-Chi/GCE)。其余用于对比的电极，有机金属骨架材料-壳聚糖电极(CuMOF-Chi/GCE)和壳聚糖电极(Chi/GCE)都按照上述方法制备。

(4)将修饰后的玻碳电极放入50mmolL^-1磷酸盐缓冲溶液溶液(pH＝7.0)中搅拌0.5小时，去除没有固定在电极表面的酶或材料。

实施例2.酪氨酸酶电化学生物传感器的电化学表征

在PGSTAT302N电化学工作站上，分别测定上述实施例1制备的CuMOF-Tyr-Chi/GCE、CuMOF-Chi/GCE、Chi/GCE及裸电极(bareGCE)在含有1mmolL-¹铁氰化钾/亚铁氰化钾(摩尔比1:1)探针和0.5molL-¹硝酸钾支持电解质的电解液中的交流阻抗信号。实验结果如图2所示，不同修饰电极的电荷转移电阻大小顺序为：CuMOF-Tyr-Chi/GCE>CuMOF-Chi/GCE>Chi/GCE>bareGCE，说明本发明中的CuMOF-Tyr-Chi复合材料已经成功修饰在电极表面，成功制备出酪氨酸酶电化学生物传感器。

实施例3.酪氨酸酶电化学生物传感器检测双酚类化合物的标准溶液

将一定体积(0.4～2μL)的双酚A标准溶液(1mmol/L)连续滴加(每50s一次)到由酪氨酸酶修饰的玻碳电极组成的三电极体系的检测溶液8ml磷酸盐缓冲溶液中，在工作电势为-0.1V的情况下进行恒电势扫描，得到的电流-时间(I-t)关系曲线，由于I-t曲线中固定时间点上检测溶液中的双酚A浓度可知，所以可以得到电流强度与双酚A浓度之间的相关曲线。在氧气存在情况下，酪氨酸酶催化双酚A生成邻苯酚类化合物，进一步被催化生成邻苯醌类化合物，邻苯醌类化合物又在较低的电势下被还原成邻苯酚类化合物。酪氨酸酶电化学生物传感器可以检测这一还原信号，并且信号强度与双酚A的浓度在一定范围内线性相关，实验结果见图3。

双酚F、双酚E、双酚B和双酚Z均采用与双酚A相同的检测过程进行检测。结果显示酪氨酸酶电化学生物传感器对这五种双酚类化合物都产生了较强的电化学响应信号。并且随着浓度的升高，电化学响应信号逐步增强，在一定浓度范围呈良好的线性关系。

在工作电压下将分析水体样品加入到检测溶液中，同时进行电化学扫描并记录响应的电流；通过电流强度和双酚类目标物浓度组成的校正曲线来计算样品中双酚类化合物的浓度含量。

实施例4.酪氨酸酶电化学生物传感器干扰物的检测

取葡萄糖、尿酸和过氧化氢等检测时常见的干扰物溶于水中，配置成一定浓度的水溶液，在双酚A浓度为0.5μM的情况下，向检测溶液滴加葡萄糖、尿酸和过氧化氢水溶液，扫描I-t曲线，得到上述三种干扰物的电信号响应。结果证明葡萄糖浓度为2mM、尿酸浓度为20μM和过氧化氢浓度为10μM时均不影响酪氨酸酶电化学生物传感器对双酚A的检测。相同检测过程中分别对有机溶剂(丙酮、乙腈、乙醇)和无机盐离子(浓度为2mM的K⁺、Na⁺、NO₃ ^-、H₂PO₄ ^-、HPO₄ ^2-、Cl^-、Ac^-离子)进行了干扰测试，结果显示上述干扰物均对本发明的酪氨酸酶电化学生物传感器无干扰作用。

本发明的优点是：1.对双酚类化合物灵敏度高；2.检测限低；3.选择性好；4.本发明的生物传感器制备过程简单，无需复杂的样品前处理过程，对目标化合物响应迅速，易于微型化。

Claims (10)

1.一种基于金属有机骨架材料的生物传感器，是基于金属有机骨架材料和壳聚糖的酪氨酸酶电化学生物传感器，其特征在于：

其采用如下过程制备获得，

(a)将金属有机骨架材料与酪氨酸酶磷酸盐缓冲溶液混合，在室温下震荡0.5小时或0.5小时以上；

(b)将壳聚糖加入到金属有机骨架材料和酶分子形成的复合材料溶液中充分混匀；

所述含有金属有机骨架材料-酪氨酸酶-壳聚糖(CuMOF-Tyr-Chi)复合物溶液中：金属有机骨架材料浓度为0.3～0.7mgmL^-1；酪氨酸酶浓度为1.0～4.0mgmL^-1；壳聚糖浓度为1.0～2.0mgmL^-1；

取4～10μL上述含有金属有机骨架材料-酪氨酸酶-壳聚糖(CuMOF-Tyr-Chi)复合物溶液滴加到已经进行过抛光处理的玻碳电极表面，在室温下静置晾干，得到酪氨酸酶电化学生物传感器。

2.如权利要求1所述的传感器，其特征在于：所述的金属有机骨架材料采用溶剂热方法合成，其具体制备过程为，

(a)将0.247～0.986g三水硝酸铜，0.227～0.906g对苯二甲酸和0.16～0.64g三乙烯二胺溶于50～200mLN,N-二甲基甲酰胺中超声混匀后，将上述溶液移入带聚四氟乙烯衬套的不锈钢反应釜中，密封后置于烘箱中加热，温度为100～140℃，反应时间为24～48小时，反应结束后将反应釜从烘箱中取出，自然降温到室温；

(b)将步骤(a)得到的产物收集和过滤，固体物质用N,N-二甲基甲酰胺洗涤，置于真空干燥箱中烘干待用，烘干温度为80～120℃。

3.如权利要求2所述的传感器，其特征在于：所述的金属有机骨架材料中三水硝酸铜可用六水硝酸锌、六水硝酸镍或六水硝酸钴替代，它们的用量分别为六水硝酸锌0.304～1.216g、六水硝酸镍0.297～1.188g或六水硝酸钴0.297～1.188g。

4.如权利要求1所述的传感器，其特征在于：所述磷酸盐缓冲溶液的组成为K₂HPO₄和KH₂PO₄等摩尔浓度(50mmol/L)混合水溶液，并将pH调至7.0。

5.如权利要求1所述的传感器，其特征在于：所述的壳聚糖是从蟹壳和/或虾壳中所获得的直链高分子聚合物；其壳聚糖脱乙酰度为75％～85％。

6.如权利要求1所述的传感器，其特征在于：玻碳电极表面的抛光处理过程为：依次用粒径分别为1μm、0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末将玻碳电极表面抛光，然后依次分别在无水乙醇和去离子水中反复超声清洗，之后用氮气将电极表面吹干待用。

7.一种权利要求1-6任一所述传感器的应用，其用于检测双酚类化合物，也可以说是一种基于金属有机骨架材料-壳聚糖复合材料的酪氨酸酶电化学生物传感器检测双酚类化合物的方法，其特征在于：

该方法包括以下步骤：

(1)将所述的酪氨酸酶电化学生物传感器放入空白检测溶液中，在工作电压下将已知浓度(0.1～1mmol/L)的双酚类化合物中的一种或二种以上作为目标分析物连续加入到上述检测溶液中，同时进行电化学扫描并记录响应的电流-时间曲线；

进一步，由于电流-时间曲线中固定时间点上检测溶液中的双酚类化合物浓度可知，通过电流-时间曲线中的电流强度I和目标物浓度C组成校正曲线；

(2)在工作电压下将分析水体样品加入到检测溶液中，同时进行电化学扫描并记录响应的电流强度；通过电流-时间曲线中的电流强度I和目标物浓度C组成的校正曲线来计算分析样品中双酚类化合物的浓度含量。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的目标分析物包括双酚A、双酚F、双酚E、双酚B以及双酚Z等双酚类化合物中的一种或二种以上；

所述电化学扫描的工作电压范围为-0.05～-0.15V，其为恒电势扫描；通过本发明酪氨酸酶电化学生物传感器检测的电流强度与目标物浓度关系而得到的标准曲线，来确定样品中是否含有双酚类化合物并同时确定双酚类化合物的浓度。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于：

检测溶液为磷酸盐缓冲溶液，其组成为pH＝7.0的K₂HPO₄和KH₂PO₄等摩尔浓度(50mmol/L)混合水溶液，体积为8mL。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于：

目标分析物被连续加入到上述检测溶液中，加入速度为每隔40～50s一次，加入体积为0.4～8μL；此时检测溶液的体积为8mL。